ES2354419T3

ES2354419T3 - Nuevas proteínas de fusión de trombomodulina dirigidas hacia el factor tisular como agentes anticoagulantes.

Info

Publication number: ES2354419T3
Application number: ES03721975T
Authority: ES
Inventors: David Light; Kirk Mclean
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2011-03-14
Anticipated expiration: 2023-04-30
Also published as: UA81114C2; DK1549341T3; US20040063632A1; JP4460443B2; WO2003093422A3; BR0304660A; KR20050045944A; KR101013697B1; DE60326970D1; US20080020965A1; CN1665534A; NO20035849L; WO2003092602A3; EP1503785B1; CA2483909A1; NZ536243A; US20080019985A1; UA85996C2; IL164733A0; JP2005538046A

Abstract

Una proteína de fusión anticoagulante, que comprende una proteína directora hacia diana o un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de la misma, que se fija al factor tisular (TF) o al complejo de factor VIIa/factor tisular (FVIIa/TF), que está ligado operativamente al dominio EGF456 de la trombomodulina (TM), o a un análogo, un fragmento, un derivado o una variante del mismo; fijándose la proteína de fusión anticoagulante al factor tisular (TF) o al complejo de factor VIIa/TF (FVIIa/TF).

Description

ANTECEDENTES 5

Mantener el equilibrio apropiado entre las actividades procoagulante y anticoagulante dentro de los vasos sanguíneos es esencial para una hemóstasis normal (Davie, E.W. y colaboradores (1991) Biochemistry, 30(43):10363-10370). Perturbar el equilibrio hacia la 10 coagulación conduce a una trombosis, lo cual puede causar ataques cardiacos, apoplejía, embolismo pulmonar y trombosis venosa. Existe una necesidad de agentes anticoagulantes más efectivos y seguros para el tratamiento de trastornos trombóticos específicos. 15

El factor tisular (“TF”) es una glicoproteína transmembranal que es el iniciador principal de la cascada de coagulación (Nemerson, Y. (1995) Thromb. Haemost 74(1):180-184). En condiciones fisiológicas normales, el TF activo no está en contacto con la sangre. Durante un daño o 20 lesión vascular, la exposición a la sangre del TF subendotelial y del colágeno conduce a la activación de los factores de la coagulación y las plaquetas y posteriormente a la formación de un tapón hemostático. La inducción inapropiada de la expresión del TF en una variedad de 25 escenarios clínicos puede conducir a una trombosis que amenace la vida y/o contribuir a complicaciones patológicas. Se cree que la exposición del TF después de la ruptura de la placa es responsable de una oclusión trombótica que conduce a un infarto de miocardio agudo y a 5 una apoplejía. En esos escenarios, las rutas de señalización proinflamatorias activadas por los factores de la coagulación también contribuyen a la formación de un edema e un tamaño aumentado del infarto. La lesión vascular asociada con una angioplastia conduce a la regulación en 10 sentido ascendente del TF sobre las SMC lo cual se cree que induce las rutas de señalización celular que están asociadas con una reestenosis. La sobreexpresión del TF en un cáncer y en una sepsis gram negativa conduce a una trombosis que amenaza a la vida y a una activación de las 15 rutas inflamatorias.

El complejo del factor VIIa (“FVIIa”)/TF está implicado en el mecanismo patógeno en una variedad de enfermedades trombóticas y el nivel de circulación del TF es un factor de riesgo para ciertos pacientes. El FVIIa y 20 el TF desempeñan unos cometidos únicos en su género en una lesión vascular manteniendo la hemóstasis e iniciando la trombosis. El TF es expresado en la adventicia normalmente, pero es regulado en sentido ascendente y expresado inapropiadamente en los medios y en la neoíntima en 25 enfermedades vasculares. La expresión del TF en placas ateroescleróticas es aumentada y protegida con respecto de la sangre por una tapa fibrosa delgada que puede romperse para exponer el TF. Las intervenciones quirúrgicas como la angioplastia con globo, el uso de dispositivos de stent, o 5 la endarterectomía dañan a la pared del bazo y exponen al TF subyacente. En la placa ateroesclerótica, de paredes delgadas, rica en lípidos, una ruptura espontánea o erosión endotelial conduce a una exposición del TF y a una trombosis, dando como resultado una angina inestable y un 10 infarto de miocardio. El TF puede circular en micropartículas derivadas de células y los niveles de TF en circulación son elevados en una angina inestable, sugiriendo que este TF en circulación puede contribuir a una formación de trombos (Soejima, H. y colaboradores 15 (1999) Circulation 99(22):2908-2913). Con frecuencia, un cáncer se asocia con un estado hipercoagulable atribuido a la sobreexpresión del TF en las células tumorales. Esto predispone al paciente a una trombosis venosa profunda, a un embolismo pulmonar y a una coagulación intravascular 20 diseminada de grado bajo (“DIC” acrónimo de disseminated intravascular coagulation). Una DIC da como resultado una deposición de fibrina microvascular que contribuye a una insuficiencia de órganos múltiples. Los resultados de unos modelos de lesión arterial aguda por trombosis indican que 25

La trombomodulina (“TM”) es una glicoproteína transmembranal que tiene propiedades anticoagulantes y es expresada predominantemente sobre la superficie luminar de 20 las células endoteliales que recubren a los vasos sanguíneos (Esmon, N.L. y colaboradores (1982) J. Biol. Chem. 257(2):859-864; Salem, H.H. y colaboradores (1983) J. Biol. Chem. 259(19):12246-12251). La TM de longitud completa, madura, es una proteína modular con 557 residuos 25 de aminoácidos que se compone de 5 dominios estructurales: una región hidrófoba, situada en el extremo terminal de N (residuos 1-226); una región rica en cisteína (residuos 226-462); una región rica en Ser/Thr glicosilada en O (residuos 463-497); una región transmembranal hidrófoba 5 (residuos 498-521); y una cola citoplasmática situada en el extremo terminal de C (residuos 522-557).

La región rica en cisteína incluye seis estructuras repetidas homólogas con un precursor de un factor de crecimiento epidérmico (“EGF”), llamadas dominios 10 similares a un EGF, con homología con un EGF o de un EGF. La región rica en cisteína puede ser dividida además en 3 dominios: las repeticiones 1, 2 y 3 similares a EGF (“EGF123”, residuos 226-344), el lazo entre dominios situado entre los EGF3 y EGF4 (residuos 345-349), y los 15 dominios 4, 5 y 6 similares a EGF (“EGF456”, residuos 350-462). La función del EGF456 es mediar en la fijación de trombina y en la activación de la proteína C. Un estudio ha sugerido que las quinta y sexta repeticiones similares a un EGF (“EGF5”, residuos 390-407, y “EGF6”, residuos 427-462, 20 respectivamente) tienen la capacidad de fijarse a la trombina (Kurosawa, S. y colaboradores (1988) J. Biol. Chem. 263 (13):5993-5996); otro sugiere que el dominio del EGF456 es suficiente para actuar como un cofactor para la actividad activadora de la proteína C mediada por trombina 25 (Zushi, M. y colaboradores (1989) J. Biol. Chem. 264(18):10351-10353). El dominio rico en Ser/Thr intensifica la fijación de la trombina mediada por EGF456, La tercera repetición similar a un EGF (“EGF”, residuos 311-344) es requerida para la activación de un agente 5 inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina (“TAFI” acrónimo de thrombin activatable fibrinolysis inhibitor). Se han descrito varios mutantes puntuales en el EGF3 que interfieren con la activación de un TAFI (Wang W. y colaboradores (2000) J. Biol. Chem.275(30):22942-22947). 10 Unos análogos a la TM que tienen la capacidad de intensificar la activación de la proteína C, mediada por trombina, pero que tienen una capacidad significativamente reducida de favorecer una activación de una TAFI, son útiles en una terapia antitrombótica (documento de 15 solicitud de patente internacional WO 01/98352). El complejo de trombina/TM convierte a la proteína C en una proteína C activada (“APC” acrónimo de activated protein C), que a su vez degrada a los factores Va y VIIa, impidiendo de esta manera una generación adicional de 20 trombina. Por lo tanto, la TM funciona como un conmutador molecular que convierte a la trombina desde un agente procoagulante a un agente anticoagulante.

La Km de la proteína C para el complejo de trombina/TM es reducida en un factor de 10 veces cuando la 25 TM está situada junto a una superficie de membrana (Esmon, C.T. (1995) FASEB J. 9(10):946-955). La concentración de la proteína C en sangre (0,065 µM) se encuentra significativamente por debajo de la Km informada (5µM) para el complejo de TM/trombina soluble, estableciendo por lo 5 tanto que la TM sobre la superficie de la membrana procoagulante dé como resultado una intensificación local notable de la velocidad de generación de la proteína C.

La TM inhibe a la trombosis por un mecanismo diferente al de la heparina o sus derivados. La heparina es 10 un cofactor para la antitrombina II e inhibe tanto al FXa como a la trombina a través de un mecanismo dependiente de la antitrombina III. La trombina fijada a un trombo es protegida contra la acción de la antitrombina III, lo cual limita la eficacia antitrombótica de la heparina o de una 15 heparina de bajo peso molecular (“LMWH” acrónimo de low molecular weight heparin) sobre coágulos preexistentes. Esto explica el fracaso de la heparina o de la LMWH en inhibir el crecimiento de trombos activado por la trombina o la protrombinasa fijada al coágulo en estudios con 20 primates no humanos. En contraste, una TM recombinante atenúa un coágulo inducido por la generación de trombina y la formación de fibrina de una manera dependiente de la dosis (Mohrl, M. y colaboradores (1998) Thromb. Haemost 80(6):925-929). El efecto agente inhibidor de la TM es 25 abolido por un anticuerpo anti-proteína C. La inhibición de la actividad procoagulante unida a un coágulo es clínicamente relevante debido a que una actividad procoagulante unida a un coágulo da como resultado un crecimiento más rápido del trombo y finalmente una oclusión 5 vascular o complicaciones tromboembólicas. La inhibición del crecimiento de un trombo permite que los sistemas fibrinolíticos endógenos eliminen los coágulos más rápida y completamente. Además, se espera también que la TM sea más efectiva que la heparina en condiciones patológicas donde 10 la antitrombina en plasma esté agotada, tal como una DIC. Aunque tanto la TM como la heparina inhiben el consumo de plaquetas y de fibrinógeno en una DIC experimental, únicamente la TM fue efectiva cuando se agotaron los niveles de antitrombina III. 15

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invención proporciona unas nuevas proteínas de fusión, que actúan como agentes anticoagulantes, y comprenden una proteína directora hacia 20 diana o un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de la misma, que se fija a este factor tisular (“TF”) o al complejo de factor VIIa/factor tisular (“FVIIa/TF”), que está ligado operativamente al dominio EGF456 de la trombomodulina (“TM”), o a un análogo, un 25 fragmento, un derivado o una variante del mismo; fijándose la proteína de fusión anticoagulante al factor tisular (“TF” o al complejo de factor VIIa/TF (“FVIIa/TF”).

La proteína de fusión anticoagulante de esta invención se dirige hacia, y se fija a, el TF o el complejo 5 de FVIIa/TF, en el sitio de la lesión, localizando a la TM en el sitio de la lesión, e impidiendo de este modo la formación de trombos y funcionando por lo tanto más efectivamente como un agente anticoagulante en comparación con un anticuerpo anti-TF soluble o con una TM soluble o 10 fragmentos de esta TM. La proteína de fusión es más efectiva que una heparina de bajo peso molecular (“LMWH”) en el tratamiento de ciertas enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, sepsis, coagulación intravascular diseminada, apoplejía isquémica, trombosis venosa profunda, 15 síndromes coronarios agudos, complicaciones trombóticas después de una angioplastia, y coagulopatía en un cáncer avanzado. Además, la proteína de fusión tiene uso en una cirugía microvascular, en injertos de piel y venas, y en trasplantes de órganos. 20

En otro aspecto, la invención proporciona unas composiciones farmacéuticas que incluyen las proteínas de fusión en cuestión.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para proteger a un paciente contra la formación de 25 trombos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un uso en prevenir y tratar una trombosis venosa profunda (“DVT” acrónimo de deep vein thrombosis)) o una coagulación intravascular diseminada (“DIC”) o un síndrome coronario 5 agudo o un cáncer con evidencia de coagulopatía.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un uso en regular la respuesta inflamatoria en un paciente.

En otro aspecto más, la proteína de fusión de la invención puede ser usada para formar un recubrimiento no 10 trombógeno sobre la superficie de dispositivos médicos que entran en contacto con la sangre.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un estuche (kit) que comprende una proteína de fusión que comprende una proteína directora, que se fija al TF o al 15 complejo de FVIIA/TF, y dominios de TM. De manera alternativa, el estuche puede comprender unas secuencias de ADN que codifiquen los componentes de la proteína de fusión.

También se describen métodos para producir las 20 proteínas de fusión de la invención, tanto recombinantes como sintéticas.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. La fijación del scFv(TF)3e10 al sTF aumenta 25 la afinidad aparente del sTF para el FVIIa. El ensayo de activación del sTF/FVIIa fue efectuado tal como se describe dentro del Ejemplo 5 titulado “ensayo de activación de sTF/FVIIa” usando FVIIa 2 nM en (presencia y ausencia de scFv(TF)3e10 800 nM. El sTF 5 fue valorado en el ensayo y se determinó la velocidad de disociación del sustrato cromógeno (S-2266). La KD aparente del sTF fue calculada usando un acoplamiento de 4 parámetros patrones.

Figura 2. Medición de la afinidad de fijación de 10 scFv(TF)3e10 para el sTF. El ensayo del sTF/FVIIa fue tal como se describe dentro del Ejemplo 5 titulado “ensayo de activación del sTF/FVIIa” usando sTF 3 nM y FVIIa 2 nM. La concentración de sTF usada fue inferior a la KD para la fijación de FVIIa. La fijación del 15 anticuerpo scFv(TF)3e10 redujo la KD del sTF para la fijación a FVIIa, conduciendo al aumento en la formación del complejo de sTF/FVIIa y, por lo tanto, en la velocidad de disociación del sustrato cromógeno S2266. El ScFv(TF)3e10 fue añadido en concentraciones 20 crecientes y la velocidad de reacción creciente fue usada para determinar la KD aparente del anticuerpo para sTF usando un acoplamiento de 4 parámetros patrones.

Figura 3. El análisis por microcalorimetría muestra 25 que el scFv(TF)3e10 tiene una afinidad 20 veces mayor para el complejo de sTF/FVIIa que el sTF solo. La calorimetría por valoración isotérmica se efectuó usando un instrumento MicroCal VP-ITC. El complejo de sTF/FVIIa fue formado previamente añadiendo un exceso 5 molar de 2,3 veces de FVIIai al sTF. Se usó una cromatografía por exclusión de tamaños para comprobar que el sTF estuviera completamente convertido en complejo. Para la determinación de la afinidad del anticuerpo para el complejo, se añadió complejo de 10 sTF/VIIa 1,2 µM a la celda del microcalorímetro y se añadió anticuerpo scFv(TF)3e10 65 µM a la jeringa. Para la determinación de la afinidad del anticuerpo para sTF solo, se añadió sTF 10 µM a la celda y se añadió scFv(TF)3e10 141 µM a la jeringa. El análisis 15 de los datos se efectuó usando programas lógicos (software) MicroCal Origin. Los datos fueron acoplados a un solo sitio de fijación.

Figura 4. El scFv(TF)3e10 inhibe de una manera dependiente de la dosis al ensayo de activación de FX. 20 Los detalles de este ensayo son descritos dentro del Ejemplo 5 titulado “ensayo de activación del Factor X”. La CI50 representa la dosis requerida para alcanzar una inhibición máxima del 50%.

Figura 5. La proteína de fusión inhibe de manera más 25 potente la coagulación que el anticuerpo del TF o TMi456 solo. Un ensayo del tiempo de protrombina (PT) fue efectuado para comparar la proteína de fusión con el anticuerpo d TF o de TMi456 solo. Se añadió un volumen apropiado de agente inhibidor concentrado, ya 5 sea el anticuerpo de TF (scFv(TF)3e10), el TMi456, o la fusión (scFv(TF)3e10-TMi456), a 100 µl de tromboplastina humana recombinante (Ortho Recombiplastin). Aproximadamente 2 minutos después se añadieron 100 µl de un plasma humano reconstituido. El 10 tiempo de coagulación fue determinado en un Coagulometro de Haemoliance. Se generaron unas curvas de respuesta a la dosis para cada agente inhibidor y entonces se usó un análisis de regresión para calcular la concentración (en nM) necesaria para la 15 prolongación en dos veces del tiempo de coagulación.

Figura 6. La proteína de fusión retiene la actividad completa del cofactor para la activación de la proteína C. El ensayo descrito dentro del Ejemplo 5 titulado “Ensayo (cromógeno) de activación de la 20 proteína C” contenía 20 ml de una muestra de TM, ya sea TMi456, que contiene los dominios de EGF 4-6 y el lazo entre dominios situado entre el EGF3 y el EGF4, o la fusión (scFv(TF)3e10-TMi456), 20 µl de proteína C 1,5 µM, y 20 µl de alfa trombina 3 nM. La activación 25 se dejó desarrollar durante 1 hora. La fase de activación fue detenida añadiendo 20 µl de hirudina 0,16 u/ml. Entonces se añadieron 100 µl de S2266 1 mM y se determinó la A405 cada 10 segundos durante 30 minutos. La velocidad de reacción e dependiente de la 5 cantidad de la proteína C activada que se genera. Los datos se expresan en mOD/min.

Figura 7. La velocidad de activación de la proteína C por la proteína de fusión es mejorada sobre superficies de fosfolípidos que contienen TF. La 10 velocidad de activación de la proteína C por Tmi456 no es afectada por la adición de vesículas de TF. El ensayo descrito dentro del Ejemplo 5 titulado “Ensayo de activación de la proteína C (sobre una superficie rica en TF)” contenía 20 µl de una muestra de TM, ya 15 sea el Tmi456 o la fusión (scFv(TF)3e10-Tmi456), 20 µl de la proteína C 1,5 µM, 20 µl de alfa trombina 3 nM, y 20 µl de un tampón o de vesículas de TF (Innovina, TF recombinante humano, 4X la concentración normal para PT). Se dejó que la activación procediera durante 20 1 hora. La fase de activación fue detenida añadiendo 20 µl de hirudina 0,16 u/ml. Entonces se añadieron 100 µl de S2266 1 mM y se determinó la A405 cada 10 segundos durante 30 minutos. La velocidad de reacción depende de la cantidad de proteína C activada 25 generada. Los datos se expresan en mOD/min.

Figura 8. La proteína de fusión muestra una mayor especificidad para la coagulación inducida por TF que el TMi456. El ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) es sensible a agentes 5 inhibidores de las rutas intrínseca y central de la coagulación. La coagulación que ocurre en este ensayo es independiente del TF. Los agentes inhibidores, ya sea el anticuerpo de TF (scFv(TF)3e10), el TMi456, o la fusión (scFv(TF)3e10-Tmi456), fueron diluidos en 50 10 µl de un plasma humano reconstituido en una concentración final que dio una prolongación de dos veces en el ensayo de PT. Se añadieron entonces al coagulómetro 50 µl del reactivo de APTT (Alexin HS) y 50 µl de reactivo de CaCl2 (0,02 mol/L) y se determinó 15 el tiempo de coagulación en segundos.

Figura 9. La proteína de fusión inhibe de manera más potente la coagulación de una sangre completa, inducida por TF, que cualquiera de sus componentes solos. La coagulación de la sangre completa fue 20 analizada usando un analizador Hemoscopio Thromboelastogragh (TEG). A una sangre completa citratada, se le añadieron 120 nM del anticuerpo de TF (scFv(TF)3e10), del Tmi456 o de la fusión (scFv(TF)3e10-Tmi456) junto con 10 µl de un reactivo 25 de tromboplastina (dilución de 1:64) y 20 µl de CaCl2 0,2 M. Se obtuvo el valor de R (tiempo para la formación de fibrina inicial) para cada muestra. Este valor fue entonces convertido en un % del valor de R testigo no inhibido. 5

Figura 10. La proteína de fusión muestra una respuesta a la dosis más predecible que la LMWH en un ensayo de coagulación de sangre completa (TEG). A una sangre completa citratada se le añadieron unas concentraciones crecientes (comenzando con 15 nM y 10 aumentando por incrementos de 2X) de la fusión (scFv(TF)3e10-TMi456) o unas concentraciones crecientes (comenzando con 0,15 u/ml y aumentando en 2X) de enoxaparina (LMWH), junto con 10 µl de un reactivo de tromboplastina (dilución de 1:64) y 20 µl 15 de CaCl2 0,2 M. Se obtuvo el valor de R (tiempo para la formación de fibrina inicial) para cada muestra y se representó gráficamente en función de la concentración relativa (estableciendo la concentración más baja como 1 para cada una de ellas (valor de R 20 similar), y luego aumentando posteriormente las concentraciones en 2X).

Figura 11. La proteína de fusión scFV(TF)3e10-TMi456 es eficaz en un modelo in vivo de coagulación intravascular diseminada (“DIC”). El anticuerpo de TF 25 (scFV(TF)3e10) y la fusión (scFV(TF)3e10-TMi456) fueron evaluados en el modelo de tromboembolismo en una rata que se describe en el Ejemplo 8 para (A) el tanto por ciento de mortalidad y (B) la calificación de morbilidad-mortalidad. (A) En el grupo tratado con 5 un vehículo, la dosis usada de TF dio como resultado una letalidad del 60% (DL60). La scFV(TF)3e10-Tmi456 a razón de 0,7 nmol/kg impidió completamente la muerte. En contraste, el scFV(TF)3e10 a razón de 0,7 nmol/kg no tuvo ningún impacto sobre la muerte. La 10 scFV(TF)3e10-TMi456 fue más eficaz que una dosis 10 veces mayor de scFV(TF)3e10, (B) En el grupo tratado con un vehículo, la dosis in vivo de TF dio como resultado una calificación promedia de morbilidad-mortalidad de 2,6, sobre la base del siguiente sistema 15 de calificación: 0 = no afectado; 1 = angustia respiratoria media (se recupera en el plazo de 30 min); 2 = angustia respiratoria severa (moribundo, la recuperación requiere más de 60 min); y 3 = muerte. La scFV(TF)3e10-Tmi456 impidió de un modo dependiente de 20 la dosis la muerte y la angustia respiratoria inducidas por el TF con un valor de DE50 (dosis eficaz del 50 %) de 0,46 nmol/kg (0,019 mg/kg). La scFV(TF)3e10-TMi456 a razón de 7,0 nmol/kg impidió completamente tanto la muerte como la angustia 25

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La proteína de fusión anticoagulante de la 10 presente invención se compone de una proteína directora hacia diana o un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de la misma, que se fija al factor tisular (“TF”) o al complejo de factor VIIa/factor tisular (“FVIIa/TF”), que está ligado operativamente al dominio EGF456 de 15 trombomodulina (“TM”), o a un análogo, un fragmento, un derivado o una variante del mismo, fijándose la proteína de fusión anticoagulante al factor tisular (“TF” o al complejo de factor VIIa/TF (“FVIIa/TF”).

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Definiciones:

Para describir la presente invención, se definen los siguientes términos como se indica a continuación.

El término de “proteínas o polipéptidos recombinantes” se refiere a proteínas o polipéptidos 25 producidos por técnicas de ADN recombinante, es decir producidos a partir de células, microbios o mamíferos, transformados por una construcción artificial de ADN exógeno que codifica el polipéptido deseado. Las proteínas o los polipéptidos expresadas/os en la mayoría de los 5 cultivos de bacterias estarán libres de glicano. Las proteínas o los polipéptidos expresadas/os en levaduras pueden tener un patrón de glicosilación diferente del de las/los expresadas/os en células de mamífero.

El término de proteínas o polipéptidos 10 “nativas/os” se refiere a proteínas o polipéptidos recuperadas/os a partir de una fuente natural. El término “TM nativa” incluirá a la TM natural y fragmentos de la misma.

Una “secuencia codificadora” de ADN es una 15 secuencia de ADN que es transcrita a un ARNm (mensajero) y traducida en un polipéptido en una célula anfitriona cuando es colocada bajo el control de unas secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora son determinados por un codón de iniciación situada en el 20 extremo terminal de N 5’ y un codón de detención de la traducción situada en el extremo terminal de C 3’. Una secuencia codificadora puede incluir secuencias procarióticas, un ADNc procedente de un ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico procedentes de un ADN 25 eucariótico, y secuencias de un ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción se localizará usualmente en 3’ con respecto a la secuencia codificadora.

Una “proteína de fusión” es una proteína que resulta de la expresión de al menos dos secuencias 5 codificadoras heterólogas ligadas operativamente. La proteína de fusión de esta invención se compone de una proteína directora hacia diana que o un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de la misma, que se fija al TF o al complejo de FVIIa/TF, que está ligado 10 operativamente al dominio de EGF456 de trombomodulina (“TM”) o a un análogo, un fragmento, un derivado o una variante del mismo, fijándose la proteína de fusión anticoagulante al factor tisular (“TF” o al complejo de factor VIIa/TF (“FVIIa/TF”);. 15

Una “proteína directora hacia diana” es una proteína que se fija o interactúa con otra proteína o con un complejo de proteínas. La proteína directora hacia diana de esta invención es una proteína que se fija a o interactúa con el TF o con el complejo de FVIIa/TF. Por 20 ejemplo, un anticuerpo anti-TF o anti-complejo de FVIIa/TF, es una proteína directora hacia diana de esta invención. Otros dos ejemplos de proteínas directoras hacia dianas es el factor VIIa inhibido en el sitio activo (“FVIIai”), que puede fijarse al TF para formar un complejo de FVIIai/TF 25 inactivo, y el agente inhibidor de la ruta del factor tisular (“TFPI”), que puede fijarse a e inactivar el complejo de FVIIa/TF.

Una “secuencia de nucleótidos” es un heteropolímero de desoxirribonucleótidos (con las bases de 5 adenina, guanina, timina o citosina). Las secuencias de ADN que codifican las proteínas de fusión de esta invención pueden ser ensambladas a partir de fragmentos de ADN que se derivan de un ADNc (cromosómico) sintético, y engarzadores de oligonucleótidos cortos para proporcionar un gen 10 sintético que es capaz de ser expresado en un vector de expresión recombinante. En la discusión de la estructura de molécula de ADN de doble hebra particulares, las secuencias pueden ser descritas aquí de acuerdo con el convenio normal de dar únicamente la secuencia en la dirección de 5’ a 3’ a 15 lo largo de la hebra no transcrita de ADNc.

Un “vector de expresión recombinante” es una construcción artificial de ADN replicable usada o bien para amplificar o expresar un ADN que codifica la proteína de fusión de la presente invención. Un vector de expresión 20 contiene secuencias de control de ADN y una secuencia codificadora. Las secuencias de control de ADN incluyen secuencias promotoras, sitios de fijación a ribosomas, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores situados corriente 25 arriba e intensificadores. Los sistemas de expresión recombinante, como se definen aquí, expresarán la proteína de fusión tras una inducción de los elementos reguladores.

El término de “células anfitrionas transformadas” se refiere a unas células que han sido transformadas y 5 transfectadas con un ADN exógeno. El ADN exógeno puede o no estar integrado (unido por enlace covalente) a un ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula. En procariotas y en una levadura, por ejemplo, el ADN exógeno puede ser mantenido sobre un elemento episomal, tal como un 10 plásmido, o integrado establemente en un ADN cromosómico. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada de manera estable es una en la que el ADN exógeno ha quedado integrado dentro de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad 15 de los linajes o clones celulares eucarióticos para producir una población de células hijas que contienen el ADN exógeno.

El término “trombomodulina (TM)” se refiere a una glicoproteína de la superficie celular endotelial que forma 20 un complejo de alta afinidad con la trombina. Los genes que codifican la TM nativa (tanto en su forma genómica como en la de ADNc) han sido aislados y secuenciados de a partir de seres bovinos y humanos (Jackman, R.W. y colaboradores (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83(23):8834-8838 y 25 Jackman, R.W: y colaboradores (1987) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 84(18):6425-6429. Las secuencias para las TM bovina, humana y de ratón exhiben un alto grado de homología entre sí. El ADNc de la TM humana codifica una proteína de 60,3 kDa de 575 aminoácidos, incluyendo una secuencia señal de 5 aproximadamente 18 aminoácidos, véase por ejemplo, la Patente Estadounidense 5.827.824.

Cuando la trombina se fija a la TM puede haber un aumento de mil veces o más en la velocidad de activación de la proteína C que forma la proteína C activada por la 10 enzima anticoagulante. Además, cuando la trombina se ha fijado a la TM, la trombina no trabaja ya como una enzima procoagulante. Específicamente, la formación de fibrina catalizada por la trombina, la activación del factor V, y la activación de las plaquetas, son inhibidas todas ellas 15 en presencia de la TM. Por lo tanto, la TM convierte a la trombina en un agente anticoagulante fisiológico.

El término de “dominio de trombomodulina (TM)” se refiere a una secuencia añadida de aminoácidos discreta que puede ser asociada con una función o característica 20 particular de la TM, como la unidad estructural terciaria característica. El gen de TM de longitud completa codifica un precursor o pro-polipéptido que contiene los siguientes dominios: los aminoácidos añadidos –18-1 son la secuencia de señal; los aminoácidos 1-226 son la región hidrófoba 25 situada en el extremo terminal de N; los aminoácidos 227-462 es la región rica en cisteína, que consiste en 6 repeticiones similares a EGF en serie fijadas por pequeños péptidos o lazos entre dominios; los aminoácidos 463-497 constituyen una región rica en Ser/Thr glicosilada en O; 5 los aminoácidos 498-521 constituyen una región transmembranal hidrófoba; y los aminoácidos 522-557 constituyen la cola citoplasmática situada en el extremo terminal de C. La región rica en cisteína puede ser dividida además en 3 dominios: los aminoácidos 226-344 son 10 el EGF123, que consiste en las repeticiones 1, 2 y 3 similares a EGF (residuos 226-344); los aminoácidos 345-349 constituyen el lazo entre dominios entre el EGF3 y el EGF4; y los aminoácidos 350-462 son el EGF456, que consiste en los dominios 4, 5 y 6 similares a EGF. Véase, por ejemplo, 15 Yost, C.S. y colaboradores (1983) Cell 34(3):759-766; Wen, D.Z. y colaboradores (1987) Biochemistry 26(14):4350-4357; y Wang, W. y colaboradores (2000), supra.

Los términos “análogo”, “fragmento”, “derivado” y “variante”, cuando se refieren a las proteínas de fusión de 20 esta invención, así como a las proteínas directoras hacia dianas y a los dominios de TM, significan análogos, fragmentos, derivados y variantes de las proteínas de fusión, de las proteínas directoras hacia dianas y de los dominios de TM que retienen sustancialmente la misma 25 función o actividad biológica, como se describe adicionalmente más adelante.

Un “análogo” incluye un pro-polipéptido que incluye dentro de él la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión de esta invención. La proteína de fusión 5 activa de esta invención puede ser disociada a partir de los aminoácidos adicionales que completan la molécula de pro-proteína de fusión por procesos naturales in vivo o por procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como por disociación enzimática o química. Por ejemplo, la TM nativa 10 es expresada naturalmente como un pro-polipéptido de 575 aminoácidos que es luego procesado in vivo para liberar el polipéptido maduro activo de 557 aminoácidos.

Un “fragmento” es una porción de la proteína de fusión, de la proteína directora hacia diana o del (de los) 15 dominio(s) de TM, que retiene una actividad funcional sustancialmente similar, tal como se muestra en los ensayos in vitro descritos aquí, tal como se describe más adelante.

Un “derivado” incluye todas las modificaciones en la proteína de fusión que conservan sustancialmente las 20 funciones aquí descritas e incluyen una estructura adicional y la función inherente, por ejemplo proteínas de fusión PEGiladas que tienen una mayor vida mitad, proteínas de fusión glicosiladas en O, modificadas por la adición de sulfato de condroitina, y proteínas de fusión biotiniladas, 25 como se describe más adelante.

Los términos “actividad funcional sustancialmente similar” y “sustancialmente la misma función o actividad biológica” significan cada uno de ellos que el grado de actividad biológica que está dentro de aproximadamente 30% 5 hasta 100% o más de la actividad biológica demostrada por el polipéptido con el que se está comparando cuando la actividad biológica de cada polipéptido es determinada por el mismo procedimiento o ensayo. Por ejemplo, una proteína de fusión o un (o varios) dominio(s) de TM que tienen una 10 actividad funcional sustancialmente similar a la de la proteína de fusión del Ejemplo 2 (SEQ ID NO: 2) son uno(s) que, cuando se prueba(n) en el ensayo de activación de la proteína C (cromógeno) descrito en el Ejemplo 5, demuestra(n) una acumulación de proteína C activada. Una 15 proteína directora hacia diana que tiene una actividad funcional sustancialmente similar a la del anticuerpo anti-TF del Ejemplo 1 (SEQ ID NO: 1) es una que, cuando se prueba en el ensayo de sTF/FVIIa o en los ensayos de activación de FX que se describen en el Ejemplo 5, 20 demuestra la capacidad de fijarse o neutralizar al TF o al complejo de FVIIa/TF.

La “similitud” entre dos polipéptidos es determinada comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos conservados sustitutos de un polipéptido con la 25 secuencia de un segundo polipéptido. Tales sustituciones conservativas incluyen las descritas anteriormente en The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 por Dayhoff (1978) y por Argos (1989) EMBO J. 8:779-785. Por ejemplo, los aminoácidos pertenecientes a uno de los siguientes 5 grupos constituyen cambios conservativos:

- Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr:

- Cys, Ser, Tyr, Thr;

- Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;

- Lys, Arg, His; 10

- Phe, Tyr, Trp, His; y

- Asp, Glu.

Todos los otros términos técnicos usados aquí tienen los mismos significados que son usados comúnmente por aquellos expertos en la técnica a la que pertenece la 15 presente invención.

Proteína Directora hacia diana:

La proteína directora hacia diana de esta invención es una proteína que tiene la capacidad de fijarse 20 específicamente a una molécula diana preseleccionada particular, por ejemplo, un TF o un complejo de FVIIa/TF, y sirve entonces para dirigir la proteína de fusión hacia una célula o un tejido que lleve la molécula diana preseleccionada. 25

En una forma de realización de esta invención, la proteína directora hacia diana es un anticuerpo que puede fijarse y neutralizar al TF o al complejo de FVIIa/TF. Un “anticuerpo” como se usa aquí, incluye moléculas de inmunoglobulina (“Ig”) intactas, así como fragmentos de las 5 mismas, tales como Fab, F(ab’)2, y Fv, que son capaces de fijarse a un epítopo de TF o a un complejo de FVIIa/TF. Típicamente, se requieren al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguos para formar un epítopo. Sin embargo, los epítopos que implican aminoácidos no contiguos pueden 10 requerir más, por ejemplo al menos 15, 25 ó 50 aminoácidos.

Típicamente, un anticuerpo que se fija específicamente al TF o al complejo de FVIIa/TF proporciona una señal de detección al menos 5, 10 ó 20 veces mayor que una señal de detección proporcionada con otras proteínas 15 cuando se use con un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que se fijan específicamente al TF o al complejo de FVIIa/TF no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar al TF o al complejo del FVIIa/TF desde la solución. 20

El TF o el complejo de FVIIa/TF puede ser usado para inmunizar a un mamífero, tal como un ratón, una rata, un conejo, un cerdo, un mono, o un ser humano para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, el TF o el complejo de FVIIa/TF puede ser conjugado con una proteína portadora, 25 como seroalbúmina bovina, tiroglobulina, y hemocianina de cangrejo bayoneta. Dependiendo de las especies anfitrionas, pueden ser usados varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, un adyuvante de Freund, geles minerales (por 5 ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de cangrejo bayoneta, y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en seres humanos, son especialmente útiles BCG 10 (bacillus de Calmette-Guerin) y Cornybacterium parvum.

Los anticuerpos monoclonales que se fijan específicamente al TF o al complejo de FVIIa/TF pueden ser preparados usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por linajes de 15 células continuo en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas, y la técnica del hibridoma de EBV (Kohler et al (1985) Nature 256:495-497; Kozbor y colaboradores (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote y 20 colaboradores (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80:2026-2030; y Cote y colaboradores (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120).

Además, pueden ser usadas las técnicas desarrolladas para la producción de “anticuerpos 25 quiméricos”, el empalme de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con una especificidad antigénica y una actividad biológica apropiadas (Morrison y colaboradores (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855; Neuberger y colaboradores 5 (1984) Nature Nature 312:604-608; Takeda y colaboradores (1985) 314:452-454). Los anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos también pueden ser “humanizados” para evitar que un paciente monte una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando éste sea usado terapéuticamente. Tales 10 anticuerpos pueden ser suficientemente similares en su secuencia a los anticuerpos humanos que se han de usar directamente en la proteína de fusión o pueden requerir una alteración de unos cuantos residuos clave. Las diferencias de secuencias entre anticuerpos de roedor y secuencias 15 humanas pueden ser minimizadas reemplazando unos residuos que difieren de los presentes en las secuencias humanas por una mutagénesis dirigida a un sitio de residuos individuales o injertando regiones enteras que determinan la complementariedad. De manera alternativa, se pueden 20 producir anticuerpos humanizados usando métodos recombinantes, como se describe en el documento de patente británica GB2188638B. Los anticuerpos que se fijan específicamente a un TF o a un complejo de FVIIa/TF pueden contener sitios de fijación a antígenos que están parcial o 25

De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena pueden ser adaptadas usando métodos conocidos en la técnica para 5 producir anticuerpos de una sola cadena que se fijan específicamente a un TF o a un complejo de FVIIa/TF. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de composición idiotípica distinta, pueden ser generados arrastrando la cadena desde bibliotecas de Ig combinatorias 10 aleatoreamente (Burton (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-11123).

Los anticuerpos de una sola cadena también pueden ser construidos usando un método de amplificación de ADN, como una PCR (reacción en cadena de la polimerasa), usando 15 ADNc de hibridoma como un molde (Thirion y colaboradores (1996) Eur. J. Cancer Prev. 5:507-511). Los anticuerpos de una sola cadena pueden ser mono- o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos de una sola cadena tetravalentes, biespecíficos 20 es ensañada, por ejemplo, en Coloma y Morrison (1997) Natl. Biotechnol. 15:159-163. La construcción de anticuerpos de una sola cadena bivalentes, biespecíficos es ensañada en Mallendar y Voss (1994) J. Biol. Chem. 269:199-216.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un 25 anticuerpo de una sola cadena puede ser construida usando una síntesis manual o automatizada de nucleótidos, clonada dentro de una construcción artificial de expresión usando métodos clásicos de ADN recombinante, e introducida dentro deuna célula para expresar la secuencia codificadora. De 5 manera alternativa, los anticuerpos de una sola cadena pueden ser producidos directamente usando, por ejemplo, la tecnología de presentación visual de fagos filamentosos (Verhaar y colaboradores (1995) Int. J. Cancer 61:497-501; y Nicholls y colaboradores (1993) J. Immunol. Meth. 165:81-10 91).

Se pueden producir también anticuerpos que se fijan específicamente a un TF o a un complejo de FVIIa/TF induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o escrutando bibliotecas de Ig o paneles de 15 reactivos de fijación de alta especificidad, como se describe en la bibliografía (Orlandi y colaboradores (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:3833-3837; Winter y colaboradores (1991) Nature 349:293-299).

En otra forma de realización de esta invención, 20 la proteína directora hacia diana es una entidad directora hacia diana diferente de un anticuerpo que puede fijarse y neutralizar al TF. Dos de tales ejemplos son el factor FVIIa inhibido en el sitio activo (FVIIai) y el agente inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI). 25

Tanto el FVIIa como el FVIIai forman un complejo de alta afinidad con el TF (Sorenson, B.B. y Rao, L.V. (1998) Blood Coagul. Fibrinolysis 9 (Suplemento 1): páginas 67-71). El FVIIai es un agente anticoagulante neutralizante del TF que actúa compitiendo con el FVIIa endógeno en 5 cuanto a la fijación al TF expuesto. El FVIIai inhibe la capacidad del FVIIa proteolíticamente activo para formar un complejo de FVIIa-TF competente y de esta forma inhibe el comienzo de la coagulación. Mediante una fusión genética de los dominios de TM con el FVIIai, La TM podría ser dirigida 10 a superficies protrombóticas ricas en TF.

El ADNc que codifica el FVII humano ha sido aislado y secuenciado (Hagen, H.S. y colaboradores (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83(8):2412-246, que se incorpora aquí como referencia). El ADNc de FVII humano puede ser 15 producido por técnicas clásicas de ADN recombinante partiendo de un ARNm aislado a partir de un hígado humano. El FVIIai puede ser producido mutando la serina del sitio activo por técnicas clásicas de ADN recombinante o tratando químicamente el FVIIa catalíticamente activo con una 20 peptidil clorometilcetona, que modifica de manera irreversible e inhibe el sitio activo.

El TFPI dirige hacia diana e inhibe al complejo de FVIIa/TF de una manera dependiente del FXa (Salemink, I. y colaboradores (1999) J. Biol. Chem. 274(40):28225-28232). 25 El TFPI se fija primeramente al FXa y luego el complejo de TFPI-FXa se fija e inhibe al complejo de FVIIa/TF. Mediante una fusión genética de dominios de TM con el TFPI, la TM podría ser dirigida a superficies protrombóticas ricas en TF. 5

El ADNc que codifica el TFPI humano ha sido aislado y secuenciado (Wun, T.C. y colaboradores (1988) J. Biol. Chem. 263(13)6001-6004). El ADNc de TFPI humano puede ser producido por técnicas clásicas de ADN recombinante partiendo de un ARNm aislado a partir de un hígado humano. 10

La proteína directora hacia diana de la invención (es decir, los anticuerpos u otras proteínas relevantes) puede ser expresada y purificada por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos y las proteínas se pueden purificar por afinidad haciéndolos/las pasar 15 sobre una columna a que se ha fijado el TF. Los anticuerpos o las proteína fijados/as pueden luego ser eluídos a partir de la columna usando un tampón con una concentración alta en sal.

En una forma de realización preferida de esta 20 invención, la proteína directora hacia diana es un anticuerpo de scFv que se fija al TF, que inhibe la activación del FX por el complejo de FVIIa/TF y no compite en cuanto a la fijación con el FVIIa. Con el fin de producir el anticuerpo de scFV que se fija al TF, la 25 biblioteca de anticuerpos humanos HuPLaBL3, que fue presentada gráficamente sobre un fago filamentoso, fue seleccionada contra el TF soluble inmovilizado. Los anticuerpos procedentes del fago que se fija al TF fueron sobreexpresados en E.coli y purificados por afinidad usando 5 una columna con e-marca. Los anticuerpos purificados fueron caracterizados además usando BIAcore, que es un ensayo del factor VIIa dependiente del sTF (ensayo de sTF/FVIIa), un ensayo de activación del FX, y el ensayo de PT. La secuencia del anticuerpo de scFV que se fija al TF, 10 designada como scFV(TF)3e10, es mostrada en el Ejemplo 1 y corresponde a la SEQ ID NO: 1. El aislamiento, la producción y la caracterización del anticuerpo de scFV que se fija al TF se describen con mayor detalle más adelante.

15

Trombomodulina:

La porción del (los) dominio(s) de TM de la proteína de fusión actúa como un cofactor para la activación de la proteína C catalizada por trombina, lo cual a su vez degrada a los factores Va y VIIa impidiendo 20 por lo tanto además la formación de trombos. Los dominios de TM incluyen por ejemplo el dominio de la región hidrófoba situada en el extremo terminal de N, el dominio EGF123, el lazo entre dominios entre el EGF3 y el EGF4, el dominio EGF456, y el dominio de la región rica en Ser/Thr 25 glicosilada en O. El dominio EGF456, en particular, media en la fijación de la trombina y en la activación de la proteína C (Kurosawa, S. y colaboradores (1988), supra y Zushi, M y colaboradores (1989) supra). En formas de realización preferidas de esta invención, la porción del 5 (de los) dominio(s) de TM de la proteína de fusión comprende el dominio EGF456 solo o en combinación con uno o más de los otros dominios de TM. En formas de realización aún más preferidas de esta invención, el dominio EGF456 contiene mutaciones puntuales que hacen a la proteína más 10 resistente a una lesión por oxidación y a las proteasas, y/o aumentan su eficiencia catalítica.

La secuencia de ADN de longitud completa que codifica la TM humana facilita la preparación de genes y es usada como un punto de partida para construir secuencias de 15 ADN que codifican péptidos de TM y proteínas de fusión que contienen TM y fragmentos/péptidos de TM.

El gen de longitud completa para la TM puede ser preparado por varios métodos. Las bibliotecas genómicas humanas se encuentran comercialmente disponibles. Unas 20 sondas de oligonucleótidos, específicas para estos genes, pueden ser sintetizadas usando la publicada secuencia del gen. Se conocen métodos para escrutar bibliotecas genómicas con sondas de oligonucleótidos. La publicación de la secuencia del gen para la TM demuestra que no existen 25 intrones dentro de la región codificadora. Por lo tanto, un clon genómico proporciona el material de partida necesario para construir un plásmido de expresión para la TM usando métodos conocidos.

Un fragmento de ADN que codifica la TM puede ser 5 recuperado aprovechándose de las ventajas de los sitios de endonucleasas de restricción que han sido identificados en regiones que flanquean o están internas en el gen. (Jackman, R.W. y colaboradores (1987), supra). De manera alternativa, los genes de longitud completa también pueden 10 ser obtenidos a partir de un banco de ADNc. Por ejemplo, el ARN mensajero preparado a partir de células endoteliales proporciona un material de partida adecuado a partir de la preparación de ADNc. Los métodos para producir bancos de ADNc son bien conocidos (véase por ejemplo, Sambrook, J.F. 15 y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), que se incorpora aquí como referencia).

Proteína de Fusión: 20

La proteína de fusión anticoagulante de esta invención comprende una proteína directora hacia diana, o un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de la misma, fijándose la proteína de fusión anticoagulante al factor tisular (“TF” o al complejo de factor VIIa/TF 25 (“FVIIa/TF”).

En una forma de realización particularmente preferida, la proteína de fusión comprende un anticuerpo que se fija al TF, ligado operativamente al dominio EGF456 de TM y el lazo entre dominios entre el EGF3 y el EGF4 5 (“TMi456”), o análogos, fragmentos, derivados o variantes del mismo.

La proteína de fusión de la presente invención incluye, pero no se limita a, construcciones artificiales en las que la porción situada en el extremo terminal de C 10 de un anticuerpo de una sola cadena está fusionada a la porción situada en el extremo terminal de N de un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de un(os) dominio(s) de TM, la porción situada en el extremo terminal de C de un anticuerpo de IgG está fusionada con la porción 15 situada en el extremo terminal de N de un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de un(os) dominio(s) de TM, la porción situada en el extremo terminal de C de un anticuerpo de Fab está fusionada con la porción situada en el extremo terminal de N de un análogo, un fragmento, un 20 derivado o una variante de un(os) dominios de TM, la porción situada en el extremo terminal de N de un anticuerpo de una sola cadena está fusionada a la porción situada en el extremo terminal de C de un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de un(os) dominio(s) 25 de TM, la porción situada en el extremo terminal de N de un anticuerpo de IgG está fusionada con la porción situada en el extremo terminal de C de un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de un(os) dominio(s) de TM, la porción situada en el extremo terminal de N de un 5 anticuerpo de Fab está fusionada a la porción situada en el extremo terminal de C de un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de un(os) dominio(s) de TM, más de un anticuerpo de una sola cadena está fusionado tanto con la porción situada en el extremo terminal de N como con la 10 porción situada en el extremo terminal de C de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un(os) dominio(s) de TM, más de un anticuerpo de IgG está fusionado tanto con la porción situada en el extremo terminal de N como con la porción situada en el extremo terminal de C de un análogo, 15 fragmento, derivado o una variante de un(os) dominio(s) de TM, más de un anticuerpo de Fab está fusionado tanto con la porción situada en el extremo terminal de N como con la porción situada en el extremo terminal de C de un análogo, fragmento, derivado o una variante de un(os) dominio(s) de 20 TM, más de un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de un dominio de TM está fusionado tanto con la porción situada en el extremo terminal de N como con la porción situada en el extremo terminal de C de un anticuerpo de una sola cadena, más de un análogo, un 25

Las proteínas de fusión de la presente invención incluyen las proteínas de fusión de los Ejemplos 2 (SEQ ID 15 NO: 2) y 3 (SEQ ID NO: 3), así como las proteínas de fusión que tienen variaciones no sustanciales en las secuencias de ellas. Una “variación no sustancial” incluiría cualquier variante de secuencia, sustitución o supresión que mantenga sustancialmente al menos una función biológica de los 20 polipéptidos de la invención, preferiblemente la actividad de cofactor para la activación de la proteína C mediada por trombina. Esos equivalentes funcionales pueden incluir preferiblemente proteínas de fusión que tienen al menos una identidad de aproximadamente el 90% con las proteínas de 25 fusión de las SEQ ID NOs: 2 ó 3, y de manera más preferible al menos una identidad del 95% con las proteínas de fusión de las SEQ ID NOs: 2 ó 3, y de manera aún más preferible al menos una identidad del 97% con las proteínas de fusión de las SEQ ID NOs: 2 ó 3, y también incluyen porciones de 5 dichas proteínas de fusión que tienen sustancialmente la misma actividad biológica. Sin embargo, cualquier proteína de fusión que tenga una variación no sustancial en la secuencia de aminoácidos con respecto de las proteínas de fusión de las SEQ ID NOs: 2 y 3 que demuestre una 10 equivalencia funcional como se describe adicionalmente aquí, está incluida en la descripción de la presente invención.

En otra forma de realización, la proteína de fusión comprende un anticuerpo que se fija al TF ligado 15 operativamente al dominio EGF3 de TM, lo cual es requerido para activar al activador de la fibrinólisis activable por trombina (TAFI).

Análogos, Fragmentos, Derivados y Variantes: 20

Un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de las proteínas de fusión, así como las proteínas directoras hacia dianas o el (los) dominio(s) de TM, de la presente invención puede ser: (i) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un 25 residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y dicho residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético; o (ii) uno en el que uno o más de los residuos de aminoácidos incluye(n) un grupo 5 sustituyente, o (iii) uno en el que la proteína de fusión madura está fusionada con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida mitad de la proteína de fusión (por ejemplo, poli(etilenglicol), o (iv) uno en el que unos aminoácidos adicionales están fusionados con la 10 proteína de fusión madura, tal como una secuencia directora o secretora o una secuencia que es empleada para la purificación de la proteína de fusión madura, o (v) uno en el que la secuencia de polipéptido está fusionada con un polipéptido más grande, es decir, una albúmina humana, un 15 anticuerpo o un Fc, para conseguir una duración aumentada del efecto. Se considera que dichos/as análogos, fragmentos, derivados y variantes están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. 20

Preferiblemente, los derivados de la presente invención contendrán sustituciones de aminoácidos conservativas (definidas adicionalmente más adelante) hechas en uno o más residuos predichos de aminoácidos preferiblemente no esenciales. Un residuo de aminoácido “no 25 esencial” es un residuo que puede ser alterado con respecto de la secuencia natural (de tipo silvestre) de una proteína sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido “esencial” es requerido para la actividad biológica. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es 5 una en la que el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos que tienen 10 cadenas laterales de carácter básico (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de carácter ácido (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas eléctricamente (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, 15 cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales de carácter 20 aromático (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Las sustituciones no conservativas no serían hechas para residuos de aminoácidos conservados o para residuos de aminoácidos que residan dentro de un dominio de proteína conservado, a menos que las sustituciones no 25

Además, unos derivados preferidos de la presente invención incluyen unas proteínas de fusión maduras que han sido fusionadas con otro compuesto, tal como un compuesto 25 que aumenta la vida mitad del polipéptido y/o que reduce la inmunogenicidad potencial del polipéptido (por ejemplo, poli(etilenglicol), “PEG”). El PEG puede ser usado para conferir solubilidad en agua, tamaño, velocidad lenta de eliminación renal, y una inmunogenicidad reducida a la 5 proteína de fusión. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense 6.214.966. En el caso de las PEGilaciones, la fusión de la proteína de fusión con el PEG puede ser efectuada por cualesquier medios conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, una PEGilación puede ser 10 efectuada introduciendo primero una mutación de cisteína dentro de la proteína de fusión, seguida por una derivatización específica para un sitio con PEG-maleimida. La cisteína puede ser añadida al extremo terminal de C de los péptidos. Véase, por ejemplo, Tsutsumi y colaboradores 15 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 97(15):8548-8553. Otra modificación que puede ser efectuada en la proteína de fusión implica una biotinilación. En ciertos casos, puede ser útil tener biotinilada a la proteína de fusión, de modo tal que ella pueda reaccionar fácilmente con la 20 estreptavidina. Unos métodos para la biotinilación de proteínas son bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, el sulfato de condroitina puede ser ligado con la proteína de fusión.

Unas variantes de las proteínas de fusión, de las 25 proteínas directoras hacia dianas y del (de los) dominios de TM de esta invención incluyen unos polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión, de las proteínas directoras hacia dianas y del (de los) 5 dominios de TM originales. El término “suficientemente similar” significa una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes con relación a una segunda secuencia de aminoácidos, de modo tal que las 10 secuencias de aminoácidos primera y segunda tienen un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que es idéntico en al menos aproximadamente 45%, de manera preferible en 15 aproximadamente 75% hasta 98%, son definidas aquí como suficientemente similares. Preferiblemente, las variantes serán suficientemente similares a la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión preferidas de esta invención. Las variantes incluyen unas variantes de 20 proteínas de fusión codificadas por un polinucleótido que se hibrida con un polinucleótido de esta invención o un complemento del mismo en condiciones rigurosas. Esas variantes generalmente retienen la actividad funcional de las proteínas de fusión de esta invención. Pueden ser 25

Las variantes incluyen proteínas de fusión, así como proteínas directoras hacia dianas y dominio(s) de TM, 20 que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a una mutagénesis. Unas variantes que tienen actividad de cofactor para la activación de la proteína C mediada por trombina, pueden ser identificadas explorando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes de 25 truncación o puntuales, de las proteínas de fusión o del (de los) dominios de TM de esta invención, usando el ensayo de activación de la proteína C que se describe en el Ejemplo 5. Unas variantes que tienen actividad de fijación del TF o del complejo de VIIa/TF pueden ser identificadas 5 seleccionando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes de truncación o puntuales, de las proteínas de fusión o de las proteínas directoras hacia dianas de esta invención usando el ensayo de sTF/FVIIa o ensayo de activación de FX del Ejemplo 5 que se describen 10 en el Ejemplo 5. Además, los análogos bioequivalentes de las proteínas de fusión también pueden ser construidos haciendo varias sustituciones en residuos o secuencias en la porción del (de los) dominio(s) de TM de la proteína de fusión que puede hacer a la proteína de fusión más 15 resistente a la lesión por oxidación o a las proteasas, véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense 5.827.824, o aumentar la eficiencia catalítica de la proteína de fusión, véase, por ejemplo Adler, M. y colaboradores (1995) J. Biol. Chem. 270(40):23366-23372 y la solicitud de patente 20 PCT WO01/98352, publicada el 27 de Diciembre de 2001.

En una forma de realización, es generada una biblioteca diversificada de variantes por mutagénesis combinatoria al nivel de los ácidos nucleicos y es codificada por una biblioteca diversificada de genes. Una 25 biblioteca diversificada de variantes puede ser producida, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos para dar secuencias de genes de modo tal que un conjunto degenerado de potenciales secuencias de aminoácidos variantes sea expresable en forma 5 de polipéptidos individuales, o, de manera alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la presentación de fagos) que contenga dentro de él el conjunto de secuencias. Existe una diversidad de métodos que pueden ser usados para producir bibliotecas de 10 variantes potenciales a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia degenerada de gen puede ser efectuada en un aparato sintetizador de ADN automático, y el gen sintético se puede ligar entonces dentro de un vector de expresión apropiado. 15 El uso de un conjunto degenerado de genes permite proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias variantes potenciales. Unos métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (véase, por 20 ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y colaboradores (1984a) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y colaboradores (1984b) Science 198: 1056; Ike y colaboradores (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Se conocen en la técnica varias tecnologías para 25 escrutar productos génicos de bibliotecas combinatorias producidas por mutaciones puntuales o por truncación, y para escrutar bibliotecas de ADNc en cuanto a productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Tales tecnologías son adaptables para el escrutinio rápido de las 5 bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de proteínas de fusión, así como de proteínas directoras hacia dianas y de dominio(s) de TM, en cuanto a la actividad de cofactor para la activación de la proteína C mediada por trombina o en cuanto a la actividad de 10 fijación al TF o al complejo de FVIIa/TF. Las tecnologías más ampliamente usadas, que son aplicables para el análisis de alto rendimiento para escrutar bibliotecas grandes de genes incluyen típicamente la clonación de la biblioteca de genes dentro de vectores de expresión replicables, la 15 transformación de las células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores y la expresión de los genes combinatorios en unas condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto había sido detectado. La 20 mutagénesis recursiva de conjunto (REM acrónimo de recursive ensemble mutagenesis), una tecnología que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede ser usada en combinación con los ensayos de escrutinio para identificar las variantes deseadas. 25

Producción de proteínas de fusión:

La proteína de fusión de esta invención es producida fusionando la proteína directora hacia diana con, o fijándola de otro modo a, el (o los) dominio(s) de TM o 5 los análogos, los fragmentos, los derivados o las variantes de los mismos por cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Los dos componentes pueden ser unidos químicamente entre sí por cualquiera de una variedad de procedimientos químicos bien conocidos. Por ejemplo, el 10 engarce puede hacerse por medio de reticuladores heterobifuncionales, por ejemplo, con SPDP, carbodiimida, glutaraldehído y similares.

En una forma de realización más preferida, la proteína directora hacia diana de esta invención puede ser 15 fusionada con el (los) dominio(s) de TM por medios recombinantes, tal como a través del uso de técnicas de ADN recombinante para producir un ácido nucleico que codifica tanto a la proteína directora como al polipéptido que codifica el dominio de TM y expresando la secuencia de ADN 20 en una célula anfitriona tal como E. coli o una célula de mamífero. El ADN que codifica la proteína de fusión puede ser clonado en un ADNc o en forma genómica por cualquier procedimiento de clonación que sea conocido por los expertos en la técnica. Véase por ejemplo, Sambrook, J.F. y 25 colaboradores (1989) supra.

En el caso en el que la proteína directora sea el anticuerpo, una vez que ha sido identificada una secuencia de ADN que codifica una región Fv que, cuando es expresada, muestra una actividad de fijación específica, las proteínas 5 de fusión que comprenden esa región Fv pueden ser preparadas por métodos conocidos por un experto en la técnica. Así, por ejemplo, Chaudhary, V.K. y colaboradores (1989) Nature 339(6223): 394-397; Batra, J.K. y colaboradores (1990) J. Biol. Chem. 265(25):15198-15202; 10 Batra, J.K. y colaboradores (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86(21):8545-8549; Chaudhary, V.K. y colaboradores (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87(3):1066-1070 describen la preparación de varias proteínas de fusión con anticuerpos de una sola cadena. La región Fv puede ser 15 fusionada directamente con el (los) dominio(s) de TM o puede ser unida a través de una secuencia de engarzador. La secuencia de engarzador puede estar presente simplemente para proporcionar un espacio entre la entidad directora hacia diana y el (los) dominio(s) de TM o para facilitar la 20 movilidad entre estas regiones para permitirles a cada una alcanzar su conformación óptima. La secuencia de ADN que comprende el conectador también puede proporcionar unas secuencias (como de cebadores o sitios de restricción) para facilitar la clonación o puede mantener el marco de lectura 25 entre la secuencia que codifica la entidad directora hacia diana y la secuencia que codifica el (los) dominio(s) de TM. El diseño de tales péptidos conectadores será bien conocido por los expertos en la técnica.

En la presente invención, se pueden secuencias de 5 engarzadores para enlazar la proteína directora hacia diana con el (los) dominio(s) de TM. En una forma de realización preferida de la presente invención, se usan dos secuencias de engarzadores para construir una proteína de fusión que se compone de un anticuerpo de una sola cadena y del 10 dominio EGF546 de TM y el lazo entre dominios entre el EGF3 y el EGF4 (TMi456). La primera de ellas enlaza los dominios pesado y ligero del anticuerpo de una sola cadena. La primera secuencia de engarzador tiene una longitud de 5 aminoácidos. Será evidente que se pueden usar otras cortas 15 secuencias de engarzadores, con 0 a 10 aminoácidos. El segundo engarzador en la presente invención es un engarzador de 15 aminoácidos que liga el anticuerpo al (a los) dominio(s) de TM. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden usar muchas diferentes secuencias 20 de engarzadores y aún tener como resultado una proteína de fusión que retenga la actividad anticoagulante y la activación de la proteína C. Unas modificaciones del engarzador existente tendrán como meta maximizar la intensificación de la activación de la proteína C sobre 25 superficies de fosfolípidos que contengan TF.

En un enfoque preferido, el anticuerpo de una sola cadena fue preparado usando una biblioteca presentadora de fagos. En la primera etapa de construcción de una biblioteca presentadora de fagos, los genes 5 variables (VH (procedente de IgM) Vκ y VL) fueron clonados por una PCR a partir del ARNm reunido a partir de una médula ósea, nodos linfáticos y bazos humanas/os usando un conjunto de cebadores específicos para una familia. Las bibliotecas de pCITE-VH (de 3,8x109 miembros), de pZ604-Vκ 10 (1,6x107) y de pZ604-VL (3,2x107) resultantes representan una diversidad permanente y alta de genes de V. Los genes de VH fueron amplificados a partir de la biblioteca de pCITE-VH. Los genes de Vκ y VL fueron amplificados por una PCR a partir de las bibliotecas de pZ604-Vκ y de pZ604-VL 15 con JH inversa y una secuencia de engarzador en el extremo 5’. Los productos de la PCR que contienen VH, Vκ y VL purificados en un gel fueron luego empalmados entre sí para producir el repertorio de genes de scFV. El repertorio de genes de scFV fue clonado para dar un vector fagémido 20 pZ603, y el producto de la ligación fue sometido a electroporación dentro de células de E. coli TG1 competentes para generar la biblioteca presentadora de fagos de scFV, HuPhabL3, con 5,2x109 transformantes individuales (Kay, B.K. y colaboradores (1996) Phage 25 Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego CA; Marks, J.D. y colaboradores (1991) J. Mol. Biol. 222(3):581-597; Sheets, M.D. y colaboradores (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95(11):6157-6162). 5

En una forma de realización preferida de la presente invención, se preparó un anticuerpo de una sola cadena (scFv(TF)3e10) que tiene un único sitio de fijación de VH/VL para el TF. La secuencia de aminoácidos de scFv(TF)3e10 (SEQ ID NO: 1) se describe en el Ejemplo 1, 10

En una forma de realización preferida de la presente invención, un fragmento de PCR que contiene la secuencia de TMi456 (con las mutaciones M388L y H381G) flanqueada por sitios para NotI fue subclonado dentro del sitio para NotI del pZ612/3e10 (un vector de expresión en 15 bacterias para elscFv(TF)3e10 basado en pCANTAB5 de Pharmacia). Aquí, unas mutaciones puntuales en las porciones de TM de las proteínas de fusión de la invención se especifican con la designación de una sola letra del residuo de aminoácido de la TM nativa, seguida por el 20 número de posición del aminoácido en la TM madura y la designación de una sola letra de la mutación de aminoácido. Por ejemplo, M388L indica que la metionina en la posición de aminoácido 388 de la TM madura ha sido cambiada por leucina. El sitio para NotI se encuentra entre la secuencia 25 del anticuerpo y la secuencia de la e-marca. Esto generó una construcción artificial de expresión en bacterias (pKM101) para una proteína de fusión que se compone de TMi456 – un engarzador de 15 aminoácidos – de la scFv(TF)3e10, seguido por la secuencia de la e-marca. Para 5 generar un vector de expresión en un mamífero, en primer lugar se generó un fragmento de PCR a partir del molde de pKM101, Este fragmento fue diseñado para su ligación a en los sitios para StuI/MscI del vector de expresión pTHR525 de TM. Esto generó un vector (pKM113) que tenía la 10 secuencia de señal de Solulin seguida por la secuencia de la proteína de fusión madura seguida por la secuencia de e-marca. El vector contiene el gen de resistencia a la ampicilina y marcadores de selección de higromicina y DHFR. La expresión es impulsada por el promotor LTR de MPSV. Una 15 mutagénesis dirigida a un sitio fue efectuada sobre ese vector para incluir las mutaciones R456G y H457Q que confieren a la porción de TM resistencia a las proteasas. El vector resultante es referido como pKM115. El vector pMK115 tenía un engarzador de 15 aminoácidos que separaba a 20 los dominios de VH y VL y otro engarzador de 15 aminoácidos que separaba al dominio de VL con respecto del TMi456, El engarzador que separaba a los VH y VL se disminuyó a 5 aminoácidos para dirigir la formación de un dímero con mayor avidez, referido como pHM115,5, La proteína de fusión 25

10

Expresión y Purificación de Proteínas de Fusión:

Existen varias maneras de expresar las proteínas de fusión recombinantes in vitro, incluyendo células de E. coli, de baculovirus, de levadura, de mamífero u otros sistemas de expresión. Los métodos para la expresión de 15 genes clonados en bacterias son bien conocidos. Para obtener un nivel de expresión alto de un gen clonado en un sistema procariótico, es esencial construir vectores de expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte para dirigir la terminación de la transcripción del ARNm. 20 Unos ejemplos de regiones reguladoras adecuadas para esta finalidad son la región de promotor y de operador del gen de la beta-glicosidasa en E. coli, la ruta biosintética del triptófano en E. coli, o el promotor situado a la izquierda del fago Lambda. Es útil la inclusión de marcadores de 25 selección en vectores de ADN transformados en E. coli. Unos ejemplos de tales marcadores incluyen los genes que especifican una resistencia a la ampicilina, a la tetraciclina o al cloranfenicol.

De los sistemas de células eucarióticas 5 superiores útiles para la expresión de las proteínas de fusión y de los análogos de las mismas, existen numerosos sistemas de células a seleccionar entre ellos. Unos ejemplos ilustrativos de linajes de células de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, células RPMI 7932, VERO y 10 HeLa, linajes de células de ovario de hámster chino (CHO), linajes de células WI38, BHK, COS-7, C127 o MDCK. Un linaje preferido de células de mamífero es el CHL-1. Cuando se usa el CHL-1 se incluye la higromicina como un marcador de selección eucariótico. Las células CHL-1 se derivan de 15 células de melanoma RPMI 7032, que es un linaje de células humanas fácilmente disponible. El linaje de células CHL-1 ha sido depositado en la ATCC de acuerdo con las condiciones del tratado de Budapest y se le ha asignado el #CRL 9446, depositado el 18 de Junio de 1987. Las células 20 adecuadas para usarse en esta invención están comercialmente disponibles a partir de la ATCC. Unos linajes de células ilustrativos incluyen Spodoptera frugiperda y Bombyx mori.

El sistema procariótico, E. coli, no es 25 susceptible a una modificación posterior a la traducción, tal como una glicosilación. Además, las proteínas con complejos modelos de disulfuro son con frecuencia mal plegadas cuando son expresadas en E. coli. Para la proteína de fusión descrita aquí había una reducción notable en la 5 actividad de cofactor de la trombomodulina cuando se expresaba en E. coli aunque ambas actividades estaban aún presentes. Con el sistema procariótico, la proteína expresada o bien está presente en el citoplasma celular en una forma insoluble así denominada de cuerpos de inclusión, 10 encontrada en la fracción soluble después de que la célula hubiera sido lisada, o es dirigida dentro del periplasma por adición de secuencias de señales de secreción apropiadas. Si la proteína expresada está en cuerpos de inclusión insolubles, usualmente se requiere una 15 solubilización y un repliegue posterior de los cuerpos de inclusión.

Muchos vectores de expresión procarióticos son conocidos por los expertos en la técnica, tales como los pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), 20 pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, EE.UU.), que se encuentran comercialmente disponibles.

Los promotores comúnmente usados en sistemas de expresión microbianos recombinantes incluyen el sistema 25 promotor de beta-lactamasa (penicilinasa) y de lactosa (Chang, A.C. y colaboradores (1978) Nature 275(5681):617-624; Goeddel, D.V. y colaboradores (1979) Nature 281(5732):544-548), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, D.V. y colaboradores (1980), Nucl. Acids Res. 5 8(18):4057-4074) y el promotor de tac (Maniatis, T. y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Otro sistema de expresión bacteriano útil emplea el promotor pL del fago lambda y el represor termoinducible clts857 (Bernard, H.U. y 10 colaboradores (1979) Gene 5(1):59-76; Love, C.A. y colaboradores (1996) Gene 176(1-2):49-53). Las proteínas de fusión recombinantes también pueden ser expresadas en levaduras anfitrionas como Saccharomyces cerevisiae. Esto usualmente proporciona la capacidad de efectuar varias 15 modificaciones posteriores a la traducción. La proteína de fusión expresada puede ser segregada dentro del material sobrenadante del cultivo en donde residen no muchas otras proteínas, haciendo más fácil a la purificación. Los vectores de levadura para la expresión de las proteínas de 20 fusión en esta invención contienen ciertas características requeridas. Los elementos del vector se derivan generalmente de levaduras y bacterias para permitir la propagación del plásmido en ambas. Los elementos de bacterias incluyen un origen de replicación y un marcador 25

Unos promotores adecuados en vectores de 5 levaduras para la expresión incluyen los promotores del gen de TRP1, o del gen de ADH1 o ADHII, el gen de la fosfatasa ácida (PH03 o PH05), el gen de isocitocromo, o los promotores implicados en la ruta glicolítica, tales como el promotor de la enolasa, de la gliceraldehído-3-fosfato 10 deshidrogenasa (GADPH), de la 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), de la hexocinasa, de la piruvato cinasa, de la triosafosfato isomerasa y de la fosfoglucosa isomerasa (Hitzeman, R.A. y colaboradores (1980) J. Biol. Chem. 255(24):12073-12080; Hess, B. y colaboradores (1968) J. 15 Adv. Enzyme Reg. 7:149-167; y Holland, M.J. y Holland, J.P. (1978) Biochemistry 17(23):4900-4907).

Los vectores de levaduras comercialmente disponibles incluyen pYES2, pPIC9 (Invitrogen, San Diego, CA), Yepc-pADH2a, pYcDE-1 (Washington Research, Seattle, 20 WA), pBC102-K22 (ATCC # 67255), y YpGX265GAL4 (ATCC # 67233). Los linajes de células de mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a COS-7, células L, C127, 3T3, de Ovario de Hámster Chino (CHO), HeLa, BHK, CHL-1, NSO, y HEK293 se pueden emplear para expresar las proteínas de fusión 25 recombinantes de esta invención. Las proteínas recombinantes producidas en células de mamíferos son normalmente solubles y están glicosiladas y tienen extremos terminales de N auténticos. Los vectores de expresión de mamíferos pueden contener elementos no transcritos tales 5 como un origen de replicación, un promotor y un intensificador, y secuencias no traducidas en 5’ o 3’ tales como sitios de fijación a ribosomas, un sitio de poliadenilación, sitio de aceptor y un sitio de empalme, y secuencias de terminación de la transcripción. Los 10 promotores destinados a usarse en vectores de expresión de mamíferos son usualmente por ejemplo promotores víricos tales como los de Polioma, Adenovirus, HTLV, Virus de Simio 40 (SV 40), y citomegalovirus humano (CMV).

Dependiendo del sistema de expresión y del 15 anfitrión seleccionado, una proteína de fusión recombinante homogénea puede ser obtenida usando diversas combinaciones de cromatografía convencional que se usan para la purificación de proteínas. Éstas incluyen: cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de fase inversa, 20 cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, y la CLAP (HLPC = cromatografía de alto rendimiento) si el sistema de expresión segrega la proteína de fusión dentro de los 25 medios de crecimiento, la proteína puede ser purificada directamente a partir de los medios. Si la proteína de fusión no es segregada, entonces es aislada a partir de los materiales lisados celulares. La disrupción de células puede ser efectuada por cualquier método convencional, 5 incluyendo un ciclo de congelación y descongelación, sonicación (tratamiento con ultrasonidos), disrupción mecánica o el uso de agentes de lisis de células.

En una forma de realización preferida de esta invención, los construcciones artificiales de expresión de 10 mamíferos fueron transfectadas en células CHO DXB11. Se seleccionaron unas poblaciones estables usando 400 µg/ml de higromicina B en el medio HAMS/F12, Los niveles de expresión fueron de aproximadamente 500 µg/l. Para aumentar los niveles de expresión se seleccionó una población usando 15 metotrexato 100 nM en el medio MEM alfa. El nivel de expresión aproximado de esta población fue de 5 mg/l.

La construcción artificial de fusión contiene la secuencia de e-marca situada en el extremo terminal de C de la proteína. Las columnas de afinidad anti-e-marca fueron 20 compradas de American/Pharmacia Biotech. Los medios de cultivo de células fueron filtrados a través de un filtro de 0,22 µm y cargados dentro de una columna con e-marca de 5 ml a razón de 2 ml/min. La columna fue lavada con NaN3 al 0,05% en un tampón de fosfato 0,2 M, de pH 7,0, y luego 25 recogida dentro de unos tubos que contenían 0,1 volúmenes de un tampón de Tris 1M, de pH 8,2 para neutralizar el tampón de elusión. Alternativamente, el medio de cultivo filtrado fue cargado sobre una columna con proteína A. En este caso, la columna fue lavada con ácido cítrico 50 mM, 5 NaCl 300 mM, de pH 6,5 y eluída con el mismo tampón a un pH de 3,0, En ambos casos, las muestras purificadas fueron cargadas posteriormente sobre una columna con Sephadex 200 para separar los monómeros con respecto de las formas dímeras de la proteína de fusión. 10

Composiciones Farmacéuticas:

La invención también proporciona unas composiciones farmacéuticas que pueden ser administradas a un paciente para lograr un efecto terapéutico. Las 15 composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser preparadas para la administración combinando una proteína de fusión que tiene el grado deseado de pureza y la cantidad farmacéuticamente efectiva con vehículos fisiológicamente aceptables. 20

Las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser usadas en composiciones farmacéuticas, para administración por vía intravenosa o administración por vía subcutánea o administración por vía intratecal. De este modo, las proteínas de fusión descritas anteriormente serán 25 combinadas preferiblemente con un vehículo estéril farmacéuticamente aceptable, tal como dextrosa al cinco por ciento, una solución de Ringer lactada, una solución salina normal, agua estéril o cualquier otra solución tamponadora fisiológica preparada comercialmente, diseñada para una 5 infusión intravenosa. Deberá entenderse que la selección de la solución del vehículo, y la dosificación y la administración de la composición variarán con el individuo y el escenario clínico particular, y serán gobernadas por procedimientos médicos clásicos. 10

De acuerdo con los métodos de la presente invención, estas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en unas cantidades efectivas para inhibir las consecuencias patológicas que están asociadas con la generación de trombina en exceso en el individuo. 15

La administración de la proteína de fusión puede ser por inyección intravenosa de un bolo, por una infusión intravenosa constante o por una combinación de ambas rutas. De manera alternativa, o además, la proteína de infusión mezclada con los excipientes apropiados puede ser llevada 20 dentro de la circulación desde un sitio intramuscular. El tratamiento sistémico con la proteína de fusión puede ser vigilado determinando el tiempo de tromboplastina parcial activada (PT) con muestras en serie de sangre tomadas del paciente. El tiempo de coagulación observado en este ensayo 25 es prolongado cuando se logra un nivel suficiente de la proteína de fusión en la circulación.

Las proteínas de fusión recombinantes y las composiciones farmacéuticas de esta invención son útiles para administración por una vía parenteral, tópica, 5 intravenosa, oral o local. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en una variedad de formas de dosificación unitaria dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitarias pueden ser administradas en la forma que incluye 10 pero no se limita a tabletas, cápsulas, polvos, soluciones y emulsiones.

Las proteínas de fusión recombinantes y las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para una administración por vía 15 intravenosa. Las composiciones para la administración comprenden corrientemente una solución del anticuerpo de una sola cadena o de una proteína de fusión que comprende el anticuerpo de una sola cadena disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en un vehículo 20 acuoso. Se pueden usar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, una solución salina tamponada. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materia indeseable. Las composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización 25 convencionales, bien conocidas.

Una composición farmacéutica típica para la administración por vía intravenosa puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Las cantidades administradas son claramente específicas para proteínas y 5 dependen de su potencia y de su perfil farmacocinético. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica, y son descritos con mayor detalle en publicaciones tales como Remington’s Pharmaceutical 10 Science, 15ava ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980).

Las composiciones que contienen las presentes proteínas de fusión o un cóctel de las mismas (es decir, junto con otras proteínas) pueden ser administradas como 15 tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un paciente que padece de un trastorno o de una enfermedad hemorrágico/a en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la hemorragia. Una cantidad adecuada para 20 lograr esto es definida como una “cantidad terapéuticamente efectiva”. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente.

La administración única o múltiple de las 25 composiciones puede ser efectuada dependiendo de la dosificación y de la frecuencia que se requiere y es tolerada por el paciente. En cualquier caso, la composición deberá proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de esta invención para tratar de una manera 5 efectiva al paciente.

Las proteínas de fusión de la invención, o sus composiciones farmacéuticamente aceptables, son administradas en una cantidad terapéuticamente efectiva, que variará dependiendo de una diversidad de factores que 10 incluyen la actividad de la proteína de fusión específica que se emplea; la estabilidad metabólica y la duración de la acción de la proteína de fusión; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, y la dieta del paciente; y el modo y el momento de la administración; la 15 velocidad de excreción; la combinación de fármacos; la gravedad de los estados de enfermedad particulares; y la terapia a la que está siendo sometido el anfitrión. Generalmente, una cantidad diaria terapéuticamente efectiva es de desde aproximadamente 0,14 mg hasta aproximadamente 20 14,3 mg/kg de peso corporal por día de una proteína de fusión de la invención, o de una composición farmacéuticamente aceptable de la misma; preferiblemente, de desde aproximadamente 0,7 mg hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día; de la manera más 25 preferible, de desde aproximadamente 1,4 mg hasta aproximadamente 7,2 mg/kg de peso corporal por día. Por ejemplo, para una administración a una persona de 70 kg, el intervalo de dosis sería de desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 1,0 gramos por día de una proteína de 5 fusión de la invención, o de una composición farmacéuticamente aceptable de la misma, de manera preferible de desde aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 700 mg por día, de manera más preferible de desde aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 500 mg 10 por día.

Terapia Génica:

Una proteína de fusión de la invención se puede emplear también de acuerdo con la presente invención por 15 expresión de tal proteína de fusión in vivo, lo cual con frecuencia es citado con frecuencia como “terapia génica”. Así, por ejemplo, las células pueden ser tratadas genéticamente con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica la proteína de fusión ex vivo, las células 20 tratadas genéticamente son luego proporcionadas a un paciente que ha de ser tratado con la proteína de fusión. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden ser tratadas genéticamente por procedimientos conocidos en la técnica mediante el uso de 25 una partícula retrovírica que contiene un ARN que codifica la proteína de fusión de la presente invención.

La liberación local de la proteína de fusión anticoagulante de la presente invención usando una terapia génica puede proporcionar el agente terapéutico a la zona 5 diana, las células endoteliales que recubren a los vasos sanguíneos.

Ambas metodologías de la terapia génica in vitro e in vivo son consideradas. Se conocen varios métodos para transferir genes potencialmente terapéuticos a poblaciones 10 de células definidas. Véase, por ejemplo, Mulligan (1993) Science 260:926-931. Estos métodos incluyen:

1) Una transferencia directa de genes. Véase, por ejemplo Wolff y colaboradores (1990) Science 247:1465-1468; 15

2) Una transferencia de ADN mediada por liposomas. Véase, por ejemplo, Caplen y colaboradores (1995) Nature Med. 3:39-46; Crystal (1995) Nature Med. 1:15-17; Gao y Huang (1991) Biochem, Biophys. Res. Comm.179;280-285; 20

3) Una transferencia de ADN mediada por retrovirus. Véase, por ejemplo Kay y colaboradores (1993) Science 262:117-119; Anderson (1992) Science 256:808-813.

4) Una transferencia de ADN mediada por virus de ADN. Tales virus de ADN incluyen adenovirus 25 (preferiblemente vectores basados en Ad2 o Ad5), virus de herpes (preferiblemente vectores basados en el virus del herpes simple), y parvovirus (preferiblemente vectores basados en parvovirus “defectuosos” o no autónomo, de manera más preferible 5 vectores basados en virus asociados con adeno, de la manera más preferible, vectores basados en AAV-2). Véanse, por ejemplo, Ali y colaboradores (1994) Gene Therapy 1:367-384; la Patente Estadounidense 4.797.368, y la Patente Estadounidense 5.139.941. 10

La elección de un sistema de vector particular para transferir el gen que interesa dependerá de una variedad de factores. Un factor importante es la naturaleza de la población de células diana. Aunque los vectores retrovíricos han sido estudiados extensamente y usados en 15 un cierto número de aplicaciones de terapia génica, estos vectores generalmente no son adecuados para infectar células que no se dividen. Además, los retrovirus tienen el potencial de oncogenicidad. Sin embargo, unos perfeccionamientos recientes en el campo de los vectores 20 lentivíricos pueden evitar alguna de esas limitaciones. Véase Naldini y colaboradores (1996) Science 272:263-267.

Los retrovirus a partir de los que se pueden derivar los vectores de plásmidos retrovíricos mencionados aquí anteriormente incluyen, pero no se limitan a, el virus 25 de la Leucemia Murina de Moloney, el virus de la necrosis del bazo, retrovirus tales como el virus del Sarcoma de Rous, el Virus del Sarcoma de Harvey, el virus de la leucosis aviar, el virus de la leucemia del mono gibbon, el virus de la inmunodeficiencia humana, los adenovirus, el 5 virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y el virus del tumor mamario. En una forma de realización, el vector de plásmido retrovírico se deriva del virus de la Leucemia Murina de Moloney.

Los adenovirus tienen la ventaja de que tienen 10 una amplia gama de anfitriones, pueden infectar a células inactivas o diferenciadas terminalmente, tales como neuronas o hepatocitos, y parecer esencialmente no oncogénicos. Véase, por ejemplo Ali y colaboradores (1994), supra, página 367. Los adenovirus no parece que se integran 15 en el genoma del anfitrión. Debido a que ellos existen extracromosómicamente, el riesgo de mutagénesis por inserción se reduce en gran medida. Ali y colaboradores (1994), supra, página 373.

Los virus asociados con adeno exhiben ventajas 20 como vectores basados en adenovirus. Sin embargo, los AAV exhiben una integración específica para un sitio en el cromosoma humano 19 (Ali y colaboradores (1994) supra. página 377).

En una forma de realización preferida, el ADN que 25 codifica las proteínas de fusión de esta invención es usado en terapia génica para trastornos que incluyen, pero no se limitan a, una trombosis venosa profunda, la coagulación intravascular diseminada, el síndrome coronario agudo o un cáncer con evidencia de coagulopatía. 5

De acuerdo con esta forma de realización, la terapia génica con un ADN que codifica las proteínas de fusión de esta invención es proporcionada a un paciente que necesita del mismo, concurrentemente con el, o inmediatamente después del, diagnóstico. 10

El experto en la técnica apreciará que se puede usar cualquier vector adecuado para la terapia génica que contiene un ADN que codifica la proteína de fusión de la invención o un ADN que codifica análogos, fragmentos, derivados o variantes de la proteína de fusión de la 15 invención de acuerdo con esta forma de realización. Las técnicas para construir tal vector son conocidas. Véase, por ejemplo, Anderson, W.F. (1998) Nature 392:25-30; Verma I.M. y Somia, N. (1998) Nature 389:239-242. La introducción del vector que contiene el ADN de la proteína de fusión al 20 sitio diana puede ser lograda usando técnicas conocidas.

El vector para la terapia génica incluye uno o más promotores. Unos promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, LTR retrovírico; el promotor de SV40; y el promotor de citomegalovirus 25 humano (CVM) descrito en Miller y colaboradores (1989) Biotechniques 7(9):980-990, o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero no se limitan a, los promotores de histona, de pol III, y de β-actina). 5 Otros promotores víricos que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, promotores de adenovirus, promotores de timidina cinasa (TK), y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas 10 contenidas aquí.

La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, 15 promotores de adenovirus, tales como el promotor tardío mayor de adenovirus; o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de metalotioneina; los 20 promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor de ApoAl; los promotores de globina humana; los promotores de timidina cinasa vírica, como el promotor de timidina cinasa de Herpes Simple; LTR retrovíricos (incluyendo los LTR retrovíricos modificados que se han 25 descrito aquí anteriormente); el promotor de β-actina; y el promotor de la hormona del crecimiento humana.

El vector de plásmido retrovírico es empleado para transducir linajes de células empaquetados para formar linajes de células productores. Unos ejemplos de células 5 empaquetadas que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, los linajes de células PE501, PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X; VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP+#-86, GP-envAm12 y DAN como se describen en Miller (1990) Human Gene Therapy 1:5-14. El vector puede transducir a las células 10 empaquetadas a través de cualesquier medios conocidos en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, la electroporación, el uso de liposomas y la precipitación con CaPO4. En una alternativa, el vector de plásmido retrovírico puede ser encapsulado en un liposoma, o ser 15 acoplado a un lípido, y luego administrado a un anfitrión. El linaje de células productoras genera partículas infecciosas de un vector retrovírico que incluyen la(s) secuencia(s) de ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) los polipéptidos. Tales partículas de vector retrovírico pueden 20 ser empleadas entonces para transducir células eucarióticas, ya sea in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen, 25 pero no se limitan a, células no diferenciadas embrionarias, células de carcinoma embrionarias, así como células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales. 5

Un enfoque diferente de terapia génica es la “terapia transcariótica” en la que las células del paciente son tratadas ex vivo para inducir los genes cromosómicos durmientes (inactivos) para producir la proteína que interesa después de su reintroducción en el paciente. La 10 terapia transcariótica supone que el individuo tiene un complemento normal de genes necesarios para la activación. La terapia transcariótica implica introducir un promotor u otra secuencia reguladora exógena, capaz de activar a los genes nacientes o incipientes, en el ADN cromosómico de las 15 células del paciente ex vivo, cultivar y seleccionar en cuanto a células productoras de proteínas activas, y luego reintroducir las células activadas en el paciente con la intención de que ellas resulten completamente establecidas. Las células “activadas con genes” producen entonces la 20 proteína que interesa durante un periodo de tiempo significativo, posiblemente durante tanto tiempo como la vida del paciente. Las Patentes Estadounidenses Nºs 5.641.670 y 5.733.761 describen con detalle este concepto.

25

Estuches:

Esta invención se relaciona además con estuches destinados a investigación o diagnóstico. Los estuches incluyen típicamente uno o más recipientes que contienen los anticuerpos de una sola cadena de la presente 5 invención. En una forma de realización preferida, los estuches comprenden unos recipientes que contienen anticuerpos de una sola cadena en una forma adecuada para derivatizarse con una segunda molécula, por ejemplo un(os) dominio(s) de TM o fragmentos de los mismos. En una forma 10 de realización más preferida, los estuches comprenden unos recipientes que contienen las proteínas de fusión de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3,

En otra forma de realización, los estuches pueden contener unas secuencias de ADN que codifican las proteínas 15 de fusión. Preferiblemente, las secuencias de ADN que codifican esas proteínas de fusión son proporcionadas en un plásmido adecuado para la transfección dentro de, y expresión por, una célula anfitriona. El plásmido puede contener un promotor (con frecuencia un promotor inducible) 20 para regular la expresión del ADN en la célula anfitriona. El plásmido puede contener también unos sitios de restricción apropiados para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN dentro del plásmido para producir diversas proteínas de fusión. Los plásmidos pueden contener 25 también otros numerosos elementos para facilitar la clonación y la expresión de las proteínas codificadas. Tales elementos son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, marcadores seleccionables, codones de iniciación y codones de terminación. 5

Indicaciones Terapéuticas:

Las enfermedades en las que la formación de trombos desempeña un cometido etiológico significativo incluyen un infarto de miocardio, la coagulación 10 intravascular diseminada, la trombosis venosa profunda, un embolismo pulmonar, una apoplejía isquémica, un choque séptico, el síndrome de angustia respiratoria aguda, una angina inestable y otras condiciones oclusivas arteriales y venosas. Las proteínas de fusión de esta invención son 15 útiles en todas estas, así como en otras, enfermedades en las que la formación de trombos es patológica. Otras condiciones patológicas en las que la proteína de fusión de esta invención puede ser útil incluyen un cáncer con coagulopatía e inflamación. Los compuestos también pueden 20 encontrar uso en injertos de piel y venas y en trasplantes de órganos. Por el concepto de útil se entiende que los compuestos son útiles para el tratamiento, ya sea para evitar una enfermedad o para impedir su progreso a un estado más grave. Los compuestos de esta invención también 25 proporcionan un agente anticoagulante seguro y efectivo, por ejemplo, en pacientes que reciben unas prótesis biológicas tales como válvulas cardiacas. Estos compuestos pueden reemplazar a la heparina y la warfarina en el tratamiento de, por ejemplo, un embolismo pulmonar o un 5 infarto de miocardio agudo. Las proteínas de fusión de esta invención también pueden encontrar uso para revestir a dispositivos médicos en los que la coagulación es una cuestión de preocupación.

10

Ensayos:

Se encuentran disponibles un cierto número ensayos de laboratorio para medir la actividad de TM de una proteína de fusión de la invención. La actividad de la proteína C puede ser medida en el ensayo descrito por 15 Salem, H.H. y colaboradores (1984), supra y Galvin, J.B. y colaboradores (1987) J. Biol. Chem 262(5):2199-2205. De manera breve, el ensayo consiste en dos pasos. El primer paso es la incubación de la proteína de fusión de ensayo con trombina y con la proteína C en condiciones definidas. 20 En el segundo paso, la trombina es inactivada con hirudina o antitrombina III y heparina, y la actividad de la proteína C recientemente activada es determinada mediante el uso de un sustrato cromógeno, por lo que el cromóforo es liberado por la actividad proteolítica de la proteína C 25 activada. El ensayo es llevado a cabo con los reactivos purificados.

De manera alternativa, el efecto de una proteína de fusión puede ser medido usando ensayos de tiempo de coagulación en plasma, tales como el tiempo de 5 tromboplastina parcial activada (APTT), el tiempo de coagulación de trombina (TCT) y/o el tiempo de protrombina (PT). Esos ensayos distinguen entre diferentes mecanismos de inhibición de la coagulación, e implican la activación de la proteína C. La prolongación del tiempo de coagulación 10 en cualquiera de estos ensayos demuestra que la molécula puede inhibir la coagulación en plasma.

Los ensayos anteriores son usados para identificar proteínas de fusión con una actividad de TM, que son capaces de fijar a la trombina y de activar a la 15 proteína C tanto en sistemas purificados como en un medio con plasma. Entonces se usan unos ensayos adicionales para evaluar otras actividades de la TM nativa, tales como la inhibición de la formación de fibrina catalizada por trombina a partir del fibrinógeno (Jakubowski, H.V. y 20 colaboradores (1986) J. Biol. Chem. 261(8):3876-3882), la inhibición de la activación del factor V por trombina (Esmon, C.T. y colaboradores (1982), J. Biol. Chem. 257(14):7944-7947), la inhibición acelerada de trombina por antitrombina III y cofactor II de heparina (Esmon, N.L. y 25 colaboradores (1983) J. Biol. Chem. 258(20):12238-12242), la inhibición de la activación del factor XIII por trombina (Polgar, J. y colaboradores (1987) Thromb. Haemost. 58(1):140), la inhibición de la inactivación de la proteína S mediada por trombina (Thompson, E.A. y Salem, H.H. 5 (1986), J. Clin. Inv. 78(1):13-17), y la inhibición de la activación y aglomeración de plaquetas mediadas por trombina (Esmon, N.L. y colaboradores (1983), supra).

Los siguientes ensayos, descritos con detalle más adelante en el Ejemplo 5, son usados para medir la potencia 10 in vitro de las proteínas de fusión de la invención: 1) el ensayo de activación de la proteína C (cromógeno); 2) el ensayo de activación de sTF/FVIIa; 3) el ensayo de activación del Factor X; y 4) el ensayo de activación de la proteína C (sobre una superficie rica en TF). 15

Para llevar a cabo los procedimientos de la presente invención, por supuesto debe comprenderse que la referencia a tampones, medios, reactivos, células, condiciones de cultivo no pretende ser limitadora, sino que debe leerse como que incluye todos los materiales 20 relacionados que un experto en la técnica reconocería como que son de interés o valor en el contexto particular en el que es presentada esta discusión. Por ejemplo, con frecuencia es posible sustituir un sistema de tampón o un medio de cultivo por otro y lograr aún resultados similares 25 aunque no idénticos. Los expertos en la técnica tendrán suficiente conocimiento de tales sistemas y metodologías de manera tal que sean capaces, sin experimentación indebida, de hacer tales sustituciones que sirven de manera óptima para sus propósitos usando los métodos y los 5 procedimientos descritos aquí.

La presente invención será ahora descrita mejor por medio de los siguientes ejemplos no limitadores. Para aplicar la descripción del ejemplo, deberá tenerse claramente en mente que otras y diferentes formas de 10 realización de los métodos descritos de acuerdo a la presente invención no les sugerirán dudas a los expertos en la técnica relevante.

Sin ninguna elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción 15 anterior, utilizar la presente invención en su extensión más completa. Las siguientes formas de realización específicas preferidas, por lo tanto, deben ser consideradas de ninguna otra manera como meramente ilustrativas, y no limitadoras del resto de la descripción. 20

En los ejemplos anteriores y en los siguientes, todas las temperaturas se exponen no corregidas en grados Celsius, y todas las partes y porcentajes están en peso, a menos que se indique otra cosa.

Los siguientes ejemplos se proporcionan como una 25 guía para ayudar a la práctica de la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1

Construcción artificial scFv(TF)3e10 del Anticuerpo Anti-TF 5 de una Sola Cadena

(-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A Q

V N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A S

G F S F T D A W M S W V R Q A P G K E L E W V S

S I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R D 10

N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A

R V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T V

S A G G G G S G A P N F M L T Q P H S V S A S P

G K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q

Q R P G S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D R 15

F S G S I D T S S N S A S L T I S G L K T E D E

A D Y Y C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T V

L G A A A G A P V P Y P D P L E P R A A (264)

EJEMPLO 2 20

Construcción artificial 1 de Proteína de Fusión -scFv(TF)3e10-TMi456

scFv(TF)3e10VHVLTMi456

25

(-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A Q

V N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A S

G F S F T D A W M S W V R Q A P G K E L E W V S

S I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R D

N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A 5

R V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T V

S A G G G G S G A P N F M L T Q P H S V S A S P

G K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q

Q R P G S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D R

F S G S I D T S S N S A S L T I S G L K T E D E 10

A D Y Y C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T V

L G A A A G G G G S G G G G S G G G G S V E P V

D P C F R A N C E Y Q C Q P L N Q T S Y L C V C

A E G F A P I P H E P H R C Q M F C N Q T A C P

A D C D P N T Q A S C E C P E G Y I L D D G F I 15

C T D I D E C E N G G F C S G V C H N L P G T F

E C I C G P D S A L A G Q I G T D C A A A G A P

V P Y P D P L E P R A A (400)

La proteína de fusión scFv(TF)3e10-TMI456 (SEQ ID NO: 2) consiste en un péptido de señal (desde -18 hasta 20 –1), en un dominio de VH (desde 1 hasta 126), en un engarzador de VH-VL (desde 127 hasta 131), en un dominio de VL (desde 132 a 246), en un engarzador de VL-TM (desde 247 hasta 264), en un dominio de TMi456 (desde 265 hasta 382) y en la secuencia de e-marca (desde 383 hasta 400). Las 25 mutaciones H381G, M388L, R456G y H457Q en TMi456 están subrayadas.

EJEMPLO 3

Construcción artificial 2 de Proteína de Fusión -scFv(TF)3e10-TMi456∆

5

scFv(TF)3e10

VHVLTMi456

(-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A Q 10

V N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A S

G F S F T D A W M S W V R Q A P G K E L E W V S

S I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R D

N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A

R V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T V 15

S A G G G G S N F M L T Q P H S V S A S P G K T

V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R P

G S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D R F S G

S I D T S S N S A S L T I S G L K T E D E A D Y

Y C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G A 20

A A G G G G S G G G G S G G G G S V E P V D P C

F R A N C E Y Q C Q P L N Q T S Y L C V C A E G

F A P I P H E P H R C Q M F C N Q T A C P A D C

D P N T Q A S C E C P E G Y I L D D G F I C T D

I D E C E N G G F C S G V C H N L P G T F E C I 25

C G P D S A L A G Q I G T D C (379)

La proteína de fusión scFv(TF)3e10-TMI456∆ (SEQ ID NO: 3) consiste en un péptido de señal (desde -18 hasta –1), en un dominio de VH (desde 1 hasta 126), en un engarzador de VH-VL (127 a 131), en un dominio de VL (desde 5 132 hasta 243), en un engarzador de VL-TM (desde 244 hasta 261), y en un dominio de TMi456 (desde 262 hasta 379). Las mutaciones H381G, M388L, R456G y H457Q en TMi456 están subrayadas.

10 EJEMPLO 4

Expresión de la Proteína de Fusión en Células de Bacteria/Mamífero

La expresión bacteriana fue posible, pero produjo una proteína que tuvo una actividad de cofactor de TM muy 15 reducida. La proteína de fusión fue expresada en células CHO. El plásmido de expresión contiene ambos marcadores de selección de higromicina B y de DHFR. La selección original se efectuó en higromicina 400 µg/ml para seleccionar una población. La población resultante fue entonces sometida a 20 selección con metotrexato 100 nM. Durante esta selección, las células que tienen copias amplificadas de la región de ADN que contiene el marcador de selección, y el gen diana, son seleccionadas entre la población. Los niveles de expresión fueron aumentados desde aproximadamente 0,3 mg/l 25 hasta aproximadamente 6 mg/l como resultado de esta selección.

EJEMPLO 5 Ensayos in vitro 5

1 Ensayo de Activación de Proteína C (cromógeno)

Este ensayo se efectuó mezclando 20 µl de cada una de las siguientes proteínas en una placa de microtitulación: una muestra de TM (desconocida o patrón), trombina (3nM), y proteína C (1,5 µM). El diluyente de ensayo para cada 10 proteína fue Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl2 2,5 mM, BSA 2,5 mg/ml, de pH 7,4. Los pocillos fueron incubados durante 2 horas a 37°C después de lo cual se terminó la activación de la proteína C por medio de la adición de 20 µl de hirudina (0,16 unidades/µl de 370 nM) en el diluyente de 15 ensayo e incubación durante 10 minutos adicionales.

La cantidad de la proteína C activada formada fue detectada añadiendo 100 µl de S2266 1 mM (diluyente de ensayo), y continuando la incubación de la placa a 37°C. La absorbencia a 405 nm en cada pocillo fue leída cada 10 20 segundos durante 30 minutos, usando un lector de placas Molecular Devices. Los datos de absorbencia fueron almacenados, y se calculó el cambio en la absorbencia por segundo (pendiente) en cada pocillo. El cambio de la absorbencia por segundo es proporcional a pmol/ml de 25 proteína C activada.

Esta relación fue determinada empíricamente usando concentraciones variables de la proteína C totalmente activada. Las muestras que contienen la proteína C activada en un 100% fueron generadas mezclando la proteína C de 0 a 5 1,5 µM con una TM de conejo 60 nM y trombina 30 nM, incubando durante 0 a 4 horas, añadiendo hirudina y midiendo la actividad de S2266 como se hizo anteriormente. Las condiciones en las que el 100% de la proteína C fue activada fueron definidas como aquellas en que la actividad 10 de S2266 (A405/seg.) alcanzó una meseta.

Una unidad de actividad se define como 1 pmol de la proteína C activada generada por ml/min en las condiciones de reacción definidas anteriormente. De manera alternativa, los valores de actividad son informados en comparación con 15 una TM de conejo solubilizada con detergente.

2. Ensayo de Activación de sTF/FVIIa

El principio de este ensayo se describe más adelante. El enlace de amida de la p-nitroanilida del tripéptido del 20 sustrato es hidrolizado por el complejo de sTF/FVIIa. El producto cromóforo liberado, la p-nitroanilida, es vigilado a 405 nm y la concentración del producto formado por unidad de tiempo es calculada usando un coeficiente de extinción molar de 9920 M-1cm-1, Los valores de CI50 (C) son 25 determinados acoplando las velocidades iniciales en la ecuación de 4 parámetros:

Y = (A-D)/(x/C)ˆB)+D

H-D-Val-Leu-Arg-p-NA → H-D-Val-Leu-Arg + p-NA 5

Sustrato de S2266 Tripéptido Cromóforo

Reactivos y soluciones:

1.Tampón de ensayo: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM,

CaCl2 5 mM, BSA al 0,1%, de pH 7,5 10

2. FVIIa humano (HCVIIA-0060, de Haematologic Technologies Inc.): solución de trabajo 10 x – preparar una solución 20 nM en el tampón de ensayo antes del uso.

3 TF soluble (Berlex): 10 x solución de trabajo – preparar una solución 30 nM en el tampón de ensayo antes 15 del uso.

4. Sustrato cromógeno S2266 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.):

solución original: 10 mM en H2O, almacenada a 4°C.

2,5 x solución de trabajo – preparar una solución 2,5 mM en el tampón de ensayo antes del uso. 20

5. Anticuerpo: preparar diluciones 2,5 x en el tampón de ensayo antes del uso.

Condiciones de ensayo:

Los ensayos se efectuaron en una placa de 25 microtitulación de 96 pocillos a la temperatura ambiente. Las concentraciones finales de los componentes son las siguientes:

sTF 3 nM

Anticuerpo varía desde 1.000 a 0,625 nM 5

FVIIa 2 nM

S2266 1 mM

Procedimiento de Ensayo:

1. Pipetear 0,1 ml de 2,5x AB (o un testigo con tampón) 10 dentro de cada pocillo.

2. Añadir 0,025 ml de 10x sTF e incubar durante 10 min. a la temperatura ambiente con agitación moderada.

3. Añadir 0,025 ml de 10x FVIIA, e incubar durante 10 min. a la temperatura ambiente con agitación moderada. 15

4. Añadir 0,01 ml de 2,5x del sustrato S2266, inmediatamente transferir la placa a un lector de placas y medir los parámetros cinéticos enzimáticos a 405 nm a intervalos de 10 segundos durante 15 min.

20

3. Ensayo de Activación del Factor X:

El principio de este ensayo se describe más adelante. El factor FVIIa es incubado con vesículas de TF humano recombinante para formar un complejo con una proteasa capaz de activar al sustrato, FX. Este complejo es formado en 25 presencia de (o ausencia) de diferentes concentraciones de anticuerpo, luego es introducido el sustrato FX y la reacción se deja desarrollar para formar el producto, la proteasa activa FXa, que es capaz de hidrolizar el enlace amida de la p-nitroanilida del sustrato cromógeno S2222, El 5 producto cromóforo liberado, la p-nitroanilida, es vigilado a 405 nm y se calcula la concentración del producto formado por unidad de tiempo usando un coeficiente de extinción molar de 9.920 M-1cm-1, Los valores de CI50 (C) son determinados acoplando las velocidades iniciales dentro de 10 la ecuación de 4 parámetros: Y = (A-D)/(1+(x/C)ˆB)+D

Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA → Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH + p-NA

Sustrato S2222 Cromóforo

15

Reactivos y soluciones:

1. Un tampón de ensayo: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA al 0,1%, de pH 7,5

2. FVIIa humano (HCVIIA-0031, de Haematologic Technologies Inc.): solución de trabajo 4 x – preparar una 20 solución 100 pM en el tampón de ensayo antes del uso.

3. TF Humano Recombinante (reconstituido en nuestro laboratorio a partir de Innovin, Dade): ´Solución de trabajo - preparar una dilución 1:480 en el tampón de ensayo antes del uso. 25

4. Factor X (HCX-0060, Haematologic Technologies Inc.): 4 x Solución de trabajo – preparar una solución 1.000 nM en el tampón de ensayo antes del uso.

5. Sustrato cromógeno S2222 (Kabi Pharmacia Hepar Inc.):

Solución original: 6mM en H2O, almacenado a 4°C. 5

Solución de trabajo - preparar una solución 0,78 mM en 3,57 mM de EDTA (para detener la reacción), 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl pH 7,5 antes del uso.

6. Anticuerpo:

Preparar una dilución 4 x en el tampón de ensayo antes del 10 uso.

Condiciones de Ensayo:

Los ensayos se efectúan en una placa de microtitulación de 96 pocillos a la temperatura ambiente. 15 Las concentraciones finales de los componentes son las siguientes:

Vesículas de rTF ¼ de dilución 1:480,

Anticuerpo varía desde 100 a 0,625 nM.

FVIIa 25 pM 20

FX 250 nM

S2222 0,546 mM

Procedimiento de ensayo:

1. Pipetear 0,015 ml de 4xAB (o testigo con tampón) en cada 25 pocillo.

2. Añadir 0,015 ml de 4x vesículas de rTF

3. Añadir 0,015 ml de 4x FIIa, incubar durante 10 min. a la temperatura ambiente con agitación moderada.

4. Añadir 0,015 ml de 4x FX, incubar durante 5 min. A la 5 temperatura ambiente con agitación moderada.

5. Añadir 0,14 ml del sustrato S2222, transferir inmediatamente la placa a un lector de placas y medir los parámetros cinéticos enzimáticos a 405 nm a intervalos de 10 segundos durante 15 minutos. 10

4. Ensayo de Activación de la Proteína C (sobre una Superficie rica en TF).

Este ensayo se efectúa como para el ensayo de activación de la proteína C cromógeno listado anteriormente 15 con la excepción de que en este ensayo las vesículas de PC/PS que contienen TF son añadidas a la proteína de fusión, o al testigo con TM, antes de añadir la trombina y la proteína C.

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EJEMPLO 6

Características de los Anticuerpos Anti-TF

Se aislaron siete diferentes anticuerpos que se fijan al TF de una biblioteca presentadora de fagos de anticuerpos de una sola cadena humana. Las afinidades de 25 los anticuerpos que se fijan a sTF, medidas usando el BIAcore, estaban entre 35 y 470 nM. El ensayo de sTF/FVIIa se usó para determinar si los anticuerpos bloquearían la formación de un complejo de VIIa/TF activo. En el ensayo de sTF/VIIa, la fijación de VIIa al sTF acelera la velocidad 5 de disociación frente al sustrato peptídico cromógeno S2266 en > 20 veces. Los anticuerpos que inhiben la fijación de FVIIa al TF bloquean esta aceleración. Entre los siete diferentes anticuerpos aislados, únicamente uno de ellos, el scFV(TF)3e10 no inhibe al ensayo de sTF/VIIa. Este 10 anticuerpo aumentó la afinidad del FVIIa para sTF, haciendo disminuir la KD en 5 veces (Figura 1). La KD del anticuerpo scFv(TF)3e10 para sTF, medida usando el ensayo de sTF/FVIIa, fue de 65,4 nM (Figura 2). Se usó una microcalorimetría para comparar la afinidad de scFv(TF)3e10 15 para TF en comparación con el complejo de FVIIa/TF. Estos experimentos revelaron que el anticuerpo tiene una afinidad 20 veces mayor para el complejo de TF/FVIIa en comparación con sTF libre (33 nM frente a 600 nM, Figura 3). Los anticuerpos fueron comparados usando el ensayo de 20 activación de FX, que consiste en TF de longitud completa en vesículas de fosfolípidos, en FVIIa y en FX. La cantidad de FXa generado se determinó usando el sustrato cromógeno S2765. Aunque el anticuerpo scFv(TF)3e10 no tiene la afinidad más alta tal como se mide por BIAcore y aumenta la 25

El anticuerpo scFv(TF)3e10 fue identificado sobre la base de la fijación a un TF soluble humano recombinante. La homología de secuencias del TF entre el humano y el murino 10 o entre el humano y el de conejo es de 58% y 71%, respectivamente. El anticuerpo se fija a un epítopo único sobre el TF humano que interfiere con la activación del FX por el complejo de FVIIa/TF. Fisiológicamente, el anticuerpo tiene una ventaja sobre los anticuerpos que 15 compiten con el FVII o el FVIIa en la fijación al TF. La KD tanto del FVII como de FVIIa en un plasma humano es de 10 nM, o mayor entre 100 y 1.000 veces que la KD. La velocidad de salida para el complejo de alta afinidad será lenta (de 70 hasta 700 segundos, suponiendo que kon = 108 M-1seg-1). En 20 contraste, la Km del FX para el complejo VIIa/TF está entre 0,200 y 4 µM y la concentración de FX en un plasma humano es de 130 nM (entre 0,03 y 0,65 veces la KD). La función principal del complejo de FVIIa/TF en una coagulación es convertir el FX en Fxa. 25

EJEMPLO 7

Características In Vitro de la Proteína de Fusión scFv(TF)3e10-TMi456

Las características de una proteína de fusión de la 5 invención, scFv(TF)3e10-TMi456, fueron averiguadas en una variedad de ensayos in vitro. La proteína de fusión, scFv(TF)3e10-TMi456, retenía la capacidad de inhibir la activación del FX por el complejo de FVIIa/TF (CI50=0,5 nM, no se muestran los datos) y actuaba como un cofactor para 10 la activación de la proteína C catalizada por trombina (ensayo cromógeno, Figura 6). No se observó ninguna diferencia significativa en la actividad de cofactor de TM entre la proteína de fusión y el Tmi456 solo, en ausencia de vesículas de fosfolípidos que contienen el TF. En 15 contraste, la actividad de cofactor de TM de la proteína de fusión, pero no del Tmi456, aumentó en >5 veces en presencia de vesículas de fosfolípidos que contienen el TF (Figura 7). La potencia in vitro de la proteína de fusión, scFv(TF)3e10-Tmi456, contra una coagulación inducida por TF 20 (ensayo de PT, ruta de coagulación extrínseca) fue 6 veces mejor que la del anticuerpo scFv(TF)3e10 y 17 veces mejor que el TMi456 solo (Figura 5). En contraste, la potencia in vitro de la proteína de fusión contra las rutas de coagulación intrínseca y común no fue afectada 25 significativamente (ensayos de APTT y TCT, no se muestran datos). Por lo tanto, la dosis de la proteína de fusión que produjo una prolongación de dos veces en la PT tenía únicamente un efecto modesto sobre el APTT, mientras que el TMi456, en una dosis equivalente en el PT, causó un aumento 5 de 4 veces en el APTT (Figura 8). Este perfil in vitro es consistente con el esperado para los agentes anticoagulantes dirigidos hacia TF/FVIIa que son conocidos por tener una eficacia superior en las relaciones de hemorragia en modelos de trombosis en animales. En 10 concordancia con los ensayos de coagulación basados en el plasma, la proteína de fusión scFv(TF)3e10-TMi456 era más potente en el ensayo de coagulación de sangre completa inducida por TF (Thromboelastograph, TEG) que o bien el scFv(TF)3e10 o el Tmi456 solo (Figura 9). Además, la 15 proteína de fusión scFv(TF)3e10-Tmi456 tenía una respuesta a la dosis más predecible en el ensayo de coagulación de sangre completa inducida por TF que la heparina de bajo peso molecular (LMWH, Figura 10). En resumen, los datos anteriores demuestran que las proteínas de fusión de la 20 invención son unos agentes anticoagulantes potentes y selectivos in vitro.

EJEMPLO 8

Modelo de Tromboembolismo de Rata In Vivo

La porción del anticuerpo de TF de la proteína de fusión scFv(TF)3e10-TMi456, es específica para un TF de 5 primate. Se desarrolló un modelo de tromboembolismo dirigido por un TF humano (reactivo de tromboplastina que contiene un TF recombinante humano, Ortho) en ratas Sprague-Dawley machos conscientes (350-400 g, n>7/grupo). En este modelo de coagulación intravascular diseminada 10 (DIC), el TF, a través de una inyección de tromboplastina, induce una deposición de fibrina pulmonar, una insuficiencia respiratoria y la muerte. Se inyectaron unas dosis equimolares de scFv(TF)3e10-TMi456 o de scFv(TF)3e10, o de vehículo en la vena de la cola, seguidas, 15 minutos 15 después, por una inyección de bolos de tromboplastina (0,5 ml/kg). En el grupo tratado con el vehículo, esta dosis de TF dio como resultado una letalidad de 60% (DL60), usualmente dentro de 5 minutos después de una inyección de tromboplastina. Las ratas fueron calificadas de acuerdo al 20 siguiente sistema de calificación de morbilidad-mortalidad: 0 = sin afectar; 1 = angustia respiratoria media (recuperación dentro de 30 minutos); 2 = angustia respiratoria severa (moribundo, la recuperación requirió más de 60 minutos); y 3 = muerte. La calificación promedia 25 se usó para comparar la eficacia de 4 grupos de tratamiento diferentes. Los resultados obtenidos usando este ensayo in vivo son descritos en la Figura 11, La proteína de fusión de la invención era capaz de inhibir la muerte y la angustia respiratoria en este ensayo. 5

Los ejemplos anteriores pueden ser repetidos con éxito similar sustituyendo los reactivos descritos de manera genérica o específica y/o las condiciones de funcionamiento de esta invención por los/las que se usaron en los ejemplos precedentes. 10

Aunque la invención ha sido ilustrada con respecto a la producción de ciertas construcciones artificiales de proteínas de fusión, es evidente que pueden hacerse variaciones y modificaciones de la invención sin apartarse del espíritu ni del alcance de la invención. 15

LISTA DE SECUENCIAS

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión anticoagulante, que comprende una proteína directora hacia diana o un análogo, un fragmento, un derivado o una variante de la misma, que se fija al factor tisular (TF) o al complejo de factor 5 VIIa/factor tisular (FVIIa/TF), que está ligado operativamente al dominio EGF456 de la trombomodulina (TM), o a un análogo, un fragmento, un derivado o una variante del mismo; fijándose la proteína de fusión anticoagulante al factor tisular (TF) o al complejo de factor VIIa/TF 10 (FVIIa/TF).
2. La proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el dominio de TM comprende el lazo entre dominios entre el EGF3 y el EGF4,
3. La proteína de fusión según las reivindicaciones 1 15 ó 2, en la que dicho dominio EGF456 contiene al menos una mutación puntual seleccionada del grupo que consiste en seleccionada del grupo que consiste en H381G, M388L, R456G y H457Q, que hace a dicha proteína de fusión más resistente a la lesión por oxidación o a la actividad de proteasas o 20 que aumenta la eficiencia catalítica de dicha proteína de fusión.
4. La proteína de fusión según la reivindicación 3, en la que dicho dominio EGF456 consiste en mutaciones puntuales en H381G, M388L, R456G y H457Q. 25
5. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha proteína directora hacia diana es un anticuerpo que se fija a TF.
6. La proteína de fusión según la reivindicación 5, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 5
7. La proteína de fusión según la reivindicación 6, en la que dicho anticuerpo monoclonal se fija al complejo de FVIIa/TF con mayor afinidad que al TF solo.
8. La proteína de fusión según las reivindicaciones 6 o 7, en la que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo 10 de una sola cadena, un anticuerpo dímero de Fab o un anticuerpo de IgG.
9. La proteína de fusión según la reivindicación 8, en la que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de una sola cadena. 15
10. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 6 hasta 9, en la que dicho anticuerpo monoclonal está ligado operativamente a más de un dominio de TM.
11. La proteína de fusión según una cualquiera de las 20 reivindicaciones 6 hasta 10, en la que dicho anticuerpo monoclonal neutraliza al TF.
12. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicha proteína de fusión está glicosilada, está modificada por la adición de 25 un poli(etilen glicol) o está biotinilada para la fijación de estreptavidina.
13. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuya composición comprende un 5 excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha proteína de fusión.
14. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12 para su uso en proteger contra la formación de trombos. 10
15. La proteína de fusión según la reivindicación 14, en la que la protección contra la formación de trombos se relaciona con la apoplejía isquémica, con complicaciones trombóticas después de una angioplastia o con una cirugía microvascular. 15
16. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12 para su uso en prevenir y tratar la trombosis venosa profunda (DVT), la coagulación intravascular diseminada (DIC), el síndrome coronario agudo, o un cáncer con evidencia de coagulopatía en un 20 paciente.
17. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12 para su uso en regular la respuesta inflamatoria en un paciente, en la que la respuesta inflamatoria está seleccionada del grupo que 25 consiste en sepsis, injertos de piel y venas, y trasplantes de órganos.
18. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12 para su uso en formar un recubrimiento no trombógeno sobre la superficie de un 5 dispositivo médico.
19. Un estuche que comprende la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12.
20. Un estuche que comprende unas secuencias de ADN que codifican los componentes de la proteína de fusión 10 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12.
21. Una composición para terapia génica, que comprende el ADN que codifica la proteína de fusión que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3, en combinación con una cantidad terapéuticamente 15 efectiva de un vector de terapia génica.
22. La proteína de fusión según la reivindicación 9, en que dicha proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3.

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