ES2343576T3 - Metodo para disminuir el contenido de organismos patogenos presentes en productos alimenticios. - Google Patents
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Abstract
Método para mejorar la supresión de crecimiento de patógenos tal como Listeria spp. en un producto alimenticio fermentado, dicho método comprende las fases de: (i) proporcionar un material alimenticio, (ii) mezclar el material alimenticio con un cultivo iniciador proporcionando el cambio deseado en las características de la matriz alimenticia durante la fermentación, (iii) mezclar el material alimenticio con al menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina. (iv) someter la mezcla obtenida en la fase (iii) a un proceso de fermentación, dicho proceso de fermentación siendo llevado a cabo a una temperatura que es igual a o inferior a 30ºC y caracterizado además por el hecho de que, la acidificación adicional provocada por el cultivo adjunto es 0.5 unidad de pH o inferior permitiendo al mismo tiempo una producción de bacteriocina en una cantidad suficientemente alta como para resultar en una reducción de cuentas de Listeria expresada como log cfu/g de producto fermentado que es 2 o más al final de la maduraración, y obtener el producto alimenticio fermentado.
Description
Método para disminuir el contenido de organismos
patógenos presentes en productos alimenticios.
La presente invención se refiere al campo de
mejoramiento de la seguridad microbiana en la producción de
productos alimenticios. En particular la presente invención se
refiere a cepas microbianas útiles para la reducción de la cantidad
de organismos patógenos p.ej. la Listeria cuando se añade a
productos alimenticios fermentados, tal como un producto cárnico
fermentado.
Durante la producción de productos alimenticios
fermentados, tal como p.ej. productos embutidos, más a menudo se
aplica un cultivo iniciador para controlar el proceso de
fermentación en vez de confiar en la flora de desarrollo natural.
Comúnmente, el cultivo iniciador comprende una combinación de una o
más bacterias del ácido láctico (LAB) y una o más especies de las
familias Micrococcaceae y Stafilococcaceae. Durante el
proceso de fermentación las bacterias del ácido láctico producen
principalmente ácido láctico por lo cual el pH desciende al valor de
pH deseado dependiendo del cultivo y de las condiciones de
procesamiento (temperatura, tipo/contenido de azúcar etc.) y el
producto alimenticio producido.
Mientras que las bacterias de ácido láctico son
responsables principalmente de la formación ácida, las especies
Micrococcaceae y especies Stafilococcaceae son
responsables del incremento de la formación del sabor por la
producción de compuestos no volátiles y volátiles mediante
diferentes fases de reacción bioquímica. Adicionalmente, las
Micrococcaceae spp. y Streptococcaceae spp. son
responsables de la velocidad e intensidad de formación de color, en
particular en tipos de embutidos fermentados.
Las Micrococcaceae spp. y
Streptococcoceae spp. son muy sensibles al pH bajo ya que su
crecimiento se ralentiza drásticamente cuando el pH se reduce a un
pH por debajo de 5.0. En p.ej. la fabricación de embutidos secos es
esencial para el sabor y formación de color de los productos
cárnicos que el perfil de acidificación se controle bien y que no se
altere de lote a lote. En particular, una disminución rápida del pH
puede comprometer la calidad y resultar en un perfil de sabor menos
maduro y menos complejo, que obligará al fabricante del producto
alimenticio a madurar el producto alimenticio durante un periodo de
tiempo más largo para alcanzar la misma intensidad de sabor
(Tjeneretal., 2003).
En la fabricación de productos alimenticios
fermentados la presencia de organismos patógenos como Listeria
monocytogenes puede ser un problema si las materias primas están
contaminadas. Durante la producción de p.ej. embutidos fermentados,
la Listeria monocytogenes normalmente disminuirá en números
durante la fermentación y periodo de maduración, debido, en primer
lugar a la formación de ácido láctico, el resultante descenso de pH
y debido a la reducción de actividad de agua provocada por el
proceso de secado posterior. No obstante, bastante a menudo, un
número considerable de Listeria monocytogenes sobrevive. Esto
puede causar un problema de seguridad grave ya que el consumo de
alimentos infectados puede dar lugar a infecciones listeriales
letales (listeriosis).
A fin de reducir la presencia de microorganismos
patógenos en el producto alimenticio, cierta bacteria de ácido
láctico que produce bacteriocinas incluyendo cepas de
Pediococcus y ciertas cepas de Lactobacillus, se ha
añadido al cultivo iniciador para producir bacteriocinas, algunas de
las cuales mata y/o inactiva los organismos patógenos y por
consiguiente reduce su concentración en el producto.
Foegeding et al. (1992) describen la
eficacia de la pediocina producida in situ por Pediococcus
acidilactici como componente antilistérico. No obstante, la
fermentación de embutidos se llevó a cabo a 38ºC lo que provocó una
producción extensiva de ácido y por lo tanto un descenso muy rápido
en el pH. Como se menciona anteriormente un descenso rápido del pH
compromete la calidad general del producto y resulta en un perfil
con sabor menos maduro y menos complejo. Por lo tanto, la influencia
adversa de Pediococcus acidilactici, en la calidad general
del producto resultante hace el método inadecuado para
fermentaciones de alimentos donde se aplican las condiciones y
características mencionadas anteriormente.
El modelo de utilidad BA1994 00266 describe un
cultivo iniciador bacteriano de ácido láctico que comprende un
Pediococcus spp. productora de bacteriocina, y
Lactococcus seleccionada productora de bavaricina útil para
inhibir los organismos patógenos de p.ej. Listeria en
productos cárnicos incluidos los productos embutidos
fermentados.
Evidentemente, Pediococcus spp. a menudo
no son bien calificados como cultivos iniciadores en la fabricación
de productos alimenticios aunque las especies se conocen por su
potencial para disminuir la cantidad de organismos patógenos p.ej.
Listeria.
Por lo tanto, hay una necesidad persistente en
la industria de poder disminuir la cantidad de organismos patógenos
y al mismo tiempo obtener las características óptimas del producto
alimenticio fermentado p.ej. el perfil de acidificación, sabor y
desarrollo de color.
Por consiguiente, en aspectos interesantes, se
proporcionan métodos para A) fabricar un producto alimenticio
fermentado y B) para disminuir la concentración de Listeria
spp. (en particular Listeria monocytogenes en un producto
alimenticio fermentado. Dichos métodos comprenden las fases de:
(i) proporcionar un producto alimenticio,
(ii) mezclar el producto alimenticio con un
cultivo iniciador proporcionando el cambio deseado en las
características de la matriz alimenticia durante la fermentación
(p.ej. una acidificación deseada),
(iii) mezclar el producto alimenticio con al
menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus
acidilactici productora de bacteriocina,
(iv) someter la mezcla obtenida en la fase (iii)
a un proceso de fermentación, dicho proceso de fermentación llevado
a cabo a una temperatura que es igual a o inferior a 30ºC y se
caracteriza además por el hecho de que la acidificación adicional
provocada por el cultivo adjunto es 0,5 unidad de pH o inferior
mientras que permite una producción de bacteriocina en una cantidad
suficientemente alta como para resultar en una reducción de cuentas
de Listeria expresada como Log CFU/g de producto fermentado
que es 2 o más al fin de la maduración, y obtener el producto
alimenticio fermentado.
Antes de una discusión de los aspectos
detallados y formas de realización de la invención se proporciona
una definición de los términos específicos utilizados en la
presente.
Como se utiliza en la presente, el término
"fermentación" o "fermentación alimenticia" se refiere al
proceso de cambios bioquímicos p.ej. una acidificación en material
animal y/o vegetal (es decir una matriz alimenticia), que implica la
actividad de células microbianas vivas bajo condiciones aeróbicas
y/o anaeróbicas para obtener un producto alimenticio de la calidad
deseada.
El término "cultivo adjunto" se ha de
entender como un cultivo microbiano que se puede añadir a una matriz
alimenticia y que produce un producto bacteriostático y/o
bacteriocrítico (p.ej. bacteriocinas y antibióticos) sin afectar
adversamente al perfil deseado de la fermentación de dicha matriz
alimenticia. Preferiblemente, el cultivo adjunto no afecta
adversamente el perfil de acidificación durante la fabricación del
producto alimenticio.
Se deduce que las "condiciones subóptimas para
el crecimiento" se ha de entender como las condiciones de
crecimiento que permiten que el cultivo adjunto, al añadirse a la
matriz alimenticia, se comporte como se ha descrito
anteriormente.
El término "cultivo iniciador" se refiere a
una preparación que contiene células microbianas que se destina a la
inoculación de una matriz alimenticia para someterla a la
fermentación. El cultivo iniciador se destina a proporcionar el
cambio deseado en las características de la matriz alimenticia
durante la fermentación (p.ej. una acidificación deseada).
Típicamente, un cultivo iniciador proliferará durante el proceso de
fermentación.
Un "agente bioprotector" se ha de entender
como un organismo vivo que ejerce su efecto bioprotector cuando se
añade a una matriz alimenticia sin afectar adversamente la matriz
alimenticia.
El efecto bioprotector se define como un efecto
logrado por la producción de un producto bacteriostático y/o
bacteriocrítico, mediante el cual la presencia y/o actividad de
organismos indeseados p.ej. Listeria monocytogenes se inhibe
y/o disminuye.
En el presente contexto, el término
"microorganismo" se utiliza en su significado normal. Por lo
tanto, en su significado más amplio, el término
"microorganismo" se destina a cubrir algas, protozoos, virus,
bacterias y hongos. Los microorganismos preferidos son las bacterias
y hongos, en particular bacterias, tal como la bacteria del ácido
láctico.
La expresión "Bacterias del Ácido Láctico
(LAB)" designa un grupo de bacterias Gram positivas, catalasa
negativas, no motiles, microaerofílicas o anaeróbicas que fermentan
el azúcar con la producción de ácidos incluyendo ácido láctico como
el ácido producido predominantemente, ácido acético, ácido fórmico y
ácido propiónico. Las bacterias de ácido láctico más útiles
industrialmente se encuentran entre las especies de
Lactococcus, especies de estreptococo, especies de
Enterococcus, especies de Lactobacillus, especies de
Leuconostoc, especies de Pediococcus y especies de
bifidobacterium.
Las cepas de cultivo iniciador de bacterias de
ácido láctico comúnmente utilizadas se dividen generalmente en
organismos mesofílicos que tienen temperaturas de crecimiento óptimo
a aproximadamente 30ºC y organismos termofílicos que tienen
temperaturas de crecimiento óptimo en la gama de aproximadamente 40
hasta aproximadamente 45ºC. Organismos típicos pertenecientes al
grupo mesofílico incluyen Lactococcus lactis, Lactococcus lactis.
subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroide subsp. cremoris,
Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.
diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. Lactobacillus
paracasei subsp. paracasei. Las especies bacterianas de
ácido láctico termofílico incluyen como ejemplos Streptococcus
thermophilus, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium,
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus delbrueckii. subsp. bulgaricus y
Lactobacillus acidophilus.
También las bacterias estrictas anaeróbicas
pertenecientes al género Bifidobacterium incluyendo
Bifidobacterium bifídum y Bifidobacterium longum se
utilizan comúnmente como cultivos iniciadores lácteos y se incluyen
generalmente en el grupo de bacterias del ácido láctico.
Adicionalmente, se utilizan especies de Propionibacterium
como cultivos iniciadores lácteos, en particular en la fabricación
de queso. Adicionalmente, los organismos pertenecientes al género
Brevibacterium se utilizan comúnmente como cultivos
iniciadores alimenticios.
Otro grupo de cultivos iniciadores microbianos
son los cultivos fúngicos, incluyendo cultivos de levadura y
cultivos de hongos filamentosos, que se utilizan particularmente en
la producción de determinados tipos de queso y bebidas. Ejemplos de
cultivos de hongos utilizados actualmente incluyen Penicillium
roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kéfir,
Saccharomyces kéfir y Saccharomyces cerevisiae.
En la producción y almacenamiento de productos
alimenticios fermentados un problema persistente es la contaminación
potencial del material alimenticio por organismos patógenos tal como
Listeria spp. A fin de superar este problema los inventores
de la presente invención descubrieron sorprendentemente que al
aplicar al menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus
acidilactici productora de bacteriocinas al material
alimenticio, es posible reducir la cantidad de organismos patógenos
sin influenciar el perfil de fermentación y por lo tanto la calidad
sensorial deseada del producto alimenticio. Este efecto se obtiene
al someter la Pediococcus acidilactici productora de
bacteriocinas a condiciones de fermentación que son subóptimas para
el crecimiento del Pediococcus acidilactici. Típicamente,
tales condiciones serán óptimas para el crecimiento del cultivo
iniciador y lo más sorprendentemente se descubrió que tales
condiciones permiten una alta producción de bacteriocinas por
Pediococcus acidilactici. Por consiguiente, la presente
invención permite al fabricante de alimentos seleccionar y utilizar
las recetas y condiciones de procesamiento garantizando el
desarrollo óptimo p.ej. acidificación del cultivo iniciador y a la
vez garantizar la seguridad alimentaria óptima añadiendo al cultivo
adjunto de la presente invención en cualquier punto adecuado en el
tiempo durante el proceso de fermentación.
Como se menciona anteriormente, el cultivo
iniciador y el cultivo adjunto se pueden añadir al material
alimenticio en cualquier orden. El tiempo transcurrido entre la
adición del primer cultivo iniciador y el cultivo adjunto a la
adición del segundo es de 0 segundos, p.ej. como máximo 10 segundos,
tal como como máximo 30 segundos, p.ej. como máximo 1 minuto, tal
como como máximo 5 minutos, p.ej. como máximo 10 minutos, tal como
como máximo 60 minutos, p.ej. como máximo 300 minutos, tal como como
máximo 600 minutos, p.ej. como máximo 1 día, tal como como máximo 2
días, p.ej. como máximo 3 días, tal como como máximo 4 días, p.ej.
como máximo 6 días.
En una forma de realización preferida de la
presente invención el cultivo iniciador se añade al mismo tiempo o
antes de que añadir el cultivo adjunto al material alimenticio.
La invención es exitosa para reducir y/o inhibir
la cantidad y/o actividad de cualquier organismo patógeno sensible a
las bacteriocinas producidas por Pediococcus spp., tal como
la pediocina, en particular Listeria spp. tal como
Listeria monocytogenes.
Se ha demostrado que la reducción en organismos
patógenos se puede proporcionar al mezclar el material alimenticio
que contiene los organismos patógenos con una Pediococcus
acidilactici productora de bacteriocinas. En particular, se
prefiere la cepa de Pediococcus acidilactici
B-LC-20 (DSM 10313) comercializada
por Chr.Hansen A/S bajo la marca registrada SafePro™. No obstante se
contempla que otras cepas de Pediococcus acidilactici
productoras de bacteriocinas pueden proporcionar las mismas
características y efectos ventajosos.
El efecto de la Pediococcus acidilactici
productora de bacteriocinas es más probablemente debido a la
tendencia de tales especies de Pediococcus a producir
bacteriocinas capaces de matar, inactivar y/o inhibir organismos
patógenos. Hasta ahora no se ha sabido que la capacidad de
Pediococcus acidilactici para inhibir organismos
patógenos p.ej. Listeria, no necesariamente tiene que causar un
aumento general en la acidificación cuando se añade como un cultivo
adjunto. La temperatura óptima de crecimiento para las especies de
Pediococcus tal como Pediococcus acidilactici es de
aproximadamente 40ºC o incluso más alto. No obstante, la mayoría de
cultivos iniciadores utilizados para las fermentaciones alimenticias
desarrollan óptimamente, es decir resultan en la deseada calidad
sensorial del producto, a temperaturas inferiores a 30ºC. Por lo
tanto, previamente no era siempre adecuado incluir Pediococcus
acidilactici a fin de controlar p.ej. Listeria ya que no se pudo
establecer un compromiso razonable entre las condiciones óptimas
para el iniciador frente a las condiciones óptimas para la cepa
Pediococcus. La presente invención permitirá al fabricante de
alimentos seleccionar libremente los deseados organismos de cultivo
iniciadores y realizar la fermentación alimenticia en condiciones
que son óptimas para el desarrollo deseado del producto alimenticio.
Al mismo tiempo la seguridad alimentaria se puede garantizar al
añadir el cultivo adjunto de la presente invención sin influir
adversamente en el perfil de la fermentación.
\newpage
Obviamente, cuando el experto en la materia
entiende que la producción de bacteriocinas por Pediococcus
acidilactici no está vinculada a un aumento en la actividad de
acidificación será posible probar las condiciones que favorecen la
producción de la bacteriocinas sin ninguna producción significante
de ácido. Tales condiciones, con un impacto en el crecimiento de
organismos microbianos, son bien conocidas por el experto en la
materia. Incluyen, pero de forma no limitativa, la actividad del
agua, condiciones atmosféricas, humedad relativa (RH), nutrientes
tal como la fuente de carbono, fuente de nitrógeno etc. y otros
aditivos tales como minerales, vitaminas etc.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un método para reducir la concentración de Listeria spp. en
un producto alimenticio fermentado.
En el presente contexto el término "reducir la
concentración" se refiere a una reducción en la cantidad de un
organismo patógeno. Una reducción se puede proporcionar al matar,
inactivar o inhibir la actividad del organismo patógeno. En una
forma de realización de la presente invención un 100% de los
organismos patógenos se matan, inactivan o inhiben, tal como al
menos un 90%, p.ej. al menos un 75%, tal como al menos un 50%, p.ej.
al menos un 40%, tal como al menos un 30%, p.ej. al menos un 25%,
tal como al menos un 20%, p.ej. al menos un 10%, tal como al menos
un 5%, p.ej. al menos un 1%.
En determinadas aplicaciones, una
"estabilización" de los organismos patógenos que pueden estar
presentes en la matriz alimenticia será suficiente para volver
seguro el alimento. Por lo tanto, el cultivo adjunto garantiza que
los organismos patógenos que están presentes en la matriz
alimenticia no aumenten en números.
Dicho método comprende las fases de:
(i) proporcionar un material alimenticio,
(ii) mezclar el material alimenticio con un
cultivo iniciador proporcionando el cambio deseado en las
características de la matriz alimenticia durante la fermentación
(p.ej. una acidificación deseada),
(iii) mezclar el material alimenticio con al
menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus
acidilactici productora de bacteriocinas,
(iv) someter la mezcla obtenida en la fase (iii)
a un proceso de fermentación, dicho proceso de fermentación siendo
conducido a una temperatura que es igual a o inferior a 30ºC y que
se caracteriza además por el hecho de que la acidificación adicional
provocada por el cultivo adjunto es 0,5 unidad de pH o inferior
permitiendo a la vez la producción de bacteriocinas en una cantidad
suficientemente alta como para resultar en una reducción de cuentas
de Listeria expresada como Log cfu/g de producto fermentado
que es 2 o más al final de la maduración, y obtener el producto
alimenticio fermentado.
El producto alimenticio fermentado se puede
someter a un proceso de secado simultáneamente con el proceso de
fermentación en la fase (iv) y/o después del proceso de fermentación
en la fase (iv) para obtener un producto alimenticio seco
fermentado.
Varios productos alimenticios se pueden producir
por el método según la presente invención a condición de que el
material alimenticio se fermente. Ejemplos de productos alimenticios
fermentados incluyen, pero no se limitan a productos lácteos tales
como diferentes productos de queso, producto cárnico fermentado, tal
como embutidos p.ej. embutidos untables y secos y jamón, pescado
fermentado y verduras fermentadas.
El producto alimenticio fermentado se fabrica al
proporcionar un material alimenticio que se somete a un proceso de
fermentación y opcionalmente el producto alimenticio fermentado se
somete a un proceso de secado a fin de proporcionar un producto
alimenticio fermentado seco.
A fin de reducir la concentración de organismos
patógenos, se desea que esta reducción se pueda proporcionar sin
alterar significativamente la calidad del producto alimenticio
final, es decir el fabricante de alimentos puede aplicar el cultivo
a su receta actual o preferida sin embargo sin cambiar la receta o
condiciones de procesamiento. Para obtener el efecto deseado, un
cultivo de Pediococcus acidilactici productor de
bacteriocinas se aplica a un material alimenticio como un cultivo
adjunto, que se separa del cultivo iniciador. En el presente
contexto "cultivo adjunto" es un cultivo que se añade al
material alimenticio o se une con el cultivo iniciador, pero que no
forma parte del cultivo iniciador, es decir el cultivo adjunto es un
cultivo adicional no intencionado para "producir" el producto
alimenticio fermentado, sino para suministrar una ventaja
tecnológica adicional; en este caso un efecto de muerte,
inactivación o inhibición hacia los organismos patogénicos. En el
presente contexto "cultivo adjunto" y "especies de
Pediococcus productoras de bacteriocina" se utilizan de
forma intercambiable y el cultivo adjunto se utiliza para ilustrar
adicionalmente las características específicas de la Pediococcus
acidilactici productora de bacteriocinas.
La fabricación del producto alimenticio
fermentado está siendo controlada y realizada por el cultivo
iniciador solo. El cultivo iniciador es responsable del desarrollo
de un grupo no limitativo de parámetros de calidad tal como la
acidificación, la reducción en enlace de agua y actividad del agua,
apariencia general, color, textura, olor, aroma, gusto, sabor y
otros parámetros sensoriales y tecnológicos. Por lo tanto, se
proporciona una mínima, o preferiblemente ninguna, influencia en los
parámetros de calidad del cultivo adjunto.
A fin de limitar o eliminar la influencia de la
Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas en los
parámetros de calidad, el proceso de fermentación se lleva a cabo en
condiciones subóptimas para el crecimiento de la producción de
Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas como se
ha descrito anteriormente.
En una forma de realización específica de la
presente invención el proceso opcional de secado se lleva a cabo en
condiciones que son subóptimas para el crecimiento de Pediococcus
acidilactici productora de bacteriocinas a fin de proporcionar
un efecto de acidificación limitado y permitir una alta producción
de bacteriocinas.
En el presente contexto el término
"acidificación limitada" se refiere a la influencia de al menos
un cultivo adjunto en acidificación. En una forma de realización
preferida de la presente invención la acidificación limitada
proporciona una diferencia en valor de pH provocada por el cultivo
adjunto de 0,5 unidad de pH o inferior, tal como 0,25 unidad de pH o
inferior, p.ej. 0,1 unidad de pH o inferior, tal como 0,25 unidad de
pH o inferior, p.ej. 0,075 unidad de pH o inferior, tal como 0,06
unidad de pH o inferior, p.ej. 0,05 unidad de pH o inferior, tal
como 0,04 unidad de pH o inferior, p.ej. 0,03 unidad de pH o
inferior, tal como 0,02 unidad de pH o inferior, p.ej. 0,01 unidad
de pH o inferior.
En una forma de realización preferida de la
presente invención las condiciones de crecimiento subóptimas se
proporcionan cambiando la temperatura.
A fin de proporcionar condiciones de crecimiento
subóptimas respecto al cultivo adjunto durante el proceso de
fermentación, la temperatura en el proceso de fermentación es igual
a o inferior a 30ºC, tal como igual a o inferior a 28ºC, p.ej. igual
a o inferior a 26ºC, tal como igual a o inferior a 24ºC.
A fin de proporcionar condiciones de crecimiento
subóptimas durante el proceso de secado respecto al cultivo adjunto,
la temperatura en el proceso de secado es igual a o inferior a 30ºC,
tal como igual a o inferior a 25ºC, p.ej. igual a o inferior a 20ºC,
tal como igual a o inferior a 15ºC, tal como igual a o inferior a
10ºC, p.ej. igual a o inferior a 5ºC.
Cuando se mezcla el cultivo adjunto con el
material alimenticio que bien comprende el cultivo iniciador o que
posteriormente se mezcla con un cultivo iniciador, la concentración
del al menos un cultivo adjunto aumenta el nivel de inoculación de
las bacterias de ácido láctico totales como máximo 1000 veces, p.ej.
como máximo 500 veces, tal como como máximo 100 veces, p.ej. como
máximo 50 veces, tal como como máximo 10 veces, p.ej. como máximo 8
veces, tal como como máximo 5 veces, p.ej. como máximo 4 veces, tal
como como máximo 3 veces, p.ej. como máximo 2 veces.
En una forma de realización preferida de la
presente invención al menos un cultivo adjunto se añade en una
concentración en la gama de 10^{2} -10^{10} CFU/g de producto,
p.ej. en la gama de 10^{2}-10^{9} CFU/g de
producto, tal como en la gama de 10^{3} -10^{9} CFU/g de
producto, p.ej. en la gama de 10^{4}-10^{9}
CFU/g de producto, tal como en la gama de
10^{2}-10^{8} CFU/g de producto, p.ej. en la
gama de 10^{2}-10^{7} CFU/g de producto, tal
como en la gama de 10^{3}-10^{7} CFU/g de
producto, p.ej. en la gama de 10^{4}-10^{7}
CFU/g de producto, tal como en la gama de
10^{5}-10^{7} CFU/g de producto, p.ej. en la
gama de 10^{8}-10^{7} CFU/g de producto tal como
en la gama de 10^{3}-10^{6} CFU/g de producto,
p.ej. en la gama de 10^{3}-10^{5} CFU/g de
producto, tal como en la gama de 10^{2}-10^{4}
CFU/g de producto.
En la forma de realización actualmente preferida
de la invención, el cultivo adjunto se añade en una gama de 5 x
10^{6} - 9 x 10^{7} CFU/g de producto.
En una forma de realización preferida de la
presente invención el material alimenticio y/o el producto
alimenticio seco fermentado se analiza por contenido de organismos
patógenos. Si el contenido de los organismos excede un
predeterminado nivel aceptable el cultivo adjunto se puede añadir al
material alimenticio a fin de matar, inactivar o inhibir los
organismos patógenos.
En el caso de que el material alimenticio se
analiza por contenido de organismos patógenos y que se establece que
el contenido excede un nivel predeterminado aceptable, el cultivo
adjunto se puede añadir directamente al material alimenticio para
matar, inactivar o inhibir los organismos patógenos.
En el caso que el producto alimenticio
fermentado seco se analice por contenido de organismos patógenos y
se establezca que el contenido excede un nivel predeterminado
aceptable, los lotes de materiales alimenticios producidos
posteriormente se mezclan con el cultivo adjunto para matar,
inactivar o inhibir los organismos patógenos.
Bajo las condiciones del método de la invención
la Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas se
puede añadir a una fermentación alimenticia sin afectar adversamente
al perfil de la fermentación. Por lo tanto, las especies se pueden
utilizar como cultivos adjuntos para garantizar la seguridad
microbiana del producto alimenticio fermentado.
Naturalmente, las características utilizadas
para describir el método de la invención también se aplicarán cuando
la cepa se utilice como un cultivo adjunto como se ha descrito
anteriormente.
En formas de realización específicas, el cultivo
adjunto se proporciona en un paquete adecuado. Tales paquetes pueden
ser p.ej. una bolsa, un tetra-Pak, una lata y
cualquier otro medio adecuado descrito en la técnica para contener
especies microbianas.
Preferiblemente, el paquete o material
correspondiente de marketing dispone de instrucciones que indican
las condiciones de fermentación que son subóptimas para el
crecimiento de la Pediococcus acidilactici productora de
bacteriocina.
Además, el cultivo adjunto se puede proporcionar
en cualquier forma adecuada p.ej. en una forma congelada o
liofilizada.
En una forma de realización preferida el cultivo
adjunto es una preparación liofilizada de
B-LC-20 (DSM 10313) proporcionada
por Chr.Hansen A/S bajo la marca registrada SafePro™
La cepa aislada es útil para los objetivos de la
invención que se describen en la presente. Adicionalmente, se
contempla que la Pediococcus acidilactici productora de
bacteriocina se puede utilizar como un agente bioprotector para
mejorar la seguridad de todos los productos alimenticios.
Aunque, la invención se centra en la aplicación
del cultivo adjunto durante una fermentación alimenticia, está
dentro del ámbito de aplicación de la presente invención que el
cultivo adjunto se puede añadir a una matriz alimenticia que no se
somete a un proceso de fermentación.
Una muestra de la cepa se ha depositado según el
tratado de Budapest en el International Recognition of the Deposit
of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure. El depósito
se hizo el 24 de Octubre de 1995 bajo el número de acceso DSM
10313.
La invención se ilustra además en los siguientes
ejemplos, no limitativos y en los dibujos, donde
La Fig 1. A y B ilustran el desarrollo del pH
durante la maduración de embutidos aplicados con o sin
B-LC-20 junto con un cultivo
iniciador Chr. Hansen Bactoferm™ de fermentación rápida. Los
embutidos se fermentaron a 24- 20ºC durante 3 días, seguido de la
maduración a entre 18 a 16ºC durante 11 días, y
Fig 2. A y B ilustran el desarrollo del pH
durante la maduración de embutidos aplicados con o sin
BLC-20 junto con un cultivo iniciador Chr. Hansen
Bactoferm™ de fermentación tradicional. Los embutidos se fermentaron
a 24-20ºC durante 4 días, seguido de la maduración
a entre 18 a 14ºC durante 17 días.
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Se demuestra la influencia del cultivo adjunto
en la acidificación y un resumen de los perfiles encontrados de
pH/tiempo al aplicar B-LC-20 a la
carne picada para embutidos. La Tabla 1 muestra el desarrollo del pH
durante el periodo de fermentación como se determinó cada segundo
día y la Tabla 2 muestra el desarrollo del pH como se determinó
continuamente desde las 0 a 68 horas.
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Los resultados muestran que no hay ninguna
influencia significante en el pH final en cuanto a la adición del
cultivo adjunto en forma de B-LC-20
junto con el cultivo de control como comparación con la adición del
cultivo de control solo. B-LC-20 se
añadió en una concentración de 1.1 x 10^{7} CFU/g de carne picada
para embutidos. Se añadió el cultivo de control en una concentración
de bacterias de ácido láctico total de 3.3 x 10^{6} CFU/g.
Se demuestra que hay una ligera influencia de
B-LC-20 durante las primeras
20-60 horas, pero la diferencia máxima entre las dos
curvas es de 0.06 unidad de pH que está bien dentro de la variación
normal encontrada entre lote y lote en producciones de embutidos
reales.
El cultivo iniciador del control consiste en una
mezcla de lactobacilli, pediococci, micrococci y staphylococci.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron dos ensayos independientes para
evaluar el comportamiento de Listeria en embutidos a lo largo del
proceso de maduración. Se fabricaron tres lotes en cada ensayo. Uno
con el cultivo iniciador de control no activo contra la Listeria y
dos lotes con el cultivo iniciador de control junto con un cultivo
iniciador antilisteria añadido en dos concentraciones diferentes
(B-LC-20, Chr. Hansen A/S). Cada
lote se inoculó con un cóctel de cinco cepas de Listeria
monocytogenes (aproximadamente 10^{3} CFU/g) en el momento de
la fabricación.
La maduración se hizo en una cámara de prueba en
un entorno adaptado versátil de modelo Sanyo
MLR-350H, con un periodo de fermentación durante 72h
a 14ºC con 80%RH.
En los tiempos seleccionados se tomaron muestras
de tres embutidos de cada lote para determinar las cuentas de
bacterias de Listeria y ácido láctico, pH y pérdida de peso.
El comportamiento de Listeria fue similar en
ambos ensayos, mostrando diferencias importantes entre el lote de
control (A) y el lote al que se le añadieron los cultivos con
contenido de antilisteria (B y C) donde la Listeria disminuyó 2 log
cfu/g (ensayo 1) y 3 log cfu/g en el ensayo 2. No se observó ninguna
diferencia significante en las cuentas de Listeria entre los lotes B
y C. En conclusión el mencionado resultado señala que el cultivo
bacteriano B-LC-20 resultó ser un
cultivo adecuado para los embutidos fabricados según la presente
formulación, mostrando una reducción adicional de Listeria después
del periodo de fermentación y hasta el final de la maduraración en
comparación con el cultivo iniciador de control solo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una prueba de estimulación de Listeria en
embutidos secos a lo largo del proceso de maduración se diseñó según
el siguiente protocolo. Dos ensayos independientes (ensayo 1 y
ensayo 2) se realizaron en el Institut de Recerca I Tecnología
Agroalimentáries (IRTA), de Monells, España. Se evaluó la actividad
anti-Listeria del cultivo de bacterias del ácido
lático B-LC-20 en dos
concentraciones diferentes.
El cultivo anti-listeria
B-LC-20 de Chr. Hansen y el cultivo
iniciador de control se almacenaron liofilizados (-20ºC) hasta su
uso.
Listeria monocytogenes: dos cepas fueron
de la colección de la cepa de IRTA, es decir, la cepa CTC1011 y
CTC1034; y tres cepas fueron suministradas por Chr. Hansen (P01,
P05, P15). Cada cepa se crió por separado en el medio estándar IRTA
"TSBYE" y se almacenó liofilizada (-20ºC). Se determinaron
cuentas viables antes de cada prueba a fin de calcular la dilución
apropiada para alcanzar la inoculación esperada en la mezcla de
carne (aproximadamente 10^{3} CFU/g).
Se fabricaron tres lotes (de 12 Kg cada
uno).
Lote A de control (cultivo iniciador) + cóctel
de Listeria monocytogenes
Lote B de control (cultivo iniciador) +
B-LC-20 concentración baja
Lote C de control (cultivo iniciador) +
B-LC-20 concentración alta
Los cultivos bacterianos se añadieron por
separado en el momento de la mezcla. Primero se añadió el cóctel de
L. monocitogenes (en 20 ml de solución salina), seguido del
cultivo iniciador y el cultivo adjunto.
La fermentación y secado de los embutidos se
hizo en una cámara de ensayo en ambiente versátil adaptado del
modelo Sanyo MLR-350H.
La fermentación se llevó a cabo durante 72h a
24ºC con RH >90%.
Después del periodo de fermentación las
condiciones se ajustaron para el secado hasta el día 29 a 14ºC con
el 80% de RH.
Durante la fermentación y secado, se midió el pH
y pérdida de peso en 3 embutidos marcados por lote, diariamente
durante la primera semana y con un intervalo de 3-4
días durante las últimas 3 semanas.
Tres embutidos diferentes de cada lote (A, B, C)
se analizaron a cada tiempo de muestreo (días: cero (después de 4
horas), 2, 7, 14 y 29). Cada muestra consistía en 25 gramos de un
embutido previamente homogenizado.
La determinación de Listeria se hizo a
cada tiempo de muestreo, excepto el día 0, por la Técnica del Número
más probable (MPN) en caldo base "Fraser" (Oxoid) + suplemento
selectivo Half Fraser (Oxoid) (48 horas, a 37ºC) seguido de la
confirmación de tubos positivos en Base de Agar selectiva Palcam
para Listeria (Merck) + Suplemento selectivo según Van Netten et
al. (Merck) (48 horas, a 37ºC).
Las cuentas de Listeria en el tiempo cero
se hicieron por extendiendo las apropiadas diluciones en placas de
agar Palcam suplementadas e incubando a 37ºC durante 72 horas. Las
cuentas de bacterias del ácido lático se realizaron a cada tiempo de
muestreo en MRS Agar. (72 horas a 30ºC bajo condiciones
anaeróbicas).
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los lotes se inocularon de la siguiente
manera:
Lote A (cultivo iniciador de control, 3.0 x
10^{6} CFU/g), lote B (cultivo iniciador de control +
B-LC-20 de concentración baja (2.9 X
10^{7} CFU/g de carne picada), lote C (cultivo iniciador de
control + B-LC-20 de concentración
alta (5.6 x 10^{7} CFU/g de carne picada). Todos los lotes se
inocularon con un cóctel de 5 cepas diferentes de Listeria
monocytogenes (CTC1011, CTC1034; P01; P05, P15).
\vskip1.000000\baselineskip
Los lotes se inocularon de la siguiente
manera:
Lote A (cultivo iniciador de control, 2.6 x
10^{6} CFU/g), lote B (cultivo iniciador de control +
B-LC-20 de concentración baja (1.5 x
10^{7} CFU/g), lote C (cultivo iniciador de control +
B-LC-20 concentración alta (5.9 x
10^{7} CFU/g).
Todos los lotes se inocularon con un cóctel de 5
cepas diferentes de Listeria monocytogenes (CTC1011, CTC1034;
P01; P05, P15).
Se realizaron dos ensayos independientes para
valorar el comportamiento de Listeria en embutidos a lo largo del
proceso de maduración. Se fabricaron tres lotes en cada prueba. Un
control con cultivo iniciador no activo contra Listeria y dos lotes
con el mismo cultivo iniciador más un cultivo adjunto antilisteria
añadido a dos concentraciones diferentes (B-LC- 20)
en cada lote. Cada lote se inoculó con un cóctel de cinco cepas de
Listeria monocytogenes (aprox. 1 03 cfu/g) en el momento de
la fabricación.
En ambos ensayos y después de 2 días de
fermentación la Listeria disminuyó. Las cuentas en el lote B
y C fueron inferiores que en el lote A. Estas diferencias entre el
lote de control A y los lotes inoculados con los cultivos
antilisteriales aumentaron hasta el fin de la maduraración. En el
ensayo 1, al final de la maduración, la Listeria disminuyó 1
Log cfu/g en el lote A mientras que en el lote B y C la
Listeria se redujo más de 2 Log cfu/g. En el ensayo 2 al
final de la maduración la Listeria disminuyó 1.8 (Log cfu/g)
en el lote A, y más de 3 Logs en el lote B y C.
Las cuentas de bacterias del ácido láctico
alcanzaron el máximo después de 2 días de fermentación con valores
similares al final del proceso en cada lote (alrededor de 108 cfu/g)
en ambos ensayos. La curva de pH fue similar para los diferentes
lotes en ambos ensayos. El pH mínimo se registró después de 4 días
en el ensayo 1 y después de 3 días en el ensayo 2 a pesar de que el
pH en el tiempo cero era más alto en el ensayo 2. La caída de pH en
los lotes de control fue similar en ambos ensayos a la caída de pH
en el lote con el cultivo adjunto añadido. \DeltapH fue de entre
1.22 - 1.24 en el lote A después de 3-4 días de
fermentación, y entre 1.26 - 1.34 en los lotes B y C. Las pequeñas
diferencias fueron provocadas probablemente por la glucosa extra
añadida con la bolsa de cultivo adjunto. La pérdida de peso mostró
un perfil similar en ambos ensayos sin diferencias entre los
lotes.
El cultivo
B-LC-20 demostró ser un cultivo
adjunto protector adecuado para embutidos fermentados fabricados
según la presente formulación, mostrando una reducción adicional de
Listeria después del periodo de fermentación y hasta el fin
de la maduración, en comparación con un cultivo iniciador de control
solo.
En general, la adición de inoculo extra de
bacterias de ácido láctico reduce el tiempo para el comienzo de la
fermentación (la fase de latencia) y de ese modo acelera el ritmo de
la acidificación en general. Al aumentar el inoculo por 10 veces (de
5-10^{5} a 5-10^{6} CFU/g) la
fase de latencia de acidificación para un embutido fermentado de
tipo noreuropeo típico se redujo a la mitad y el tiempo para
alcanzar un pH de 5.3 y 4.9 se redujo un 25 y 30%,
respectivamente.
La adición de
B-LC-20 a la receta de embutidos en
el Ejemplo 2, ensayo 1 dio lugar a un nivel de inoculación aumentada
de bacterias del ácido láctico total de aprox. 15 veces, de
3\cdot10^{6} a entre
3\cdot10^{7}-6\cdot10^{7}. Se esperaba que
la fase de latencia se redujese considerablemente y el tiempo para
alcanzar pH 4.9 se redujese al menos un 30%. Esta reducción esperada
no tuvo lugar, el pH alcanzó 4.9 después de 2 días para los tres
lotes, es decir la adición de un cultivo adjunto tal como
B-LC-20 a la receta existente no
aceleró el tiempo de acidificación como se esperaba. En el ejemplo
1, la velocidad de acidificación de la tabla 1 y 2 no aumentó
significativamente tampoco.
Por lo tanto, los inventores de la presente
invención descubrieron sorprendentemente que el uso de un cultivo
adjunto tal como B-LC-20 proporciona
una reducción anti-listerial única para embutidos
fermentados ya que se descubrió que Pediococcus acidilactici
es un productor fuerte de pediocina (que destruye Listeria
monocytogenes) a temperaturas de fermentación europea (<26ºC)
aunque no es un acidificador fuerte a esta temperatura.
La reducción de Listeria es provocada
principalmente por la pediocina producida por un cultivo adjunto tal
como B-LC-20 en el material
alimenticio durante la fermentación y proceso de secado. El efecto
de pediocina es un fenómeno bien conocido en la bibliografía. No
obstante, la singularidad del cultivo adjunto
(B-LC-20) y el método aquí descrito
es que el fabricante de alimentos puede utilizar el cultivo adjunto
junto con el cultivo de acidificación normal ya que no altera el
perfil general de la acidificación y la calidad del producto
significativamente. Como se menciona anteriormente, el perfil de
acidificación es de máxima importancia para la calidad sensorial.
Por lo tanto, el fabricante no necesita cambiar su receta actual o
condiciones de procesamiento, pero obtendrá la ventaja de reducción
en números de Listeria.
La influencia del cultivo adjunto
B-LC-20 en el perfil de
acidificación de cuatro tipos de embutidos fermentados con cultivos
iniciadores diferentes se demuestran en las Figuras 1 y 2. En todos
los casos, la adición del cultivo adjunto en la carne picada para
embutidos junto con el cultivo iniciador no influenció el perfil de
acidificación de los embutidos significativamente. Además,
evaluaciones internas sensoriales mostraron que la calidad sensorial
de los embutidos se mantuvo sin cambios por la adición de
B-LC-20.
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\vskip1.000000\baselineskip
\sqbulletFoegeding, P.M.
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Enhanced control of Listeria monocytogenes by in
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no. 3. 884-890 [0092]
\sqbulletTjener, K. Stahnke, L.
H. Andersen, L. Martinussen, J. A fermented meat model
system for studies of microbial aroma formation Meat Science,
2003, vol. 66, no. 1. 211-218 [0092]
Claims (13)
1. Método para mejorar la supresión de
crecimiento de patógenos tal como Listeria spp. en un producto
alimenticio fermentado, dicho método comprende las fases de:
(i) proporcionar un material alimenticio,
(ii) mezclar el material alimenticio con un
cultivo iniciador proporcionando el cambio deseado en las
características de la matriz alimenticia durante la
fermentación,
(iii) mezclar el material alimenticio con al
menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus
acidilactici productora de bacteriocina.
(iv) someter la mezcla obtenida en la fase (iii)
a un proceso de fermentación, dicho proceso de fermentación siendo
llevado a cabo a una temperatura que es igual a o inferior a 30ºC y
caracterizado además por el hecho de que, la acidificación
adicional provocada por el cultivo adjunto es 0.5 unidad de pH o
inferior permitiendo al mismo tiempo una producción de bacteriocina
en una cantidad suficientemente alta como para resultar en una
reducción de cuentas de Listeria expresada como log cfu/g de
producto fermentado que es 2 o más al final de la maduraración, y
obtener el producto alimenticio fermentado.
2. Método según la reivindicación 1, en donde el
proceso de fermentación se está llevando a cabo a una temperatura
igual a o inferior a 25ºC.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde
el producto alimenticio fermentado se somete a un proceso de secado
simultáneamente con el proceso de fermentación en la fase (iv) y/o
después del proceso de fermentación en la fase (iv) para obtener un
producto alimenticio fermentado seco.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la diferencia máxima en valor
de pH provocado por la adición de al menos un cultivo adjunto es
0.25 unidad de pH o menos.
5. Método según la reivindicación 4, en donde la
temperatura en el proceso de fermentación es igual a o inferior a
28ºC.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la adición de al menos un
cultivo adjunto aumenta el nivel de inoculación de bacterias de
ácido láctico totales al menos 1000 veces.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde al menos un cultivo adjunto
se añade en una concentración en la gama de 10^{2} -10^{10}
CFU/g de producto.
8. Método según la reivindicación 7, en donde el
al menos un cultivo adjunto se añade en una concentración de 2 x
10^{7} CFU/g de producto.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el producto alimenticio
fermentado se selecciona del grupo que consiste de productos lácteos
fermentados.
10. Uso de una cepa de Pediococcus
acidilactici productora de bacteriocina como cultivo adjunto
para la supresión de Listeria spp. en un producto alimenticio
fermentado, en donde dicho cultivo, cuando se añade a un proceso de
fermentación de alimentos, se está sometiendo a una temperatura
igual a o inferior a 30ºC, produciendo así bacteriocina mientras
afecta el perfil de acidificación de la fermentación de 0.5 unidad
de pH o menos.
11. Uso según la reivindicación 10, en donde la
cepa Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina es
la cepa Pediococcus acidilactici DSM 10313.
12. Uso según la reivindicación 10 u 11, en
donde la condición que es subóptima para el crecimiento es una
temperatura igual a o inferior a 26ºC.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
10 -13, en donde el cultivo adjunto es una preparación liofilizada
de DSM 10313 proporcionada por Chr. Hansen A/S bajo la marca
SafePro.
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