ES2283403T3 - Regulacion de la proteina similar al receptor de la lipoxina a4 humana. - Google Patents
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Abstract
El uso de un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2; (ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2 en la selección de los compuestos útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios, en el que se pone en contacto un compuesto de ensayo con el polipéptido, se mide el enlace del compuesto de ensayo con el polipéptido y se selecciona un compuesto de ensayo que enlaza con el polipéptido como un compuesto útil en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios.
Description
Regulación de la proteína similar al receptor de
la lipoxina A_{4} humana.
La invención se refiere al área de los
receptores acoplados a la proteína G. De manera más particular, se
refiere al área de las proteínas similares al receptor de la
lipoxina A_{4} y a su uso en la selección de fármacos en el campo
de las enfermedades inflamatorias.
Muchos procesos biológicos médicamente
significativos están mediados por las rutas de transducción de la
señal que implican a las proteínas G (Lefkowitz, Nature 351,
353-354, 1991). La familia de los receptores
acoplados a la proteína G (GPCR) incluye receptores para las
hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, y virus. Los
ejemplos específicos de GPCR incluyen los receptores para dichos
diversos agentes tales como dopamina, calcitonina, hormonas
adrenérgicas, endotelina, AMPc, adenosina, acetilcolina, serotonina,
histamina, trombina, cinina, hormona estimulante del folículo,
opsinas, gen-1 de la diferenciación endotelial,
rodopsinas, odorizantes, citomegalovirus, las propias proteínas G,
proteínas efectoras tales como fosfolipasa C, adenil ciclasa, y
fosfodiesterasa, y proteínas accionadoras tales como la proteína
quinasa A y proteína quinasa C.
Los GPRC poseen siete regiones conservadas de
expansión de la membrana que conectan al menos ocho bucles
hidrófilos divergentes. Se han caracterizado los GPRC (conocidos
también como receptores 7TM) como incluyendo estas siete
extensiones hidrófobas conservadas de aproximadamente 20 a 30
aminoácidos, que conectan al menos ocho bucles hidrófilos
divergentes. La mayor parte de los GPRC tienen residuos con una
única cisteína conservada en cada uno de los primeros dos bucles
extracelulares, que forman enlaces disulfuro que se piensa que
estabilizan la estructura funcional de la proteína. Se designaron
estas siete regiones transmembrana como TM1, TM2, TM3, TM4, TM5,
TM6, y TM7. Se ha implicado a TM3 en la transducción de la
señal.
La fosforilación y lipidación (palmitilación o
farnesilación) de los residuos de cisteína puede tener influencia
sobre la transducción de la señal de algunos GPCR. La mayor parte de
los GPCR contienen emplazamientos potenciales de fosforilación
dentro del tercer bucle citoplásmico y/o el término carboxilo. Para
diversos GPRC, tales como el receptor
\beta-adrenérgico, la fosforilación mediante la
protein quinasa A y/o las quinasas específicas del receptor media
la insensibilización del receptor.
Para algunos receptores, se cree que los
emplazamientos de enlace del ligando de los GPRC comprenden
manguitos hidrófilos formados por varias regiones GPRC
transmembrana. Estos manguitos hidrófilos están rodeados por
residuos hidrófobos de los GPRC. Se piensa que el lado hidrófilo de
cada hélice GPRC transmembrana está orientado hacia el interior, y
forma un emplazamiento de enlace del ligando polar. Se ha implicado
a TM3 en diversos GPRC que tienen un emplazamiento de enlace del
ligando, tal como el residuo aspartato del TM3. Las serinas de TM5,
una asparagina de TM6, y las fenilalaninas o tirosinas de TM6 o TM7
están también implicadas en el enlace del ligando.
Los GPRC se acoplan en el interior de la célula
mediante proteínas G heterotriméricas a diversos enzimas, canales
iónicos, y transportadores intracelulares (véase Johnson y
col., Endoc. Rev. 10, 317-331, 1989). Las
diferentes subunidades alfa de la proteína G estimulan efectores
concretos para modular las diversas funciones biológicas de una
célula. La fosforilación de los residuos citoplásmicos de los GPRC
es un mecanismo importante para la regulación de algunos GPRC. Por
ejemplo, en una forma de transducción de la señal, el efecto del
enlace de la hormona es la activación del enzima, adenilato
ciclasa, en el interior de la célula. La activación del enzima
mediante las hormonas es dependiente de la presencia del nucleótido
GTP. GTP tiene influencia también sobre el enlace de la hormona.
Una proteína G conecta el receptor de la hormona a la adenilato
ciclasa. La proteína G intercambia GTP para enlazar GDP cuando se
activa mediante un receptor de la hormona. La forma transportadora
de GTP se enlaza a continuación con la adenilato ciclasa activada.
La hidrólisis de GTP a GDP, catalizada por la propia proteína G,
devuelve la proteína G a su forma basal inactiva. De esta manera, la
proteína G tiene un doble papel, como un intermedio que retransmite
la señal desde el receptor al efector, y como un reloj que controla
la duración de la señal.
En los pasados 15 años se han introducido
satisfactoriamente en el mercado cerca de 350 agentes terapéuticos
que hacen diana en los receptores 7TM. Esto indica que estos
receptores tienen un historial establecido y probado como dianas
terapéuticas. De manera clara, existe necesidad de identificación y
caracterización de otros receptores que puedan jugar un papel en la
prevención, mejoramiento, o corrección de disfunciones o
enfermedades entre las que se incluyen, pero no se limitan a,
infecciones tales como las infecciones bacterianas, fúngicas,
protozoarias, y víricas, de manera particular aquellas producidas
por los virus VIH, dolor, cánceres, anorexia, bulimia, asma,
enfermedades de Parkinson, fracaso agudo del corazón, hipotensión,
hipertensión, retención urinaria, osteoporosis, angina de pecho,
infarto de miocardio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia
prostática benigna, y transtornos psicóticos y neurológicos que
incluyen ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, delirio,
demencia, algunos retrasos mentales, y disquinesias, tales como
enfermedad de Huntington y síndrome de Tourett.
Las lipoxinas (productos de interacción con la
lipoxigenasa) son una nueva serie de metabolitos derivados del
ácido araquidónico (Serhan y col., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 18, 943-949 (1984); Serhan y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
5335-5339, 1984). La característica distintiva de
una lipoxina es la presencia de una estructura de tetraeno
conjugada con trihidroxilo. Se han caracterizado al menos dos
lipoxinas biológicamente activas: la lipoxina A_{4} [ácido
(5S,6R,15S)-5,6,15-trihidroxi-7,9,13-trans-11-cis-eicosa-tetraenoico]
y la lipoxina B_{4} [ácido
(5S,14R,15S)-5,14,15-trihidroxi-6,10,12-trans-8-cis-eicosatetraenoico]
(Serhan. y col., J. Biol. Chem. 261,
16340-16345; Serhan y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 83, 1983-1987, 1986).
Se ha demostrado que la lipoxina A_{4} contrae
el músculo liso pulmonar (pulmón de cobaya), pero no el íleo o la
tráquea de cobaya, y relaja (dilata) el músculo liso pulmonar a
concentraciones de menos de 1 \muM (Dahlen y col., Acta
Physiol. Scand. 130, 643-647, 1987). La
administración tópica de la lipoxina A_{4} en la bolsa de la
quijada del hámster induce una pronunciada dilatación arteriolar,
pero no cambia los diámetros venulares (Dahlen y col., en
ADV. EXPER. MED. BIOL. 229, Capítulo 9, pp. 107-130,
1988). Se ha demostrado también que la lipoxina A_{4} induce los
neutrófilos para generar radicales superóxido, liberación de la
elastasa, y promueve la quimiotaxis por los leucocitos (Serhan y
col., en PROSTAGLANDINS, LEUKOTRIENES AND LIPOXINS, J. M.
Bailey, ed., Plenum, N. Y., pp. 3-16, 1985).
Se ha sugerido el uso de la lipoxina A_{4}
para inducir la respuesta inflamatoria de los neutrófilos con el
fin de proporcionar un modelo experimental para evaluar la eficacia
de compuestos tales con los derivados de la lipoxina B_{4} en la
prevención de esta respuesta (Samuelsson y col., Patente de
Los Estados Unidos 4.560.514): Se ha sugerido también que la
lipoxina A_{4} puede ejercer algunos de sus efectos biológicos
mediante el enlace con el receptor de la lipoxina D_{4} (Jacques
y col., Br. J. Pharmacol. 95, 562-568,
1988), y que la lipoxina A_{4} y LTD_{4} pueden incluso
compartir un receptor común (Lefer y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85, 8340-8344, 1988).
Los estudios en neutrófilos humanos han
establecido una relación inversa entre la generación de lipoxinas y
leucotrienos tras la exposición de estas células al
15-HETE y al ionóforo de calcio A23187 (Serhan, en
ADVANCES IN PROSTAGLANDIN, THROMBOXANE AND LEUKOTRIENE RESEARCH, B.
Samuelsson y col., eds., Raven Press, N. Y., Volumen 18). De
manera adicional, resultados recientes indican que las células
mesengiales pueden generar lipoxinas a partir de fuentes endógenas
de LT_{4} (Garrick y col., Kidney Int. Proceedings 21st
Annual Meeting of the American Society of Nephrology, Vol. 25, p.
292, 1989), que se pueden proporcionar mediante leucocitos
activados (por ejemplo, durante el metabolismo transcelular). De
esta manera, los niveles locales de estos compuestos pueden ser
elevados tras la infiltración de los leucocitos en los
glomérulos.
Una forma de realización de la invención es un
procedimiento de selección de agentes que puedan regular la
actividad de un polipéptido similar al receptor A_{4}. Se pone en
contacto un compuesto de ensayo con el polipéptido similar al
receptor A_{4} que comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada entre el grupo constituido por secuencias de
aminoácidos que son al menos un 30% idénticas a la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº. 2 y la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº. 2. Se detecta el
enlace del compuesto de ensayo con el polipéptido. Se identifica por
tanto un compuesto de ensayo que enlaza con el polipéptido como
agente potencial para la actividad reguladora de un polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} útil en el tratamiento
de una enfermedad asociada con los procesos inflamatorios.
Otra forma de realización de la invención es un
procedimiento de selección de agentes útiles en el tratamiento de
una enfermedad asociada con procesos inflamatorios que reduce la
actividad de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}. Se pone en contacto, o se incuba, un compuesto de ensayo
con una célula biológica, en la que la célula biológica es una
célula-T y/o ha sido transformada con un
polinucleótido, en el que el polinucleótido comprende una secuencia
de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las
secuencias de nucleótidos que se hibridan bajo condiciones de
restricción con la secuencia de nucleótidos que se muestra en la
SEC DE ID Nº 1 y la secuencia de nucleótidos que se muestra en la
SEC DE ID Nº 1. Se detecta el enlace del compuesto de ensayo con el
polinucleótido. Se identifica un compuesto de ensayo que enlaza con
el polinucleótido como un agente potencial para reducir la
actividad de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}. El agente puede trabajar disminuyendo la cantidad del
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante la
interacción con el ARNm similar al receptor de la lipoxina
A_{4}.
La Fig. 1 muestra la secuencia de ADN que
codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}.
La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de
un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.
La invención se refiere al uso, tal como se
define mediante las reivindicaciones, de un polinucleótido aislado
que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} y que se selecciona entre el grupo constituido por:
- a)
- un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEC DE ID Nº 1;
- b)
- un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de restricción con un polinucleótido especificado en (a),
- c)
- un polinucleótido, que comprende un polinucleótido tal como se ha definido en a) o b).
También se puede usar un polipéptido similar al
receptor de la lipoxina humana en la selección de agonistas o
antagonistas del receptor similar al de la lipoxina A_{4} útiles
en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos
inflamatorios.
Se muestra en la SEC DE ID Nº 2 la secuencia
de aminoácidos del polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} útil para la invención y definida mediante las
reivindicaciones o es al menos un 30% idéntica con la SEC DE ID Nº:
2. Se muestra en la SEC DE ID Nº 1 una secuencia de nucleótidos que
codifica la SEC DE ID Nº 2, con los codones de inicio y parada
indicados.
Los polipéptidos similares al receptor de la
lipoxina A_{4} útiles para la invención tal como se definen
mediante las reivindicaciones comprenden la secuencia de aminoácidos
que se muestra en la SEC DE ID Nº 2 o son idénticos en al menos
un 30% a la SEC DE ID Nº. 2. Un polipéptido similar al receptor de
la lipoxina A_{4} de la invención puede ser por tanto una porción
de una molécula similar al receptor de la lipoxina A_{4}, una
molécula de longitud completa similar al receptor de la lipoxina
A_{4}, o una proteína de fusión que comprende toda o una porción
de de una molécula similar al receptor de la lipoxina A_{4}.
De manera preferible, un polipéptido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} enlaza con la lipoxina A_{4} o un
análogo de la lipoxina A_{4}. Se puede determinar el enlace tal
como se describe, por ejemplo, en los ejemplos específicos a
continuación.
Las variantes del polipéptido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} que son biológicamente activas,
es decir, retienen la capacidad de enlazar la lipoxina
A_{4} o un análogo de la lipoxina A_{4}, y/o que media un
efecto biológico, tal como la formación de AMP cíclico, la
movilización de calcio intracelular o el metabolismo del
fosfoinositido, también son polipéptidos similares al receptor de la
lipoxina A_{4.} Se determina el porcentaje de identidad entre una
variante de polipéptido pretendido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} y una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº.
2 usando el programa de alineación Blast2.
Las variaciones en el porcentaje de identidad
pueden ser debidas, por ejemplo, a las sustituciones, inserciones,
o delecciones de aminoácidos. Se definen las sustituciones de
aminoácidos como un reemplazo de un aminoácido. Son de naturaleza
conservativa cuando el aminoácido sustituido tiene propiedades
estructurales y/o químicas similares. Los ejemplos de sustituciones
conservativas son la sustitución de una leucina con una isoleucina
o valina, un aspartato con glutamato, o una treonina con una
serina.
Las inserciones o delecciones de aminoácidos son
cambios en o dentro de una secuencia de aminoácidos. Están
comprendidas normalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5
aminoácidos. Se puede encontrar la directriz para la determinación
de qué residuos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar, o
borrar sin suprimir la actividad biológica o inmunológica de un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando
programas de ordenador bien conocidos en la técnica, tales como el
software DNASTAR. Se puede determinar fácilmente si un cambio de
aminoácido da como resultado un polipéptido biológicamente activo
similar al receptor de la lipoxina A_{4} evaluando la actividad
del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, tal como
se describe, por ejemplo, en los ejemplos específicos a
continuación.
Las proteínas de fusión son útiles para generar
anticuerpos frente a las secuencias de aminoácidos de polipéptidos
similares al receptor de la lipoxina A_{4} y para el uso en
diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, se pueden usar las
proteínas de fusión para identificar las proteínas que interactúan
con las porciones de un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}. Se pueden usar con este objetivo la cromatografía
de afinidad de proteínas o los ensayos basados en bibliotecas para
las interacciones proteína-proteína, tales como los
sistemas híbridos de dos levaduras o los de exposición de fagos.
Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se pueden
usar también para la selección de fármacos.
Una proteína de fusión de un polipéptido similar
al receptor de la lipoxina A_{4} comprende dos segmentos de
polipéptido fusionados conjuntamente por medio de un enlace
peptídico. Se pueden seleccionar los aminoácidos contiguos para uso
en una proteína de fusión a partir de la secuencia de aminoácidos
que se muestra en la SEC DE ID Nº 2 o a partir de una variante
biológicamente activa de aquellas secuencias, tales como aquellas
descritas anteriormente. El primer segmento de polipéptido puede
comprender también el polipéptido de longitud completa similar al
receptor de la lipoxina A_{4}.
El segundo segmento de polipéptido puede ser una
proteína de longitud completa o un fragmento de proteína. Las
proteínas comúnmente usadas en la construcción de una proteína de
fusión incluyen \beta-galactosidasa,
\beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde
(GFP), proteínas autoflorescentes, que incluyen proteína
fluorescente azul (BFP),
glutatión-S-transferasa (GST),
luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), y cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT). De manera adicional, se usan etiquetas de
epitopos en las construcciones de las proteínas de fusión, que
incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas FLAG, etiquetas de
hemaglutinina de la gripe (HA), etiquetas Myc, etiquetas
VSV-G, y etiquetas de tioredoxina (Trx). Otras
construcciones de fusión pueden incluir proteína de enlace con la
maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de regiones de enlace Lex a ADN
(DBD), y fusiones de proteínas BP16 y virus del herpes simple (VSH).
Se puede construir mediante ingeniería genética una proteína de
fusión para que contenga un emplazamiento de rotura localizado entre
la secuencia que codifica el polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} y la secuencia de la proteína heteróloga, de tal
manera que se pueda romper el polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} y purificarse por eliminación del resto
heterólogo.
Se puede sintetizar químicamente una proteína de
fusión, tal como se conoce en la técnica. De manera preferible, una
proteína de fusión se produce mediante dos segmentos de polipéptido
enlazados covalentemente o mediante procedimientos estándar en la
técnica de la biología molecular. Se pueden usar procedimientos de
ADN recombinante para preparar proteínas de fusión, por ejemplo,
fabricando un constructo de ADN que comprenda las secuencias de
codificación seleccionadas a partir de la SEC DE ID Nº 1 en un
marco de lectura apropiado con nucleótidos que codifiquen el
segundo segmento de polipéptido y expresen el constructo de ADN en
una célula huésped, tal como se conoce en la técnica. Están
disponibles muchos kits para construir proteínas de fusión de
compañías tales como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene
(La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL Internacional Corporation (MIC;
Watertown, MA), y Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá;
1-888-DNA-KITS).
Se pueden obtener especies homólogas del
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} humana usando
polinucleótidos del polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} (descritos anteriormente) para fabricar sondas o cebadores
adecuados para seleccionar bibliotecas de expresión de ADNc a partir
de otras especies, tales como ratones, monos, o levaduras, que
identifican los ADNc que codifican los homólogos del polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4}, y que expresan los ADNc
tal como se conoce en la técnica.
Un polinucleótido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} puede ser de cadena única o doble y comprende una
secuencia de codificación o el complemento de una secuencia de
codificación de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}. Se muestra en la SEC DE ID Nº 1 una secuencia de
codificación del polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}.
Las secuencias de nucleótidos degenerados que
codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina
A_{4}, así como las secuencias de nucleótidos homólogos que son
idénticas en al menos 50, de manera preferible aproximadamente 75,
90, 96, o 98% a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC
DE ID Nº 1, son también polinucleótidos similares al receptor de la
lipoxina A_{4}. Se determina el porcentaje de identidad de la
secuencia entre las secuencias de dos polinucleótidos usando
programas de ordenador tales como ALIGN que emplea el algoritmo
FASTA, usando un intervalo de búsqueda por afinidad con una
penalización de intervalo abierto de -12 y una penalización de
intervalo de extensión de -2. Las moléculas de ADN complementario
(ADNc), especies homólogas, y variantes de los polinucleótidos
similares al receptor de la lipoxina A_{4} que codifican los
polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} activa
son también polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina
A_{4}.
Las variantes y homólogos de los polinucleótidos
similares al receptor de la lipoxina A_{4} descritos más arriba
son también polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina
A_{4}. Normalmente, se pueden identificar las secuencias
homólogas de los polinucleótidos similares al receptor de la
lipoxina A_{4} mediante la hibridación de los polinucleótidos
candidatos con los polinucleótidos conocidos similares al receptor
de la lipoxina A_{4} bajo condiciones de restricción, tal como se
conoce en la técnica. Por ejemplo, usando las siguientes condiciones
de lavado -2X SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M, pH 7,0),
SDS al 0,1%, dos veces a temperatura ambiente, 30 minutos cada una;
a continuación 2 X SSC, SDS al 0,1%, una vez a 50ºC, 30 minutos; a
continuación 2X SSC, dos veces a temperatura ambiente, 10 minutos
cada una - se pueden identificar las secuencias homólogas que
contienen en su mayor parte aproximadamente un
25-30% de pares de bases desemparejadas. De manera
más preferible, las cadenas homólogas de ácido nucleico contienen
un 15-25% de pares de bases desemparejadas, incluso
de manera más preferible un 5-15% de pares de bases
desemparejadas.
Se pueden identificar también especies homólogas
de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}
que se describen en el presente documento fabricando sondas o
cebadores adecuados y seleccionando librerías de expresión de ADNc
procedente de otras especies, tales como ratones, monos, o
levaduras. Se pueden identificar las variantes humanas de los
polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}, por
ejemplo, mediante la selección de librerías de expresión del ADNc
humano. Es bien sabido que la T_{m} de un ADN de cadena doble
disminuye en un 1-1,5ºC por cada 1% de disminución
en la homología (Bonner y col., J. Mol. Biol. 81, 123
(1973). Se pueden identificar por tanto las variantes de los
polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} humana
de otras especies hibridando un polinucleótido homólogo pretendido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} con un polinucleótido que
tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº 1, o el
complemento de la misma, para formar un híbrido de ensayo. Se
compara la temperatura de fusión del híbrido de ensayo con la
temperatura de fusión de un híbrido que comprende los
polinucleótidos de la transformilasa que tienen secuencias de
nucleótidos perfectamente complementarias, y se calcula el número o
porcentaje de pares de bases desemparejadas dentro del híbrido de
ensayo.
Las secuencias de nucleótidos que hibridan con
los polinucleótidos de la transformilasa o sus complementos tras la
hibridación en condiciones de restricción y/o de lavado son también
polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}.Son
bien conocidas y comprendidas en la técnica las condiciones de
lavado con restricción y se describen, por ejemplo, en Sambrook
y col., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, 2d ed, 1989,
en las páginas 9.50-9.51.
Las condiciones de lavado con restricción
incluyen, por ejemplo, 4X SSC a 65ºC, o formamida al 50%, 4X SSC a
42ºC, o 0,5X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Las condiciones de lavado
altamente restrictivo incluyen, por ejemplo, 0,2X SSC a 65ºC.
Se puede aislar un polinucleótido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} libre de otros componentes
celulares, proteínas y lípidos. Se pueden fabricar los
polinucleótidos por una célula, y aislarse usando técnicas estándar
de purificación de ácidos nucleicos, o sintetizarse usando una
técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), o usando un sintetizador automático. Los
procedimientos para aislar polinucleótidos son rutinarios y se
conocen en la técnica. Se puede usar cualquiera de dichas técnicas
para obtener polinucleótidos aislados similares al receptor de la
lipoxina A_{4}. Por ejemplo, se pueden usar enzimas de restricción
y sondas para aislar fragmentos de polinucleótidos que comprendan
secuencias de nucleótidos similares al receptor de la lipoxina
A_{4}. Los polinucleótidos aislados están en preparaciones que
están libres, o al menos libres en un 70, 80, o 90%, de otras
moléculas.
Se pueden fabricar las moléculas de ADNc
similares al receptor de la lipoxina A_{4} con técnicas estándar
de biología molecular, usando ARNm similar al del receptor de la
lipoxina A_{4} como uno similar al receptor de la lipoxina
A_{4}. Se pueden por tanto replicar moléculas de ADNc similares al
receptor de la lipoxina A_{4} usando técnicas de biología
molecular conocidas en la técnica y descritas en manuales tales como
Sambrook y col (1989). Se puede usar una técnica de
amplificación, tal como la PCR, para obtener copias adicionales de
los polinucleótidos de la invención, usando como plantilla ADN
genómico o ADNc.
Se pueden usar técnicas de química sintética, de
manera alternativa, para sintetizar polinucleótidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4}. La degeneración del código genético
permite alternar las secuencias de nucleótidos que se van a
sintetizar que codificarán un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} que tenga, por ejemplo, la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 2, o una variante
biológicamente activa de la misma.
Se pueden obtener polipéptidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4}, por ejemplo, mediante purificación
a partir de células humanas, mediante la expresión de
polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}, o
mediante síntesis química directa.
Se pueden purificar polipéptidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4} a partir de cualquier célula humana
que exprese el receptor, incluyendo cualquier célula huésped que se
haya transfectado con un constructo de polinucleótido que exprese
el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se separa
un polipéptido purificado similar al receptor de la lipoxina
A_{4} de otros compuestos que se asocian normalmente con el
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en la célula,
tales como algunas proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando
procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos
incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión por
tamaños, fraccionamiento en sulfato de amonio, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis
preparativa en gel.
Se aísla de manera conveniente el polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} en forma de complejo con
su proteína G asociada. Están disponibles una variedad de análogos
similares al receptor de la lipoxina A_{4} y se pueden usar como
ligandos para el enlace del receptor. Son particularmente útiles
para este objetivo los análogos similares al receptor de la
lipoxina A_{4}. Una preparación de polipéptidos purificados
similares al receptor de la lipoxina A_{4} es pura en al menos un
80%; de manera preferible, las preparaciones son puras en un 90%,
95%, o 99%. Se puede evaluar la pureza de las preparaciones mediante
cualquier medio conocido en la técnica, tal como la electroforesis
en gel de SDS-poliacrilamida.
Para expresar un polipéptido similar al receptor
de la lipoxina A_{4}, se puede insertar un polinucleótido similar
al receptor de la lipoxina A_{4} en un vector de expresión que
contiene los elementos necesarios para la transcripción y
traducción de la secuencia de codificación insertada.
Se pueden usar procedimientos que son bien
conocidos por aquellas personas expertas en la técnica para
construir vectores de expresión que contengan las secuencias que
codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina
A_{4} y los elementos de control transcripcional y traduccional
apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN
recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y la
recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se
describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) y en
Ausebel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John
Wiley y Sons, Nueva York, N. Y, 1989.
Se puede utilizar una variedad de sistemas
vector de expresión / huésped para contener y expresar las
secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}. Entre estos se incluyen, pero no se limitan a,
microorganismos, tales como bacterias transformadas con
bacteriófagos recombinantes, plásmidos, o vectores de expresión de
ADN de cósmidos; levaduras transformadas con vectores de expresión
de levaduras, sistemas de células de insectos infectados con
vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus),
sistemas de células de plantas transformados con vectores de
expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la
coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco,
TMV), o con vectores de expresión de bacterias (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas de células animales.
TMV), o con vectores de expresión de bacterias (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas de células animales.
Los elementos de control o secuencias
reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector -
mejoradores, promotores, regiones 5’ y 3’ no traducidas - que
interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a
cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden
variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector
y el huésped utilizado, se puede usar cualquier número de elementos
de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores
constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en
sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales
como el promotor lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene,
La Jolla, Calif.) o del plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y
similares. Se puede usar el promotor de la polihedrina de
baculovirus en células de insectos. Se pueden clonar en el vector
los promotores o mejoradores derivados de los genomas de células de
plantas (por ejemplo, genes de choque térmico, RUBISCO, y proteínas
de almacenamiento) o a partir de virus de plantas (por ejemplo,
promotores víricos o secuencias líder). En los sistemas de células
de mamíferos, son preferibles los promotores de genes de mamíferos
o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea de
células que contenga copias múltiples de una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}, se pueden usar vectores basados en SV40 o EBV con
un marcador seleccionable apropiado.
En los sistemas bacterianos, se pueden
seleccionar numerosos vectores de expresión dependiendo del uso
pretendido del polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} para la
inducción de anticuerpos, se pueden usar vectores que promuevan un
elevado nivel de expresión de las proteínas de fusión que se
purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan
a, vectores de expresión y clonación de E. coli
multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector
BLUESCRIPT se puede ligar una secuencia que codifica el polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} en el vector en un marco
con secuencias para el amino terminal Met y los 7 residuos
posteriores de \beta-galactosidasa, de tal manera
que se produzca una proteína híbrida. Se pueden usar también
vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264,
5503-5509, 1989) o vectores pGEX (Promega, Madison,
Wis) para expresar los polipéptidos anteriores en forma de proteínas
de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). En
general, dichas proteínas de fusión son solubles y se pueden
purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción
con perlas de glutatión-agarosa seguido por la
elución en presencia de glutatión libre, Se pueden diseñar la
proteínas fabricadas en dichos sistemas para incluir heparina,
trombina, o los emplazamientos de rotura mediante proteasa del
factor Xa de tal manera que se puede dosificar el polipéptido
clonado de interés a voluntad desde el resto GST.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae,
se pueden usar numerosos vectores que contienen promotores
constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, la alcohol
oxidasa, y PGH. Para las revisiones, véase Ausebel y col.
(1989) y Grant y col., Methods Enzymol. 153,
516-544, 1987.
Si se usan vectores de expresión de plantas,
puede llevarse a cabo la expresión de las secuencias que codifican
los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} por
cualquiera de numerosos promotores. Se pueden usar, por ejemplo,
promotores víricos tales como los promotores 35S y 19S de CaMV,
sólos o en combinación con la secuencia líder omega procedente de
TMV (Takamatsu EMBO J. 6, 307-311, 1987). De
manera alternativa, se pueden usar promotores de plantas tales como
la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores del choque térmico
(Coruzzi y col., EMBO J. 3, 1671-1680,
1984; Broglie y col., Science 224,
838-843, 1984; Winter y col., Results
Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Se pueden
introducir estos constructos en las células de plantas mediante
transformación directa del ADN o mediante transfección mediada por
patógenos. Se describen dichas técnicas en numerosas revisiones
generalmente disponibles (por ejemplo, Hobbs o Murry, en
MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, Nueva
York, N. Y., pp 191-196, 1992).
Se puede usar también un sistema de insecto para
expresar el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.
Por ejemplo, en uno de dichos sistemas se usa el virus de la
polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como
vector para expresar los genes extraños en células de Spodoptera
frugiperda o en las larvas de Trichoplusia. Se pueden
clonar las secuencias que codifican los polipéptidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4} en una región no esencial del
virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarlos bajo el
control del promotor de la polihedrina, La inserción satisfactoria
de los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}
volverá inactivo el gen de la polihedrina y produce virus
recombinantes que carecen de proteína de la cubierta. A
continuación se pueden usar los virus recombinantes para infectar
células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en
las que se pueden expresar los polipéptidos similares al receptor de
la lipoxina A_{4} (Engelhard y col., Proc. Nat. Acad.
Sci. 91, 3224-3227, 1994).
Se pueden usar numerosos sistemas de expresión
basados en virus para expresar los polipéptidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4} en células huésped de mamíferos. Por
ejemplo, si se usa un adenovirus como vector de expresión, se
pueden ligar las secuencias que codifican los polipéptidos similares
al receptor de la lipoxina A_{4} en un complejo de transcripción
/ traducción del adenovirus que comprende el promotor tardío y la
secuencia líder tripartita. Se puede usar la inserción en una región
E1 o E3 no esencial del genoma vírico para obtener un virus viable
que sea capaz de expresar un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} en células huésped infectadas (Logan y Sheik,
Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984).
Si se desea, se pueden usar mejoradores de la transcripción tales
como el mejorador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para
aumentar la expresión en las células huésped de mamíferos.
Se pueden usar también cromosomas artificiales
humanos (HAC) para liberar fragmentos más grandes de ADN que se
pueden contener y expresar en un plásmido. Se construyen HAC de 6M a
10M y se proporcionan a las células mediante procedimientos de
liberación convencionales (por ejemplo, liposomas, amino polímeros
policatiónicos, o vesículas).
Se pueden usar también señales específicas de
iniciación para conseguir una traducción más eficiente de las
secuencias que codifican los polipéptidos similares al receptor de
la lipoxina A_{4}. Dichas señales incluyen el codón de iniciación
ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en los que las
secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}, su codón de iniciación, y las secuencias corriente
arriba, se insertan en el vector de expresión apropiado, sin
necesitarse señales de control transcripcional o traduccional
adicionales. Sin embargo, en los casos en los que únicamente se
inserta la señal de codificación o un fragmento de la misma,
deberán proporcionarse señales exógenas de control traduccional (que
incluyen el codón de iniciación ATG). El codón de iniciación deberá
estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción
del inserto completo. Los elementos traduccionales exógenos y los
codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto
naturales como sintéticos. Se puede mejorar la eficiencia de
expresión mediante la inclusión de mejoradores que sean apropiados
para el sistema celular concreto que se usa (véase Scharf y
col., Results Probl. Cell. Differ. 20,
125-162, 1994).
Se puede escoger una cepa de célula huésped por
su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas
o para procesar el polipéptido expresado similar al receptor de la
lipoxina A_{4} de la manera deseada. Dichas modificaciones del
polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación,
carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y
acilación. Se puede usar también el procesamiento
post-traduccional que rompe una forma "prepro"
del polipéptido para facilitar la inserción, el plegado y/o la
función correcta. Están disponibles en la American Type Culture
Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209) diferentes células huésped que tienen
la maquinaria celular específica y los mecanismos característicos
para las actividades post-traduccionales (por
ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), y se pueden escoger para
asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína
extraña.
Se prefiere la expresión estable para la
producción a largo plazo con alto rendimiento de las proteínas
recombinantes. Se pueden transformar, por ejemplo, las líneas
celulares que expresan de manera estable los polipéptidos similares
al receptor de la lipoxina A_{4} usando vectores de expresión que
pueden contener orígenes víricos de la replicación y/o elementos de
expresión endógena y un gen marcador seleccionable sobre el mismo o
sobre un vector separado. Tras la introducción del vector, se puede
dejar crecer a las células durante 1-2 días en un
medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El
objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a la
selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de
las células que expresan satisfactoriamente las secuencias
introducidas similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Pueden
proliferar los clones resistentes de células transformadas estables
usando técnicas apropiadas de cultivo de tejidos para el tipo de
célula. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE, R. I.
Freshney, ed., 1986.
Se puede usar cualquier número de sistemas de
selección para recuperar las líneas de células transformadas.
Entre estos se incluyen, pero no se limitan a,
los genes de la timidina quinasa (Wigler y col., Cell
II, 223-32, 1977) y la adenina
fosforibosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22,
817-23, 1980) del virus del herpes simple que se
pueden emplear en las células tk o aprf, de manera
respectiva. También, se puede usar como base para la selección
antimetabolitos, antibióticos, o la resistencia a los herbicidas.
Por ejemplo, dhfr confiere resistencia al metotrexato
(Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 77,
3567-70, 1980), npt confiere resistencia a
los aminoglicósidos, a la neomicina y a G-418
(Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol.
150, 1-14, 1981) y als y pat
confieren resistencia al clorsulfuron y a la fosfinotricin
acetiltransferasa, de manera respectiva (Murry, 1992, más
arriba). Se han descrito genes seleccionables adicionales. Por
ejemplo, trpB permite a las células utilizar indol en lugar
de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar
histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl.
Acad. Sci. 85, 8047-51, 1988). Se pueden usar
marcadores visibles tales como antocianinas,
\beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y
luciferasa y su sustrato luciferina, para identificar los
transformantes y cuantificar la cantidad de la expresión de la
proteína transitoria o estable atribuible a un sistema específico
de vector (Rhodes y col., Methods Mol. Biol. 55,
121-131, 1995).
Aunque la presencia de la expresión del gen
marcador sugiere que está también presente el polinucleótido similar
al receptor de la lipoxina A_{4}, puede necesitar confirmarse su
presencia y expresión. Por ejemplo, si se inserta una secuencia que
codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}
dentro de una secuencia de gen marcador se pueden identificar las
células transformadas que contienen las secuencias que codifican un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante la
ausencia de función del gen marcador. De manera alternativa, se
puede colocar un gen marcador en tándem con una secuencia que
codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}
bajo el control de un promotor único. La expresión del gen marcador
en respuesta a la inducción o selección indica normalmente la
expresión del polinucleótido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}.
De manera alternativa, se pueden expresar las
células huésped que contienen un polinucleótido similar al receptor
de la lipoxina A_{4} que expresan un polipéptido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} mediante una variedad de
procedimientos conocidos por aquellas personas expertas en la
técnica. Entre estos procedimientos se incluyen, pero no se limitan
a, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y
bioensayo de proteínas o técnicas de inmunoensayo que incluyen
tecnologías de membrana, solución o basadas en chip para la
detección y/o cuantificación del ácido nucleico o la proteína. Por
ejemplo, se puede detectar la presencia de una secuencia de
polinucleótidos que codifica un polipéptido similar al receptor de
la lipoxina A_{4} mediante hibridación o amplificación
ADN-ADN o ADN-ARN usando sondas o
fragmentos o fragmentos de polinucleótidos que codifican un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Los ensayos
basados en la amplificación del ácido nucleico implican el uso de
oligonucleótidos seleccionados a partir de secuencias que codifican
un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} para
detectar los transformantes que contienen un polinucleótido similar
al receptor de la lipoxina A_{4}.
Se conocen en la técnica una variedad de
protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4}, usando anticuerpos
tanto policlonales como monoclonales específicos del polipéptido,
tal como se conoce en la técnica. Los ejemplos incluyen el ensayo
inmunosorbente enlazado al enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA),
y clasificación de células activada mediante fluorescencia (FACS).
Se puede usar un inmunoensayo monoclonal de dos emplazamientos
usando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epitopos no
interferentes sobre un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}, o se puede emplear un ensayo de enlace
competitivo. Se describen estos y otros ensayos en Hampton y
col., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, San
Pablo, Minn., (1990) y Maddox y col., J. Exp. Med.
158, 1211-1216, (1983).
Se conocen una amplia variedad de técnicas de
marcado y de conjugación por aquellas personas expertas en la
técnica y se pueden usar en diversos ensayos de ácidos nucleicos y
aminoácidos. Los medios para producir la hibridación marcada o las
sondas PCR para detectar las secuencias relacionadas con los
polinucleótidos que codifican los polipéptidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4} incluyen oligomarcado, traducción
por cortes, marcado final, o amplificación mediante PCR usando un
nucleótido marcado. De manera alternativa, se pueden clonar las
secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} en un vector para la producción de una sonda de
ARNm. Se conocen dichos vectores en la técnica, están comercialmente
disponibles, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in
vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN
polimerasa apropiada tal como T7, T3, o SP6. Se pueden llevar a cabo
estos procedimientos usando una variedad de kits comercialmente
disponibles (Amersham pharmacia Biotec, Promega y US Biochemical).
Las moléculas o marcas indicadoras adecuadas que se pueden usar
para la facilidad de la detección incluyen radionucleidos, enzimas,
y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos, así
como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y
similares.
Se pueden cultivar células huésped transformadas
con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido similar
al receptor de la lipoxina A_{4} bajo condiciones adecuadas para
la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo
celular. El polipéptido producido mediante una célula transformada
se puede segregar o contener intracelularmente dependiendo de la
secuencia y/o el vector usado. Como aquellas personas expertas en
la técnica comprenderán, se pueden diseñar vectores de expresión que
contengan polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos similares
al receptor de la lipoxina A_{4} para contener secuencias señal
con secreción directa de polipéptidos solubles similares al receptor
de la lipoxina A_{4} a través de la membrana celular procariota o
eucariota, o que dirijan la inserción de la membrana del polipéptido
en el receptor de la lipoxina A_{4} enlazado con la membrana.
Tal como se ha descrito anteriormente, se pueden
usar otras construcciones para unir una secuencia que codifica un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} con una
secuencia de nucleótido que codifica una región de polipéptido que
facilitará la purificación de las proteínas solubles. Dichas
regiones que facilitan las purificación incluyen, pero no se limita
a, péptidos quelantes metálicos tales como los módulos de
histidina-triptófano que permiten la purificación
sobre metales inmovilizados, regiones de proteína A que permiten la
purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y la región
utilizada en el sistema de purificación mediante extensión /
afinidad FLAGS (Inmunex Corp., Seattle, Wash.). Se puede usar
también la inclusión de secuencias ligantes rompibles tales como
las específicas para el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen,
San Diego, CA) entre la región de purificación y el polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} para facilitar la
purificación. Uno de dichos vectores de expresión proporciona la
expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} y 6 residuos de histidina
que preceden una tioredoxina o un emplazamiento de rotura de la
enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación
por IMAC (cromatografía de afinidad iónica mediante metal
inmovilizado, tal como se describe en Porath y col., Prot.
Exp. Purif. 3, 263-281, 1992), mientras que el
emplazamiento de rotura de la enteroquinasa proporciona un medio
para purificar el polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} de la proteína de fusión. Se describen los vectores que
contienen proteínas de fusión en Kroll y col., DNA Cell.
Biol. 12, 441-453,
1993.
1993.
Se pueden sintetizar las secuencias que
codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}
usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase
Caruthers y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser.
215-223, 1980; Horn y col. Nucl. Acids Res. Symp.
Ser. 225-232, 1980). De manera alternativa, el
propio polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} se
puede producir usando procedimientos químicos para sintetizar su
secuencia de aminoácidos, tales como mediante la síntesis directa
del péptido usando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am.
Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge y
col., Science 269, 202-204, 1995). Se
puede llevar a cabo la síntesis de proteínas usando técnicas
manuales o mediante automatización. Se puede conseguir la síntesis
automatizada, por ejemplo, usando el Applied Biosystems 431A Peptide
Synthesizer (Perkin Elmer). De manera opcional, se pueden
sintetizar de manera separada fragmentos de los polipéptidos
similares al receptor de la lipoxina A_{4} y combinarse usando
procedimientos químicos para producir una molécula de longitud
completa.
Se puede purificar de manera sustancial el
péptido sintetizado de nuevo mediante cromatografía líquida de alta
resolución preparativa (por ejemplo, Creighton, PROTEINS: STRUCTURES
AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman y Co., Nueva York, N. Y.,
1983). Se puede confirmar la composición de un polipéptido sintético
similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante análisis o
secuenciamiento de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de
degradación de Edman; véase Creighton, más arriba). De manera
adicional, se puede alterar cualquier porción de la secuencia de
aminoácidos del polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} durante la síntesis directa y/o combinarse usando
procedimientos químicos con secuencias de otras proteínas para
producir una variante de polipéptido o una proteína de fusión.
Como aquellas personas expertas en la técnica
comprenderán, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótido
que codifiquen el polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} que posean codones que no se produzcan naturalmente. Se
pueden seleccionar por ejemplo, los codones preferidos por un
huésped procariota o eucariota concreto para aumentar el índice de
expresión de la proteína o para producir un transcripto de ARN que
tenga las propiedades deseadas, tales como una vida media que sea
más larga que la del transcripto generado a partir de la secuencia
que se produce de manera natural.
Se pueden construir mediante ingeniería genética
las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento
usando los procedimientos generalmente conocidos en la técnica para
alterar las secuencias que codifican el polipéptido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} por una variedad de razones, que
incluyen pero no se limitan a, las alteraciones que modifican la
clonación, procesamiento, y/o expresión del polipéptido o producto
de ARNm. Se puede usar la mezcla de ADN mediante fragmentación
aleatoria y reensamblado mediante PCR de los fragmentos del gen y
los oligonucleótidos sintéticos para construir mediante ingeniería
genética las secuencias de nucleótidos. Se puede usar, por ejemplo,
la mutagénesis dirigida al emplazamiento para insertar nuevos
emplazamientos de restricción, alterar los modelos de glicosilación,
cambiar la preferencia del codón, producir variantes ayustadas,
introducir mutaciones, y así sucesivamente.
Se puede generar cualquier tipo de anticuerpo
conocido en la técnica para enlazar de manera específica con un
epitopo de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}. Tal como se usa en el presente documento "anticuerpo"
incluye las moléculas intactas de inmunoglobulina, así como los
fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab’)_{2}, y
Fv, que son capaces de enlazar un epitopo de un polipéptido similar
al receptor de la lipoxina A_{4}, Normalmente se requieren 6, 8,
10, o 12 aminoácidos contiguos para formar un epitopo. Sin embargo,
los epitopos que impliquen aminoácidos no contiguos pueden necesitar
más aminoácidos, al menos 15, 25, o 50.
Se puede usar terapéuticamente un anticuerpo que
enlace de manera específica con un epitopo de un polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4}, así como en ensayos
inmunoquímicos, tales como Western blots, ELISA,
radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos,
inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en
la técnica. Se pueden usar diversos inmunoensayos para identificar
los anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Son bien
conocidos en la técnica numerosos protocolos para los ensayos de
enlace competitivo o inmunoradiométricos. Dichos inmunoensayos
implican normalmente la medida de la formación del complejo entre
un inmunógeno y un anticuerpo que enlaza de manera específica con el
inmunógeno.
Normalmente, un anticuerpo que enlaza de manera
específica con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} proporciona una señal de detección al menos 5-, 10-, o 20
veces mayor que una señal de detección proporcionada con otras
proteínas cuando se usan en un ensayo inmunoquímico. De manera
preferible, los anticuerpos que enlazan de manera específica con
los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} no
detectan otras proteínas en los ensayos inmunoquímicos y pueden
inmunoprecipitar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} a partir de la solución.
Se pueden usar polipéptidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4} para inmunizar un mamífero, tal como
un ratón, rata, conejo, cobaya, mono, o ser humano, para producir
anticuerpos policlonales. Si se desea, se puede conjugar un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} con una
proteína vehículo, tal como albúmina de suero bovino,
tiroglobulina, y hemocianina de lapa americana. Dependiendo de las
especies huésped, se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar
la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, pero no se
limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo,
hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo,
lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones
en aceite, hemocianina de lapa americana, y dinitrofenol). Entre
los adyu-
vantes usados en seres humanos, son especialmente útiles BCG (bacilli Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
vantes usados en seres humanos, son especialmente útiles BCG (bacilli Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Se pueden preparar anticuerpos monoclonales que
enlacen de manera específica con un polipéptido similar al receptor
de la lipoxina A_{4} usando cualquier técnica que proporcione la
producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares
continuas en el cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan
a, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B
humanas, y la técnica del hibridoma de EBV (Kohler y col.,
Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor y
col., J. Immunol. Methods 81, 31-42,
1985; Cote y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 80,
2026-2030, 1983; Cole y col., Mol. Cell
Biol. 62, 109-120, 1984).
De manera adicional, se pueden usar las técnicas
desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos",
el ayustamiento de los genes de anticuerpo de ratón con los genes de
anticuerpo humano para obtener una molécula con especificidad y
actividad biológica apropiada al antígeno (Morrison y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855, 1984;
Neuberger y col., Nature 312, 604-608,
1984; Takeda y col., Nature 314,
452-454, 1985). Se pueden también "humanizar"
los anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos para evitar que un
paciente desencadene una respuesta inmune contra el anticuerpo
cuando este se usa terapéuticamente. Dichos anticuerpos pueden ser
suficientemente similares en la secuencia a los anticuerpos humanos
que se van a usar directamente en la terapia o pueden requerir la
alteración de unos pocos residuos clave. Se pueden minimizar las
diferencias de secuencias entre los anticuerpos de roedores y las
secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento
de los residuos individuales o mediante injerto de las regiones que
determinan la complementariedad completa. De manera alternativa, se
pueden producir anticuerpos humanizados usando procedimientos
recombinantes, tal como se describe en el Documento GB2188638B. Los
anticuerpos que enlazan de manera específica con un polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} pueden contener
emplazamientos de enlace con el antígeno que se humanizan parcial o
completamente, tal como se describe en el Documento U. S.
5.565.332.
De manera alternativa, se pueden adaptar las
técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena
única usando los procedimientos conocidos en la técnica para
producir anticuerpos de cadena única que enlacen de manera
específica con los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina
A_{4}. Se pueden generar anticuerpos con especificidad
relacionada, pero de distinta composición idiotípica, mediante
mezcla de cadenas procedentes de bibliotecas combinatorias
aleatorias de inmunoglobina (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci.
88, 11120-23, 1991).
Se pueden construir anticuerpos de cadena única
usando un procedimiento de amplificación del ADN, tal como la PCR,
usando un ADNc de hibridoma como plantilla (Thirion y col.,
1996. Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Los
anticuerpos de cadena única pueden ser mono- o biespecíficos, y
pueden ser bivalentes o tetravalentes. Se muestra la construcción
de anticuerpos de cadena única biespecífica, tetravalente, por
ejemplo, en Coloma y Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15,
159-63. Se muestra la construcción de anticuerpos de
cadena única biespecífica, bivalente en Mallender y Voss, 1994,
J. Biol. Chem. 269, 199-206.
Se puede construir una secuencia de nucleótidos
que codifique un anticuerpo de cadena única usando la síntesis de
nucleótidos manual o automatizada, clonarse en un constructo de
expresión usando los procedimientos estándar de ADN recombinante, e
introducirse en una célula para expresar la secuencia de
codificación, tal como se describe a continuación. De manera
alternativa, se pueden producir anticuerpos de cadena única
directamente usando, por ejemplo, la tecnología de fagos
filamentosos (Verhaar y col., 1995, Int. J. Cancer 61,
497-501; Nicholls y col., 1993, J.
Immunol. Meth. 165, 81-91).
Se pueden producir también anticuerpos que
enlacen de manera específica con los polipéptidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4} induciendo la producción in vivo en
la población de linfocitos o seleccionando bibliotecas de
inmunoglobulina o paneles de reactivos de enlace altamente
específicos tal como se describe en la bibliografía (Orlandi y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86,
3833-3837, 1989; Winter y col., Nature
349, 293-299, 1991).
Se pueden construir otros tipos de anticuerpos y
usarse terapéuticamente en los procedimientos de la invención. Por
ejemplo, se pueden construir anticuerpos quiméricos tal como se
describe en el Documento WO 93/03151. También se pueden preparar
proteínas de enlace, que se deriven de las inmunoglobulinas y que
sean multivalentes y multiespecíficas, tales como los
"diacuerpos" descritos en el Documento WO 94/13804.
Se pueden purificar los anticuerpos de acuerdo
con la invención mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica. Por ejemplo, pueden purificarse los anticuerpos por
afinidad mediante el paso sobre una columna a la que se enlaza el
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. A
continuación se pueden eluir los anticuerpos enlazados a partir de
la columna usando un tampón con una elevada concentración de
sal.
Los oligonucleótidos de sentido contrario son
secuencias de nucleótidos que son complementarias con una secuencia
específica de ADN o ARN. Una vez introducidos en una célula, los
nucleótidos complementarios se combinan con las secuencias
naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear
la transcripción o la traducción. De manera preferible, un
oligonucleótido de sentido contrario tiene al menos 11 nucleótidos
de longitud, pero pueden ser al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40,
45, o 50 o más nucleótidos de longitud. Se pueden usar también
secuencias más largas. Se pueden proveer moléculas de
oligonucleótidos de sentido contrario en un constructo de ADN e
introducirse en una célula para disminuir el nivel de los productos
génicos de la proteína similares al receptor de la lipoxina A_{4}
en la célula.
Los oligonucleótidos de sentido contrario pueden
ser desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de
ambos. Se pueden sintetizar los oligonucleótidos manualmente o
mediante un sintetizador automatizado, mediante enlace covalente
del extremo 5’ de un nucleótido con el extremo 3’ de otro nucleótido
con enlaces internucleótidos no fosfodiéster tales como
alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos,
alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres
fosfato, carbamatos, acetamidato, ésteres de carboximetilo,
carbonatos, y triésteres de fosfato. Véase Brown, Meth. Mol.
Biol 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol.
Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann y col.,
Chem. Rev. 90, 543-583, 1990.
Se pueden obtener modificaciones de la expresión
del gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}
diseñando oligonucleótidos de sentido contrario que formarán dúplex
en el control, 5’, o las regiones reguladoras del gen de la
proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se prefieren
los oligonucleótidos derivados del emplazamiento de inicio de la
transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 a partir
del emplazamiento de partida. De manera similar, se puede conseguir
la inhibición usando la metodología de emparejamiento de bases de
la "triple hélice". El emparejamiento de la triple hélice es
útil debido a que produce la inhibición de la capacidad de la doble
hélice de abrirse lo suficiente para el enlace con las polimerasas,
los factores de transcripción, o los chaperones. Se han descrito en
la bibliografía los avances terapéuticos usando ADN triplex (por
ejemplo, Gee y col., en Huber y Carr, MOLECULAR ADN
IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y.,
1994). Se puede diseñar también un oligonucleótido de sentido
contrario para bloquear la traducción del ARNm para evitar que el
transcripto se enlace con los ribosomas.
No se requiere complementariedad precisa para la
formación satisfactoria del complejo entre un oligonucleótido de
sentido contrario y la secuencia complementaria de un polinucleótido
similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Los oligonucleótidos de
sentido contrario que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4, o 5 o más
extensiones de nucleótidos contiguos que son precisamente
complementarias con un polinucleótido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}, separadas cada una mediante una extensión de
nucleótidos contiguos que no son complementarios con los
nucleótidos adyacentes similares al receptor de la lipoxina A_{4},
pueden proporcionar suficiente especificidad para hacer diana al
ARNm de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. De
manera preferible, cada extensión de nucleótidos contiguos
complementarios tiene al menos 4, 5, 6, 7, u 8 o más nucleótidos de
longitud. Las secuencias intervinientes no complementarias tienen de
manera preferible 1, 2, 3, o 4 nucleótidos de longitud. Una persona
experta en la técnica puede usar fácilmente el punto de fusión
calculado de una pareja de sentido
contrario-sentido directo para determinar el grado
de desemparejamiento que se tolerará entre un oligonucleótido de
sentido contrario concreto y una secuencia concreta de
polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.
Se pueden modificar los oligonucleótidos de
sentido contrario sin afectar a su capacidad para hibridarse con un
polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Estas
modificaciones pueden ser internas o en uno o en ambos extremos de
la molécula de sentido contrario. Por ejemplo, se pueden modificar
los enlaces fosfato internucleósidos añadiendo restos de colesterol
o diamina con números variables de residuos de carbono entre los
grupos amino y la ribosa terminal. Se pueden emplear también bases
modificadas y/o azúcares, tales como la arabinosa en vez de la
ribosa, o un oligonucleótido 3’,5’ sustituido en el que se
sustituyen el grupo 3’ hidroxilo o el grupo 5’ fosfato, en un
oligonucleótido de sentido contrario modificado. Se pueden preparar
estos oligonucleótidos modificados mediante los procedimientos bien
conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Agrawal y col.,
Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann
y col., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990;
Uhlmann y col., Tetrahedron. Lett. 215,
3539-3542, 1987.
Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad
catalítica. Véase, por ejemplo, Cech, Science 236,
1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem.
59, 543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct.
Biol. 2, 605-609; 1992, Couture y Stinchcomb,
Trends Genet. 12, 510-515, 1996. Se pueden
usar las ribozimas para inhibir la función del gen rompiendo una
secuencia de ARN, tal como se conoce en la técnica (por
ejemplo, Haseloff y col., Patente de los Estados Unidos
5.641.673). El mecanismo de acción de la ribozima implica la
hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima
con el ARN diana complementario, seguida por la rotura
endonucleolítica. Los ejemplos incluyen las moléculas de ribozima
de cabeza de martillo construidas mediante ingeniería genética que
pueden catalizar de manera específica y eficiente la rotura
endonucleolítica de las secuencias específicas de nucleótidos.
Se puede usar la secuencia de codificación de un
polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} para
generar ribozimas que enlazarán de manera específica con el ARNm
transcrito a partir del polinucleótido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}. Se han desarrollado procedimientos de diseño y
construcción de ribozimas que pueden romper otras moléculas de ARN
en trans en una secuencia elevada de manera específica y se
describen en la técnica (véase Haseloff y col., Nature
334, 585-591, 1988). Se puede dirigir, por
ejemplo, la actividad de rotura de las ribozimas en ARN específicos
construyendo mediante ingeniería genética una región de
"hibridación" discreta en la ribozima. La región de hibridación
contiene una secuencia complementaria con el ARN diana y de esta
manera hibrida de manera específica con la diana (véase, por
ejemplo, Gerlach y col., Documento EP 321.201).
Se pueden identificar los emplazamientos
específicos de rotura de ribozimas dentro del ARN diana de la
proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} escaneando la
molécula diana buscando los emplazamientos de rotura de la ribozima
que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez
identificadas, se pueden evaluar las secuencias cortas de ARN de
entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del ARN
diana que contiene el emplazamiento de rotura para las
características estructurales secundarias que pueden volver la
diana inoperable. Se puede evaluar también la adecuabilidad de las
dianas de ARN de la proteína candidata similar al receptor de la
lipoxina A_{4} ensayando la accesibilidad a la hibridación con
oligonucleótidos complementarios, usando ensayos de protección de
la ribonucleasa. Se muestran en la SEC DE ID Nº 1 las secuencias
del nucleótido y sus complementos proporcionan las fuentes de las
secuencias adecuadas de la región de hibridación. Se pueden usar
secuencias complementarias más largas para aumentar la afinidad de
la secuencia de hibridación para la diana. Se pueden relacionar
integralmente las regiones de hibridación y rotura de la ribozima de
tal manera que tras la hibridación con el ARN diana a través de las
regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima puede
romper la diana.
Se pueden introducir ribozimas en las células
como parte de un constructo de ADN. Se pueden usar procedimientos
mecánicos, tales como la microinyección, la transfección mediada por
liposomas, la electroporación, o la precipitación con fosfato de
calcio, para introducir en las células un constructo de ADN que
contenga la ribozima en las que se desea disminuir la expresión de
la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. De manera
alternativa, si se desea que las células retengan de manera estable
el constructo de ADN, se puede suministrar el constructo en un
plásmido y mantenerse como un elemento separado o integrado en el
genoma de las células, tal como se conoce en la técnica. Un
constructo de ADN que codifique la ribozima puede incluir elementos
reguladores transcripcionales, tales como un elemento promotor, un
mejorador o un elemento UAS, y una señal terminadora
transcripcional, para controlar la transcripción de las ribozimas
en las células.
Como se muestra en Haseloff y col.,
Patente de los Estados Unidos 5.641.673, se pueden construir
mediante ingeniería genética las ribozimas de tal manera que la
expresión de la ribozima se producirá en respuesta a los factores
que inducen la expresión de un gen diana. Se pueden construir
también mediante ingeniería genética las ribozimas para
proporcionar un nivel adicional de regulación, de tal manera que
sólo se produce la destrucción del ARNm cuando se inducen en las
células una ribozima y un gen diana.
Los ensayos descritos son para seleccionar los
compuestos de ensayo que enlazan a o modulan la actividad de un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} o a un
polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Un
compuesto de ensayo enlaza de manera preferible con un polipéptido o
polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. De
manera más preferible, un compuesto de ensayo disminuye o aumenta la
actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}
de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} o la
expresión de un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} en al menos aproximadamente 10, de manera preferible
aproximadamente 50, de manera más preferible aproximadamente 75,
90, o 100% en relación con la ausencia del compuesto de ensayo.
Los compuestos de ensayo pueden ser agentes
farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser compuestos
anteriormente desconocidos por tener alguna actividad farmacológica.
Se pueden producir de manera natural los compuestos o diseñarse en
el laboratorio. Se pueden aislar a partir de microorganismos,
animales, o plantas y se pueden producir de manera recombinante, o
sintetizarse mediante procedimientos químicos conocidos en la
técnica. Si se desea, se pueden obtener los compuestos de ensayo
usando cualquiera de los numerosos procedimientos de bibliotecas
combinatorias conocidos en la técnica, que incluyen pero no se
limitan a, bibliotecas biológicas, bibliotecas direccionables
espacialmente en paralelo en fase sólida o en fase solución,
procedimientos de bibliotecas sintéticas, que requieren
desconvolución, el procedimiento de biblioteca "una perla un
compuesto" y los procedimientos de bibliotecas sintéticas que
usan la selección mediante cromatografía de afinidad. La hipótesis
de la biblioteca biológica se limita a las bibliotecas de
polipéptidos, mientras que las otras cuatro soluciones son
aplicables a las bibliotecas de polipéptidos, oligómeros no
péptidos, o bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas. Véase
Lam, Anticancer Drugs Des. 12, 145, 1997.
Se conocen bien en la técnica los procedimientos
para la síntesis de bibliotecas moleculares (véase, por
ejemplo, DeWitt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A. 90, 6909, 1993; Erb y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
91, 1994; Zuckermann y col., J. Med. Chem. 37,
2678, 1994; Cho y col., Science 261, 1303, 1993;
Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059,
1994; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33,
2061; Gallop y col., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994).
Se pueden presentar las bibliotecas de compuestos en solución
(véase, por ejemplo, Hougten, Biotechniques
13, 412-421, 1992), o en perlas (Lam, Nature
354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature
364, 555-556, 1993), bacterias o esporas
(Ladner, Patente de los Estados Unidos 5.223.409), plásmidos (Cull
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89,
1865-1869, 1992), o fagos (Scout y Smith, Science
249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249,
404-406, 1990); Cwirla y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J.
Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; y Ladner, Patente
de los Estados Unidos 5.223.409).
Se pueden seleccionar los compuestos de ensayo
por la capacidad de enlazar con los polipéptidos o polinucleótidos
similares al receptor de la lipoxina A_{4} o por afectar la
actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}
o la expresión del gen de la proteína similar al receptor de la
lipoxina A_{4} que usa la selección de alto rendimiento. Se
pueden ensayar en paralelo muchos compuestos discretos, usando la
selección de alto rendimiento, de tal manera que se pueden
seleccionar rápidamente grandes números de compuestos de ensayo.
Las técnicas más ampliamente establecidas utilizan placas de
microvaloración de 96 pocillos. Los pocillos de las placas de
microvaloración requieren normalmente volúmenes de ensayo que
oscilan entre 50 y 500 \mul. De manera adicional a las placas,
están comercialmente disponibles muchos instrumentos, materiales,
pipeteadores, robots, lavadores de placas, y lectores de placas para
ajustar el formato de 96 pocillos.
De manera alternativa, se pueden usar los
"ensayos libres de formato" o ensayos que no tienen barreras
físicas entre las muestras. Por ejemplo, se describe por
Jayawickreme y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
19, 1614-18 (1994) un ensayo que usa células
con pigmento (melanocitos) en un ensayo homogéneo simple para las
bibliotecas de péptidos combinatorios. Se colocan las células bajo
agarosa en placas petri, a continuación se colocan las perlas que
transportan los compuestos combinatorios sobre la superficie de la
agarosa. Se liberan parcialmente los compuestos combinatorios a
partir de los compuestos de las perlas. Se pueden visualizar los
compuestos activos como zonas de pigmentos oscuros debido a que los
compuestos se difunden localmente en la matriz de gel, los
compuestos activos producen en las células cambios de colores.
Se describe por Chelsky otro ensayo libre de
formato, "Strategies for Screening Combinatorial Libraires: Novel
and Tradicional Approaches", informado en la First Annual
Conference de la Society for Biomolecular Screening en Filadelfia,
PA. (Nov. 7-10, 1995). Chelsky colocó un enzima de
ensayo homogéneo simple para la anhidrasa carbónica en el interior
de un gel de agarosa de tal manera que el enzima en el gel podría
producir un cambio de color a lo largo del gel. A partir de ahí, se
colocaron las perlas que transportaban los compuestos combinatorios
mediante un fotoligante en el interior del gel y se liberaron los
compuestos parcialmente mediante luz UV. Se observaron los
compuestos que inhibieron el enzima como zonas locales de inhibición
que tenían un cambio de color inferior.
Se describe otro ejemplo aún por Salmon y
col., Molecular Diversity 2, 57-63
(1996). En este ejemplo, se seleccionaron bibliotecas combinatorias
para los compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre las células
cancerosas que crecían en agar.
Se describe en Beutel y col., Patente de
los Estados Unidos 5.976.813, otro procedimiento de selección de
alto rendimiento. En este procedimiento, se colocaron las muestras
de ensayo en una matriz porosa. A continuación se colocaron uno o
más componentes de ensayo en el interior, sobre la parte superior o
en la parte inferior de una matriz tal como un gel, una lámina
plástica, u otra forma de soporte sólido fácilmente manipulado.
Cuando se introdujeron las muestras en la matriz porosa, se
difundieron de manera suficientemente lenta, de tal manera que se
llevaron a cabo los ensayos sin que las muestras se mezclaran entre
sí.
Para los ensayos de enlace, el compuesto de
ensayo es de manera preferible una molécula pequeña que enlaza con
y ocupa el emplazamiento activo del polipéptido similar al receptor
de la lipoxina A_{4}, haciendo por tanto inaccesible al sustrato
el emplazamiento de enlace del ligando, de tal manera que se evita
la actividad biológica normal. Los ejemplos de dichas moléculas
pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o
moléculas similares a péptidos. Los ligandos potenciales que enlazan
con un polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a,
los ligandos naturales de las proteínas conocidas similares al
receptor de la lipoxina A_{4}y los análogos o derivados de los
mismos.
En los ensayos de enlace, el compuesto de ensayo
o el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} puede
comprender una marca detectable, tal como una marca fluorescente,
radioisotópica, quimioluminiscente, o enzimática, tal como
peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa. A
continuación se puede llevar a cabo la detección de un compuesto de
ensayo que se enlaza con el polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}, por ejemplo, mediante conteo directo de la
emisión, mediante conteo por centelleo, o determinando la
conversión de un sustrato apropiado en un producto detectable.
De manera alternativa, se puede determinar el
enlace de un compuesto de ensayo con un polipéptido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} sin marcar ninguno de los
interactuantes. Por ejemplo, se puede usar un microfisiómetro para
detectar el enlace de un compuesto de ensayo con un polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Un microfisiómetro (por
ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la
velocidad a la cual una célula acidifica su entorno usando un sensor
potenciométrico dirigible por la luz (LAPS). Se pueden usar los
cambios en esta velocidad de acidificación como un indicador de la
interacción entre un compuesto de ensayo y un polipéptido similar
al receptor de la lipoxina A_{4} (McConnell y col.,
Science 257, 1906-1912, 1992).
Se puede llevar también a cabo la determinación
de la capacidad de un compuesto de ensayo para enlazar con un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando una
tecnología tal como el Análisis de Interacción Bimolecular en
tiempo real (BIA) (Sjolander y Urbaniczky, Anal. Chem. 63,
2338-2345, 1991, y Szabo y col., Curr.
Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). BIA es
una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas en
tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo,
BIAcore^{TM}). Se pueden usar los cambios de resonancia en el
plasmón superficial del fenómeno óptico (SPR) como una indicación de
las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.
En otro aspecto más de la invención, se puede
usar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} como
una "proteína cebo" en un ensayo doble híbrido o ensayo triple
híbrido (véase, por ejemplo Patente de los Estados Unidos
5.283.317; Zervos y col., Cell 72,
223-232, 1993; Madura y col., J. Biol.
Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel y
col., Biotechniques 14, 920-924, 1993;
Iwabuchi y col., Oncogene 8,
1693-1696, 1993; y Brent, Documento WO 94/10300),
para identificar otras proteínas que enlazan a o interactúan con el
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} y modular su
actividad.
El sistema doble híbrido se basa en la
naturaleza modular de la mayor parte de los factores de
transcripción que consiste en el enlace separable del ADN y las
regiones de activación. De manera breve, el ensayo utiliza dos
constructos de ADN diferentes. Por ejemplo, en un constructo, se
puede fusionar el polinucleótido que codifica un polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} con un polinucleótido que
codifica la región de enlace del ADN de un factor de transcripción
conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro
constructo, se puede fusionar una secuencia de ADN que codifica una
proteína sin identificar ("presa" o "muestra") con un
polinucleótido que codifica la región de activación del factor de
transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa"
son capaces de interactuar in vivo para formar un complejo
dependiente de la proteína, el enlace de ADN y las regiones de
activación del factor de transcripción se presentan en proximidad
cerrada. Esta proximidad permite la transcripción de un gen
indicador (por ejemplo, LacZ) que está enlazado de manera operable a
un emplazamiento regulador transcripcional sensible al factor de
transcripción. Se puede detectar la expresión del gen indicador, y
se pueden aislar las colonias de células que contienen el factor de
transcripción funcional y usarse para obtener la secuencia de ADN
que codifica la proteína que interactúa con el polipéptido similar
al receptor de la lipoxina A_{4}.
Puede ser deseable inmovilizar el polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} (o el polinucleótido) o
el compuesto de ensayo para facilitar la separación del enlace de
las formas no enlazadas de uno o ambos de los interactuantes, así
como acomodar la automatización del ensayo. De esta manera, se
pueden enlazar a un soporte sólido el polipéptido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} (o el polinucleótido) o el compuesto
de ensayo. Los soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se
limitan a, portas de vidrio o plástico, placas de cultivo de
tejido, pocillos de microvaloración, tubos, chips de silicio, o
partículas tales como perlas (que incluyen, pero no se limitan a,
látex, poliestireno, o perlas de vidrio). Se puede usar cualquier
procedimiento conocido en la técnica para ligar el polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} (o el polinucleótido) o
el compuesto de ensayo a un soporte sólido, que incluye el uso de
enlaces covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o parejas de
restos de enlace ligadas de manera respectiva al polipéptido (o el
polinucleótido) o al compuesto de ensayo y al soporte sólido. Los
compuestos de ensayo se enlazan de manera preferible al soporte
sólido en un orden, de tal manera que se puede rastrear la
localización de los compuestos de ensayo individuales. Se puede
llevar a cabo el enlace de un compuesto de ensayo a un polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} (o el polipéptido) en
cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los
ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microvaloración,
tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga.
En una forma de realización, el polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} es una proteína de
fusión que comprende una región que permite enlazarse el polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} a un soporte sólido.
Pueden absorberse las proteínas de fusión de la
glutatión-S-transferasa sobre perlas
de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, San Luis, Mo) o placas de
microvaloración derivatizadas con glutatión, que se combinan a
continuación con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y
el polipéptido no absorbido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}; a continuación se incuba la mezcla bajo condiciones
conductoras para la formación del complejo (por ejemplo, en
condiciones fisiológicas para la sal y el pH). Tras la incubación,
se lavan las perlas o los pocillos de las placas de microvaloración
para eliminar cualquier componente no enlazado. Se puede determinar
el enlace de los interactuantes directa o indirectamente, tal como
se ha descrito anteriormente. De manera alternativa, se pueden
disociar los complejos a partir del soporte sólido antes que se
determine el enlace.
También se pueden usar otras técnicas para
inmovilizar las proteínas o los polinucleótidos sobre un soporte
sólido en el ensayo de selección de la invención. Por ejemplo, se
pueden inmovilizar un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} (o el polinucleótido) o un compuesto de ensayo
utilizando la conjugación de la biotina y la estreptavidina. Se
pueden preparar los polipéptidos biotinilados similares al receptor
de la lipoxina A_{4} (o los polinucleótidos) o los compuestos de
ensayo a partir de biotina-NSH
(N-hidrosuccinimida) usando las técnicas bien
conocidas en la técnica (por ejemplo, el kit de biotinilación,
Pierce Chemicals, Rockford, III) e inmovilizarse en los pocillos de
las placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce
Chemical). De manera alternativa, se pueden derivatizar en los
pocillos de la placa los anticuerpos que enlazan de manera
específica con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}, el polinucleótido, o un compuesto de ensayo, pero que no
interfieren con un emplazamiento de enlace deseado, tal como el
emplazamiento activo del polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}. Se puede atrapar la diana no enlazada o la
proteína en los pocillos mediante conjugación de los
anticuerpos.
Los procedimientos para detectar dichos
complejos, de manera adicional a aquellos descritos anteriormente
para los complejos inmovilizados mediante GST, incluyen la
inmunodetección de los complejos usando anticuerpos que enlazan de
manera específica con el polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4} o el compuesto de ensayo, los ensayos enlazados al
enzima que se apoyan en detectar una actividad del polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4}, y la electroforesis en
gel de SDS bajo condiciones no reductoras.
Se puede llevar también a cabo la selección de
los compuestos de ensayo que enlazan con un polipéptido o
polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, en una
célula intacta. Se puede usar cualquier célula que comprenda un
polipéptido o polinucleótido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} en un sistema de ensayo basado en células. Se puede
producir de manera natural un polinucleótido similar al receptor de
la lipoxina A_{4} en la célula o se puede introducir usando
técnicas como aquellas descritas anteriormente. Se determina el
enlace del compuesto de ensayo con un polipéptido o polinucleótido
similar al receptor de la lipoxina A_{4} tal como se ha descrito
anteriormente.
Se pueden ensayar los compuestos de ensayo para
la capacidad de aumentar o disminuir la señal de transducción
mediada por un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4}. Los ensayos funcionales incluyen el uso de células que
expresan el receptor acoplado a la proteína G (por ejemplo, células
CHO transfectadas) en un sistema que mide los cambios de pH
extracelular producidos por la activación del receptor
(véase, por ejemplo, Science 246,
181-296, 1989). Se pueden poner en contacto los
compuestos, por ejemplo, con una célula que expresa el polipéptido
receptor de la presente invención y una segunda respuesta del
mensajero, se pueden medir, por ejemplo la señal de
transducción o los cambios del pH, para determinar si el compuesto
potencial activa o inhibe el receptor. Se pueden llevar a cabo
ensayos funcionales tras poner en contacto un polipéptido
purificado similar al receptor de la lipoxina A_{4}, una
preparación de membrana celular, o una célula intacta con un
compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que disminuya la
actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}
en al menos aproximadamente 10, de manera preferible aproximadamente
50, de manera más preferible aproximadamente 75, 90, o 100%, se
identifica como un agente potencial para disminuir la actividad de
la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Un compuesto
de ensayo que aumenta la actividad de la proteína similar al
receptor de la lipoxina A_{4} en al menos aproximadamente 10, de
manera preferible aproximadamente 50, de manera más preferible
aproximadamente 75, 90, o 100%, se identifica como un agente
potencial para aumentar la actividad de la proteína similar al
receptor de la lipoxina A_{4}.
Otro procedimiento de selección implica el uso
de melanóforos que se transfectan para expresar el receptor
acoplado a la proteína G de la presente invención. Dicha técnica de
selección se describe en el Documento WO 92/01810. De esta manera,
por ejemplo, se puede emplear dicho ensayo para seleccionar un
compuesto que inhiba la activación del polipéptido receptor de la
presente invención poniendo en contacto las células melanóforas que
codifican el receptor con el ligando receptor y un compuesto que se
va a seleccionar. La inhibición de la señal generada por el ligando
indica que un compuesto es un antagonista potencial para el
receptor, es decir, inhibe la activación del receptor. Se
puede emplear la selección para identificar un compuesto que activa
el receptor poniendo en contacto dichas células con los compuestos
que se van a seleccionar y determinar si cada compuesto genera una
señal, es decir, activa el receptor.
Dicha otra técnica más de selección implica
introducir el ARN que codifica un receptor acoplado a la proteína G
en oocitos de Xenopus para expresar la transitoriedad del
receptor. A continuación, se pueden poner en contacto los oocitos
del receptor con el ligando del receptor y un compuesto que se va a
seleccionar, seguido por la detección de la inhibición o la
activación de una señal de calcio en el caso de la selección de los
compuestos que se consideran para inhibir la activación del
receptor.
Otra técnica de selección implica la expresión
del receptor acoplado a la proteína G en las células en las que el
receptor se enlaza con una fosfolipasa C o D. Dichas células
incluyen las células endoteliales, las células del músculo liso,
las células embriónicas de riñón, etc. Se puede llevar a cabo la
selección tal como se ha descrito anteriormente cuantificando el
grado de activación del receptor a partir de los cambios en la
actividad de la fosfolipasa.
Se proporcionan en los ejemplos específicos a
continuación ejemplos detallados de ensayos funcionales tales como
aquellos descritos anteriormente.
En otra forma de realización, se identifican los
compuestos de ensayo que aumentan o disminuyen la expresión del gen
de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se pone
en contacto un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} con un compuesto de ensayo y se determina la expresión de un
ARN o producto de polipéptido del polinucleótido similar al
receptor de la lipoxina A_{4}. Se compara el nivel de expresión
del ARNm o el polipéptido apropiado en presencia del compuesto de
ensayo con el nivel de expresión del ARNm o el polipéptido en
ausencia del compuesto de ensayo. A continuación se puede
identificar el compuesto de ensayo como modulador de la expresión
en función de esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del
ARNm o el polipéptido es mayor en presencia del compuesto de ensayo
que en su ausencia, se identifica el compuesto de ensayo como un
estimulador o mejorador de la expresión del ARNm o el polipéptido.
De manera alternativa, cuando la expresión del ARNm o el
polipéptido es menor en presencia del compuesto de ensayo que en su
ausencia, se identifica el compuesto de ensayo como un inhibidor de
la expresión del ARNm o el polipéptido.
Se puede determinar el nivel de expresión del
ARNm o el polipéptido de la proteína similar al receptor de la
lipoxina A_{4} mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica para detectar el ARNm o el polipéptido. Se pueden usar
procedimientos cualitativos o cuantitativos. Se puede determinar,
por ejemplo, la presencia de los productos del polipéptido de un
polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando una
variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen
procedimientos inmunoquímicos tales como el radioinmunoensayo,
Western blotting, e inmunohistoquímicos. De manera alternativa, se
puede determinar la síntesis del polipéptido in vivo, en un
cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro,
detectando la incorporación de aminoácidos marcados en un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.
Se puede llevar a cabo dicha selección en un
sistema de ensayo libre de células o en una célula intacta. Se
puede usar cualquier célula que exprese un polinucleótido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} en un sistema de ensayo basado en
células. Se puede producir el polinucleótido similar al receptor de
la lipoxina A_{4} en la célula o se puede introducir usando
técnicas tales como aquellas descritas anteriormente. Se puede usar
un cultivo primario o una línea celular establecida, tal como CHO o
las células 293 de riñón embriónico humano.
Los GPRC son ubicuos en mamíferos, incluyendo
los seres humanos, y son responsables de muchas funciones
biológicas, que incluyen muchas patologías. De acuerdo con esto, es
deseable encontrar compuestos y fármacos que por una parte
estimulen los GPCR y que por la otra puedan inhibir algunos GPRC.
Por ejemplo, se pueden emplear compuestos que activan un GPCR con
objetivos terapéuticos, tales como el tratamiento del asma, la
enfermedad de Parkinson, el fracaso agudo de corazón, la retención
urinaria, y la osteoporosis. De manera concreta, los compuestos que
activan los receptores de la presente invención son útiles en el
tratamiento de diversas enfermedades cardiovasculares, tales como
las producidas por la carencia de flujo sanguíneo pulmonar o
hipertensión. De manera adicional, se pueden usar también estos
compuestos en el tratamiento de diversos transtornos fisiológicos
relacionados con el control anormal del fluido y la homeostasis del
electrolito y en las enfermedades asociadas con la secreción
anormal de aldosterona inducida por angiotensina.
De manera general, se pueden emplear los
compuestos que inhiben la activación de un GPCR para una variedad
de objetivos terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de la
hipotensión y/o la hipertensión, angina de pecho, infarto de
miocardio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna,
y transtornos psicóticos y neurológicos que incluyen la
esquizofrenia, agitación maníaca, depresión, delirio, demencia o
retraso mental grave, disquinesias, tales como la enfermedad de
Huntington o el síndrome de Tourett, entre otros. Los compuestos
que inhiben los GPCR han sido también útiles en la reversión de la
anorexia endógena y en el control de la bulimia. De manera
concreta, los compuestos que inhiben la activación de los receptores
de la presente invención son útiles en el tratamiento de diversas
enfermedades cardiovasculares tales como las producidas por el flujo
sanguíneo pulmonar excesivo o hipotensión. De manera adicional, se
pueden usar también estos compuestos en el tratamiento de diversos
transtornos fisiológicos relacionados con el control anormal del
fluido y la homeostasis del electrolito y en las enfermedades
asociadas con la secreción anormal de aldosterona inducida por
angiotensina.
Se puede usar, por ejemplo, la modulación del
enlace de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}
con su ligando natural en el control de la hemostasis, reactividad
vascular, de manera especial la vasoconstricción, y las reacciones
anafilácticas y alérgicas en mamíferos, de manera preferible en
seres humanos (véase la Patente de los Estados Unidos
5.079.261). Se puede usar, por ejemplo, el bloqueo del enlace del
ligando de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}
con el receptor para reducir la respuesta inflamatoria de los
neutrófilos. De manera alternativa, se pueden usar los agonistas de
la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} para inducir
o mejorar esta respuesta inflamatoria.
Se puede usar los nuevos agentes identificados
mediante los ensayos de selección descritos anteriormente para
regular la actividad de la proteína humana similar al receptor de la
lipoxina A_{4}. De acuerdo con esto, se describe el uso de un
compuesto de ensayo identificado tal como se describe en el presente
documento en un modelo animal apropiado. Se pueden usar, por
ejemplo, un agente identificado tal como se describe en el presente
documento (por ejemplo, un agente modulador, una molécula de
ácido nucleico de sentido contrario, un anticuerpo específico,
ribozima, o un compañero de enlace con proteína) en un modelo animal
para determinar la eficacia, la toxicidad, o los efectos
secundarios del tratamiento con dicho agente. De manera alternativa,
se puede usar un agente identificado tal como se describe en el
presente documento en un modelo animal para determinar el mecanismo
de acción de dicho agente.
Se puede administrar un reactivo que afecte la
actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}
a una célula humana, tanto in vitro como in vivo, para
reducir la actividad de la proteína similar al receptor de la
lipoxina A_{4}. El reactivo enlaza de manera preferible con un
producto de expresión de un gen de la proteína similar al receptor
de la lipoxina A_{4}. Si el producto de expresión es una proteína,
el reactivo es de manera preferible un anticuerpo. Para el
tratamiento de las células humanas ex vivo, se puede añadir
un anticuerpo a una preparación de células madre que se han retirado
del cuerpo. A continuación se pueden sustituir las células en el
mismo u otro cuerpo humano, con o sin propagación clonal, tal como
se conoce en la técnica.
Se puede dosificar el reactivo usando un
liposoma. De manera preferible, el liposoma es estable en el animal
en el que se ha administrado durante al menos aproximadamente 30
minutos, de manera más preferible durante al menos aproximadamente
1 hora, e incluso de manera más preferible durante al menos
aproximadamente 24 horas. Un liposoma comprende una composición
lípida que es capaz de dirigir un reactivo, de manera particular un
polinucleótido, a un emplazamiento concreto en un animal, tal como
un ser humano. De manera preferible, la composición lípida del
liposoma es capaz de hacer diana en un órgano específico de un
animal, tal como el pulmón, el hígado, el brazo, el corazón, el
cerebro, los nódulos linfáticos, y la piel.
Un liposoma útil comprende una composición
lípida que es capaz de fusionarse con la membrana plasmática de la
célula diana para liberar sus contenidos en la célula. De manera
preferible, la eficiencia de la transfección de un liposoma es
aproximadamente de 5 \mug de ADN por 16 nmol de liposomas
liberados en aproximadamente 10^{6} células, de manera más
preferible aproximadamente 1,0 \mug de ADN por 16 nmol de
liposomas liberados en aproximadamente 10^{6} células, e incluso
de manera más preferible aproximadamente 2,0 \mug de ADN por 16
nmol de liposomas liberados en aproximadamente 10^{6} células. De
manera preferible, un liposoma está entre aproximadamente 100 y 500
nm, de manera más preferible entre aproximadamente 150 y 450 nm, e
incluso los más preferible, entre aproximadamente 200 y 400 nm de
diámetro.
Los liposomas adecuados incluyen aquellos
liposomas usados de manera habitual en, por ejemplo, los
procedimientos de dosificación de genes conocidos por aquellas
personas expertas en la técnica. Los liposomas más preferidos
incluyen los liposomas que tienen una composición lípida
policatiónica y/o los liposomas que tienen un esqueleto de
colesterol conjugado con el polietilenglicol. De manera opcional, un
liposoma comprende un compuesto capaz de dirigir el liposoma a una
célula tumoral, tal como un ligando de la célula tumoral expuesto en
la superficie externa del liposoma.
Se puede conseguir complejar un liposoma con un
reactivo tal como un oligonucleótido de sentido contrario usando
los procedimientos que son habituales en la técnica (véase, por
ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.705.151). De manera
preferible, se combinan entre aproximadamente 0,1 \mug y
aproximadamente 10 \mug de polinucleótidos con aproximadamente 8
nmol de liposomas, de manera más preferible, se combinan entre
aproximadamente 0,5 \mug y aproximadamente 5 \mug de
polinucleótidos con aproximadamente 8 nmol de liposomas, e incluso
de manera más preferible, se combinan aproximadamente 1,0 \mug de
polinucleótidos con aproximadamente 8 nmol de liposomas.
Se pueden dosificar los anticuerpos en tejidos
específicos in vivo usando la dosificación dirigida mediada
por el receptor. Se muestran las técnicas de liberación del ADN
mediadas por el receptor en, por ejemplo, Findeis y col. Trends
in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiou y
col., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT
GENE TRANSFER (J. A. Wolff, ed) (1994); Wu y Wu, J. Biol. Chem.
263, 621-24 (1988); Wu y col., J. Biol. Chem.
269, 542-46 (1994); Zenke y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 3655-59 (1990); Wu
y col., J. Biol. Chem. 266, 338-42
(1991).
La determinación de una dosis terapéuticamente
efectiva está bien comprendida dentro de las capacidades de
aquellas personas expertas en la técnica. Una dosis terapéuticamente
efectiva se refiere a la cantidad de ingrediente activo que aumenta
o disminuye la actividad de la proteína similar al receptor de la
lipoxina A_{4} en relación con la actividad de la proteína
similar al receptor de la lipoxina A_{4} que se produce en
ausencia de la dosis terapéuticamente efectiva.
Se puede estimar inicialmente, para cualquier
compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva en ensayos de
cultivos celulares o en modelos animales, normalmente ratones,
conejos, perros, o cerdos. Se puede usar también el modelo animal
para determinar el intervalo de concentración apropiada y la ruta de
administración. A continuación se puede usar dicha información para
determinar las dosis útiles y las rutas de administración en los
seres humanos.
Se pueden determinar la eficacia terapéutica y
la toxicidad, por ejemplo, la DE_{50} (la dosis terapéuticamente
efectiva en el 50% de la población) y la DL_{50} (la dosis letal
en el 50% de la población), mediante los procedimientos
farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales
experimentales. La relación de dosis entre efectos tóxicos y
terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la
relación, DL_{50}/DE_{50}.
Se prefieren las composiciones farmacéuticas que
presentan elevados índices terapéuticos. Se usan los datos
obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y los estudios
animales en la formulación de un intervalo de dosificación para uso
humano. La dosificación contenida en dichas composiciones está
comprendida de manera preferible dentro de un intervalo de
concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} con poca o
nada de toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo
dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad
del paciente, y la ruta de administración.
\newpage
El médico determinará la dosificación exacta, a
la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiere
tratamiento. Se ajustan la dosificación y la administración para
proporcionar niveles suficientes del ingrediente activo o para
mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en
cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud
general del sujeto, la edad, el peso, y el género del sujeto, la
dieta, el tiempo y la frecuencia de la administración, la(s)
combinación(es) del(os) fármaco(s), las
sensibilidades a la reacción, y la tolerancia / respuesta a la
terapia. Se puede administrar una composición farmacéutica que
actúe a largo plazo cada 3 ó 4 días, cada semana, o una vez cada dos
semanas dependiendo de la vida media y a la velocidad de
aclaramiento de la formulación concreta.
Las cantidades normales de dosificación pueden
variar entre 0,1 y 100.000 microgramos, hasta una dosis total de
aproximadamente 1 g, dependiendo de la ruta de administración. Se
proporcionan en la bibliografía tanto la directriz como las
dosificaciones y procedimientos concretos de liberación y están
generalmente disponibles para los médicos expertos en la técnica.
Aquellas personas expertas en la técnica emplearán diferentes
formulaciones para nucleótidos que para las proteínas o sus
inhibidores. De manera similar, la liberación de los polinucleótidos
o los polipéptidos será específica para células, dolencias,
localizaciones concretas, etc.
Si el reactivo es un anticuerpo de cadena única,
se pueden construir e introducir los polinucleótidos que codifican
el anticuerpo en una célula, bien ex vivo o in vivo,
usando técnicas bien establecidas que incluyen, pero no se limitan
a, transferencia del ADN mediada por
transferrina-policatión, transfección con ácidos
nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por
liposomas, transporte intracelular de perlas de látex recubiertas
con ADN, fusión protoplástica, infección vírica, "pistola
genética", y transfección mediada por calcio fosfato o DEAE.
Las dosificaciones efectivas in vivo de
un anticuerpo están en el intervalo de entre aproximadamente 5
\mug y aproximadamente 50 \mug/kg, entre aproximadamente 50
\mug y aproximadamente 5 mg/kg, entre aproximadamente 100 \mug
y aproximadamente 500 \mug (kg de peso corporal del paciente, y
entre aproximadamente 200 y aproximadamente 250 \mug/kg de peso
corporal del paciente. Para la administración de los polinucleótidos
que codifican los anticuerpos de cadena única, las dosificaciones
efectivas in vivo están en el intervalo entre aproximadamente
100 ng y aproximadamente 200 ng, entre 500 ng y aproximadamente 50
mg, entre aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 2 mg, entre
aproximadamente 5 \mug y aproximadamente 500 \mug, y entre
aproximadamente 20 \mug y aproximadamente 100 \mug de ADN.
Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo
es de manera preferible un oligonucleótido de sentido contrario o
una ribozima. Se pueden introducir en las células polinucleótidos
que expresen los oligonucleótidos de sentido contrario o las
ribozimas mediante una variedad de procedimientos, tal como se ha
descrito anteriormente.
De manera preferible, un reactivo reduce la
expresión de un gen de la proteína similar al receptor de la
lipoxina A_{4} o la actividad de un polipéptido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} en al menos aproximadamente 10, de
manera preferible aproximadamente 50, de manera más preferible
aproximadamente 75, 90, o 100 en relación con la ausencia del
reactivo. Se puede evaluar la efectividad del mecanismo escogido
para disminuir el nivel de expresión de un gen de la proteína
similar al receptor de la lipoxina A_{4} o la actividad de un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando
procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como la
hibridación de sondas de nucleótidos con ARNm específico de la
proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4},
RT-PCR cuantitativa, detección inmunológica de un
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, o la medida
de la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina
A_{4}.
Se puede administrar cualquiera de las
composiciones farmacéuticas de la invención en combinación con otros
agentes terapéuticos apropiados. Una persona normalmente experta en
la técnica puede hacer la selección de los agentes apropiados para
uso en la terapia de combinación, de acuerdo con los principios
farmacéuticos convencionales. La combinación de los agentes
terapéuticos puede actuar de manera sinérgica para efectuar el
tratamiento o la prevención de los diversos transtornos descritos
anteriormente. Mediante esta hipótesis, se puede ser capaz de
alcanzar la eficacia terapéutica con dosificaciones más bajas de
cada agente, reduciendo de esta manera el potencial de los efectos
secundarios adversos.
Se puede aplicar cualquiera de los
procedimientos terapéuticos descritos anteriormente a cualquier
sujeto que necesite de dicha terapia, incluyendo, por ejemplo,
mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos,
monos, y lo más preferible, seres humanos.
Se insertó el polinucleótido de la SEC DE ID
Nº 1 en el vector de expresión pCEV4, y el vector de expresión
pCEV4-polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} obtenido se transfectó en células 293 de riñón embriónico
humano. Se fragmentaron las células en un matraz de cultivo en 5 ml
de Tris HCl, EDTA 5 mM, pH 7,5, y se lisaron mediante sonicación.
Se centrifugaron los lisados celulares a 1000 rpm durante 5 minutos
a 4ºC. Se centrifugó el sobrenadante a 30.000 x g durante 20 minutos
a 4ºC. Se suspendió el residuo en un tampón de enlace que contenía
Tris HCl 50 mM, MgSO_{4} 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5,
suplementado con BSA al 0,1%, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml
de leupeptina, y 10 \mug/ml de fosforamidón. Se añadieron las
diluciones óptimas de la suspensión de membranas, definidas como las
concentraciones requeridas de proteína para enlazar menos de un 10%
de un radioligando añadido, es decir, lipoxina A_{4} marcada con
^{125}I, a las placas de microvaloración de polipropileno con 96
pocillos que contenían el ligando, los péptidos no marcados, y el
tampón de enlace hasta un volumen final de 250 \mul.
En los ensayos de enlace de saturación en
equilibrio se incubaron las preparaciones de membrana en presencia
de concentraciones crecientes (0,1 nM a 4 nM) del ligando
^{125}I.
Se incubaron las mezclas de la reacción de
enlace durante una hora a 30ºC. Se detuvo la reacción mediante
filtración a través de filtros GF/B tratados con polietileneimina al
0,5%, usando un cosechador celular. Se midió la radioactividad
mediante conteo por centelleo, y se analizaron los datos mediante un
programa de regresión no lineal por ordenador. Se define el enlace
no específico como la cantidad de radioactividad que permanece tras
la incubación de la proteína de la membrana en presencia de 100 nM
de péptido no marcado. Se midió la concentración de la proteína
mediante el procedimiento de Bradford usando el Reactivo
Bio-Rad, con albúmina de suero bovino como patrón.
Se demostró la actividad similar al receptor de la lipoxina A_{4}
del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEC DE ID Nº 2.
Se fragmentaron células 293 de riñón embriónico
humano con un polinucleótido que expresa la proteína similar al
receptor de la lipoxina A_{4} en un matraz de cultivo en 5 ml de
Tris HCl, EDTA 5 mM, pH 7,5, y se lisaron mediante sonicación. Se
centrifugaron los lisados celulares a 1000 rpm durante 5 minutos a
4ºC. se centrifugó el sobrenadante a 30.000 x g durante 20 minutos
a 4ºC. Se suspendió el residuo en tampón de enlace que contenía
Tris HCl 50 mM, MgSO_{4} 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5,
suplementado con BSA al 0,1%, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml
de leupeptina, y 10 g/ml de fosforamidón. Se añadieron las
diluciones óptimas de la suspensión de membranas, definidas como la
concentración de proteínas requerida para enlazar menos del 10% del
radioligando añadido, es decir, la lipoxina A_{4} marcada con
^{125}I a las placas de microvaloración de polipropileno con 96
pocillos que contenían el ligando o el compuesto de ensayo, y el
tampón de enlace hasta un volumen final de 250 \mul.
En los ensayos de enlace de saturación en
equilibrio, se incubaron las preparaciones de membranas en presencia
de concentraciones crecientes (0,1 nM a 4 nM) del ligando ^{125}I
o el compuesto de ensayo (actividad específica 2200 Ci/mmol). Se
determinaron las afinidades de enlace de los diferentes compuestos
de ensayo en ensayos de enlace de competición en equilibrio, usando
péptido ^{125}I 0,1 nM en presencia de doce concentraciones
diferentes de cada compuesto de ensayo.
Se incubaron las mezclas de la reacción de
enlace durante una hora a 30ºC. Se detuvo la reacción mediante
filtración a través de filtros GF/B tratados con polietileneimina al
0,5%, usando un cosechador celular. Se midió la radioactividad
mediante conteo por centelleo, y se analizaron los datos mediante un
programa de regresión no lineal por ordenador.
Se define el enlace no específico como la
cantidad de radioactividad que permanece tras la incubación de la
proteína de la membrana en presencia 100 nM de péptido no marcado.
Se midió la concentración de proteína mediante el procedimiento de
Bradford usando el Reactivo Bio-Rad, con albúmina de
suero bovino como estándar. Un compuesto de ensayo que aumenta la
radioactividad de la proteína de membrana en al menos un 15% en
relación con la radioactividad de la proteína de membrana que no se
incubó con un compuesto de ensayo se identifica como un compuesto
que enlaza un polipéptido similar al receptor de la lipoxina
A_{4} humana.
Se puede evaluar la inhibición de la formación
de AMP cíclico mediada por el receptor en células LM(tk-) que
expresan la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se
plaquearon las células en placas de 96 pocillos y se incubaron en
solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) suplementada
con HEPES 10 mM, teofilina 5 mM, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5
mg/ml de leupeptina, y 10 g/ml de fosforamidón durante 20 minutos a
37ºC en CO_{2} al 5%. Se añadió un compuesto de ensayo y se incubó
durante 10 minutos más a 37ºC. Se aspiró el medio y se detuvo la
reacción mediante la adición de 100 ml de HCl. Se almacenaron las
placas a 4ºC durante 15 minutos. Se midió el contenido de AMPc en la
solución de detención mediante radioinmunoensayo.
Se cuantificó la radioactividad usando un
contador gamma equipado con software de reducción de datos. Se
identifica un compuesto de ensayo que disminuye la radioactividad
de los contenidos de un pocillo en relación con la radioactividad
de los contenidos de un pocillo en ausencia del compuesto de ensayo
como un inhibidor potencial de la formación de AMPc. Se identifica
un compuesto de ensayo que aumenta la radioactividad de los
contenidos de un pocillo en relación con la radioactividad de los
contenidos de un pocillo en ausencia del compuesto de ensayo como
un mejorador potencial de la formación de AMPc.
Se pudo medir la concentración de calcio libre
intracelular mediante microespectrofluorometría usando el tinte
indicador fluorescente Fura-2/AM (Bush y
col., J. Neurochem. 57, 562-74, 1991). Se
sembraron células transfectadas de manera estable en una placa de
cultivo de 35 mm que contenía un inserto de porta de vidrio. Se
lavaron las células con HBS, se incubaron con un compuesto de
ensayo, y se cargaron con 100 \mul de Fura-2/AM
(10 \muM) durante 20-40 minutos. Tras el lavado
con HBS para eliminar la solución de Fura-2/AM, se
equilibraron las células en HBS durante 10-20
minutos. A continuación se visualizaron las células bajo el objetivo
de 40X de un microscopio Leitz Fluovert FS.
Se determinó la emisión de fluorescencia a 510
nM, con longitudes de onda de excitación que alternaban entre 340
nM y 380 nM. Se convirtieron los datos de fluorescencia pura en
concentraciones de calcio usando curvas normalizadas de
concentración de calcio y las técnicas de software de análisis. Se
identifica un compuesto de ensayo que aumenta la fluorescencia en
al menos un 15% en relación con la fluorescencia en ausencia de un
compuesto de ensayo como un compuesto que moviliza el calcio
intracelular.
Se plaquearon células LM(tk-) que
expresan de manera estable el ADNc de la proteína similar al
receptor de la lipoxina A_{4} humana en placas de 96 pocillos y
crecieron hasta confluencia. El día antes del ensayo se cambió el
medio de crecimiento en 100 \mul de medio que contenía suero al 1%
y 0,5 \muCi de ^{3}H-myinositol. Se incubaron
las placas durante la noche en un incubador con CO_{2} (CO_{2}
al 5% a 37ºC). Se retiró el medio inmediatamente antes del ensayo,
y se sustituyó por 200 \mul de PBS que contenía Lic. 10 mM, y se
equilibraron las células con el nuevo medio durante 20 minutos.
Durante este intervalo, se equilibraron también las células con el
antagonista, se añadieron como una alícuota de 10 \mul de una
solución concentrada 20 veces en PBS.
Se inició la acumulación del fosfato de
^{3}H-inositol a partir del metabolismo del
fosfolípido de inositol añadiendo 10 \mul de una solución que
contenía un compuesto de ensayo. Se añadieron 10 \mul en el primer
pocillo para medir la acumulación basal. Se evaluaron once
concentraciones diferentes de compuestos de ensayo en los
siguientes 11 pocillos de cada hilera de placas. Se llevaron a cabo
todos los ensayos por duplicado repitiendo las mismas adiciones en
dos hileras consecutivas de placas.
Se incubaron las placas en un incubador con
CO_{2} durante una hora. Se finalizó la reacción añadiendo 15
\mul de ácido tricloroacético al 50% v/v (TCA), seguido por una
incubación de 40 minutos a 4ºC. Tras la neutralización del TCA con
40 \mul de Tris 1 M, se transfirió el contenido de los pocillos a
una placa con filtro Multiscreen HV (Millipore) que contenía Dowex
AG1-X8 (malla de 200-400, en forma
de formiato). Se prepararon las placas con filtro añadiendo a cada
pocillo 200 \mul de suspensión de Dowex AG1-X8
(50% v/v, agua:resina). Se colocaron las placas con filtro en una
tubería de vacío para lavar o eluir el lecho de resina. Se lavó
cada pocillo 2 veces con 200 \mul de agua, seguido por 2 x 200
\mul de tetraborato de sodio 5 mM / formiato de amonio 60 mM.
Se eluyeron los ^{3}H-IP en
placas vacías de 96 pocillos con 200 \mul de formiato de amonio
1,2 M / ácido fórmico 0,1. Se añadió el contenido de los pocillos a
3 ml del cóctel de centelleo y se determinó la radioactividad
mediante conteo por centelleo líquido.
Ensayos de enlace normalizados. Se llevaron a
cabo los ensayos de enlace en un tampón de enlace que contenía
HEPES 50 mM, pH 7,4, BSA al 0,5%, y MgCl_{2} 5 mM. Se llevó a cabo
el ensayo normalizado del enlace del radioligando (por ejemplo,
^{125}I-lipoxina A_{4},
-^{125}I-lipoxina A_{4}, análogo, o -compuesto
de ensayo) con los fragmentos de membrana que comprendían los
polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} tal como
sigue en placas de microvaloración de 96 pocillos (por ejemplo,
placas Dynatech Immulon II Removawell). Se diluyó el radioligando
en tampón de enlace + PMSF/Baci en los cpm deseados por 50 \mul,
a continuación se añadieron alícuotas de 50 \mul a los pocillos.
Para las muestras de enlace no específico se añadieron también 5
\mul de ligando frío 40 \muM por pocillo. Se inició el enlace
añadiendo 150 \mul por pocillo de membrana diluida a la
concentración deseada (10-30 \mug de proteína de
membrana / pocillo) en tampón de enlace + PMSF/Baci. A continuación
se cubrieron las placas con selladores de placa miliares Linbro
(Flor Labs) y se colocaron en un Dynatech Microshaker II. Se dejó
proceder el enlace a temperatura ambiente durante
1-2 horas y se detuvo centrifugando la placa durante
15 minutos a 2.000 x g. Se decantaron los sobrenadantes y se
lavaron los residuos de membrana una vez mediante adición de tampón
de enlace enfriado en hielo, breve agitación, y recentrifugación.
Se colocaron los pocillos individuales en tubos de 12 x 75 mm y se
contaron en un contador LKB Gammamaster (eficiencia del 78%). El
enlace específico mediante este procedimiento es idéntico al que se
midió cuando se eliminó el ligando libre mediante filtración rápida
(3-5 segundos) y lavado en filtros de fibra de
vidrio recubiertos con polietileneimina.
Se usaron también tres variaciones del ensayo de
enlace normalizado.
- 1.
- Se llevaron a cabo los ensayos competitivos de enlace del radioligando con un intervalo de concentración de ligando frío frente a ligando marcado con ^{125}I tal como se ha descrito anteriormente con una modificación. Se hicieron todas las diluciones de los ligandos que se estaban evaluando en 40X PMSF/Baci a una concentración 40X de la concentración final en el ensayo. A continuación se añadieron muestras de péptido (5 \mul cada una) por pocillo de microvaloración. Se diluyeron las membranas y el radioligando en el tampón de enlace sin inhibidores de la proteasa. Se añadió el radioligando y se mezcló con el ligando frío, y a continuación se inició el enlace mediante la adición de membranas.
- 2.
- Se llevó a cabo el entrecruzamiento químico del radioligando con el receptor tras una etapa de enlace idéntica a la del ensayo normalizado. Sin embargo, se llevó a cabo la etapa de lavado con el tampón de enlace menos BSA para reducir la posibilidad del entrecruzamiento no específico del radioligando con el BSA: Se llevó a cabo la etapa de entrecruzamiento tal como se describe a continuación.
- 3.
- Se llevaron también a cabo ensayos de enlace a más gran escala para obtener residuos de membrana para los estudios de solubilización del complejo receptor:ligando y para la purificación del receptor. Estos son idénticos a los ensayos normalizados excepto en que (a) se llevó a cabo el enlace en tubos de polipropileno de volúmenes entre 1-250 ml, (b) la concentración de la proteína de membrana es casi de 0,5 mg/ml, y (c) para la purificación del receptor, se redujo la concentración de BSA en el tampón de enlace a 0,25%, y se llevó a cabo la etapa de lavado con tampón de enlace sin BSA, lo que reduce la contaminación de BSA del receptor purificado.
Tras una etapa de enlace del radioligando tal
como se ha descrito anteriormente, se volvieron a suspender los
residuos de las membranas en 200 \mul por pocillo de placa de
microvaloración de tampón de enlace enfriado en hielo sin BSA. A
continuación se añadieron 5 \mul por pocillo de
N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida
4 mM (ANB-NOS, Pierce) en DMSO y se mezclaron. Se
mantuvieron las muestras en hielo y se irradiaron con UV durante 10
minutos con una lámpara Mineralight R-52G (UVP Inc.,
San Gabriel, Calif.) a una distancia de 5-10 cm. A
continuación se transfirieron las muestras a tubos de micrófuga
Eppendorf, se aglutinaron las membranas mediante centrifugación, se
eliminaron los sobrenadantes, y se solubilizaron las membranas en
tampón de muestra Laemmli SDS para electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE). Se llevó a cabo PAGE tal como se describe a
continuación. Se visualizaron las proteínas radiomarcadas mediante
autoradiografía de los geles secos con película kodak XAR y
selecciones del intensificador de imagen Dupont.
Se llevó a cabo la solubilización de la membrana
en tampón que contenía Tris 25 mM, pH 8, glicerol al 10% (p/v)
y
CaCl_{2} 0,2 mM (tampón de solubilización). Se fabricaron detergentes altamente solubles que incluían Triton X-100, desoxicolato, deosoxicolato:lisolecitina, CHAPS y zwittergentes en tampón de solubilización a concentraciones al 10%
y se almacenaron como alícuotas congeladas. Se fabricó lisolecitina fresca debido a la insolubilidad tras la congelación-descongelación y se fabricó digitonina fresca a concentraciones más bajas debido a su solubilidad más limitada.
CaCl_{2} 0,2 mM (tampón de solubilización). Se fabricaron detergentes altamente solubles que incluían Triton X-100, desoxicolato, deosoxicolato:lisolecitina, CHAPS y zwittergentes en tampón de solubilización a concentraciones al 10%
y se almacenaron como alícuotas congeladas. Se fabricó lisolecitina fresca debido a la insolubilidad tras la congelación-descongelación y se fabricó digitonina fresca a concentraciones más bajas debido a su solubilidad más limitada.
Para solubilizar las membranas, se volvieron a
suspender los residuos lavados tras la etapa de enlace, libres de
partículas visibles pipeteando y sometiendo a vórtex en tampón de
solubilización a 100.000 x g durante 30 minutos. Se retiraron los
sobrenadantes y se mantuvieron en hielo y se descartaron los
residuos.
Tras el enlace de los ligandos ^{125}I y la
solubilización de las membranas con detergente se puede evaluar el
complejo R:L intacto mediante cuatro procedimientos diferentes. Se
llevaron a cabo todos en hielo o en habitación enfriada a
4-10ºC.
- 1.
- Cromatografía en columna (Knuhtsen y col., Biochem. J. 254, 641-647, 1988). Se equilibraron las columnas Sephadex G-50 (8 x 250 mm) con tampón de solubilización que contenía detergente a la concentración usada para solubilizar las membranas y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. Se aplicaron las muestras de las membranas solubilizadas (0,2-0,5 ml) a las columnas y se eluyeron a un caudal de aproximadamente 0,7 ml/minuto. Se recogieron las muestras (0,18 ml). Se determinó la radioactividad en un contador gamma. Se determinaron los volúmenes vacíos de las columnas mediante el volumen de elución del dextrano azul. Se consideró la radioactividad eluyente en el volumen vacío enlazada a la proteína. Se consideró no enlazada la radioactividad eluyente posterior, en el mismo volumen como ligandos libres de ^{125}I.
- 2.
- Precipitación del polietilenglicol (Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 318-322, 1972). Para una muestra de 100 \mul de membranas solubilizadas en un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm, se añadieron 0,5 ml de gamma globulina bovina al 1% (p/v) (Sigma) en tampón de fosfato de sodio 0,1 M, seguido por 0,5 ml de polietilenglicol al 25% (p/v) (Sigma) y se mezclaron. Se mantuvo la mezcla en hielo durante 15 minutos. A continuación se añadieron por muestra 3 ml de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,4. Se filtraron rápidamente las muestras (1-3 segundos) sobre filtros de fibra de vidrio GF/B Whatman y se lavaron con 4 ml de tampón fosfato. Se determinó el complejo receptor precipitado mediante PEG : ^{125}I-Ligando, mediante conteo gamma de los filtros.
- 3.
- Enlace del filtro GFB/PEI (Buns y col., Analytical Biochem. 132, 74-81, 1983). Se mojaron los filtros de fibra de vidrio GF/B Whatman en polietileneimina (PEI, Sigma) durante 3 horas. Se sustituyeron las muestras de las membranas solubilizadas (25-100 \mul) en tubos de polipropilénglicol de 12 x 75 mm. A continuación se añadieron 4 ml de tampón de solubilización por muestra y se filtraron las muestras inmediatamente a través de filtros GFB/PEI (1-3 segundos) y se lavaron con 4 ml de tampón de solubilización Se determinó el complejo CPM del receptor : ^{125}I-ligando adsorbido en los filtros mediante conteo gamma.
- 4.
- Carbón activo/ Dextrano (Paul y Said, Peptides 7 [Suppl. 1], 147-149, 1986). Se disolvió dextrano T70 (0,5 g, Pharmacia) en 1 litro de agua. Se añadieron a continuación 5 g de carbón activo (Norit A, alcalino; Fisher Scientific). Se agitó la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente y se almacenó a continuación a 4ºC hasta su uso. Para medir el complejo R:L, se añadieron 4 partes por volumen de suspensión de carbón / dextrano en 1 parte por volumen de membrana solubilizada. Se mezclaron las muestras y se mantuvieron en hielo durante 2 minutos y a continuación se centrifugaron durante 2 minutos a 11.000 x g en una microfuga Beckman. Se adsorbió el carbón / dextrano libre de radioligando y se descartó con el residuo. Los complejos Receptor : 125I-Ligando permanecieron en el sobrenadante y se determinaron mediante conteo gamma.
Se llevó a cabo el enlace del receptor
biotinilado con las membranas GH_{4} Cl tal como se ha descrito
anteriormente. Las incubaciones se realizaron durante 1 hora a
temperatura ambiente. En el protocolo de purificación normalizado,
las incubaciones del enlace contienen 10 nM de
Bio-S29. Se añadió ligando marcado con ^{125}I
como trazador a niveles de 5.000-100.000 cpm por mg
de proteína de membrana. Las incubaciones control contienen 10
\mumol de ligando frío para saturar el receptor con el ligando no
biotinilado.
Se llevó también a cabo la solubilización del
complejo receptor:ligando tal como se ha descrito anteriormente,
con desoxicolato al 0,15%:lisolecitina en tampón de solubilización
que contenía MgCl_{2} 0,2 mM, para obtener 100.000 x g se
sobrenadantes que contenían el complejo R:L solubilizado.
Se lavó la estreptavidina inmovilizada
(estreptavidina entrecruzada con agarosa en forma de perlas al 6%,
Pierce Chemical Co.; "SA-agarosa") en tampón de
solubilización y se añadió a las membranas solubilizadas a 1/30 del
volumen final. Se incubó esta mezcla con agitación constante
mediante rotación extremo con extremo durante 4-5
horas a 4-10ºC. A continuación se aplicó la mezcla a
una columna y se lavó mediante el material no enlazado. Se
determinó el enlace del radioligando con la
SA-agarosa comparando los cpm en los 100.000 x g
del sobrenadante con los del efluente en la columna tras la
adsorción de la SA-agarosa. Finalmente, se lavó la
columna con 12-15 volúmenes de columna de tampón de
solubilización + desoxicolato al 0,15%:lisolecitina + 1/500
(vol/vol) 100 x 4 pasos.
Se eluyó la columna de estreptavidina con tampón
de solubilización + EDTA 0,1 mM + EGTA 0,1 mM + GTP 0,1
mM-gamma-S (Sigma)+ desoxicolato al
0,15% (p/vol):lisolecitina + 1/100 (vol/vol) 100 veces, 4 pases. En
primer lugar, se pasó un volumen de columna de tampón de elución a
través de la columna y se detuvo el flujo durante
20-30 minutos. A continuación se pasaron a través
3-4 más volúmenes de columna de tampón de elución.
Se combinaron todos los eluatos.
Se incubaron los eluatos de la columna de
estreptavidina durante la noche (12-15 horas) con
aglutinina inmovilizada de gérmen de trigo (agarosa WGA, Vector
Labs) para adsorber el receptor mediante la interacción del
carbohidrato enlazado covalentemente con la lectina WGA; La
relación (vol/vol) de agarosa WGA a eluato de la columna de
estreptavidina es de manera general 1:400. Se puede usar también un
intervalo entre 1:1000 y 1:200. Tras la etapa de enlace, se
aglutino la resina mediante centrifugación, se retiró el
sobrenadante y se guardó, y se lavó la resina 3 veces
(aproximadamente 2 minutos cada vez) en tampón que contenía HEPES 50
mM, pH 8, MgCl_{2} 5 mM, y desoxicolato al 0,15%:lisolecitina.
Para eluir el receptor enlazado con el WGA, se extrajo la resina
tres veces mediante mezclado repetido (mezclador en vórtex de baja
velocidad) durante un período de 15-30 minutos en
hielo, con e columnas de resina cada vez, de
N-N’-N’’-triacetilquitotriosa 10 mM en el mismo
tampón HEPES usado para lavar la resina. Tras cada etapa de
elución, se centrifugó la resina y se retiró cuidadosamente el
sobrenadante, libre de residuos de agarosa WGA. Los tres eluatos
combinados contienen el receptor purificado final. El material no
enlazado con WGA contiene las subunidades de proteína G eluidas de
manera específica a partir de la columna de estreptavidina, así
como los contaminantes no específicos. Todas estas fracciones se
almacenaron congeladas a -90ºC.
Se pusieron en contacto los polipéptidos
purificados similares al receptor de la lipoxina A_{4} que
comprendían una proteína
glutatión-S-transferasa y se
adsorbieron sobre placas de microvaloración de 96 pocillos
derivatizadas con glutatión con los compuestos de ensayo
procedentes de una biblioteca de moléculas pequeñas, a pH 7,0, en
una solución de tampón fisiológico. Los polipéptidos similares al
receptor de la lipoxina A_{4} comprenden la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 2. Los compuestos de
ensayo comprenden una etiqueta fluorescente. Se incubaron las
muestras durante 5 minutos a una hora. Se incubaron las muestras
control en ausencia de un compuesto de ensayo.
Se eliminó por lavado de los pocillos la
solución tampón que contenía los compuestos de ensayo. Se detectó
el enlace de un compuesto de ensayo con un polipéptido similar al
receptor de la lipoxina A_{4} mediante las medidas de
fluorescencia de los contenidos de los pocillos. Se identificó un
compuesto de ensayo un compuesto de ensayo que aumenta la
fluorescencia en un pocillo en al menos un 15% en relación con la
fluorescencia de un pocillo que el que no se incubó, como un
compuesto que enlaza un polipéptido similar al receptor de la
lipoxina A_{4}.
Se administró un compuesto de ensayo a un
cultivo de células CHO transfectadas con un polinucleótido similar
al receptor de la lipoxina A_{4} y se incubó a 37ºC durante 10 a
45 minutos. Un cultivo del mismo tipo de células incubadas durante
el mismo tiempo sin el compuesto de ensayo proporcionó un control
negativo.
Se aisló ARN de los dos cultivos tal como se
describe en Chirgwin y col., Biochem. 18,
5294-99, 1979. Se prepararon Northern blots usando
20 a 30 g de ARN total y se hibridaron con una sonda específica de
proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} marcada con
^{32}P a 65ºC en Express-hyb (CLONTECH). La sonda
comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados entre el
complemento de la SEC DE ID Nº 1. Se identificó un compuesto de
ensayo que disminuye la señal específica de la proteína similar al
receptor de la lipoxina A_{4} en relación con la señal obtenida
en ausencia del compuesto de ensayo, como un inhibidor de la
expresión del gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina
A_{4}.
Se llevó a cabo la síntesis de los
oligonucleótidos de sentido contrario de la proteína similar al
receptor de la lipoxina A_{4} que comprenden al menos 11
nucleótidos contiguos seleccionados entre el complemento de la
SEC DE ID Nº 1 en un sintetizador de serie Pharmacia Gene Assembler
usando el procedimiento de la fosforamidita (Uhlmann y col.,
Chem. Rev. 90, 534-83, 1990). Tras el
ensamblaje y la desprotección, se precipitaron dos veces los
oligonucleótidos con etanol, se secaron, y se suspendieron en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración
deseada. Se ensayó la pureza de estos oligonucleótidos mediante
electroforesis capilar en gel y HPLC de intercambio iónico. Se
determinaron los niveles de endotoxina en la preparación de
oligonucleótidos usando el Ensayo del Amebocito Luminoso (Bang,
Biol. Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361-362,
1953).
Se inyectaron los oligonucleótidos de sentido
contrario directamente en un tejido inflamado en un medio acuoso
(una composición acuosa) a una concentración de
0,1-100 \muM con una aguja. Se colocó la aguja en
el tejido y se retiró a la vez que se expresaba la composición
acuosa en el interior del tejido.
Se monitorizó el tejido inflamado durante un
período de días o semanas. Se pueden proporcionar inyecciones
adicionales de los oligonucleótidos antisentido durante este tiempo.
La inflamación en el tejido disminuyó gradualmente.
El perfil de la expresión se basa en un análisis
cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
denominado también análisis cinético, descrito en primer lugar en
Higuchi y col., 1992 y en Higuchi y col., 1993. El principio es que
en cualquier ciclo dado dentro de la fase exponencial de la PCR, la
cantidad de producto es proporcional al número inicial de copias de
la plantilla. Usando esta técnica, se midieron los niveles de
expresión de genes concretos, que se transcribe a partir de los
cromosomas como ARN mensajero (ARNm), haciendo en primer lugar una
copia del ADN (ADNc) del ARNm, y a continuación llevando a cabo la
PCR cuantitativa en el ADNc, un procedimiento denominado reacción
en cadena de la polimerasa mediante transcripción inversa
cuantitativa (RT-PCR cuantitativa).
Se llevó a cabo el análisis
RT-PCR cuantitativa del ARN de diferentes tejidos
humanos para investigar la distribución en el tejido del ARNm del
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. En la mayor
parte de los casos, se usaron como plantilla 25 \mug del ARN
total procedente de diversos tejidos (incluyendo el Panel
I-V del ARN Total Humano, Clontech Laboratories,
Palo Alto, CA, USA), para sintetizar el ADNc de la primera cadena
usando el Sistema de Síntesis de la Primera Cadena
SUPERSCRIPT^{TM} para la RT-PCR (Life
Technologies, Rockville, MD, USA). Se llevó a cabo la síntesis del
ADNc de la primera cadena de acuerdo con el protocolo del
fabricante usando oligo (dT) para hibridar con las colas 3’ poli A
del ARNm y preparar la reacción de síntesis. A continuación se
usaron 10 ng del ADNc de la primera cadena como plantilla en una
reacción en cadena de la polimerasa. En otros casos, se usaron como
plantilla 10 ng de ADNc comercialmente disponible (Panel MTC de
Sistema Inmune Humano y Panel MTC de Fracciones de Sangre Humana,
Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) en una reacción en
cadena de la polimerasa. Se llevó a cabo la reacción en cadena de la
polimerasa en un LightCycler (Roche Molecular Biochemicals,
Indianápolis, IN, USA), en presencia del tinte fluorescente de
enlace con el ADN SYBR Verde I que enlaza con la ranura menor de la
doble hélice de ADN, producida únicamente cuando se sintetiza
satisfactoriamente el ADN de cadena doble en la reacción (Morrison y
col., 1998). Tras el enlace con el ADN de cadena doble, se pudo
medir cuantitativamente la luz que emite SYBR Verde I mediante el
equipo LightCycler. Se llevó a cabo la reacción en cadena de la
polimerasa usando los cebadores de oligonucleótido
LBRI004-L4 (TCTGTGCCCAGTCCCTGTGATGAA) y
LBRI004-R2 (TCTGTCTGCCCTGGGCTCTTTCAC) y se tomaron
las medidas de la intensidad de la luz emitida tras cada ciclo de
la reacción cuando la reacción había alcanzado una temperatura de
91 grados C. Se convirtieron las intensidades de luz emitida en
números de copia del transcripto del gen por nanogramo de ADNc de
la plantilla por comparación con los estándares que se hacen
reaccionar simultáneamente de la concentración conocida.
Para corregir las diferencias en los niveles de
transcripción por célula en los diversos tipos de tejidos, se llevó
a cabo un procedimiento de normalización usando niveles de expresión
similarmente calculados en los diversos tejidos de cinco diferentes
genes domésticos:
gliceraldehído-3-fosfatasa (G3PDH),
hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HPRT),
beta-actina, porfobilinógeno desaminasa (PBGD), y
beta-2-microglobulina. Se consideró
el nivel de expresión del gen doméstico por ser relativamente
constante para todos los tejidos (Adams y col., 1993, Adams
y col., 1995, Liew y col., 1994) y se usó por tanto
como norma de medida para aproximar números relativos de células
por \mug de ARN total usados en la etapa de síntesis del ADNc.
Excepto para el uso de un conjunto ligeramente diferente de genes
indicadores y el uso del sistema LightCycler para medir los niveles
de expresión, el procedimiento de normalización fue esencialmente el
mismo que el que se describe en el RNA master Blot User manual,
Apéndice C (1997, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA). De
manera breve, se midieron los niveles de expresión de los cinco
genes domésticos en todas las muestras de tejido en tres reacciones
independientes por gen usando el LightCycler y una cantidad
constante (25 \mug) de ARN de partida. Se registraron los números
de copia calculados para cada gen, derivados de la comparación con
estándares que se hacen reaccionar simultáneamente de
concentraciones conocidas y se convirtieron en un porcentaje de la
suma de los números de copia del gen en todas las muestras de
tejido. A continuación, se calculó para cada muestra de tejido, la
suma de los valores del porcentaje para cada gen, y se calculó un
factor de normalización dividiendo el valor del porcentaje de la
suma para cada tejido por el valor del porcentaje de la suma de uno
de los tejidos arbitrariamente seleccionados como estándar. Para
normalizar un valor experimentalmente obtenido para la expresión de
un gen concreto en una muestra de tejido, se multiplicó el valor
obtenido por el factor de normalización para el tejido ensayado. Se
usó este procedimiento de normalización para todos los tejidos
excepto aquellos derivados del Panel MTC de Fracciones de Sangre
Humana, que mostró una variación importante en algunos genes
domésticos dependiendo de si se había activado el tejido o no. En
estos tejidos, se llevó a cabo la normalización con un gen
doméstico único,
beta-2-microglobulina.
Se proporcionan a continuación los resultados,
que muestran los números de copia experimentalmente obtenidos del
ARNm por 10 ng de ADNc de primera cadena a la izquierda y los
valores normalizados a la derecha. En las tablas 1 y 2 se muestran
los ARN usados para la síntesis del ADNc, junto con su suministrador
y los números del catálogo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Perfil de expresión del ARNm del
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4},
selección de cuerpo
completo
\newpage
Perfil de expresión del ARNm del
polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, selección de
sangre /
pulmón
En resumen, el polipéptido similar al receptor
de la lipoxina A_{4} está muy expresado en el útero, hígado,
placenta, y sistema gastrointestinal, y se encuentran niveles más
bajos de expresión en el bazo, timo, y médula espinal. Presenta
también elevada expresión en los leucocitos de la sangre periférica,
en los que parece estar principalmente expresado en las células T y
B. La activación mitógena de las células CD8^{+} T y las células
CD19^{+} B parece infraregular la expresión del polipéptido
similar al receptor de la lipoxina A_{4}, mientras que el efecto
opuesto, la sobreregulación, se ve tras la activación mitógena de
las células CD4^{+} T.
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sequence tags. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:10145-10649.
<110> Bayer AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> REGULACIÓN DE LA PROTEÍNA SIMILAR AL
RECEPTOR DE LA LIPOXINA A4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> REG. DEL RECEPTOR HUMANO DE LA
LIPOXINA A4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/189.037
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-03-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (2)
1. El uso de un polipéptido
seleccionado entre el grupo constituido por
- (i)
- un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2;
- (ii)
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2
en la selección de los compuestos
útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos
inflamatorios, en el que se pone en contacto un compuesto de ensayo
con el polipéptido, se mide el enlace del compuesto de ensayo con
el polipéptido y se selecciona un compuesto de ensayo que enlaza con
el polipéptido como un compuesto útil en el tratamiento de una
enfermedad asociada con procesos
inflamatorios.
2. El uso de una célula biológica
que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo
constituido por
- (i)
- el polinucleótido de la SEC DE ID Nº: 1
- (ii)
- un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de restricción con el polinucleótido de la SEC DE ID Nº: 1 y codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A4.
en la selección de los compuestos
útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos
inflamatorios, en el que la célula biológica es una célula T y/o se
ha transformado con dicho polinucleótido, y en el que se pone en
contacto un compuesto de ensayo con la célula biológica, se mide la
cantidad de ARNm transcrito o el polipéptido expresado mediante
dicho polinucleótido y se selecciona un compuesto de ensayo que
altera la cantidad de ARNm transcrito o el polipéptido expresado
mediante dicho polinucleótido como un compuesto útil en el
tratamiento de una enfermedad asociada con procesos
inflamatorios.
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