ES2239532A1 - Metodo para evaluar el riesgo y la predisposicion a desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr. - Google Patents
Metodo para evaluar el riesgo y la predisposicion a desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr.Info
- Publication number
- ES2239532A1 ES2239532A1 ES200400269A ES200400269A ES2239532A1 ES 2239532 A1 ES2239532 A1 ES 2239532A1 ES 200400269 A ES200400269 A ES 200400269A ES 200400269 A ES200400269 A ES 200400269A ES 2239532 A1 ES2239532 A1 ES 2239532A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- epcr
- polypeptide
- autoantibodies
- subject
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 230000007170 pathology Effects 0.000 title claims description 40
- 238000011161 development Methods 0.000 title description 4
- 108010009900 Endothelial Protein C Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 102000009839 Endothelial Protein C Receptor Human genes 0.000 claims abstract description 69
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108091007231 endothelial receptors Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 65
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 51
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 50
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 claims description 36
- 208000001951 Fetal Death Diseases 0.000 claims description 31
- 231100000479 fetal death Toxicity 0.000 claims description 31
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 31
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 31
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims description 30
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims description 26
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 24
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 13
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 12
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 12
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 11
- 101001012038 Homo sapiens Endothelial protein C receptor Proteins 0.000 claims description 11
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 claims description 11
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 11
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000051068 human PROCR Human genes 0.000 claims description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 11
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 11
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 10
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 claims description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 9
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 8
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 208000002296 eclampsia Diseases 0.000 claims description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 5
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 claims description 4
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 claims description 4
- -1 S-tag Proteins 0.000 claims description 4
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 claims description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 claims description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 206010002329 Aneurysm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001362 Fetal Growth Retardation Diseases 0.000 claims description 3
- 206010070531 Foetal growth restriction Diseases 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000030941 fetal growth restriction Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 claims description 2
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 2
- 241001195348 Nusa Species 0.000 claims description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 claims description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 2
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 108010018381 streptavidin-binding peptide Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 1
- 206010048628 rheumatoid vasculitis Diseases 0.000 claims 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 abstract description 32
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 abstract description 32
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 abstract description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 9
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 abstract 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 30
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 27
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 7
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102100030024 Endothelial protein C receptor Human genes 0.000 description 5
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 5
- 108010042591 activated protein C receptor Proteins 0.000 description 5
- 230000003429 anti-cardiolipin effect Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 4
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 4
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 4
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 3
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- 201000004988 autoimmune vasculitis Diseases 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 102000036213 phospholipid binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091011000 phospholipid binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- WPVINHLVHHPBMK-ULQDDVLXSA-N (2s)-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]-1-[(2s)-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)CCN1C(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 WPVINHLVHHPBMK-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTXMJCHSFOPGME-UHFFFAOYSA-N 4,7-dimethoxy-1,3-benzodioxole Chemical group COC1=CC=C(OC)C2=C1OCO2 HTXMJCHSFOPGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021561 4-Nitrophenylphosphatase Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000030107 Abortions spontaneous Diseases 0.000 description 1
- OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N Ala-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CN=CN1 OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 201000000736 Amenorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010001928 Amenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000533363 Apion Species 0.000 description 1
- MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OGTCOKZFOJIZFG-CIUDSAMLSA-N Asp-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OGTCOKZFOJIZFG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 241000070918 Cima Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- UWQDKRIZSROAKS-FJXKBIBVSA-N Gly-Met-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UWQDKRIZSROAKS-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 101001120470 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Peptidoglycan-associated lipoprotein Proteins 0.000 description 1
- XIGFLVCAVQQGNS-IHRRRGAJSA-N His-Pro-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XIGFLVCAVQQGNS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- TVSPLSZTKTUYLV-ZPFDUUQYSA-N Ile-Glu-Met Chemical compound N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O TVSPLSZTKTUYLV-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 238000001347 McNemar's test Methods 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 102000032626 PAR-1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010070519 PAR-1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- FJLODLCIOJUDRG-PYJNHQTQSA-N Pro-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 FJLODLCIOJUDRG-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N Tyr-Thr-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O UUBKSZNKJUJQEJ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- KNYHAWKHFQRYOX-PYJNHQTQSA-N Val-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N KNYHAWKHFQRYOX-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000540 amenorrhea Toxicity 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 230000003208 anti-thyroid effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940043671 antithyroid preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000008011 embryonic death Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010085109 glycyl-histidyl-arginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009593 intrauterine fetal growth Effects 0.000 description 1
- 230000009602 intrauterine growth Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- OTQCKZUSUGYWBD-BRHMIFOHSA-N lepirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 OTQCKZUSUGYWBD-BRHMIFOHSA-N 0.000 description 1
- 229960004408 lepirudin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229940127234 oral contraceptive Drugs 0.000 description 1
- 239000003539 oral contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000033962 signal peptide processing Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N sodium;n-[5-amino-2-(4-aminophenyl)sulfonylphenyl]sulfonylacetamide Chemical compound [Na+].CC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Método para evaluar el riesgo y la predisposición a desarrollar una patología relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente al EPCR. El método para evaluar el riesgo y la predisposición de un sujeto a desarrollar una patología relacionada con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos frente al receptor endotelial de la PC/PC activada (EPCR), tal como una enfermedad autoinmune, una enfermedad vascular o complicaciones obstétricas, se basa en la detección y cuantificación in vitro de autoanticuerpos frente al EPCR en una muestra de dicho sujeto.
Description
Método para evaluar el riesgo y la predisposición
a desarrollar una patología relacionada con la presencia de
autoanticuerpos frente al EPCR.
La presente invención se relaciona con el empleo
de autoanticuerpos frente al receptor endotelial de la proteína
C/proteína C activada (EPCR) como marcador para evaluar el riesgo y
la predisposición de un sujeto a desarrollar una patología
relacionada con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
frente al EPCR, tal como una enfermedad autoinmune, una enfermedad
vascular o complicaciones obstétricas.
Las enfermedades autoinmunes son unas
enfermedades que se caracterizan por la presencia de reacciones
inmunológicas en las que algo desencadena la reacción del sistema
inmune contra los propios tejidos del cuerpo y la producción de
anticuerpos anormales que atacan a dichos tejidos (autoanticuerpos).
Entre dichas enfermedades autoinmunes se encuentran el síndrome
antifosfolípido (SAF), la artritis reumatoide, el lupus eritematoso
sistémico, las vasculitis autoinmunes en general, etc.
El SAF se caracteriza por trombosis vascular
(venosa, arterial o microvascular) y complicaciones en el embarazo
(muerte fetal, nacimiento prematuro o aborto espontáneo múltiple)
asociadas con la presencia de anticuerpos antifosfolípido. Estos
anticuerpos son heterogéneos y reconocen una variedad de
combinaciones de fosfolípidos, proteínas de unión de fosfolípidos o
ambas. Los subgrupos más comúnmente detectados de anticuerpos
antifosfolípido son los anticuerpos anticoagulante lúpico (ACL),
anticuerpos anticaidiolipina y anticuerpos antiglicoproteína I
\beta2. Otros anticuerpos antifosfolípido no incluidos en los
criterios clásicos de laboratorio están actualmente bajo estudio.
Tales anticuerpos están dirigidos frente a fosfolípidos distintos a
la cardiolipina, tales como la fosfatidiletanolamina, o frente a
proteínas de unión de fosfolípidos, tales como la anexina V y la
proteína S. Sin embargo, se conoce poco sobre los mecanismos que
relacionan la presencia de anticuerpos antifosfolípido con la
trombosis vascular y la pérdida del embarazo.
Las enfermedades vasculares son de tres tipos
fundamentales dependiendo del tipo de vaso afectado (arterial,
venoso o vasos de pequeño calibre de la microcirculación). En el
caso de las enfermedades vasculares arteriales se produce una
esclerosis de su pared que disminuye el flujo a través de su luz y,
por lo tanto, disminuye de modo crónico el aflujo de sangre a los
territorios irrigados por esa arteria lesionada. La lesión
ateroesclerótica se puede complicar y originar un trombo dentro de
la arteria taponando totalmente el vaso y cerrando de este modo el
flujo de sangre, en cuyo caso se produce un infarto. Los más
frecuentes son el infarto de miocardio cuando la arteria trombosada
es una arteria coronaria y el infarto cerebral cuando la arteria
trombosada es una arteria que riega el cerebro. En el caso de
enfermedad vascular venosa la trombosis origina una dificultad en
el retomo de la sangre al corazón. Cuando un fragmento del trombo
de la pared venosa trombosada se libere entonces migrará hasta
quedar atrapado en la circulación venosa pulmonar, originando una
insuficiencia pulmonar aguda, conocida como embolia pulmonar. Las
enfermedades de la microcirculación se producen por inflamación y/o
trombosis de los vasos de la microcirculación de los diferentes
órganos y se manifiestan como fracaso de la función del órgano cuya
microcirculación está dañada. Las enfermedades vasculares
constituyen una importante causa de morbilidad y mortalidad en los
países occidentales. Concretamente, según datos del Instituto
Nacional de Estadística del año 2.000, las enfermedades
cardiovasculares son la primera causa de muerte en España (35,0%
aproximadamente del total de defunciones). Entre las causas
cardiovasculares más frecuentes, las enfermedades vasculares o
trombóticas arteriales del corazón (principalmente el infarto agudo
de miocardio) constituyen la primera causa de muerte. Actualmente
se conocen varios factores de riesgo moleculares que pueden
explicar la aparición de trombosis en algunos pacientes, uno de
estos factores de riesgo es la presencia de los denominados
anticuerpos antifosfolípido. Originalmente se pensó que estos
autoanticuerpos estaban dirigidos frente a fosfolípidos aniónicos;
no obstante, posteriormente se ha demostrado que muchos de esos
autoanticuerpos están dirigidos frente a complejos que algunas
proteínas, tales como la glicoproteína I \beta2 o la protrombina,
forman con los fosfolípidos. Más recientemente también se han
implicado otras proteínas con función anticoagulante, tales como la
proteína C (PC), la proteína S, la trombomodulina o la anexina V,
lo cual explicaría por qué la presencia de estos autoanticuerpos
predisponen a la trombosis.
Las complicaciones obstétricas son
fundamentalmente: la muerte fetal después de la décima semana de
embarazo, el nacimiento de niños prematuros, los abortos
espontáneos antes de la décima semana del embarazo, el retraso del
crecimiento intrauterino, la eclampsia y la
pre-eclampsia.
La proteína C activada (PCA) es una de las
proteínas principales reguladoras de la cascada de coagulación. La
PC, el zimógeno de la PCA, es activada por la trombina unida a
trombomodulina sobre la superficie de las células endoteliales. La
PCA, en combinación con la proteína S (su cofactor no enzimático),
ejerce su función anticoagulante mediante la proteolisis de los
factores V y VIII activados. Se han identificado defectos genéticos
y adquiridos en la trombomodulina, la PC y la proteína S en
pacientes con trombosis venosa y/o arterial. El receptor endotelial
de la PC/PC activada (EPCR) es una glicoproteína que se expresa en
la membrana de las células endoteliales y que liga de manera
específica y con alta afinidad la PC y la PCA. Para que el EPCR sea
funcional precisa estar unido a una molécula de fosfolípido que
estabiliza su estructura tridimensional. La unión de la PC al EPCR
incrementa de forma notable su activación por el complejo
trombina-trombomodulina sobre la superficie celular
endotelial. La misión del EPCR es concentrar la PC en la superficie
endotelial y presentarla al complejo
trombina-trombomodulina favoreciendo de este modo
una eficiente activación de la PC. El EPCR aumenta (unas nueve
veces aproximadamente) la tasa de activación de la PC en la
superficie de células endoteliales in vivo por lo que es el
responsable del 90% de los niveles de PCA circulantes. Además, sólo
cuando la PCA está unida al EPCR puede activar el
receptor-1 activado por proteasa activa que genera
una señal celular "citoprotectora" y bloquea la apoptosis.
El EPCR se expresa principalmente en el endotelio
de las venas y arterias, sobre todo en las de grande y mediano
calibre, y, además, se expresa muy intensamente en el
sincitiotrofoblasto. En estos lugares el EPCR previene la trombosis
y favorece el buen funcionamiento celular tanto del endotelio como
del sincitiotrofoblasto. Existen pruebas cada vez más sólidas que
apoyan un papel del EPCR en el mantenimiento del embarazo ya que la
deleción del gen EPCR en ratones "knock out" causa trombosis
placentaria y muerte embrionaria temprana en dichos ratones.
Los autores de la presente invención han
descubierto que la presencia de autoanticuerpos
anti-EPCR en suero o plasma de pacientes con
enfermedades autoinmunes, y/o en pacientes con enfermedades
vasculares y/o en pacientes con complicaciones obstétricas está
incrementada en comparación con muestras procedentes de sujetos
sanos, no afectados de tales patologías. Estas evidencias
convierten a dichos autoanticuerpos anti-EPCR en un
marcador útil para evaluar in vitro el riesgo y la
predisposición de un sujeto a desarrollar una patología relacionada
con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos frente al
EPCR, tal como una enfermedad autoinmune, una enfermedad vascular o
complicaciones obstétricas.
Se ha investigado la presencia de autoanticuerpos
anti-EPCR en pacientes con SAF y su relación con la
muerte fetal. También se ha estudiado el efecto de estos
autoanticuerpos sobre la generación de PCA en la superficie
endotelial. Posteriormente, se ha estudiado la asociación de
autoanticuerpos anti-EPCR con la muerte fetal en un
estudio pareado de casos y controles. Los resultados obtenidos
soportan el hecho de que autoanticuerpos anti-EPCR
constituyen un factor de riesgo para un episodio de muerte fetal.
Impedir la activación de la PC sobre las superficies celulares que
expresan EPCR podría ser una de las maneras por las que estos
autoanticuerpos ejercen sus efectos patológicos.
Adicionalmente, se ha puesto a punto un método
para la determinación de autoanticuerpos anti-EPCR
(IgG, IgA e IgM) y se ha demostrado que éstos están presentes en
pacientes diagnosticados de una enfermedad autoinmune (SAF y lupus
eritematoso diseminado), en pacientes con enfermedades--vasculares
(trombosis venosa y arterial) y en mujeres con complicaciones del
embarazo. Los ejemplos que acompañan a esta descripción ilustran,
entre otras cosas, el hecho de que la presencia de autoanticuerpos
anti-EPCR en suero o plasma está incrementada en
pacientes con enfermedades autoinmunes (determinado en pacientes con
SAF o con lupus eritematoso diseminado), en pacientes con
enfermedades vasculares, tales como trombosis arterial, por
ejemplo, infarto de miocardio (determinado tanto en pacientes con
SAF como en pacientes sin SAF), o ictus isquémico cerebral
(determinado en pacientes con SAF), o trombosis venosa (determinado
en pacientes con SAF), así como en pacientes con complicaciones
obstétricas, tales como con muerte fetal (determinado tanto en
mujeres con SAF como en mujeres sin SAF) o abortos de repetición
(determinado en pacientes con SAF).
Por tanto, la presente invención se relaciona, en
general, con el empleo de autoanticuerpos anti-EPCR
como marcador para evaluar in vitro el riesgo y la
predisposición de un sujeto a desarrollar una patología, en
particular, una patología relacionada con la presencia de niveles
elevados de autoanticuerpos frente al EPCR, así como para
monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto que
presente dichas enfermedades.
En un aspecto, la invención se relaciona con un
método para evaluar el riesgo y la predisposición de un sujeto a
desarrollar una patología relacionada con la presencia de niveles
elevados de autoanticuerpos anti-EPCR en dicho
sujeto, que comprende la detección y/o cuantificación in
vitro de dichos autoanticuerpos anti-EPCR en
una muestra de dicho sujeto.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
método para monitorizar in vitro el efecto de la terapia
administrada a un sujeto que presente una patología relacionada con
la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en dicho sujeto, que comprende la
detección y/o cuantificación in vitro de dichos
autoanticuerpos anti-EPCR en una muestra de dicho
sujeto.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el
empleo de la detección de autoanticuerpos anti-EPCR
en un método para evaluar el riesgo y la predisposición de un
individuo a desarrollar una patología relacionada con la presencia
de niveles elevados de autoanticuerpos anti-EPCR, o
para monitorizar in vitro el efecto de la terapia
administrada a un sujeto que presente una patología relacionada con
la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en dicho sujeto.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el
empleo de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
del EPCR o un fragmento de la misma que contiene, al menos, un
epítopo susceptible de ser reconocido por un autoanticuerpo
anti-EPCR en un método para evaluar el riesgo y la
predisposición de un individuo a desarrollar una patología
relacionada con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en dicho sujeto, o para monitorizar in
vitro el efecto de la terapia administrada a un sujeto que
presente una patología relacionada con la presencia de niveles
elevados de autoanticuerpos anti-EPCR en dicho
sujeto.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
kit para evaluar in vitro el riesgo y la predisposición de
un individuo a desarrollar una patología relacionada con la
presencia de niveles elevados de autoanticuerpos frente al EPCR en
un sujeto, o para monitorizar in vitro el efecto de la
terapia administrada a un sujeto que presente una patología
relacionada con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en dicho sujeto que comprende un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del EPCR o un
fragmento de la misma que contiene, al menos, un epítopo susceptible
de ser reconocido por un autoanticuerpo
anti-EPCR.
La Figura 1 ilustra la expresión de rshEPCR en
Pichia pastoris. El rshEPCR se purificó a partir del
sobrenadante de células de P. pastoris transformadas de
forma estable, tal como se describe en el apartado relativo a los
Materiales y Métodos (véase el Ejemplo). 10 \mul de cada una de
tres fracciones que contenían rhsEPCR fueron separadas por
SD-PAGE y las proteínas fueron detectadas
utilizando GELCODE Blue (A) o mediante Western blot con el
anticuerpo monoclonal anti-myc (Invitrogen)(B).
La Figura 2 muestra la comparación del nivel de
autoanticuerpos anti-EPCR en pacientes
diagnosticados de SAF y en controles. Se muestran los niveles de
autoanticuerpos anti-EPCR. Anticuerpos de isotipo
IgM: controles (mediana = 45 UA, unidades arbitrarias), pacientes
(mediana = 57 UA); anticuerpos de isotipo IgA: controles (mediana =
31 UA), pacientes (mediana = 39 UA); y anticuerpos de isotipo IgG:
controles (mediana = 72 UA), pacientes (mediana = 75 UA).
La Figura 3 muestra el efecto de autoanticuerpos
anti-EPCR sobre la generación de PCA por células
endoteliales, en donde puede observarse la generación de PCA en
presencia de autoanticuerpo anti-EPCR de isotipo M
del paciente C comparada con la generación de PCA en ausencia de
anticuerpo y en presencia de anticuerpo no inhibidor. Para cada
condición se realizaron 2-4 experimentos
independientes.
Para facilitar la comprensión de la presente
solicitud de patente, exponemos a continuación el significado de
algunos términos y expresiones en el contexto de la invención.
El término "sujeto" se refiere a un miembro
de una especie de un animal mamífero, e incluye, pero no se limita,
a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es
preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier
edad o raza.
La expresión "enfermedades autoinmunes" se
refiere a aquellos trastornos en los que el sistema inmune de un
individuo reacciona contra sus propios tejidos determinando una
gran variedad de enfermedades; a modo ilustrativo, dichas
enfermedades autoinmunes incluyen, entre otras, el SAF, el lupus
eritematoso sistémico, la artritis reumatoide, vasculitis
autoinmunes, etc.
La expresión "enfermedades vasculares" se
refiere a aquellas enfermedades que afectan a los vasos sanguíneos.
Cuando afecta a un vaso arterial se caracterizan por la falta de
irrigación sanguínea de un territorio determinado del organismo y
habitualmente es secundaria a la oclusión de alguna arteria, causada
ésta por una lesión ateroesclerótica de la pared o por una
trombosis, o por ambas a la vez. Cuando afecta a un vaso venoso se
caracteriza por dificultad en el retorno de la sangre al corazón
desde el territorio del organismo afectado y habitualmente es
secundario a la oclusión del vaso venoso por un trombo. Cuando
afecta a la microcirculación se caracteriza por la dificultad del
órgano cuya microcirculación está afectada para realizar su
función. A modo ilustrativo, dichas enfermedades vasculares
incluyen, entre otras, enfermedades vasculares arteriales, tales
como infarto de miocardio, ictus cerebral, accidente cerebral
transitorio, isquemia de extremidades, aterosclerosis, aneurisma,
etc., así como enfermedades vasculares venosas, tales como
trombosis venosa superficial y profunda, embolia pulmonar, etc, y
enfermedades vasculares (trombosis) de la microcirculación como el
fallo orgánico que ocurre durante infecciones o enfermedades
autoinmunes.
La expresión "complicaciones obstétricas" se
refiere a aquellos trastornos que afectan al desarrollo del
embarazo, tanto los que afectan a la madre como los que afectan al
embrión o al feto, tales como, entre otros, el aborto, la muerte
fetal, el nacimiento prematuro, el retraso del crecimiento
intrauterino, la eclampsia y la pre-eclampsia.
El término "autoanticuerpo" se refiere a los
anticuerpos producidos por un sujeto y dirigidos o específicos
contra estructuras y tejidos del propio organismo que las produce,
tales como, por ejemplo, autoanticuerpos antiplaquetares,
autoanticuerpos antitiroides, autoanticuerpos antiglóbulos rojos,
etc. En este sentido el término "autoanticuerpo
anti-EPCR" se refiere a inmunoglobulinas o
anticuerpos producidos por el propio sujeto y dirigidas
específicamente contra el EPCR de sus propios tejidos.
El término "epítopo", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a un determinante antigénico de
una proteína tal como la secuencia de aminoácidos de la proteína
que un anticuerpo específico reconoce.
Los términos "péptido" y "polipéptido"
se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos que representan un
fragmento proteico. Los términos "proteína" y "péptido",
se usan indistintamente.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la producción de autoanticuerpos
anti-EPCR en pacientes con enfermedades autoinmunes,
y/o en pacientes con enfermedades vasculares y/o en pacientes con
complicaciones obstétricas está aumentada en comparación con
muestras procedentes de sujetos sanos, no afectados de tales
patologías, lo que convierte a dichos autoanticuerpos
anti-EPCR en un marcador útil para evaluar in
vitro el riesgo y la predisposición de un sujeto a desarrollar
una patología relacionada con la presencia de niveles elevados de
autoanticuerpos anti-EPCR, tal como una enfermedad
autoinmune, una enfermedad vascular o complicaciones obstétricas. En
una realización particular, la invención permite evaluar el riesgo
de enfermedades vasculares o complicaciones obstétricas en
pacientes con enfermedad autoinmune o sin ella.
Tal como se utiliza en esta descripción, la
expresión "niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR" se refiere a niveles de UA (unidades
arbitrarias) iguales o superiores al percentil 50 de la población
normal, incluyendo, por ejemplo, niveles de UA iguales o superiores
al percentil 60 de la población normal, iguales o superiores al
percentil 70 de la población normal, iguales o superiores al
percentil 80 de la población normal, iguales o superiores al
percentil 90 de la población normal, e iguales o superiores al
percentil 95 de la población normal. Debido a la variabilidad
existente entre los sujetos (por ejemplo, por razones de raza,
etc.) es muy difícil, prácticamente imposible, establecer unos
valores absolutos indicativos de niveles elevados de
autoanticuerpos anti-EPCR aplicables a todos los
sujetos, por lo que dichos percentiles pueden calcularse fácilmente
mediante un procedimiento convencional que comprende la realización
de un ensayo para determinar en un grupo de sujetos normales (es
decir, sujetos a los que en el momento de realización del ensayo no
se les ha diagnosticado ninguna enfermedad autoinmune y que no han
sufrido ninguna enfermedad vascular ni ninguna complicación
obstétrica) los niveles de autoanticuerpos
anti-EPCR. La determinación de los autoanticuerpos
anti-EPCR se puede realizar por cualquier método
convencional, por ejemplo, mediante el ELISA descrito en el
apartado "Materiales y Métodos" (Ejemplo 1). Lógicamente, cada
sujeto tendrá un valor determinado de UA de autoanticuerpos
anti-EPCR y existirá un valor UA de
auto-anticuerpos anti-EPCR en el que
por encima de ese valor estén el 50% de la población analizada,
constituyendo dicho valor el percentil 50; evidentemente, existirá
también un valor por encima del cual estén el 40% de los sujetos
normales ensayados y ese valor se constituye el percentil 60,
asimismo, también otros valores por encima de los cuales estarán el
30%, 20%, 10% y 5% de los sujetos normales ensayados, constituyendo
dichos valores los percentiles 70, 80, 90 y 95, respectivamente.
En este sentido, en un primer aspecto, la
invención proporciona un método para evaluar el riesgo y la
predisposición de un sujeto a desarrollar una patología relacionada
con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos frente al
receptor endotelial de la PC/PC activada (EPCR) en dicho sujeto, que
comprende la cuantificación in vitro de autoanticuerpos
frente al EPCR en una muestra de dicho sujeto.
En una realización particular, la patología
relacionada con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
frente al EPCR en un sujeto se selecciona entre una enfermedad
autoinmune, por ejemplo, SAF, lupus eritematoso sistémico, artritis
reumatoide, vasculitis autoinmunes, etc.; una enfermedad vascular,
por ejemplo, una enfermedad vascular arterial, tal como infarto de
miocardio, ictus cerebral, accidente cerebral transitorio, isquemia
de extremidades, aterosclerosis, aneurisma, etc., o una enfermedad
vascular venosa, tal como trombosis
venosa-profunda, embolia pulmonar, etc., o una
enfermedad vascular de la microcirculación tal como el fallo
orgánico que ocurre durante infecciones o enfermedades autoinmunes,
etc., y complicaciones obstétricas, por ejemplo, aborto, muerte
fetal, nacimiento prematuro, retraso del crecimiento intrauterino,
eclampsia, pre-eclampsia, etc.
El método proporcionado por la presente invención
se basa en que los sujetos diagnosticados de una enfermedad
autoinmune, vascular o con complicaciones obstétricas presentan
niveles elevados de autoanticuerpos anti-EPCR, en
comparación con los correspondientes niveles en muestras procedentes
de sujetos sin historial clínico de tales enfermedades o
complicaciones obstétricas.
Dicho método comprende una etapa de obtención de
la muestra del individuo, tal como una muestra de suero o plasma,
que se puede obtener por cualquier método convencional, por
ejemplo, mediante una extracción sanguínea.
Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos
previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de dichas
enfermedades autoinmunes o vasculares, o con complicaciones
obstétricas; o también de un sujeto en tratamiento, o que ha sido
tratado previamente contra dichas enfermedades o complicaciones.
Dada la naturaleza del método de la invención, la
detección y cuantificación de dichos autoanticuerpos
anti-EPCR se realiza mediante un ensayo inmunológico
acoplado a un marcador que permita detectar y cuantificar la
formación de complejos específicos
antígeno-anticuerpo, por ejemplo, un ensayo
inmunocromatográfico (látex, oro coloidal, etc.), un ensayo
inmunológico en el que marcador es un marcador fluorescente, un
isótopo, un metal pesado, una enzima, un marcador luminiscente, un
marcador quimioluminiscente, un cromógeno, etc.
Existe una amplia variedad de ensayos bien
conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que
utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y
anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas
se incluyen el Western-blot o transferencia Western,
ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o
Radioinmunoensayo), etc.
En una realización particular, el inmunoensayo
preferido en el método de la invención que permite la detección y/o
cuantificación de dichos autoanticuerpos anti-EPCR
es un ELISA que comprende
- a)
- inmovilizar en un soporte sólido un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del EPCR o un fragmento de la misma que contiene, al menos, un epítopo susceptible de ser reconocido por un autoanticuerpo anti-EPCR;
- b)
- incubar dicho polipéptido inmovilizado con una muestra sospechosa de contener autoanticuerpos anti-EPCR procedente de dicho sujeto durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión de dichos anticuerpos al polipéptido inmovilizado y la formación de complejos polipéptido- autoanticuerpo anti-EPCR;
- c)
- retirar la muestra no unida a dicho polipéptido inmovilizado;
- d)
- incubar dichos complejos polipéptido-autoanticuerpo anti-EPCR con un segundo anticuerpo conjugado a una enzima, en donde dicho segundo anticuerpo es un anticuerpo capaz de unirse a dichos autoanticuerpos anti-EPCR.
Dicho polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos del EPCR o un fragmento de la misma que contiene, al
menos, un epítopo susceptible de ser reconocido por un
autoanticuerpo anti-EPCR puede ser bien un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del EPCR
longitud completa, o bien un polipéptido que comprende la secuencia
de aminoácidos de un fragmento del EPCR que contiene, al menos, un
epítopo susceptible de ser reconocido por un anticuerpo
anti-EPCR. En una 20 realización particular, dicho
polipéptido es una proteína de fusión que comprende:
- (i)
- una región A constituida por un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos del EPCR o un fragmento de la misma que contiene, al menos, un epítopo susceptible de ser reconocido por un anticuerpo anti-EPCR, y
- (ii)
- una región B constituida por un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento o purificación de dicha proteína de fusión y/o una secuencia de aminoácido —útil para el anclaje de dicha proteína de fusión a un soporte sólido.
Dicha región B puede estar unida al extremo mino
terminal de dicha región A o bien al extremo carboxilo terminal de
dicha región A.
En una realización particular, dicha región A
comprende la secuencia de aminoácidos de la parte soluble del EPCR
humano.
La región B comprende una secuencia de
aminoácidos útil para el aislamiento o purificación de la proteína
de fusión previamente definida y/o una secuencia de aminoácidos
útil para el anclaje de dicha proteína de fusión a un soporte
sólido. Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos que pueda
ser utilizada para aislar o purificar una proteína de fusión
(denominadas genéricamente péptidos etiqueta o "tag") y/o
cualquier secuencia de aminoácidos susceptible de ser utilizada
para el anclaje de una proteína de fusión a un soporte sólido puede
estar presente en dicha región B. En ocasiones, la secuencia de
aminoácidos útil para el aislamiento o purificación de dicha
proteína de fusión puede actuar también como secuencia de
aminoácidos útil para el anclaje de dicha proteína de fusión a un
soporte sólido y viceversa. En una realización particular, la
región B comprende una secuencia de aminoácidos útil para el
aislamiento o purificación de una proteína de fusión y una secuencia
de aminoácidos útil para el anclaje de una proteína de fusión a un
soporte sólido.
A modo ilustrativo, dicha secuencia de
aminoácidos útil para aislar o purificar una proteína de fusión y/o
dicha secuencia de aminoácidos útil para el anclaje de una proteína
de fusión a un soporte sólido puede ser, por ejemplo,
Arg-tag, His-tag,
FLAG-tag, Strep-tag, un epítopo
susceptible de ser reconocido por un anticuerpo, tal como
c-myc-tag, SBP-tag,
S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de
unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión
S-transferasa-tag, proteína de unión
a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc. (Terpe
K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003),
60:523-525), una secuencia de aminoácidos tal como:
Ala-His-Gly-His-Arg-Pro
(SEQ ID NO: 4) (2, 4, y 8 copias),
Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser
(SEQ ID NO: 5),
Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys
(SEQ ID NO: 6) (6 repeticiones),
\beta-galactosidasa,
VSV-glicoproteína (YTDIEMNRLGK) (SEQ ID NO: 7),
etc.
En una realización particular, dicha región B
está constituida por un polipéptido que comprende un epítopo
susceptible de ser reconocido por un anticuerpo (tal como el
epítopo c-myc, reconocido por un anticuerpo
anti-c-myc) y una cola de
histidinas (His-tag).
En el Ejemplo que acompaña a esta descripción se
describe la obtención de un polipéptido, denominado
\hbox{rhsEPCR,}consistente en una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de la parte soluble del EPCR humano (hsEPCR), la secuencia de aminoácidos correspondiente al epítopo c-myc y una cola de histidinas y cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 3.
El polipéptido a utilizar en el método de la
invención puede ser obtenido por métodos convencionales, por
ejemplo, por expresión en un sistema de expresión adecuado.
El segundo anticuerpo a utilizar en el ELISA
previamente mencionado es un anticuerpo específico de isotipo de
inmunoglobulinas y procede de una especie diferente a la del sujeto
cuya muestra se analiza, lo que permite caracterizar el isotipo de
los autoanticuerpos anti-EPCR. A modo ilustrativo,
dicho segundo anticuerpo específico de isotipo de inmunoglobulinas
se selecciona entre un anticuerpo anti-IgG humana,
un anticuerpo anti-IgM humana, un anticuerpo
anti-IgA humana, y sus mezclas. En una realización
particular, dicho segundo anticuerpo está conjugado a un marcador
que permite la detección del complejo, tal como una enzima, por
ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc.
El método para evaluar el riesgo y la
predisposición de un sujeto a desarrollar una patología relacionada
con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR proporcionado por esta invención se
completa comparando los niveles de autoanticuerpos determinados en
la muestra del sujeto en cuestión con los niveles normales,
entendiendo por niveles normales los de una población de sujetos
normales determinado tal como se ha indicado más arriba al definir
la expresión "niveles elevados".
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
método para monitorizar in vitro el efecto de la terapia
administrada a un sujeto que presente una patología relacionada con
la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en dicho sujeto, que comprende la
cuantificación in vitro de dichos autoanticuerpos
anti-EPCR en una muestra de dicho sujeto. El método
se lleva a cabo tal como se ha mencionado previamente, si bien, en
este caso, las muestras proceden de sujetos previamente
diagnosticados de alguna enfermedad autoinmune o vascular, o que ha
sufrido alguna complicación obstétrica, sometido a tratamiento
terapéutico, y permite analizar el efecto de la terapia, es decir,
su eficacia y efectividad, aplicada al sujeto en tratamiento con el
fin de, por ejemplo, mantener la terapia o modificarla.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el
empleo de autoanticuerpos anti-EPCR en un método
para evaluar el riesgo y la predisposición de un individuo a
desarrollar una patología relacionada con la presencia de niveles
elevados de autoanticuerpos frente al EPCR en dicho sujeto. En una
realización particular, dicha patología relacionada con la
presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en un sujeto se selecciona entre una
enfermedad autoinmune, una enfermedad vascular y complicaciones
obstétricas. Un nivel aumentado de autoanticuerpos
anti-EPCR en el sujeto se asocia con un mayor
riesgo o predisposición a desarrollar una patología relacionada con
la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en un sujeto, tal como una enfermedad
autoinmune, una enfermedad vascular y/o complicaciones
obstétricas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el
empleo de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
del EPCR o un fragmento de la misma que contiene, al menos, un
epítopo susceptible de ser reconocido por un autoanticuerpo
anti-EPCR en un método para evaluar el riesgo y la
predisposición de un individuo a desarrollar una patología
relacionada con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en dicho sujeto, que comprende la
detección y/o cuantificación in vitro de autoanticuerpos
anti-EPCR en una muestra de dicho sujeto. En una
realización particular, dicha patología relacionada con la
presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR en un sujeto se selecciona entre una
enfermedad autoinmune, una enfermedad vascular y complicaciones
obstétricas.
En una realización particular, dicho polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos del EPCR o un fragmento
de la misma que contiene, al menos, un epítopo susceptible de ser
reconocido por un autoanticuerpo anti-EPCR es un
polipéptido como el definido previamente al describir el ELISA para
detectar y/o cuantificar autoanticuerpos anti-EPCR.
En una realización particular, dicho polipéptido es el denominado
rhsEPCR (Ejemplo), consistente en una proteína de fusión que
comprende la secuencia de aminoácidos de la parte soluble del EPCR
humano (hsEPCR), la secuencia de aminoácidos correspondiente al
epítopo c-myc y una cola de histidinas y cuya
secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 3.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
kit para evaluar in vitro el riesgo y la predisposición de
un sujeto a desarrollar una patología relacionada con la presencia
de niveles elevados de autoanticuerpos anti-EPCR en
un sujeto que comprende un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos del EPCR o un fragmento de la misma que contiene, al
menos, un epítopo susceptible de ser reconocido por un
autoanticuerpo anti-EPCR. En una realización
particular, dicho polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos del EPCR o un fragmento de la misma que contiene, al
menos, un epítopo susceptible de ser reconocido por un
autoanticuerpo anti-EPCR es un polipéptido como el
definido previamente al describir el ELISA para detectar y/o
cuantificar autoanticuerpos anti-EPCR. En una
realización particular, dicho polipéptido es el denominado rhsEPCR
(Ejemplo), consistente en una proteína de fusión que comprende la
secuencia de aminoácidos de la parte soluble del EPCR humano
(hsEPCR), la secuencia de aminoácidos correspondiente al epítopo
c-myc y una cola de histidinas y cuya secuencia de
aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 3.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Participaron en el estudio 43 pacientes [44 \pm
11 años (media \pm desviación estándar (DE)), 39 mujeres y 4
varones] a los que se les había diagnosticado síndrome 0
antifosfolípido (SAF), de acuerdo con los criterios diagnósticos
internacionales [Wilson WA, Gharavi AE, Koike T, Lockshin MD,
Branch DW, Piette JC, Brey R, Derksen R, Harris EN, Hughes GR,
Triplett DA, Khamashta MA. International consensus statement on
preliminary classification criteria for definite antiphospholipid
syndrome: report of an intemational workshop. Arthritis Rheum.
1999;42:1309-11; Brandt JT, Barna LK, Triplett DA.
Laboratory identification of lupus anticoagulants: results of the
Second International Workshop for Identification of Lupus
Anticoagulants. On behalf of the Subcommittee on Lupus
Anticoagulante/Antiphospholipid Antibodies of the ISTH. Thromb
Haemost. 1995;74:1597-603] entre febrero de 1998 y
marzo de 2002. Todos los pacientes fueron identificados por tener
anticoagulante lúpico (ACL) y una historia personal de trombosis
venosa (n = 17), trombosis arterial (n = 13, de los cuales 4 con
infarto agudo de miocardio (IAM), 7 con enfermedad trombótica
cerebrovascular (ETCV), y 2 en otras regiones) o ambos [n = 13
teniendo todos ellos trombosis venosa profunda más ETCV (n = 8), IAM
(n = 1), ETCV más IAM (n = 3) o trombosis arterial en la región
mesentérica (n = 1)]. A 27 de dichos pacientes se les diagnosticó
un lupus eritematoso sistémico (LES). Se obtuvieron muestras de
suero durante el tiempo en el cual el ACL era positivo y por lo
menos 3 meses después del último episodio trombótico y se
almacenaron a -80ºC hasta que fueron estudiadas para detectar
autoanticuerpos anti-EPCR.
Como grupo control se incluyeron en el estudio 43
voluntarios sanos sin historia de trombosis ni ACL. Todos los
pacientes y controles habían dado su consentimiento informado para
la participación en el estudio.
Se realizó un estudio
caso-control pareado sobre muerte fetal. Se han
considerado 87 mujeres, de 19 a 31 años de edad (edad media: 27
años), incluidas en el estudio entre septiembre de 1996 y
septiembre de 2002 por un primer episodio de muerte fetal en la
décima semana de amenorrea que había ocurrido durante su último
embarazo. Se excluyeron mujeres con algún antecedente trombótico,
enfermedades infecciosas crónicas o con alguna enfermedad sistémica
conocida, diabetes mellitus o con antecedentes de otro tipo de
patología de la gestación (aborto espontáneo, eclampsia,
restricción de crecimiento fetal intrauterino), así como los casos
de muerte fetal debidos a alguna anormalidad cromosómica en el
cariotipo o malformación morfológica en el feto. La muerte fetal
había ocurrido durante el primer embarazo en 58 mujeres, durante el
segundo en 21 mujeres y durante el tercero en las 8 mujeres
restantes; en 75 mujeres entre las semanas 10 y 22 y en las 12
mujeres restantes entre las semanas 22 y 36 (valor medio: 17
semanas).
Un grupo control de 87 madres sanas, agrupadas
por edad, número de embarazos y tiempo transcurrido desde el final
del último embarazo, todas ellas cumplieron todos los criterios de
exclusión que el grupo de mujeres con muerte fetal, fueron
reclutadas concomitantemente durante el mismo periodo de tiempo
entre mujeres asistidas como pacientes externas en el Departamento
de Ginecología del mismo hospital, para un examen médico
sistemático.
El estudio fue aprobado por los comités de ética
de la institución de los inventores y se obtuvo el consentimiento
informado de todas las pacientes. La inclusión de los pacientes y
controles, el consentimiento informado y la recolección de muestras
de sangre tuvo lugar por lo menos 6 meses (6-12
meses) después de la muerte fetal. Las muestras de sangre fueron
recogidas, procesadas y almacenadas a -80ºC, de acuerdo con los
procedimientos convencionales. Los procedimientos de recogida
fueron idénticos en todos los casos y en los controles.
Para expresar el EPCR humano recombinante en
forma soluble (rhsEPCR), se ha amplificado la secuencia del EPCR
humano soluble (hsEPCR), que comprende el dominio extracelular sin
su péptido señal ni los dominios de transmembrana e intracelular
(Entrez-Protein: 21730830, residuos
1-193, numeración correspondiente a la forma madura
de la proteína después del procesamiento del péptido señal)
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los
iniciadores
SEQ ID NO: 1 y
SEQ ID NO: 2,
que añadían un sitio de restricción ClaI y otro
Notl en los extremos 5' y 3' respectivamente, utilizando como molde
cDNA de células endoteliales. Estas modificaciones permitieron
ligar la secuencia de rhsEPCR a los sitios ClaI y NotI del plásmido
\pi\PiIXZ\alphaX (Stratagene, La Jolla, CA) a continuación de
la señal de secreción del factor \alpha de Saccharomyces
cerevisiae que permite la secreción eficiente de muchas
proteínas al medio extracelular desde el interior de levaduras.
El inserto se clonó en fase de lectura con un
epítopo c-myc y una etiqueta de 6 histidinas
presentes en dicho vector pPICZ\alphaC. Debido al proceso de
clonaje se añadieron un resto de serina y otro de isoleucina en el
extremo amino del rhsEPCR el cual se expresa fusionado, en su
extremo carboxi terminal, a una cola que contiene el epítopo
c-myc y 6 histidinas para facilitar su purificación
y el anclaje del rhsEPCR al fondo de los pocillos de la microplaca
mediante un anticuerpo monoclonal anti c-myc.
Mediante secuenciación directa se comprobó que la secuencia del
inserto y del vector era la correcta. La SEQ ID NO: 3 muestra la
secuencia del rhsEPCR obtenido, deducida a partir de la secuencia
de DNA, que comprende los residuos añadidos por la técnica de
clonaje empleada, los residuos de la región extracelular del
rhsEPCR humano, el epítopo myc, y la cola de 6 histidinas.
Con el vector de expresión previamente preparado
y tras linearización del mismo con la enzima de restricción Pmel,
se transformaron células de Pichia pastoril mediante un
método químico (Easy Comp, Invitrogen), dando como resultado la
integración, mediante recombinación homóloga, de la secuencia
codificante de rhsEPCR en el promotor endógeno de respuesta a
metanol. El producto de la transformación se cultivó en presencia
de zeocina para seleccionar aquellas colonias de P. pastoris
transformadas con el vector que contenía la secuencia codificante
del rhsEPCR que a su vez contiene el gen de la resistencia a la
zeocina. Brevemente, las levaduras transformadas se cultivaron en 4
ml de medio BMY [1% de (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de
peptona, fosfato potásico 100 mM (pH 6,0), 1,34% (p/v) de fuente de
nitrógeno de levaduras con sulfato amónico, 4x10-5%
(p/v) de biotina] suplementado con 1% (v/v) de glicerol (BMGY) y se
incubaron a 28-30ºC durante unas 18 horas con
agitación. Las células se recogieron por centrifugación a 2.000 g
durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se
descartó y se procedió a inducir la expresión de rhsEPCR con
metanol al 1% durante 18 horas. Para ello, las células se
resuspendieron en 3 ml de BMY suplementado con 0,5% (p/v) de
metanol y se incubaron durante 18 horas a 28-30ºC
aproximadamente con agitación vigorosa. Tras la inducción, las
muestras procedentes del medio condicionado se cargaron en geles de
NuPAGE Bis-Tris al 12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y
el rhsEPCR se detectó mediante Western Blot utilizando el
anticuerpo monoclonal anti-myc (Invitrogen). Para la
producción a gran escala se seleccionó la colonia que secretó la
concentración más alta de rhsEPCR. En las colonias seleccionadas
por su alta capacidad de producción de rhsEPCR se estudió el
metabolismo del metanol (metabolizador rápido o lento) de las
colonias, lo que permitió establecer las condiciones óptimas de
expresión para la colonia más adecuada. Una vez optimizadas las
condiciones de cultivo e inducción con metanol, se aumentó la
escala para producir grandes cantidades de rhsEPCR.
Dado que P. pastoris secreta muy pocas
proteínas al medio, un alto porcentaje de las proteínas halladas en
el medio de cultivo corresponden a rhsEPCR, lo cual simplificó
considerablemente su purificación. Brevemente, el rhsEPCR fue
purificado a partir de los sobrenadantes de los cultivos de levadura
mediante un proceso de purificación en 3 pasos que comprendía
cromatografía de afinidad metálica, intercambio amónico y
cromatografía de filtración en gel. Para ello, el sobrenadante del
cultivo se concentró y dializó frente a fosfato sódico 100 mM, NaCl
10 mM, pH 7,6 y, a continuación, se sometió a cromatografía de
afinidad metálica en una columna de 5 ml Hitrap (Amersham
Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido) cargada con cobre. La
fracción que se unió a la columna se eluyó con un tampón que
contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se dializó frente
a Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) sin NaCl, y, a
continuación, se sometió a una cromatografía de intercambio
apiónico en una 5 columna Resource Q column (Amersham Biosciences)
y elución con un gradiente 0,0-300 mM de NaCl en un
volumen equivalente al de 20 columnas. Las fracciones eluídas que
contenían el rhsEPCR se reunieron y concentraron mediante
ultrafiltración centrífuga y, a continuación, se aplicaron a una
columna a Superdex 75-HR10/30 (Amersham
Biosciences) para efectuar la filtración en gel. La concentración de
proteína purificada se determinó utilizando el ensayo de proteína
total BCA (Pierre, Rockford, IL) y patrones de albúmina sérica
bovina (BSA). Para detectar el rhsEPCR purificado, las muestras se
cargaron en geles al 12% de NuPAGE Bis-Tris
(Invitrogen, Carlsbad, CA) y se realizó una electroforesis en
condiciones reductoras seguido de tinción con azul de Coomassie. Un
gel de electroforesis se sometió a electroblotting y el
rhsEPCR fue detectado con el anticuerpo monoclonal
anti-myc (Invitrogen). Para estimar el peso
molecular del rhsEPCR se utilizó un patrón de peso molecular
incluido en cada gel de electroforesis.
Se determinaron por separado los niveles de
autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo IgG, IgA o
IgM, por ser éstos los encontrados con mayor frecuencia en los
pacientes con alteraciones autoinmunes en los que se detectan
anticuerpos dirigidos frente a alguna de sus propias estructuras
(autoanticuerpos).
En los tres casos se tapizaron microplacas de 96
pocillos (Costar, Acton, MA, EEUU) con 100 \mul/pocillo de un
anticuerpo monoclonal anti-c-myc
(Invitrogen, EEUU) a 1,5 \mug/ml en una solución de
Na_{2}CO_{3} a 100 mmol/l, pH 9,6, durante la noche a 4ºC. Este
anticuerpo es utilizado como anticuerpo de captura y -está dirigido
hacia la etiqueta c-myc añadida y presente en el
rhsEPCR. De este modo, el rhsEPCR es anclado al pocillo preservando
sus epítopos extracelulares. Después del lavado con TB (Tris 20 mM,
NaCl 150 mM, 0,05% de Tween-20, pH 7,4), los sitios
de unión no específicos fueron bloqueados con 3% (p/v) de BSA en TB
a temperatura ambiente (TA) durante 4,5 horas. A continuación, se
añadieron 100 \mul/pocillo de una solución que contenía
3\mug/ml de rhsEPCR en TB suplementado con 1% de BSA (TB1) y se
incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave.
En paralelo se incubaron pocillos blanco con TB 1 sin rhsEPCR.
Después del lavado con TB se añadieron a cada pocillo 100 \mul de
una dilución de la muestra 1:100 (plasma o suero) en TB 1 y se
incubaron durante la noche a 4ºC. A continuación, los pocillos
fueron lavados con TB, y los autoanticuerpos
anti-EPCR que permanecieron unidos al fondo del
pocillo fueron detectados bien con un anticuerpo policlonal murino
anti-IgA humana conjugado con peroxidasa (Biotrend),
bien con un anticuerpo policlonal murino anti-IgM
humana conjugado con peroxidasa (Zymed) o bien con un anticuerpo
policlonal murino anti-IgG humana conjugado con
fosfatasa alcalina (Zymed). Después de un periodo de 2 horas de
incubación a temperatura ambiente con agitación suave se realizó un
lavado.
Para determinar los niveles de autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipo IgA o IgM, se añadieron 100
\mul de una solución 0,4 mg/ml de o-fenilendiamina
(Kodak) que contenía Na_{2}HPO_{4} 0,07 M, citrato de sodio
0,04 M y 0,02% (v/v) de H_{2}O_{2}, pH 5,0. Después de un
tiempo de revelado de 5 y 8 minutos en oscuridad para IgA e IgM,
respectivamente, se añadieron 100 \mul de H_{2}SO_{4} para
detener la reacción y 5 minutos después se leyeron las absorbancias
a 492 nm en un lector de microplaca (iEMS REader, Labsystems,
Finlandia).
En la placa empleada para medir autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipo IgG se añadieron 100 \mul de
una solución 1 ng/ml de 4-nitrofenil fosfatasa
(Sigma) en dietanolamina 0,1 M, pH 10,3. Después de 15 minutos, la
reacción fue detenida con 100 \mul de NaOH 1 M y la absorbancia
leída después de la estabilización del color a 405 nm en el lector
de microplaca (iEMS REader). Todas las muestras fueron ensayadas al
menos dos veces en diferentes ensayos.
Para asegurar que todas las absorbancias medidas
en cada placa caían en un rango lineal, se construyó, para cada
isotipo, una curva usando diluciones seriadas de la muestra cuya
absorbancia fue la más alta registrada. Para permitir comparaciones
entre placas, se eligió una muestra para ensayar en cada placa
(muestra patrón) lo que permitía introducir un factor de corrección.
Las unidades arbitrarias (UA) fueron definidas de la siguiente
manera: para cada muestra paciente (muestra problema) la
absorbancia específica se calculó sustrayendo la absorbancia de los
pocillos blanco y, a continuación, multiplicando por 1.000 y por un
factor de corrección correspondiente a la relación entre la
absorbancia específica de la muestra patrón ensayada en una placa
dada (placa de referencia) y en la placa donde la muestra problema
es ensayada. Los coeficientes de variación inter e
intra-ensayo fueron evaluados con el uso de cinco
muestras probadas cinco veces para el coeficiente de variación
inter-ensayo (menor de 5%) y en tres ocasiones
diferentes para calcular el coeficiente de variación
inter-ensayo (menor de 10%).
La línea celular utilizada fue EA.hy926, una
línea de células endoteliales humanas transformada que ha retenido
la capacidad de expresar trombomodulina y EPCR
(Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Mollica JS,
Ferrell GL, Esmon CT. The endothelial cell protein C receptor
augments protein C activation by the
thrombin-thrombomodulin complex. Proc Natl Acad Sci
USA. 1996;93:10212-6). Se incubaron 5x10^{4}
células por pocillo de una placa de 96 pocillos con 0,02 U/ml de
trombina (0,17 nM) (ERL, Swansea, Reino Unido) y concentraciones
crecientes de PC (Baxter, Deerfield, IL, USA) oscilando entre 50 y
1.000 nM en tampón Tris 20 mM, pH 7,4, suplementado con NaCl 150
mM, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 0,6 mM, 1% de BSA, 0,001% de
Tween-20 y 0,02% de NaN_{3}. Después de 45
minutos a temperatura ambiente se añadió lepirudina (Schering AG,
Berlin, Germany) a una concentración final de 0,2 \mul, para
inhibir la trombina y 3-4 minutos después se añadió
el sustrato cromogénico S-2366 (Chromogenix, Milan,
Italy) a una concentración final de 0,4 mM con el objeto de
monitorizar su proteolisis por la PCA. El incremento en la
absorbancia a 405 nm fue registrado cinéticamente en un lector de
microplaca (iEMS REader, Labsystems, Finlandia). El ajuste de los
datos de la curva a la ecuación de Michaelis-Menten
fue realizado usando el programa Enzfitter (Biosoft, Cambridge,
Reino Unido) que calculó el valor de la Km de la activación de la
PC bajo esas condiciones. Donde fue necesario, se añadieron 45
\mug/ml de autoanticuerpos anti-EPCR purificados
de pacientes (véase más abajo) simultáneamente con la trombina y la
PC. Así, el efecto de los autoanticuerpos anti-EPCR
sobre la activación de la PC podaría ser analizado.
Muestras de suero de 1 ml que contenían
autoanticuerpos anti-EPCR fueron diluidas en tampón
fosfato salino (PBS) (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 0,15 M, pH=7,4)
y pasadas a través de un filtro de 0,45 \mum. El filtrado fue
aplicado a una columna HitTrap activada por NHS HP (Amersham
Biosciences) donde previamente se había inmovilizado un anticuerpo
monoclonal murino anti-IgM humana (Maruyama S,
Kubagawa H, Cooper MD. Activation of human B cells and inhibition
of their terminal differentiation by monoclonal
anti-murine antibodies. J Immunol.
1985;135:192-9). La IgM humana fue eluída con 5 ml
de glicina 0,1 M, pH 2,5 y recogida en 100 \mul de Tris 1 M, pH
9,0. La fracción que contenía la IgM humana fue concentrada y
dializada frente a TB suplementado con CaCl_{2} 5 mM y MgCl_{2}
0,6 mM, pH 7,4.
Muestras de 1 ml de suero fueron diluidas en PBS
y aplicadas manualmente a una columna de jacalina (Pierce). La
fracción adsorbida fue eluida con 2 ml de melibiosa 0,1 M en PBS y
subsiguientemente dializada frente a PBS. Puesto que fueron
necesarios pasos posteriores de purificación, las muestras fueron
aplicadas a una columna de afinidad HiTrap Protein G HP (Amersham
Biosciences) para retirar la IgG contaminante. El producto no
ligado que contenía la fracción IgA fue dializado frente a
KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,0, y finalmente aplicado a una columna
de afinidad HiTrap Blue HP (Amersham Pharmacia Biotech) para
retirar la albúmina. El material no ligado que contenía la fracción
de IgA purificada fue recogido y dializado frente a tampón TB
suplementado con CaCl_{2} 5 mM y MgCl_{2} 0,6 mM, pH 7,4.
Muestras de suero de 1 ml que contenían
autoanticuerpos anti-EPCR fueron diluidas en tampón
fosfato salino (PBS) (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 0,15 M, pH=7,4)
y pasadas a través de un filtro de 0,45 \mum. El filtrado fue
aplicado a una 5 columna HitTrap Protein G HP (Amersham
Biosciences). La IgG humana fue eluída con 5 ml de glicina 0,1 M,
pH 2,5 y recogida en 100 \mul de Tris 1 M, pH 9,0. La fracción
que contenía la IgM humana fue concentrada y dializad frente a TB
suplementado con CaCl_{2} 5 mM y MgCl_{2} 0,6 mM, pH 7,4.
El rhsEPCR (2 mg en 3 ml de NaHCO_{3} 100 mM,
pH 8,5) fue unido a una columna de afinidad HitTrap
NHS-activated HP (Amersham Biosciences) siguiendo
las instrucciones del fabricante. Después de que la reacción
hubiera sido detenida con glicina 0,1 M, la columna de rhsEPCR fue
lavada extensamente con NaCl 2 M. De esta manera, la columna de
rhsEPCR era capaz de ligar PC en TBS, pH 7,4, suplementado con
CaCl_{2} 20 mM y MgCl_{2} 0,6 mM. La PC podía ser eluída de la
columna con TBS suplementado con ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA) (datos no mostrados). Puesto que el rhsEPCR ligado a la
columna mantenía su capacidad para unirse a la PC, seguramente
debería retener la conformación nativa y los epítopos reconocidos
por los autoanticuerpos. Por tanto, la columna así preparada era
adecuada para eliminar autoanticuerpos anti-EPCR a
partir de una muestra de suero o plasma.
En el estudio de casos y controles de SAF, la
comparación entre pacientes (casos) y controles para la frecuencia
de niveles elevados de anticuerpos anti-EPCR IgM,
IgA e IgG fue realizada según el test de la
chi-cuadrado. La "odds ratio" (OR)
(Martínez-González MA, de
Irala-Estevez J & Guillén Grima F, (1999), ¿Qué
es una odds ratio?, Medicina Clínica, 112,
11:416-422) y el intervalo de confianza del 95% se
calcularon como una medida de la asociación entre SAF y
autoanticuerpos anti-EPCR.
En el estudio de pareado de casos y controles de
muerte fetal, la comparación entre casos y controles para variables
continuas y por categorías fue realizada según el
test-t para muestras pareadas y con el test McNemar,
respectivamente. La asociación entre los niveles de autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipos IgG e IgM con el ACL y con
anticuerpos anti-cardiolipina de isotipo IgM se
evaluó con coeficientes de correlación para variables continuas y
con el test de Mann-Whitney para variables por
categorías.
Para evaluar el riesgo de muerte fetal asociado
con altos niveles de autoanticuerpos anti-EPCR de
isotipos IgG e IgM, se utilizó un análisis de regresión múltiple
con pares de casos y controles. Las principales variables
independientes fueron los niveles de autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipos IgG e IgM por categorías, de
acuerdo con la distribución de esas inmunoglobulinas los controles.
Se utilizaron diferentes puntos de corte (cut-off)
para determinar los niveles asociados con un riesgo más alto. Se
realizaron análisis univariados y multivariados, ajustando por
factores de riesgo de muerte fetal conocidos. No fue posible
incluir en el modelo completo los factores V Leiden (FVL) y ACL por
lo que se consideraron entonces dos modelos para ensayar el efecto
de autoanticuerpos anti-EPCR:
(1) introduciendo simultáneamente los niveles de
autoanticuerpos anti-EPCR isotipos IgM e IgG,
anticuerpo anti-cardiolipina de isotipo IgM, ACL y
protrombina G20210A, y
(2) igual que el modelo 1, pero ajustando por la
presencia/ausencia de FVL, en lugar de ACL.
El modelo (1) fue usado para evaluar la hipótesis
de que los anticuerpos anti-cardiolipina y el ACL
eran marcadores, más que factores etiológicos, de un estado
protrómbico causado por autoanticuerpos anti-EPCR.
Todos los cómputos fueron realizados con SPSS, versión 10.0 (SPSS
Inc.).
Con el objeto de poder investigar la presencia de
autoanticuerpos anti-EPCR en plasma y suero, en
primer lugar se produjo rhsEPCR usando el sistema de expresión de
la levadura P. pastoris. Usando el protocolo descrito, se
pudo purificar de un cultivo de P. pastoris más de 5 mg de
rhsEPCR. Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y análisis Western
blot con el anticuerpo monoclonal de anti-myc, el
rhsEPCR aparecía como una banda única y ligeramente heterogénea
reflejando los distintos grados de glicosilación, tal como se había
descrito previamente (Fukudome K, Kurosawa S,
Steams-Kurosawa DJ, He X, Rezaie AR, Esmon CT. The
endothelial cell protein C receptor. Cell surface expression and
direct ligand binding by the soluble receptor. J Biol Chem.
1996;271:17491-8) [véase la Figura 1].
El rhsEPCR fue capaz de inhibir la actividad
anticoagulante de la PCA en un ensayo de coagulación, tal como se
ha descrito previamente (Regan LM, Steams-Kurosawa
DJ, Kurosawa S, Mollica J, Fukudome K, Esmon CT. The endothelial
cell protein C receptor. Inhibition of activated protein C
anticoagulant function without modulation of reaction with
proteinase inhibitors. J Biol Chem.
1996;271:17499-503) (datos no mostrados). Además de
unir la PC con la afinidad esperada (véase más abajo), la
activación de la PC por trombina sobre la superficie de las células
endoteliales estaba 30 caracterizada por una Km de 51\pm10 nM. La
activación disminuyó considerablemente en presencia de rhsEPCR 2
\muM (Km = 1.000 nM aproximadamente), lo que significa una Ki de
70 nM aproximadamente, sugiriendo que el rhsEPCR se une a la PC con
una eficiencia similar a la del EPCR nativo, tal como ha sido
descrito previamente (Fukudome K, Kurosawa S,
Stearns-Kurosawa DJ, He X, Rezaie AR, Esmon CT. The
endothelial cell protein C receptor. Cell surface expression and
direct ligand binding by the soluble receptor. J Biol Chem.
1996;271:17491-8; Regan LM,
Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Mollica J,
Fukudome K, Esmon CT. The endothelial cell protein C receptor.
Inhibition of activated protein C anticoagulant function without
modulation of reaction with proteinase inhibitors. J Biol Chem.
1996;271:17499-503). Estas evidencias sugieren
fuertemente la correcta actividad y conformación del rhsEPCR, lo
que permite utilizarlo para detectar anticuerpos contra EPCR
humano.
Considerando niveles altos a aquellos superiores
al percentil 97 de cada grupo control, los niveles altos de
autoanticuerpo anti-EPCR isotipos IgM, IgA o IgG
estuvieron asociados con SAF [OR = 4,47; IC 95%:
1,15-17,40] Como se muestra en la Tabla 1. Los
niveles extremadamente elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR, como se observa en la figura 2, se
detectaron únicamente en sujetos diagnosticados de SAF: tres
pacientes mostraron un nivel muy alto de autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipo IgM (paciente A = 407 UA,
paciente B = 301 UA y paciente C = 293 UA), dos pacientes con SAF
mostraron unos niveles muy altos de autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipo IgA (paciente D = 795 UA y
paciente B = 475 UA, quien también mostró altos niveles de
autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo IgM) y dos
niveles altos de autoanticuerpos anti-EPCR de
isotipo IgG (paciente E = 230 UA y paciente F = 220 UA). Los seis
pacientes fueron mujeres con historia previa de trombosis, uno de
los criterios de selección (ictus en pacientes A, C, D y F;
enfermedad cardiovascular en paciente E, trombosis venosa en
pacientes A, B, D y F). Lo más interesante es el hecho de que todas
las, mujeres que portaban autoanticuerpos anti-EPCR
de isotipos IgM e IgA menos la paciente B, que no fue evaluable,
sufrieron múltiples episodios de muerte fetal.
Debido a este hallazgo se enfocó el análisis
sobró la posible asociación entre autoanticuerpos
anti-EPCR y muerte fetal.
La fracción de autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipo IgM, Ig A e igG de los
pacientes con niveles extremadamente elevados fueron purificadas a
partir de 1 ml de suero. La fracción de autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipo IgM del paciente C fue capaz
de disminuir la generación de PCA por células endoteliales
cultivadas en presencia de trombina (20% de la capacidad residual de
activaciones de la PC, p = 0.02). El efecto inhibitorio era
dependiente de la dosis. Para demostrar que este efecto de la
fracción de autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo
IgM del paciente con SAF era debida a un anticuerpo específico
frente a EPCR, la muestra fue desprovista por completo de
autoanticuerpo anti-EPCR específico cargándola en
una columna de afinidad donde el rhsEPCR fue inmovilizado. La
fracción obtenida en tal forma perdió la capacidad inhibitoria
sobre la generación de PCA (87,6% de generación de PC) lo que
significa que el responsable de ese fenómeno tenía que ser un
autoanticuerpo anti-EPCR específico. Ninguna de las
otras fracciones purificadas a partir de pacientes con SAF fueron
capaces de modificar la capacidad de las células endoteliales de
generar PCA (Figura 3).
Las frecuencias del factores de riesgo
previamente relacionado con la muerte fetal y de los anticuerpos
anti-EPCR en el grupo de pacientes y controles
estudiado se muestran en la Tabla 2.
El percentil del 95% de los niveles de
autoanticuerpo anti-EPCR de isotipo IgM en el grupo
control fue de 99 UA. De los 87 pacientes, 16 pacientes (18%)
tuvieron valores que excedieron este punto de corte frente a los 3
sujetos del grupo control (n = 87). La OR no ajustada para muerte
fetal en pacientes con niveles de autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipo IgM superior al percentil del
95% comparados con aquéllas que tuvieron un valor más bajo, fue de
14 (intervalo de confianza (IC) de 95%, 1,8 a 106,4). Cuando el
punto de corte fue colocado en el percentil del 90% (83 UA), la OR
fue de 5,2 (IC 95%, 1,8 a 15,3).
El percentil 95 de los niveles de autoanticuerpo
anti-EPCR de isotipo IgG en el grupo control fue de
94 UA. De los 87 pacientes, 13 pacientes (15%) tuvieron valores que
excedieron ese punto de corte frente a los 4 sujetos del grupo
control. La OR no ajustada para muerte fetal en pacientes con
autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo IgG superior a
un percentil del 95% fue de 4,3 (IC 95%, 1,2 a 15,2). Cuando el
punto de corte se colocó en el percentil del 90% (88,4 UA), la OR
era de 2,3 (IC 95%, 0,9 a 5,6).
Adicionalmente, se ha realizado un análisis
multivariado ajustando por potenciales factores de confusión. Como
se indicó anteriormente, fue imposible incluir el FVL y el ACL en
el mismo modelo multivariado por lo que se consideraron dos modelos
diferentes: Modelo (1), ajustado por anticuerpos antifosfolípido
(es decir, anticuerpos ACL y anticardiolipina) y protrombina
G20210A y el Modelo (2), en el que se incluyó el FVL pero no el ACL.
La OR asociada con autoanticuerpos anti-EPCR de
isotipo IgM superior al percentil 95 en el Modelo (1) fue de 23,1
(IC 95%, 2 a 266,3) y en el Modelo (2) de 31,0 (IC 95, 2 a 384,3).
La OR asociada con autoanticuerpos anti-EPCR de
isotipo IgG superior al percentil 95 en el Modelo (1) fue de 6,8
(IC 95%, 1,2 a 38,4). De acuerdo con el Modelo (2), que incluye el
factor V de Leiden en lugar del ACL, la OR asociada con
autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo IgG superior al
percentil 95 era de 11,0 (IC 95%, 1,6 a 73,5). Los resultados se
recogen en la Tabla 3.
Estos resultados indican que los autoanticuerpos
anti-EPCR de isotipos IgM e IgG son factores de
riesgo independientes para la muerte fetal. Sin embargo los niveles
elevados de IgA no se asociaron de manera significativa con la
muerte fetal en este grupo de mujeres estudiado.
Se ha implementado un método, en particular, un
ELISA, que permite detectar la presencia de autoanticuerpos frente
a EPCR humano. Utilizando este sistema se ha estudiado un grupo de
pacientes con SAF caracterizado por trombosis y ACL y se ha
demostrado, por primera vez en patología humana, la presencia de
autoanticuerpos anti-EPCR específicos, de isotipos
IgM, IgG e IgA. Se ha estudiado el subgrupo de pacientes con SAF
con ACL porque ha sido relacionado con un mayor riesgo de
trombosis, y, por ello, se pensó que seria un grupo con elevada
probabilidad de presentar autoanticuerpos directamente relacionados
con la manifestación clínica. De hecho, se han encontrado numerosos
pacientes con un nivel muy elevado de autoanticuerpos
anti-EPCR.
Estos autoanticuerpos podrían proporcionar una
explicación para la trombosis y pérdida de embarazo en pacientes
con SAF. En primer lugar, el EPCR es una molécula que se expresa en
el endotelio de los vasos sanguíneos grandes y en el trofoblasto.
Las inmunoglobulinas IgM e IgG pueden fijar y activar el
complemento, si estos anticuerpos se dirigen contra EPCR podrían
activar el complemento en el endotelio y lesionarlo promoviendo la
trombosis a ese nivel. En segundo lugar, se ha demostrado que la
fracción de IgM de un paciente con elevados niveles de
autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo IgM puede
reducir seriamente la generación de PCA por células endoteliales en
presencia de trombina. Este efecto inhibitorio desaparece cuando se
elimina específicamente la IgM dirigida contra EPCR mediante el
paso del conjunto de la fracción de IgM a través de una columna de
afinidad por EPCR, lo que significa que el efecto inhibitorio es
debido al autoanticuerpo anti-EPCR de isotipo IgM.
Este anticuerpo conduciría probablemente a un bajo nivel de PCA
in vivo, lo cual es, en sí mismo, un fuerte factor de riesgo
de trombosis.
Al seleccionar los pacientes según el criterio de
trombosis venosa y/o arterial no se pudo evaluar el riesgo de
trombosis asociada con los autoanticuerpos
anti-EPCR. Por el contrario, se pudo detectar un
mayor nivel de autoanticuerpos anti-EPCR,
particularmente del isotipo IgM, en mujeres con historia previa de
muerte fetal que en mujeres sin ella. A la vista de dichos
resultados en el estudio piloto se decidió llevar a cabo un estudio
pareado de casos y controles para evaluar el riesgo de primer
episodio de muerte fetal inexplicable en una población general de
mujeres asociado con la presencia de autoanticuerpos
anti-EPCR. Se ha encontrado que un elevado nivel de
autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo IgM (definido
como un valor superior al percentil 95 de la distribución de
valores en sujetos control) era un fuerte factor de riesgo para los
primeros episodios de muerte fetal, con un riesgo relativo de 23 ó
31 comparado con los niveles inferiores. Niveles elevados de
autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo IgG
constituían también un fuerte factor de riesgo, pero más débil que
el del isotipo IgM, con un riesgo relativo de 7 u 11 dependiendo
del modelo matemático utilizado. En el análisis univariado, el ACL y
el anticuerpo anticardiolipina de isotipo IgM fueron asociados con
un mayor riesgo de muerte fetal pero dicha asociación fue atenuada
en el modelo multivariado debido, quizás, a que la información dada
por los anticuerpos antifosfolípido clásicos es debida a los
autoanticuerpos anti-EPCR asociados, que podrían ser
un factor etiológico de muerte fetal más que un mero marcador de
riesgo. Asimismo, se estudió la presencia de FVL y protrombina
G20210A, que han sido recientemente asociadas con un mayor riesgo
de muerte fetal tardía, encontrándose un mayor riesgo tanto en el
análisis univariado como multivariado asociado con ese
polimorfismo, pero el riesgo no era estadísticamente significativo,
probablemente debido al número de pacientes incluidos en el
estudio.
En conclusión, este estudio pone de manifiesto,
por primera vez, la presencia de autoanticuerpos
anti-EPCR en pacientes con SAF y trombosis. La
presencia de autoanticuerpos anti-EPCR de isotipos
IgM e IgG aumenta el factor de riesgo del primer episodio de muerte
fetal. Estos autoanticuerpos pueden por sí mismos contribuir a la
trombosis y a la muerte fetal que ocurre en el SAF y en la
población general.
142 mujeres (edad, 39\pm5 años,
media\pmdesviación típica) con infarto de miocardio y 142 mujeres
sanas (edad, 39\pm5 años) emparejadas por edad y procedencia
geográfica. Se estudiaron los factores de riesgo clásicos de infarto
de miocardio (hipertensión, hipercolesterolemia, diabetes, consumo
de tabaco y consumo de anticonceptivos orales). Se determinaron los
autoanticuerpos anti- EPCR IgG, IgM e IgA en muestras de plasma
siguiendo el protocolo del ensayo ELISA descrito en el apartado
"Materiales y Métodos" (Ejemplo 1).
Los niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR, considerados estos como valores por
encima del percentil 93 de la distribución de los niveles de
anticuerpos anti-EPCR en el grupo control, se
asociaron con un aumento del riesgo del infarto. En el análisis
multivariado los niveles elevados de anticuerpos
anti-EPCR se asociaron con una Odds ratio ajustada
(OR) de 3,5 con un intervalo de confianza al 95% (IC 95%) de
1,4-8,9 para la IgA, en el caso de la IgM OR = 3,0;
IC 95%: 1,2-7,5.
Los niveles elevados de autoanticuerpos
anti-EPCR son un factor de riesgo independiente de
infarto de miocardio en mujeres.
<110> Proyecto de Biomedicina CIMA,
S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para evaluar el riesgo y la
predisposición a desarrollar una patología relacionada con la
presencia de autoanticuerpos frente al EPCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcttggcat atcgattagc caagacgcct cagatg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptattctatgc ggccgccgaa gtgtaggagc ggcttg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de anclaje 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala His Gly His Arg Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de anclaje 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val
Ile His Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína de anclaje 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RASGO MISC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> aminoácido esencial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Met Thr Cys Xaa Xaa Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VSV-glicoproteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly
Lys}
Claims (37)
1. Un método para evaluar la presencia de niveles
elevados de autoanticuerpos frente al receptor endotelial de la
PC/PC activada (EPCR) en una muestra, caracterizado porque
comprende la cuantificación in vitro de autoanticuerpos
frente al EPCR en dicha muestra procedente de un sujeto.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque dichos niveles elevados de
autoanticuerpos frente al EPCR se relacionan con una patología
seleccionada entre una enfermedad autoinmune, una enfermedad
vascular y complicaciones obstétricas.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicha patología relacionada con la presencia de niveles elevados de
autoanticuerpos frente al EPCR en un sujeto es una enfermedad
autoinmune seleccionada entre síndrome antifosfolípido, lupus
eritematoso sistémico, artritis reumatoide y vasculitis
autoinmunes.
4. Método según la reivindicación 2, en el que
dicha patología relacionada con la presencia de niveles elevados de
autoanticuerpos frente al EPCR en un sujeto es una enfermedad
vascular seleccionada entre trombosis arterial, trombosis venosa y
trombosis de la microcirculación.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
dicha enfermedad vascular es un infarto de miocardio, un ictus
cerebral, accidente cerebral transitorio, isquemia de extremidades,
aterosclerosis, aneurisma, trombosis venosa superficial, trombosis
venosa profunda, o embolia pulmonar.
6. Método según la reivindicación 2, en el que
dicha patología relacionada con la presencia de niveles elevados de
autoanticuerpos frente al EPCR en un sujeto es una complicación
obstétrica seleccionada entre aborto, muerte fetal, nacimiento
prematuro, retraso del crecimiento intrauterino, eclampsia o
pre-eclampsia.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra es una muestra de suero o plasma de dicho sujeto.
8. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho sujeto es un ser humano.
9. Método según la reivindicación 1, en el que la
cuantificación de dichos autoanticuerpos anti-EPCR
se realiza mediante un ensayo inmunológico acoplado a un
marcador.
10. Método según la reivindicación 1, en el que
la cuantificación de dichos autoanticuerpos
anti-EPCR se realiza mediante un ELISA que
comprende:
- a)
- inmovilizar en un soporte sólido un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del receptor endotelial de la PC/PC activada (EPCR) o un fragmento de la misma que contiene, al menos, un epítopo susceptible de ser reconocido por un autoanticuerpo anti-EPCR;
- b)
- incubar dicho polipéptido inmovilizado con una muestra sospechosa de contener autoanticuerpos anti-EPCR procedente de dicho sujeto durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión de dichos anticuerpos al polipéptido inmovilizado y la formación de complejos polipéptido-autoanticuerpo anti-EPCR;
- c)
- retirar la muestra no unida a dicho polipéptido inmovilizado;
- d)
- incubar dichos complejos polipéptido-autoanticuerpo anti-EPCR con un segundo anticuerpo conjugado a una enzima, en donde dicho segundo anticuerpo es un anticuerpo capaz de unirse a dichos autoanticuerpos anti-EPCR.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho polipéptido se selecciona entre:
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del EPCR longitud completa, y
- un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento del EPCR que contiene, al menos, un epítopo susceptible de ser reconocido por un anticuerpo anti-EPCR.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que comprende:
(i) una región A constituida por un polipéptido
que contiene la secuencia de 5 aminoácidos del EPCR o un fragmento
de la misma que contiene, al menos, un epítopo susceptible de ser
reconocido por un anticuerpo anti-EPCR, y
(ii) una región B constituida por un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento
o purificación de dicha proteína de fusión y/o una secuencia de
aminoácidos útil para el anclaje de dicha proteína de fusión a un
soporte sólido.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
dicha región B está unida al extremo amino terminal de dicha región
A.
14. Método según la reivindicación 12, en el que
dicha región B está unida al extremo carboxilo terminal de dicha
región A.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que dicha región A comprende la
secuencia de aminoácidos de la parte soluble del EPCR humano.
16. Método según la reivindicación 12, en el que
dicha secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento o
purificación de dicha proteína de fusión y/o dicha secuencia de
aminoácidos útil para el anclaje de dicha proteína de fusión a un
soporte sólido presente en dicha región B comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre Arg-tag,
His-tag, FLAG-tag,
Strep-tag, un epítopo susceptible de ser reconocido
por un anticuerpo, SBP-tag, S-tag,
péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa,
dominio de unión a quitina, glutatión
S-transferasa-tag, proteína de unión
a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag,
Ala-His-Gly-His-Arg-Pro
(SEQ ID NO: 4) (2, 4, y 8 copias),
Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser
(SEQ ID NO: 5),
Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys
(SEQ ID NO: 6) (6 repeticiones),
\beta-galactosidasa y
VSV-glicoproteína (SEQ ID NO: 7).
17. Método según la reivindicación 16, en el que
dicha región B está constituida por un polipéptido que comprende un
epítopo c-myc susceptible de ser reconocido por un
anticuerpo anti-c-myc y una cola de
histidinas (His-tag).
18. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que comprende la
secuencia de aminoácidos de la parte soluble del EPCR humano, la
secuencia de aminoácidos correspondiente al epítopo
c-myc y una cola de histidinas
(His-tag).
19. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que tiene la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.
20. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho segundo anticuerpo es un anticuerpo específico de isotipo de
inmunoglobulinas y procede de una especie diferente a la del sujeto
cuya muestra se analiza.
21. Método según la reivindicación 20, en el que
dicho segundo anticuerpo específico de isotipo de inmunoglublinas
se selecciona entre un anticuerpo anti-IgG humana,
un anticuerpo anti-IgM humana, un anticuerpo
anti-IgA humana, y sus mezclas.
22. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho segundo anticuerpo está conjugado a una enzima seleccionada
entre peroxidasa y fosfatasa alcalina.
23. Método según la reivindicación 1, que
comprende, además, la comparación del nivel de autoanticuerpos
anti-EPCR determinado en la muestra del sujeto con
los niveles normales.
24. Un método para monitorizar in vitro el
efecto de la terapia administrada a un sujeto que presente una
patología relacionada con la presencia de niveles elevados de
autoanticuerpos anti-EPCR en dicho sujeto, que
comprende la cuantificación in vitro de dichos
autoanticuerpos anti-EPCR en una muestra de dicho
sujeto.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
dicho sujeto es un sujeto previamente diagnosticado de alguna
enfermedad autoinmune o vascular, o que ha sufrido alguna
complicación obstétrica, y está sometido a tratamiento
terapéutico.
26. Empleo de un polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos del receptor endotelial de la PC/PC
activada (EPCR) o un fragmento de la misma que contiene, al menos,
un epítopo susceptible de ser reconocido por un autoanticuerpo
anti-EPCR en un método para evaluar el riesgo y la
predisposición de un individuo a desarrollar una patología
relacionada con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
frente al receptor endotelial de la PC/PC activada (EPCR) en dicho
sujeto, que comprende la cuantificación in vitro de
autoanticuerpos frente al EPCR en una muestra de dicho sujeto.
27. Empleo según la reivindicación 26, en el que
dicha patología relacionada con la presencia de niveles elevados de
autoanticuerpos frente al EPCR en un sujeto se selecciona entre una
enfermedad autoinmune, una enfermedad vascular y complicaciones
obstétricas.
28. Empleo según la reivindicación 26, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que comprende:
(i) una región A constituida por un polipéptido
que contiene la secuencia de aminoácidos del EPCR o un fragmento de
la misma que contiene, al menos, un epítopo susceptible de ser
reconocido por un anticuerpo anti-EPCR, y
(ii) una región B constituida por un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento
o purificación de dicha proteína de fusión y/o una secuencia de
aminoácidos útil para el anclaje de dicha proteína de fusión a un
soporte sólido.
29. Empleo según la reivindicación 28, en el que
dicha región A comprende la secuencia de aminoácidos de la parte
soluble del EPCR humano.
30. Empleo según la reivindicación 28, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que comprende la
secuencia de aminoácidos de la parte soluble del EPCR humano, la
secuencia de aminoácidos correspondiente al epítopo
c-myc y una cola de histidinas
(His-tag).
31. Empleo según la reivindicación 28, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que tiene la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.
32. Un kit para evaluar in vitro el riesgo
y la predisposición de un individuo a desarrollar una patología
relacionada con la presencia de niveles elevados de autoanticuerpos
frente al EPCR en un sujeto que comprende un polipéptido que
comprende la secuencia de aminoácidos del receptor endotelial de la
PC/PC activada (EPCR) o un fragmento de la misma que contiene, al
menos, un epítopo susceptible de ser reconocido por un
autoanticuerpo anti-EPCR.
33. Kit según la reivindicación 32, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que comprende:
(i) una región A constituida por un polipéptido
que contiene la secuencia de aminoácidos del EPCR o un fragmento de
la misma que contiene, al menos, un epítopo susceptible de ser
reconocido por un anticuerpo anti-EPCR, y
(ii) una región B constituida por un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento
o purificación de dicha proteína de fusión y/o una secuencia de
aminoácidos útil para el anclaje de dicha proteína de fusión a un
soporte sólido.
34. Kit según la reivindicación 33, en el que
dicha región A comprende la secuencia de aminoácidos de la parte
soluble del EPCR humano.
35. Kit según la reivindicación 33, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que comprende la
secuencia de aminoácidos de la parte soluble del EPCR humano, la
secuencia de aminoácidos correspondiente al epítopo
c-myc y una cola de histidinas
(His-tag).
36. Kit según la reivindicación 33, en el que
dicho polipéptido es una proteína de fusión que tiene la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.
37. Kit según la reivindicación 32, en el que
dicha patología relacionada con la presencia de niveles elevados de
autoanticuerpos frente al EPCR en un sujeto se selecciona entre una
enfermedad autoinmune, una enfermedad vascular y complicaciones
obstétricas.
Priority Applications (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200400269A ES2239532B1 (es) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | Metodo para evaluar el riesgo y la predisposicion a desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr. |
DE602005017016T DE602005017016D1 (de) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | Verfahren zur beurteilung der gefahr und veranlagung, eine mit dem vorliegen von anti-epcr-antikörpern verbundene symptomatik zu entwickeln |
BRPI0506635-2A BRPI0506635A (pt) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | método para avaliar risco e predisposição de desenvolvimento de uma patologia relacionada à presença de anti-corpos anti-repc |
MXPA06008799A MXPA06008799A (es) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | Metodo para evaluar el riesgo y la predisposicion desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr. |
EP05701698A EP1722229B8 (en) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | Method of assessing risk of and predisposition to the development of a pathology related to the presence of anti-epcr antibodies |
CA002555783A CA2555783A1 (en) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | Method for assessing risk of and predisposition to development of a pathology related to the presence of anti-epcr autoantibodies |
CNA2005800068535A CN1954216A (zh) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | 评估出现与抗epcr自身抗体的存在相关的病理的危险度和素因的方法 |
PCT/ES2005/000046 WO2005076000A1 (es) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | Método para evaluar el riesgo y la predisposición a desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr |
AT05701698T ATE445163T1 (de) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | Verfahren zur beurteilung der gefahr und veranlagung, eine mit dem vorliegen von anti-epcr-antikörpern verbundene symptomatik zu entwickeln |
AU2005210776A AU2005210776A1 (en) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | Method for assessing risk of and predisposition to development of a pathology related to the presence of anti-EPCR autoantibodies |
JP2006551864A JP2007520713A (ja) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | 抗epcr抗体の存在に関連する病状の進展の危険性および傾向の評価方法 |
RU2006132064/15A RU2375716C2 (ru) | 2004-02-06 | 2005-02-03 | Способ оценки риска развития и предрасположенности к развитию патологии, ассоциированной с присутствием аутоантител против epcr |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200400269A ES2239532B1 (es) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | Metodo para evaluar el riesgo y la predisposicion a desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2239532A1 true ES2239532A1 (es) | 2005-09-16 |
ES2239532B1 ES2239532B1 (es) | 2006-11-01 |
Family
ID=34833893
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200400269A Expired - Fee Related ES2239532B1 (es) | 2004-02-06 | 2004-02-06 | Metodo para evaluar el riesgo y la predisposicion a desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1722229B8 (es) |
JP (1) | JP2007520713A (es) |
CN (1) | CN1954216A (es) |
AT (1) | ATE445163T1 (es) |
AU (1) | AU2005210776A1 (es) |
BR (1) | BRPI0506635A (es) |
CA (1) | CA2555783A1 (es) |
DE (1) | DE602005017016D1 (es) |
ES (1) | ES2239532B1 (es) |
MX (1) | MXPA06008799A (es) |
RU (1) | RU2375716C2 (es) |
WO (1) | WO2005076000A1 (es) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090286256A1 (en) * | 2008-05-19 | 2009-11-19 | Abbott Laboratories | Isolated human autoantibodies to natriuretic peptides and methods and kits for detecting human autoantibodies to natriuretic peptides |
CN102803965A (zh) * | 2009-05-05 | 2012-11-28 | 耶达研究与发展有限公司 | 用于识别个人心血管疾病的发生的装置和方法 |
US20130035254A1 (en) * | 2010-02-12 | 2013-02-07 | Tel Hashomer Medical Research Infras | Diagnosis of systemic lupus erythematosus (sle) |
EP2630495B1 (en) * | 2010-10-18 | 2017-02-08 | Nestec S.A. | Methods for determining anti-drug antibody isotypes |
EA018848B1 (ru) * | 2010-10-20 | 2013-11-29 | Вадим Юльевич ШАНИН | Иммунологически активное вещество, способ его получения, биозонд на его основе и способ диагностики состояния здоровья с применением биозонда, фармацевтическая композиция и способ лечения с использованием фармацевтической композиции |
ES2535743T3 (es) * | 2011-02-02 | 2015-05-14 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Anticuerpos antiproteína carbamilada y el riesgo de padecer artritis |
RU2586412C2 (ru) * | 2012-06-09 | 2016-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью научно-технический центр "БиоКлиникум" (ООО НТЦ "БиоКлиникум") | Способ оценки риска возникновения патологии беременности |
RU2517051C1 (ru) * | 2013-01-09 | 2014-05-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) | Способ определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин |
CN104655860A (zh) * | 2013-11-21 | 2015-05-27 | 苏州中赢医疗科技有限公司 | 一种类风湿性关节炎的诊断标志 |
JP2017503169A (ja) | 2013-12-31 | 2017-01-26 | イエダ・リサーチ・アンド・デベロツプメント・カンパニー・リミテツド | オリゴヌクレオチド抗原を使用する全身性エリテマトーデスの診断 |
US11047855B2 (en) | 2015-03-01 | 2021-06-29 | Immunarray Ltd. | Diagnosis of systemic lupus erythematosus using protein, peptide and oligonucleotide antigens |
US20230043394A1 (en) * | 2019-12-30 | 2023-02-09 | Universitätsmedizin Der Johannes Gutenberg-Universität Mainz | Methods for detection of pathogenic antiphospholipid antibodies and for identification of inhibitors |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0600088A1 (en) * | 1992-02-05 | 1994-06-08 | Yamasa Corporation | Solid-phase reagent and assay of antibody using the same |
US6037450A (en) * | 1997-06-27 | 2000-03-14 | Oklahoma Medical Research Foundation | Diagnostic assays using soluble endothelial cell protein C/activated protein C receptor |
US6617145B2 (en) * | 1999-10-01 | 2003-09-09 | Amgen Inc | DNA molecules encoding fibrinolytically active polypeptide |
-
2004
- 2004-02-06 ES ES200400269A patent/ES2239532B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-02-03 AU AU2005210776A patent/AU2005210776A1/en not_active Abandoned
- 2005-02-03 AT AT05701698T patent/ATE445163T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-02-03 RU RU2006132064/15A patent/RU2375716C2/ru active
- 2005-02-03 JP JP2006551864A patent/JP2007520713A/ja not_active Withdrawn
- 2005-02-03 CA CA002555783A patent/CA2555783A1/en not_active Abandoned
- 2005-02-03 CN CNA2005800068535A patent/CN1954216A/zh active Pending
- 2005-02-03 EP EP05701698A patent/EP1722229B8/en active Active
- 2005-02-03 MX MXPA06008799A patent/MXPA06008799A/es unknown
- 2005-02-03 DE DE602005017016T patent/DE602005017016D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2005-02-03 WO PCT/ES2005/000046 patent/WO2005076000A1/es active Application Filing
- 2005-02-03 BR BRPI0506635-2A patent/BRPI0506635A/pt not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0600088A1 (en) * | 1992-02-05 | 1994-06-08 | Yamasa Corporation | Solid-phase reagent and assay of antibody using the same |
US6037450A (en) * | 1997-06-27 | 2000-03-14 | Oklahoma Medical Research Foundation | Diagnostic assays using soluble endothelial cell protein C/activated protein C receptor |
US6617145B2 (en) * | 1999-10-01 | 2003-09-09 | Amgen Inc | DNA molecules encoding fibrinolytically active polypeptide |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
GU, J.-M., CRAWLEY, J. T. B., FERRELL. G. et al. Disruption of the endothelial cell protein C receptor gene in mice causes placental thrombosis and early embryonic lethality. The Journal of Biological Chemistry. Noviembre 2002, Vol. 277, N 45, paginas 43335-43343. * |
GU, J.-M., CRAWLEY, J. T. B., FERRELL. G. et al. Disruption of the endothelial cell protein C receptor gene in mice causes placental thrombosis and early embryonic lethality. The Journal of Biological Chemistry. Noviembre 2002, Vol. 277, Nº 45, páginas 43335-43343. * |
OOSTING, J. D., DERKSEN, R. H. W. M., BOBBINK, I. W. G. et al. Antiphospholipid antlibodies directed against a combination of phospholipids with prothrombin, protein C, or protein S: an explanation for their pathogenic mechanism? Blood. Mayo 1993, Vol. 81, N 10, paginas 2618-2625. * |
OOSTING, J. D., DERKSEN, R. H. W. M., BOBBINK, I. W. G. et al. Antiphospholipid antlibodies directed against a combination of phospholipids with prothrombin, protein C, or protein S: an explanation for their pathogenic mechanism? Blood. Mayo 1993, Vol. 81, Nº 10, páginas 2618-2625. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2005210776A1 (en) | 2005-08-18 |
DE602005017016D1 (de) | 2009-11-19 |
WO2005076000A1 (es) | 2005-08-18 |
EP1722229A1 (en) | 2006-11-15 |
WO2005076000A8 (es) | 2005-10-27 |
MXPA06008799A (es) | 2007-04-17 |
EP1722229B1 (en) | 2009-10-07 |
RU2375716C2 (ru) | 2009-12-10 |
EP1722229B8 (en) | 2009-11-25 |
CA2555783A1 (en) | 2005-08-18 |
BRPI0506635A (pt) | 2007-05-08 |
JP2007520713A (ja) | 2007-07-26 |
ATE445163T1 (de) | 2009-10-15 |
RU2006132064A (ru) | 2008-03-20 |
CN1954216A (zh) | 2007-04-25 |
ES2239532B1 (es) | 2006-11-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2005076000A1 (es) | Método para evaluar el riesgo y la predisposición a desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr | |
US20070141625A1 (en) | Method for assessing risk of and predisposition to development of a pathology related to the presence of anti-epcr autoantibodies | |
ES2720594T3 (es) | Anticuerpos anti-fXI y métodos de uso | |
ES2406266T3 (es) | Antígeno CD14 soluble novedoso | |
JP2013078319A (ja) | フォンビルブランド因子特異的切断酵素を主成分とする診断薬および医薬品 | |
ES2948446T3 (es) | Adrenomedulina para la valoración de la congestión en un sujeto con insuficiencia cardiaca aguda | |
ES2857552T3 (es) | Inmunoensayo para detectar cininógenos de alto peso molecular escindido | |
ES2119165T5 (es) | Nueva actividad de cofactor anticoagulante. | |
KR20190120174A (ko) | 울혈의 중재 및 치료가 필요한 환자에서 울혈의 중재 및 치료에 사용하기 위한 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드 | |
JP6081714B2 (ja) | 高コレステロール血症と動脈硬化の検出方法 | |
Yatsenko et al. | Polyclonal antibodies against human plasminogen: purification, characterization and application | |
JP6417118B2 (ja) | Pcsk9測定用標準物質 | |
Keeling | Fibrinolytic Abnormalities and Antiphospholipid Antibodies | |
Sato et al. | Anti-Factor XII Autoantibodies in Patients with Recurrent Pregnancy Loss Recognize the Second Epidermal Growth Factor–Like Domain | |
JP2022553753A (ja) | 好中球細胞外トラップに関連する線維素溶解不全の診断方法 | |
JP6338933B2 (ja) | Pcsk9関連薬剤のスクリーニング、又は、当該薬剤の投与効果の確認を行うためのpcsk9の測定方法 | |
Greengard et al. | using zyxwvutsrqponmlkji |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20050916 Kind code of ref document: A1 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2239532B1 Country of ref document: ES |
|
FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180809 |