EP1497657A2 - Verfahren zur charakterisierung von primärtumoren - Google Patents

Verfahren zur charakterisierung von primärtumoren

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EP1497657A2
EP1497657A2 EP03725055A EP03725055A EP1497657A2 EP 1497657 A2 EP1497657 A2 EP 1497657A2 EP 03725055 A EP03725055 A EP 03725055A EP 03725055 A EP03725055 A EP 03725055A EP 1497657 A2 EP1497657 A2 EP 1497657A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
tumor
cells
dna
cell clusters
pbs
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03725055A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Burkhard Hermann Brandt
Nicola Tidow
Hartmut Schmidt
Axel Semjonow
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Individual
Original Assignee
Individual
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Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1497657A2 publication Critical patent/EP1497657A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for characterizing primary tumors or individual areas thereof from peripheral blood. Such methods are required to make an assessment of the degree of malignancy, the invasiveness or the metastasis potential of primary tumors.
  • Such methods are required for all types of tumors, in particular for breast cancers, ovarian cancers, colon cancers, gastric cancers, prostate cancers and bladder cancers.
  • Prostate cancer is one of the most common causes of malignant death in the western world.
  • Three types of prostate carcinoma can be derived according to prognostic criteria: (1) the small painless carcinoma, which does not grow into a clinically conspicuous or metastatic carcinoma during the patient's life span; (2) the slowly growing carcinoma, which is regionally lymphatic at the beginning and only late in the Skeleton metastasized; (3) early metastatic carcinoma, which affects the entire prostate diffusely and metastasizes directly into the skeleton.
  • curative therapy is only possible for early, ie organ-limited tumor stages. Radical prostatectomy or radiation treatment are available for this. However, the optimal type of treatment is still under discussion.
  • prostate carcinomas removed by radical prostatectomy show characteristics similar to those found in asymptomatic autopsy and appear to be relatively benign, ie organ-limited and well differentiated with a small tumor volume. Although the natural course of these cancers is not yet well known, it is believed that these cancers may not require treatment. However, about half of all prostate preparations after radical prostatectomy show a higher proportion of poorly differentiated life-threatening carcinomas than could be predicted from the preoperative biopsies. This illustrates the poor predictability of the degree of malignancy, so that the active treatment of clinically classified as insignificant carcinomas might be the right decision. There are no parameters to distinguish between potentially life-threatening prostate carcinomas and those with a relatively benign or even asymptomatic course before treatment.
  • the clinically established tumor marker PSA has also not proven to be a metastatic marker. (Jhaveri et al. Urology 1999 Nov.; 54 (5): 884-90; Pound et al. JAMA 1999 May 5; 281 (17) .1591-7; Wolff et al. Eur Urol 1998; 33 (4): 376-81). Another serum parameter is now available with the free PSA. However, this did not improve patient staging (Lin et al. Urology 1998 Sep; 52 (3): 366-71). RT-PCR to determine PSA mRNA has become the most widely used method for the detection of circulating prostate cancer cells.
  • PSMA prostate-specific membrane antigen
  • PSM prostate-specific membrane antigen
  • a complementary parameter for the detection of PSA mRNA could be the determination of the mRNA of human glandular kallikrein (hK2).
  • the protein is expressed specifically for the prostate and has a structural homology of 80% with the PSA.
  • a third of the PSA-positive patients were also positive for hK2, while in 50% of the hK2-positive samples the PSA-RT-PCR was negative (Corey et al., Urology 50, 184-188, 1997 ).
  • the present invention has the object to provide a method for the characterization of primary tumors or individual areas of primary tumors, with which a reliable staging and a reliable prognosis of the tumors can be determined.
  • the method according to the invention is advantageously based on the analysis of short, simple, repetitive sequences, the DNA, in particular but not exclusively so-called microsatellite DNA.
  • Tumors can be characterized as to whether they are proliferative, non-proliferative or apoptotic.
  • the degree of malignancy, the invasiveness, for example with regard to organ overshoot, and metastasis can be determined on the basis of the method according to the invention by genotyping cells from cell clusters.
  • tumor cells isolated from blood samples can be assigned to individual areas of a multifocal tumor, i.e. their clonality will be determined. Such a grading enables the prognosis to be assessed and the primary tumors to be finely classified.
  • micro-satellites which is stated in claim 4, has proven to be particularly advantageous are.
  • a multiplex PCR was developed for amplifying the DNA, as specified in claim 6, the selection of the microsatellites and the primers for the multiplex PCR, as specified in claim 8, in particular causing the microsatellites of each multiplex PCR extracts are distributed over as many chromosomes as possible and the amount of amplified fragments differs between the individual microsatellites in such a way that separation, for example by means of subsequent capillary electrophoresis, is possible without problems.
  • the PCR can be separated and evaluated, for example, on an automated system, such as the ABI Prism 310 Genetic Analyzer TM. Reproducible amplification patterns are possible in a concentration range from 100 ng down to 1 ng of used DNA.
  • the investigated genomic alterations of the microsatellite DNA concern the so-called LOH value (loss of heterozygosity) and the RER value (replication error).
  • LOH Score peak area allele 2 tumor x peak area allele 1 normal tissue / peak area allele 1 tumor x peak area allele 2 normal tissue used.
  • the formula is based on test results that were determined using an analog genetic analysis system. The ratio of the peak areas of the alleles in one run is included in the calculation. Table 1 shows, using the example of the marker D13S153, that the quotients of the peak areas with a low coefficient of variation can be determined.
  • the multiplex PCR protocols according to the invention thus allow a reproducible and sensitive determination of an LOH. are.
  • a multiplex PCR was developed for amplifying the DNA, as specified in claim 6, the selection of the microsatellites and the primers for the multiplex PCR, as specified in claim 8, in particular causing the microsatellites of each multiplex PCR extracts are distributed over as many chromosomes as possible and the amount of amplified fragments differs between the individual microsatellites in such a way that separation, for example by means of subsequent capillary electrophoresis, is possible without problems.
  • the PCR can be separated and evaluated, for example, on an automated system, such as the ABI Prism 310 Genetic Analyzer TM. Reproducible amplification patterns are possible in a concentration range from 100 ng down to 1 ng of used DNA.
  • the investigated genomic alterations of the microsatellite DNA concern the so-called LOH value (loss of heterozygosity) and the RER value (replication error).
  • LOH Score peak area allele 2 tumor x peak area allele 1 normal tissue / peak area allele 1 tumor x peak area allele 2 normal tissue used.
  • the formula is based on test results that were determined using an analog genetic analysis system. The ratio of the peak areas of the alleles in one run is included in the calculation.
  • Table 1 shows, using the example of the marker D13S153, that the quotients of the peak areas can be determined with a low coefficient of variation. The multiplex PCR protocols according to the invention thus allow a reproducible and sensitive determination of an LOH.
  • Table 1 Comparison of the quotients for alleles 1 and 2 in MCF-7 cells
  • the length of the fragments is also included in the calculation of a "replication error" (RER) using a factor which represents the center of gravity of the peak distribution.
  • RER replication error
  • the lower detection limit for multiplex PCR with three primer pairs was determined both on DNA from the cell lines SK-BR-3 and LNCaP and on patient DNA (comparison of tumor DNA and leukocyte DNA).
  • a reproducible band pattern was achieved for all polymorphic markers up to a concentration of> 1 ng DNA. This corresponds to a number of approximately 50 cells.
  • the tumor cells to be examined are advantageously isolated or enriched from a sample, for example a blood sample, in which epithelial cells are first enriched by means of density gradient centrifugation and then immunomagnetic isolation or enrichment of cytokeratin-positive and / or PSA- positive cell cluster is carried out. Magnetic beads are used for this purpose, to which corresponding antibodies are bound.
  • the density gradient centrifugation is advantageously carried out as in Brandt and Griwatz, Clin. Chem. 42, No. 11 1996, pp. 1881-1882. This publication is hereby incorporated into the present application with regard to its entire disclosure content.
  • the immunomagnetic cell isolation is advantageously carried out as in Griwatz et al. , J. Immunol. Meth.
  • the following antibodies were also used as primary antibodies: rabbit-mouse anti-PSA, mouse anti-cytokeratin biotinylated, mouse anti-cFas, mouse anti-M30, mouse anti-Mibl and mouse anti-Hl / H3 histone proteins and as Secondary antibodies the following antibodies: anti-rabbit and anti-mouse marked with Alexa-488 and -594 or FITC, Cy5, Cy3, RPE.
  • cells isolated by this method are predominantly cell clusters that are positive for the detection of PSA and cytokeratin. All patients with prostate cancer had such cell clusters, while the control samples for the detection of such cells were negative.
  • the size of the clusters ranges from 2 to 70 cells, with the number 10
  • the heap in 20 ml of peripheral blood was between 1 and 5400. However, about 90% of the patients have more than 100 cells (and the detection limit is therefore exceeded).
  • two classes of cell clusters could be distinguished based on the cell morphology and the nuclear staining. Heaps of dysmorphic cells were found in large numbers. In some cases, small round nucleated cells were included. In addition, 25 of the 74 patients with prostate cancer examined had clusters that consisted only of small, round and nucleated cells with a diameter of approx. 5 to 7 ⁇ m. Most of the patients (approx. 60%) had fewer than 10 such cell clusters in 20 ml of blood. In three cases, however, up to 200 such cell clusters were detectable.
  • Both groups of cell clusters differ in their detection of the apoptosis markers c-Fas and M30, as well as the proliferation markers Mib-1 and H1 / H3.
  • the dysmorphic cell clusters were positive for the cFas and M30 markers, while the group of small, round, nucleated cell clusters was negative.
  • FIG. 1 shows in partial image A the cell diameter before the cells were suspended by suspension in a hyperosmolar buffer for density gradient centrifugation. The cell diameter averages 8.02 ⁇ m.
  • FIG. 2B shows the cell diameter after being taken up in a hyperosmolar buffer such as Nycoprep or Polymorphprep. The average diameter decreased to 4.97 ⁇ m.
  • cell isolation is given as an example for different cell and tumor types.
  • Cell suspensions of the tumor are prepared as described in the procedure in V.
  • a cell suspension isolated from a breast or ovarian carcinoma as described under V. is incubated for 10 min at room temperature (RT) in PABB buffer (saturates binding sites),
  • fractions are centrifuged off and resuspended in 1% PBS / BSA
  • centrifuge epifuge, 10 min, 1500 rpm, discard supernatant, ice compartment (- 20 ° C)
  • immunomagnetic beads e.g. MACS Bead ® anti-mouse AK or, for example, also anti-rabbit, 16
  • PABB 5 ml AB serum 10% (v / v) + 50 ⁇ l BSA-C 0.1% (v / v) + 45 ml PBS
  • the ratio of tumor cells / monocytes in the first positive fraction (+) is significantly shifted, often only single monocytes are found and thus a high degree of purity of the tumor cells.
  • PBS / BSA 1 g BSA (Bovine Albumine) / 100 ml PBS
  • Antibody mouse anti-cytokeratin antibody working concentration 1:50 (in PABB) (C7, C20 or PAN) secondary antibody: anti-mouse Alexa 594 antibody working concentration 1: 100 (in PABB) isotype control in 10% AB- serum
  • Antibody Anti-PSA antibody working concentration 1:50 (in PABB) secondary antibody: Anti-Rabbit Alexa 488 antibody working concentration 1: 100 (in PABB)
  • Invasion medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 1% (v / v) 2 mM L-glutamine
  • Tissue pieces from freshly operated breast carcinomas, benign breast diseases or prostate carcinomas are placed in sterile tubes with standard medium by the surgeon and placed on ice until disaggregation (at the latest 4 hours after removal). Approximately half of each piece of tissue is removed for later expression analysis and preserved in liquid nitrogen. The other half is disaggregated using a mechanical method. A medimachine (company Dako, Hamburg) is used for this. For disaggregation, the breast tissue is cut into 3 to 10 mm 2 pieces with a scalpel and placed in a Medicon together with 1.5 ml of invasive medium. The tissue is then aggregated within 2 to 3 minutes within the medimachine to form a cell suspension which contains single cells and cell aggregates (cell clusters) of up to approx. 30 cells.
  • the cells are counted microscopically in a Neubauer counting chamber and the number of living cells is determined using the trypan blue exclusion test, which is based on the fact that certain dyes (e.g. trypan blue) cannot enter the cell interior of living cells, while dead cells deal with the relevant dye stain (Kaltenbach et al., 1958; Lindl and Bauer, 1994).
  • the isolated cell clusters are genotyped for the purpose of their assignment to areas in the primary tumor by means of PCR.
  • the PSA and cytokeratin positive tumor cells and tumor cell clusters and non-positive monocytes as a negative control (or reference for the LOH calculation) are microdissected with a sterile fine needle and placed in 1.5 ml sterile reaction vessels (Eppendorf Biopure) transferred.
  • Eppendorf Biopure 1.5 ml sterile reaction vessels
  • the cells are taken up in 10-200 ⁇ l LTE buffer (10 mM Tris / HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) and with 1-20 ⁇ l proteinase K (> 600mAU / ml ) incubated in a thermoblock or water bath at 50-56 ° C for 1-10 h and then placed on ice for 5 min. The samples are then centrifuged for 1 min at 10,000 rpm. The samples are then adjusted to a 70% solution with 99.8% ethanol pa (Roth). After briefly vortexing, the samples are centrifuged off at 15,000 rpm for 20 min, the supernatant is discarded and the DNA pellet is dried at room temperature. The DNA is then resuspended in 10-200 ⁇ l LTE buffer or double distilled water, incubated at room temperature for 1 h (rehydration) and frozen at -20 ° C. until the PCR is carried out. 28
  • DNA isolation from fresh and formalin-fixed or paraffin-embedded tissue from the primary tumors of one or more foci is carried out according to the protocols of the commercially available QIAmp DNA Mini Kit (from Qiagen, Hilden) or a comparable system from other manufacturers.
  • This kit contains QlAamp DNA Mini Spin Columns (columns), Proteinase K for the proteolytic digestion of the tissue, the lysis buffers AL and ATL, the ethanol-containing washing buffers AW1 and AW2 and the elution buffer AE.
  • Fresh tissue from a primary tumor is mechanically disrupted with a scalpel or tissue shredding machines (e.g. medomachine, DACO) provided for this purpose before tissue lysis.
  • a scalpel or tissue shredding machines e.g. medomachine, DACO
  • tissue sections embedded in paraffin dewaxing with 100% xylene is carried out before the actual DNA isolation.
  • the samples are first incubated in 1 ml xylene in 1.5 ml Eppendorf reaction vessels in a commercially available thermoblock at 70 ° C for 1 h. The supernatant was then centrifuged for 3 minutes and the process repeated twice. The tissue is then washed three times with 99.8% ethanol (Roth), then dried and transferred to the lysis buffer. The isolation is then carried out according to the manufacturer's protocols.
  • DNA isolation from EDTA-anticoagulated whole blood is carried out with the QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden) according to the known protocols or comparable methods from other manufacturers.
  • the whole blood is incubated for 10 min with buffer AL and proteinase K to lyse the cells at 54 ° C in a thermoblock, then mixed with ethanol and the mixture is added to the column (QIAmp DNA Mini Spin Columns). The samples are washed with AW1 and then with AW2 and eluted with the elution buffer AE.
  • Solutions are measured photometrically at 260, 280 and 320 nm, adjusted to 10 ng / ⁇ l and frozen at -20 ° C.
  • the PSA- and cytokeratin-positive tumor cells and tumor cell clusters are microdissected with a sterile fine needle on an inverse light microscope (Leitz Diavert) and transferred to a 1.5 ml sterile reaction vessel (Eppendorf Biopure).
  • the RNA isolation is carried out strictly according to the protocols of the RNeasy Purification Kit for total RNA minipreparation (Qiagen, Hilden), consisting of: RNeasy Mini Spin Colums, Collection tubes 1.5 and 2 ml, buffer RTL, buffer RWI, buffer RPE and RNase-free water).
  • carcinoma-specific genetic changes and mRNA expressions by means of microsatellite PCR, multiplex microsatellite PCR and TaqMan TM RT-PCR is now described below by way of example.
  • a total of three multiplex PCRs are used, which consist of microsatellite combinations No. 1: D7S522 D8S258, D16S400, No. 2: NEFL, D13S153, D17S855 and No. 3 D10S541, D16S402, D16S422.
  • the principle of these PCRs is based on the co-amplification of different DNA sections in one reaction vessel.
  • the primer sequences were set in such a way that there was no overlap in the lengths of the amplification products in the capillary electrophoretic separation. All primers are labeled with fluorescent dyes that are excited at 488 nm (see Table 3). All other commercially available fluorescent labels can also be used. Furthermore 30
  • All PCRs can be in commercially available 0.2 ml or 0.5 ml reaction tubes or in 96-well plates from different manufacturers (e.g. Eppendorf, Hamburg) on an Eppendorf Mastercycler, Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg), a Gene AmpR PCR System 9700 (PE Applied Biosystems, Rothstadt) or a commercially available, comparable thermal cycler from other manufacturers.
  • the reaction volume can be 12 ⁇ l to 100 ⁇ l.
  • the PCR reaction mixture consists of 5U / 100 ⁇ l AmpliTaq Gold TM or a qualitatively comparable polymerase and (hot start polymerases have proven successful) 1 x GeneAmp R dNTP, 2mM MgCl 2 , 30pm from each primer, 200 ⁇ M GeneAmp R buffer (all reagents from PE Applied Biosystems, Rothstadt) and 500 pg to 200 ng genomic DNA. The following temperature gradients are run for the PCR.
  • microsatellite analysis is carried out on the capillary electrophoresis devices (four color laser-induced fluorescence capillary electrophoresis system) ABI Prism 310 gene 31
  • the polymers POP4, POP5 and POP6 are used as separation medium and are suitable for the corresponding devices.
  • the length standard used is Genescan-500TM TAMRA 500 or a comparable length standard that is suitable for the capillary electrophoresis devices mentioned. The analysis and evaluation was carried out with the Genescan software.
  • Vials 0.2 ml vials from any manufacturer, suitable for PCR machines 32
  • the PSA- and cytokeratin-positive tumor cells and tumor cell clusters are microdissected with a sterile fine needle on an inverted light microscope (Leitz Diavert) and transferred to a 1.5 ml sterile reaction vessel (Eppendorf Biopure).
  • the RNA isolation is carried out strictly according to the protocols of the RNeasy purification kit for total RNA minipreparation (from Qiagen, Hilden), consisting of: RNeasy Mini Spin Colums, Collection tubes 1.5 and 2 ml, buffer RTL, buffer RW1, buffer RPE and RNase-free water).
  • the RNA is transcribed into cDNA in a two-tube reaction.
  • the reaction volume is 20 ⁇ l.
  • the reaction mixture consists of RT 1 x buffer, dNTPs (0.5 mM each) 1 ⁇ M oligo-dT primer, 10 units RNase inhibitor, 4 units Omniscript Reverse Transcriptase and RNase-free water.
  • dNTPs 0.5 mM each
  • RNase inhibitor 10 units
  • Omniscript Reverse Transcriptase 4 units
  • RNase-free water for the RT-PCR, the RNA samples are first denatured at 65 ° C for 5 min and then placed on ice.
  • RT-PCR can be performed on an Eppendorf Mastercycler, Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg), a Gene Amp R PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) or a commercially available, comparable thermal cycler from other manufacturers.
  • the PCR consists of a 37 ° C incubation step for 60 min followed by a 93 ° C denaturation step.
  • the RNA isolations and the RT-PCR can furthermore be carried out using all commercially available methods which are suitable for small amounts of tissue, e.g. the ExpressDirect TM Kit For mRNA Capture And RT System For RT-PCR (Pierce Rockford).
  • Real-time PCR can be performed on an ABI Prism 9700 HT Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Rothstadt) in 96 or 384 well plates, sealed with an optically transparent film (ABI PRISM TM optical adhesive 36
  • the reactions are usually carried out in double or triple determinations according to the regulations for TaqMan PCR according to PE Applied Biosystems (Weiterstadt).
  • the reaction mixture consists of a TaqMan R Universal PCR Master Mix, plus each
  • the temperature gradient consists of an initial 50 ° C incubation step for 2 min followed by a 95 ° C denaturation step for 10 min; 40-60 cycles are then run, which consist of a 95 ° C denaturation step for 15 seconds and a 60 ° C amplification step for 1 minute.
  • the run and the evaluation took place with the SDS software (PE Applied Biosystems, Rothstadt). Primer and TaqMan probe as well as the TaqMan mastermix can be used by different providers.
  • RNA was isolated from cells of an LNCaP cell culture that is known to express PSA. Lymphocytes from women serve as a negative control.
  • the microscopic marker in the DNA of PSA-positive epithelial cells isolated from peripheral blood and from individual foci of the primary tumor was determined using the described method.
  • the microsatellite markers were determined according to the protocol as described under 4. from DNA, which was obtained according to protocols 1 and 2.
  • the prostate preparations were isolated before DNA isolation according to the Schmid et al. (Schmid HP et 37
  • the method described in large area sections at a distance of 3 to 4 mm was systematically processed and a detailed cartographic recording of the carcinoma extension was created.
  • the tumor size, the position of the tumor in relation to the pseudocapsule of the prostate (infiltration or penetration of the capsule) and the reaching or exceeding of the surgical margins in the carcinoma were documented. Histologically confirmed tumor tissue was then obtained from the paraffin-embedded material of the primary tumor. 7 shows a so-called tumor map in which the removal sites are marked.
  • Table 5 Comparison of the genetic alterations between different foci of a primary tumor and the circulating tumor cell clusters isolated from blood
  • FIG. 5 The cluster with the marker D10S541, which is associated with early metastasis, is also preferably found in the cell clusters of the blood. In contrast, changes in the marker D8S258 prevent the cells from being sown into the peripheral blood (FIG. 6). The evaluation of the disease-free interval shows that a change in this polymorphic DNA marker is associated with a good prognosis (FIG. 6).
  • PCa prostate cancer
  • BPH benign prostate tissue

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung von Primärtumoren bzw. einzelner Bereiche von Primärtumoren, bei dem aus Probenmaterial darin befindliche Zellhaufen von Tumorzellen isoliert bzw. angereichert und anschliessend genetische Veränderungen der isolierten Zellhaufen analysiert werden.

Description

Verfahren zur Charakterisierung von Primärtumoren
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Primärtumoren bzw. einzelnen Bereichen hiervon aus dem peripheren Blut. Derartige Verfahren werden benötigt, um eine Einschätzung des Maligni- tätsgrades, der Invasivität bzw. des Metastasierungspo- tentials von Primärtumoren zu erstellen.
Derartige Verfahren werden für alle Arten von Tumoren, insbesondere für Mammakarzinome, Ovarialkarzinome, Kolonkarzinome, Magenkarzinome, Prostatakarzinome und Blasenkarzinome benötigt .
Das Prostatakarzinom (PCa) ist eines der häufigsten ma- lignombedingten Todesursachen in der westlichen Welt. Nach prognostischen Kriterien lassen sich drei Typen des Prostatakarzinoms ableiten: (1) das kleine schmerzlose Karzinom, das während der Lebensspanne des Patienten nicht zu einem klinisch auffälligen oder metastasierenden Karzinom heranwächst; (2) das langsam wachsende Karzinom, das zu Beginn regionallymphatisch und erst spät in das Skelett metastasiert ; (3) das früh metastasierende Karzinom, das die ganze Prostata diffus befällt und unmittelbar in das Skelett metastasiert. Derzeit besteht nur für frühe, d.h. noch organbegrenzte Tumorstadien, die Möglichkeit einer kurativen Therapie. Hierfür stehen die radikale Prostatektomie oder Strahlenbehandlung zur Verfügung. Die optimale Behandlungsart ist jedoch noch Gegenstand der Diskussion. Etwa 15% der durch radikale Prostatektomie entfernten Prostatakarzinome zeigen Charake- ristika wie bei asymptomatischen Autopsiebefunden und erscheinen relativ gutartig zu sein, d.h. organbegrenzt und gut differenziert bei kleinem Tumorvolumen. Obwohl der natürliche Verlauf dieser Karzinome noch nicht ausreichend bekannt ist, wird vermutet, daß diese Karzinome möglicherweise keiner Behandlung bedürfen. Etwa die Hälfte aller Prostatapräparate nach radikaler Prostatektomie zeigen jedoch einen höheren Anteil schlecht differenzierter lebensbedrohlicher Karzinome als dies an Hand der präoperativen Biopsien vorhersagbar wäre. Dies verdeutlicht damit die schlechte Vorhersagbarkeit des Maligni- tätsgrades, so daß die aktive Behandlung von klinisch als unbedeutend eingestuften Karzinomen möglicherweise doch die richtige Entscheidung sein könnte. Es fehlen Parameter, um vor einer Behandlung zwischen potentiell lebensgefährdenden Prostatakarzinomen und solchen mit relativ gutartigem oder sogar asymptomatischem Verlauf unterscheiden zu können.
Auch der klinisch etablierte Tumormarker PSA hat sich nicht als Metastasierungsmarker erwiesen. (Jhaveri et al . Urology 1999 Nov. ; 54 (5) : 884-90 ; Pound et al . JAMA 1999 May 5;281(17) .1591-7; Wolff et al . Eur Urol 1998;33(4) :376-81) . Inzwischen ist mit dem freien PSA ein weiterer Serumparameter verfügbar. Eine Verbesserung des Stagings der Patienten konnte damit jedoch nicht erzielt werden (Lin et al . Urology 1998 Sep; 52 (3) : 366-71) . Die RT-PCR zur Bestimmung der PSA mRNA ist inzwischen die am meisten verbreitete Methode zum Nachweis zirkulierender Prostatakarzinomzellen. Erste klinische Studien ergaben eine höhere diagnostische Sensitivität und Spezifität für das präoperative Staging mit Hilfe der PSA-RT-PCR im Vergleich zu bildgebenden Verfahren, PSA im Serum und hi- stologischer Klassifikation (Katz et al . , Cancer 75, 1642-1648, 1995) . Die weiteren Studien zeigten, daß der PSA-mRNA-Nachweis bei ca. einem Sechstel der Patienten mit organbegrenztem Tumor (pT2) und etwa einem Viertel der Patienten mit extrakapsulärer Ausbreitung (pT3- Tumoren) positiv ist (Melchior et al . Clin Cancer Res 1997 Feb;3 (2) :249-56) . Allerdings entwickelte nicht jeder Patient mit positivem PSA-mRNA-Nachweis eine progrediente Erkrankung .
Einen weiteren möglichen Parameter für das molekulare Staging stellt die mRNA des prostata-spezifische Membranantigen (PSMA oder PSM) dar (Israeli et al . , J Urol . 153, 573-577, 1995 ) . Bei PSA-negativen, anaplastischen Tumoren und Knochenmetastasen konnte eine hohe PSM-Expression nachgewiesen werden. Da die cDNA-Sequenz des PSM bekannt ist, konnten Studien mit der, RT-PCR zum Nachweis zirkulierender PSM positiver Zellen im peripheren Blut durchgeführt werden (Israeli et al . , Cancer Res. 53, 227-230, 1993; Israeli et al . Cancer Res. 54, 1807-1811, 1994b; Israeli et al . , J Urol. 153, 573-577, 1995; Loric et al . bestätigten mittels RT-PCR des PSM, daß eine hämatogene Aussaat von Prostatakarzinomzellen bereits bei lokal begrenzten Tumoren (pT2a und pT2b) stattfindet (Loric et al., Clin. Chem. 41, 1698-1704, 1995). In einigen Studien wurde eine höhere Sensitivität der PSM-RT-PCR gegenüber der PSA-RT-PCR bei prostatektomierten Patienten gefunden (Isreali et al . , Cancer Res. 54, 1807-1811, 1994b. Andere Autoren berichten, daß der Marker bei metastasierenden Prostatakarzinomen weniger sensitiv war (Cama et al . , J Urol. 153, 1373, 1995) und von falsch-positiven Ergebni- sen der PSM-RT-PCR bei gesunden Kontrollpersonen (Lintula et al . , J Urol. 2, 155, 693A, 1996). Die klinische Relevanz auch der PSM-RT-PCR muß deshalb in weiteren Studien geklärt werden.
Ein komplementärer Parameter zum Nachweis der PSA-mRNA könnte die Bestimmung der mRNA des humanen glandulären Kallikrein (hK2) sein. Das Protein wird prostataspezifisch exprimiert und weist zum PSA eine Strukturhomologie von 80% auf. In der Studie von Corey et al . wurde nur bei einem Drittel der PSA-positiven Patienten auch ein positiver Nachweis für hK2 geführt, während bei 50% der für das hK2 positiven Proben die PSA-RT-PCR negativ waren (Corey et al . , Urology 50, 184-188, 1997).
Neben den Problemen, die durch eine illegitime und eine physiologische, aber nicht tumorspezifische, Expression von Genen, entstehen, kann von der biologische Rationale her festgestellt werden, daß der Nachweis zirkulierender Tumorzellen mittels RT-PCR der mRNA von organspezifischen Markern der Prostata keine Aussagen über die Anzahl der Zellen und ihre Fähigkeit zu metastasieren erlaubt. Deshalb ergibt sich die Notwendigkeit, nach weiteren molekularen Markern zu suchen.
Insgesamt fehlen also prognoserelevante Parameter, die präoperativ den Typ des Karzinoms erkennen lassen. Deshalb bleibt die Kontroverse über den Sinn der Frühdiagnostik und den Stellenwert der operativen Therapie des Prostatakarzinoms bestehen. Damit bleibt auch die Frage nach der Fähigkeit der Prostatakarzinomzellen zu metastasieren, denn 20% der Patienten mit organbegrenztem Karzinome und negativem Knochenszintigramm bekommen Metastasen trotz der völligen operativen Entfernung des Primärtumors. Andererseits werden 50% der Patienten mit einem o- perablen Prostatakarzinom voraussichtlich nicht an ihrem Karzinom sterben. Ausgehend von diesem Stand der Technik stellt sich die vorliegende Erfindung die Aufgabe, ein Verfahren zur Charakterisierung von Primärtumoren bzw. einzelner Bereiche von Primartumoren zur Verfügung zu stellen, mit dem ein zuverlässiges Staging und eine zuverlässige Prognose der Tumoren bestimmt werden kann.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 und die Verwendungen nach Anspruch 15 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den abhängigen Ansprüchen sowie den auf Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens gerichteten Ansprüchen gegeben.
Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren beruht vorteilhafterweise auf der Analyse kurzer einfacher repete- tiver Sequenzen, der DNS, insbesondere aber nicht ausschließlich so genannter Microsatelliten-DNS.
Es gilt als wissenschaftlich anerkannt, dass die Bildung und Ausbreitung von malignen Tumoren mit einer Akkumulation von multiplen genetischen Veränderungen, die z.B. Gene der Zellzykluskontrolle oder der Zelldifferenzierung betreffen, verbunden ist. Kurze polymorphe DNS-Sequenzen, angefangen bei einer Base Länge, können als empfindliche Marker dieser Veränderungen dienen. Eine sehr gut untersuchte Gruppe dieser polymorphen Sequenzen sind die sogenannten Mikrosatelliten, die aus 10 bis 60 repetetiven Sequenzen von 2 bis 5 Basenpaaren bestehen und eine Länge von < 1 kb haben. Hierzu gibt es eine vielfältige Literatur. Loeb L.A., Cancer Res. 51:3075-3079, 1991; Fearon E.R., Vogelstein B. Cell 61:759-767, 1990; Peltomaki P. et al., Science 260:810-812, 1993; Isaacs, W. B. Carter, B. S. Cancer Survival 11: 15-24, 1991; Kunimi, K. et al . , Genomics, 11: 530-536, 1991; Suzuki, H. ; Komiya, A. ; Aida, S.; Akimoto, S . ; Shiraishi, T.; Yatani, R. ; Igara- shi, T. ; Shimazaki, J. , Cancer Res., 6: 956-61, 1995,; Uchida, T. et al . , Oncogene 10: 1019-1022, 1995; Berthon, P. et al., Br. J. Cancer 72: 946-51, 1995; Carter, B. S. et al., PNAS 87: 8751-5, 1990; Egawa, S. et al . , Cancer Research 55: 2418 - 2421, 1995; MacGrogan, D. et al . , Genes, Chromosomes and Cancer 10: 151-9, 1994; Macoska, J. A. et al . , Cancer Research 54: 3824 - 3830, 1994; Bova, G. S. et al . , Cancer Research 53: 3869 - 3873, 1993; Gao, X. et al . , Cancer Research, 55: 1002 1005, 1995; Macoska J A et al . , Cancer Research 55: 5390 - 5395, 1995; Suzuki H et al . Genes, Chromosomes and Cancer, 13: 168-74, 1995; Trapman J et al . , Cancer Research, 54: 6061 - 6064, 1994; Vocke C D et al,, Cancer Research, 56: 2411 - 2416, 1996; Cheng L et al . , J Nad Cancer Inst 1998 Feb 4 ; 90 (3) : 233-7; Takimoto Y et al . , Cancer 2001 Jan 15;91 (2) :362-70.
Erfindungsgemäß werden nun Alterationen derartiger Mikro- satelliten-DNS untersucht und so unter Zuhilfenahme der Darstellung genetischer Veränderungen ein Nachweis, eine Charakterisierung, Quantifizierung und eine Prognoseabschätzung für Tumoren durchgeführt. Dabei können Tumoren dahingehend charakterisiert werden, ob sie proliferativ, nicht-proliferativ oder apoptotisch sind. Der Maligni- tätsgrad, die Invasivität, beispielsweise bezüglich Organüberschreitung, und Metastasierung können aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens durch die Genotypisierung von Zellen aus Zellhaufen bestimmt werden. Insbesondere können beispielsweise aus Blutproben isolierte Tumorzellen einzelnen Bereichen eines multifokalen Tumors zugeordnet werden, d.h. ihre Klonalität bestimmt werden. Über ein derartiges Grading ist eine Prognoseeinschätzung und eine Feinklassifizierung der Primärtumoren möglich.
Dies ist insbesondere möglich, wenn Zellhaufen von Tumorzellen aus Blutproben, Nippleaspiratflüssigkeit der weiblichen Brust, Urin- oder Gewebeproben isoliert werden.
Als besonders vorteilhaft hat sich die Analyse der Mikro- satelliten herausgestellt, die im Anspruch 4 angegeben sind. Für einige dieser Mikrosatelliten wurden wie in Anspruch 6 angegeben, eine Multiplex-PCR zur Amplifikation der DNS entwickelt, wobei insbesondere durch die Auswahl der Mikrosatelliten und der wie in Anspruch 8 angegebenen Primer für die Multiplex-PCR bewirkt wird, daß die Mikrosatelliten jedes Multiplex-PCR-Ausatzes über möglichst viele Chromosomen verteilt sind und die Menge der ampli- fizierten Fragmente sich zwischen den einzelnen Mikrosatelliten derart unterscheiden, daß eine Auftrennung, beispielsweise mittels anschließender Kapillarelektrophorese, problemlos möglich ist.
Die Trennung und Auswertung der PCR kann beispielsweise auf einem automatisierten System, wie beispielsweise dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer™ erfolgen. Reproduzierbare Amplifikationsmuster sind dabei in einem Konzentrati- onsbereich von 100 ng bis herab zu 1 ng eingesetzter DNS möglich. Die untersuchten genomischen Alterationen der Mikrosatelliten-DNS betreffen zum einen den sogenannten LOH-Wert (Loss Of Heterozygosity) und zum anderen den RER-Wert (Replikationsfehler) .
Für die Berechnung des Loss of Heterozygosity (LOH) wird die publizierte Formel Canzian et al . Cancer Res 1996 Jul 15;56(14) :3331-7
LOH Score = Peakfläche Allel 2 Tumor x Peakfläche Allel 1 Normalgewebe / Peakfläche Allel 1 tumor x Peakfläche Allel 2 Normalgewebe verwendet. Die Formel basiert auf Untersuchungsergebnissen, die mit einem analogen genetischen Analysesystem ermittelt wurden. In die Berechnung geht das Verhältnis der Peakflachen der Allele in einem Lauf ein. In Tabelle 1 ist am Beispiele des Markers D13S153 gezeigt, daß die Quotienten der Peakflächen mit niedrigem Variationskoeff- zienten bestimmbar sind. Damit erlauben die erfindungsgemäßen Multiplex-PCR-Protokolle eine reproduzierbare und sensitve Bestimmung eines LOHs . sind. Für einige dieser Mikrosatelliten wurden wie in Anspruch 6 angegeben, eine Multiplex-PCR zur Amplifikation der DNS entwickelt, wobei insbesondere durch die Auswahl der Mikrosatelliten und der wie in Anspruch 8 angegebenen Primer für die Multiplex-PCR bewirkt wird, daß die Mikrosatelliten jedes Multiplex-PCR-Ausatzes über möglichst viele Chromosomen verteilt sind und die Menge der ampli- fizierten Fragmente sich zwischen den einzelnen Mikrosatelliten derart unterscheiden, daß eine Auftrennung, beispielsweise mittels anschließender Kapillarelektrophorese, problemlos möglich ist.
Die Trennung und Auswertung der PCR kann beispielsweise auf einem automatisierten System, wie beispielsweise dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer™ erfolgen. Reproduzierbare Amplifikationsmuster sind dabei in einem Konzentrationsbereich von 100 ng bis herab zu 1 ng eingesetzter DNS möglich. Die untersuchten genomischen Alterationen der Mikrosatelliten-DNS betreffen zum einen den sogenannten LOH-Wert (Loss Of Heterozygosity) und zum anderen den RER-Wert (Replikationsfehler) .
Für die Berechnung des Loss of Heterozygosity (LOH) wird die publizierte Formel Canzian et al . Cancer Res 1996 Jul 15;56(14) :3331-7
LOH Score = Peakfläche Allel 2 Tumor x Peakfläche Allel 1 Normalgewebe / Peakfläche Allel 1 tumor x Peakfläche Allel 2 Normalgewebe verwendet. Die Formel basiert auf Untersuchungsergebnissen, die mit einem analogen genetischen Analysesystem ermittelt wurden. In die Berechnung geht das Verhältnis der Peakflachen der Allele in einem Lauf ein. In Tabelle 1 ist am Beispiele des Markers D13S153 gezeigt, daß die Quotienten der Peakflachen mit niedrigem Variationskoeff- zienten bestimmbar sind. Damit erlauben die erfindungsgemäßen Multiplex-PCR-Protokolle eine reproduzierbare und sensitve Bestimmung eines LOHs . Tabelle 1: Vergleich der Quotienten für die Allele 1 und 2 bei MCF-7-Zellen
Mittelwert 0,991 Standardabw. 0,10082438
In die Berechnung eines "replication errors" (RER) geht auch die Länge der Fragmente über einen Faktor ein, der den Schwerpunkt der Peakverteilung repräsentiert.
Die untere Nachweisgrenze bei der Multiplex-PCR mit drei Primerpaaren wurde sowohl an DNA aus den Zellinien SK-BR- 3 und LNCaP als auch an Patienten-DNA (Vergleich Tumor- DNA Leukozyten-DNA) bestimmt. Ein reproduzierbares Bandenmuster wurde für alle polymorphen Marker bis zu einer Konzentration von > 1 ng DNA erzielt. Das entspricht einer Zahl von ca. 50 Zellen.
Vorteilhafterweise werden die zu untersuchenden Tumorzellen aus einer Probe, beispielsweise einer Blutprobe, isoliert bzw. angereichert, in dem zuerst mittels Dichtegra- dienten-Zentrifugation epitheliale Zellen angereichert werden und anschließend eine immunomagnetische Isolierung bzw. Anreicherung Zytokeratin-positiver und/oder PSA- positiver Zellhaufen durchgeführt wird. Hierzu werden magnetische Beads verwendet, an die entsprechende Antikörper gebunden sind. Die Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgt dabei vorteilhafterweise wie in Brandt und Gri- watz, Clin. Chem. 42, Nr. 11 1996, S. 1881-1882 beschrieben. Diese Druckschrift wird hiermit bezüglich ihres gesamten Offenbarungsgehaltes in die vorliegende Anmeldung aufgenommen. Die immunomagnetische Zellisolierung erfolgt vorteilhafterweise wie in Griwatz et al . , J. Immunol . Meth. 183, 1995, S. 251-265 beschrieben. Auch als Primärantikörper wurden die folgenden Antikörper verwendet : rabbit-mouse anti-PSA, mouse anti-Zytokeratin- biotinyliert , mouse anti-cFas, mouse anti-M30, mouse an- ti-Mibl und mouse anti-Hl/H3-Histonproteine und als Sekundärantikörper die folgenden Antikörper: anti-rabbit und anti-mouse mit Alexa-488 und -594 oder FITC, Cy5 , Cy3, RPE, markiert.
Entscheidend bei der vorliegenden Isolierungsmethode ist dabei, daß für das molekulare Staging letztlich nur Zellhaufen ausgewertet werden, die durch das genannte Verfahren isoliert werden. Als besonders vorteilhaft hat sich dabei herausgestellt, wenn während der Dichtegradienten- Zentrifugation mit hyperosmolaren Medien gearbeitet wird. Dadurch schrumpfen die Zellen der Zellenhaufen, so daß bei der anschließenden immunomagnetischen Zellisolierung die verwendete Säule nicht durch die Zellhaufen verstopft wird. Dies führt zu einer erheblich erhöhten Ausbeute an Tumorzellen aus der Blutprobe, so daß fast ausschließlich Tumorzellen auf dem Objektträger zu finden sind.
Es stellte sich heraus, daß nach diesem Verfahren isolierte Zellen überwiegend als Zellhaufen vorliegen, die positiv auf den Nachweis von PSA und Zytokeratin sind. Alle Patienten mit einem Prostatakarzinom wiesen derartige Zellhaufen auf, während die Kontrollproben für den Nachweis derartiger Zellen negativ waren. Die Größe der Haufen reicht dabei von 2 bis 70 Zellen, wobei die Anzahl 10
der Haufen in 20 ml peripherem Blut zwischen 1 und 5400 betrug. Allerdings weisen etwa 90 % der Patienten mehr als 100 Zellen auf (und damit wird die Nachweisgrenze ü- berschritten) .
Es konnten aufgrund der Zellmorphologie und der Kernfärbung prinzipiell zwei Klassen von Zellhaufen unterschieden werden. In großer Zahl wurden Haufen bestehend aus dysmorphen Zellen gefunden. In einzelnen Fällen waren in diese kleine runde kernhaltige Zellen eingeschlossen. Daneben wiesen 25 der untersuchten 74 Patienten mit Prostatakarzinom Haufen auf, die nur aus kleinen, ca. 5 bis 7 μm Durchmesser aufweisenden, runden und kernhaltigen Zellen bestanden. Die meisten der Patienten (ca. 60 %) hatten weniger als 10 derartige Zellhaufen in 20 ml Blut nachweisbar. In drei Fällen waren jedoch bis zu 200 derartige Zellhaufen nachweisbar.
Beide Gruppen von Zellhaufen unterscheiden sich bezüglich ihres Nachweises auf die Apoptosemarker c-Fas und M30, sowie die Proliferationsmarker Mib-1 und H1/H3. Die dysmorphen Zellhaufen waren für die Marker cFas und M30 positiv, während die Gruppe der kleinen, runden, kernhaltigen Zellhaufen negativ war.
Fig. 1 zeigt in Teilbild A den Zelldurchmesser, bevor die Zellen durch Suspension in einen hyperosmolaren Puffer für die Dichtegradienten-Zentrifugation suspendiert wurden. Der Zelldurchmesser beträgt dabei im Durchschnitt 8,02 μm. Fig. 2B zeigt demgegenüber den Zelldurchmesser nach Aufnahme in einen hyperosmolaren Puffer wie Nycoprep bzw. Polymorphprep . Der Durchschnittsdurchmesser verringerte sich hierbei auf 4,97 μm.
Im Folgenden wird die Zellisolierung beispielhaft für verschiedene Zeil- und Tumortypen angegeben.
I. Isolierung von Zellen aus einem Mamma- bzw. Ovarial- 11
karzinom
A: Proben-Vorbereitung
1. Es werden Zellsuspension des Tumors, wie nach dem Verfahren in V. beschrieben, präpariert. Eine wie unter V. beschrieben aus einem Mamma- bzw. Ovarial- karzinom isolierte Zellsuspension wird 10 min bei Raumtemperatur (RT) in PABB-Puffer inkubiert (sättigt Bindungsstellen ab) ,
2. zentrifugieren (10 min, 1500 rpm)
3. in lOOOμl PABB-Puffer resuspendieren, mindestens 30 min bei RT auf Schüttler inkubieren,
4. 20 μl ErbB-2-Antikörper (Ab-2, anti-mouse gegen menschliches ErbB-2) hinzufügen, mindestens 30 min bei RT inkubieren,
5. 2 ml 1 % PBS/BSA hinzufügen, mischen und zentrifugieren. In 70 μl PABB-Puffer resuspendieren und ca. 15 min bei RT inkubieren,
6. 10 μl an Magnetkügelchen gekoppelte Antikörper (IgGl Kaninchen gegen Maus-Antikörper, 1 : 10-Verdünnung) dazugeben, mindestens 30 min bei RT inkubieren (20 μl für 107 Zellen, Inkubationsvolumen 80 μl)
7. mit 1 ml PABB-Puffer waschen, abzentrifugieren (10 min, 1500 rpm)
8. in 500 μl 1 % PBS/BSA resuspendieren 12
B : Säule
MS-Säulen (Miltenyi Biotec GmbH) , Kapazität 107 Zellen verwenden
1. Säule mit 500 μl 1 % PBS/BSA waschen
2. Die mit 1 % PBS/BSA verdünnte Zellsuspension (s. Punkt I A) auf die Säule geben und die Negativfraktion auffangen, anschließend die Säule mit 1,5 ml 1% PBS/BSA spülen und ebenfalls auffangen.
3. mit Hilfe einer 10 ml Einwegspritze und eines darauf installierten Dreiwegehahns blasenfrei ca. 3 ml PBS/BSA von unten durch die Säule spülen, so daß Zellen erneut die Säule passieren können. Wiederum als Negativkontrolle auffangen. Falls die 1 Säule verstopft, d.h. die Fließgeschwindigkeit geringer wird, sofort die Säule mit PBS/BSA von unten durchspülen und das übrige Probenmaterial auf eine neue Säule geben.
4. Um die Positivfraktion aufzufangen, die Säule vom Magneten entfernen und auf ein weiteres 10 ml- Röhrchen setzen.
5. Die Säule mit 1 ml 1 % PBS/BSA ausspülen und die Fraktion auffangen, anschließend erneut die Säule mit 1 ml 1 % PBS/BSA füllen und mit dem Stempel die Positivfraktion durch die Säule drücken
C: Zytospins
1. Die Fraktionen werden abzentrifugiert und in 1 % PBS/BSA resuspendiert
2. Zytospins (8 min, 400 rpm) von positiven und negativen Fraktionen anfertigen 13
3. Zellpunkt auf Zytospin mit Fett-Stift markieren, 20 min mit 4% PFA fixieren, anschließend 2 x 5 min mit 1 % PBS/BSA waschen, bei 4 °C in feuchter Kammer aufbewahren
II. Isolierung von Tumorzellen aus Blutproben zur Zellcharakterisierung von Mamma- und Ovarialkarzinomen
1. Gradiententrennung wie unter III.1 beschrieben
2. Probenvorbereitung der angereicherten Tumorzellen wie unter I.A beschrieben, wobei von dem unter II.1. hergestellten Zellpellet ausgegangen wird.
III. Isolierung von Tumorzellen aus Blutproben zum Nachweis und zur Zellcharakterisierung von Prostata, Blasen-, Kolon- oder Magenkarzinomen
Hierzu werden die nachfolgend genauer erläuterten Schritte durchgeführt :
1. Gradiententrennung mit Polymorphprep und Nycoprep
2. Magnetische Zellseparation
a) Vorbereitung b) Säulen
3. Cytospins für die Färbung
4. Färbung
1: Gradiententrennung (hier beispielhaft Zentrifugation mit Prostata-Ca-Patientenblut)
a) 3ml Polymorphprep (Gradient) vorlegen (Dichte 1.113, Fa . Nycomed) 14
b) mit 3ml Nycoprep (Gradient ) vorsichtig überschichten
(Dichte 1 . 068)
c) ohne Durchmischung mit 4 ml EDTA-Patientenblut überschichten
d) zentrifugieren (30 min, 1500 rpm)
e) Serum abpipettieren (gleichmäßig verteilen)
f) Monozytenfraktion incl . Tumorzellen (M) sowie die Leucozytenfraktion (L) in PP-Röhrchen bringen, auf insges. ca. 4 PP-Röhrchen verteilen, anschließend mit der doppelten Menge PBS pH 7,4 mischen (waschen) , abzentrifugieren (20 min, 1500 rpm) , Überstand verwerfen
g) Erythrozytenfraktion verwerfen
h) Monozytenpellet mit insgesamt 2-5 ml PFA (Parafor- maldehyd in PBS) 4% fixieren
i) Leukozytenpellet in insgesamt 1 ml PBS aufnehmen und in 2 Eppendorfcups überführen (sammeln)
j) abzentrifugieren (Epifuge, 10 min, 1500 rpm, Überstand verwerfen, Eisfach (- 20 °C)
2. Magnetische Zellseparation mit Mikrobeads zur Anreicherung von Tumorzellen
Im folgenden wird immer nur mit dem Pellet weitergearbeitet, der Überstand wird nach jedem Waschvorgang verworfen. 15
Vorbereitung :
a) das mit PFA (Paraformaldehyd) verdünnte Pellet abzentrifugieren, Überstand verwerfen
b) Dilutionspuffer lx (Waschpuffer PBS/BSA) vorbereiten
(36 ml H2Odest + 4 ml Dilutions Buffer 10 x = Diluti- onspuffer 1 x)
c) Pellet in 5 ml PBS/BSA aufnehmen, dann in 35 ml Dilutionspuffer aufnehmen/Konzentration: 1 g/100 ml, anschließend 5 ml Permeabilisierungslδsung für Zellen (P-Lsg) dazu geben (Permeabilisierung) ,
5 min stehen lassen, vorher 1-2 x schwenken (sonst evtl. Zellen kaputt), auf drei 15 ml-PP-Röhrchen (Greiner Cell Star) verteilen, zentrifugieren (10 min, 1200 rpm) ohne Bremse, Überstand verwerfen.
d) 5 ml Fixierungslδsung für Zellen (F-Lsg) + 45 ml PBS (= Markierungslösung) , 30 ml abnehmen, davon 1-5 ml zum resuspendieren des Pellets verwenden, mit den restlichen 25 ml resuspendieren, umfüllen in zwei 15 ml-PP-Röhrchen, zentrifugieren (10 min, 1200 rpm) , Überstand verwerfen
e) Pellet in 10 ml Fixierungs-Lösung resuspendieren, erneut zentrifugieren (10 min, 1200 rpm) , Überstand verwerfen
f) Pellet in 600 μl Fixierungs-Lösung resuspendieren
g) 200 μl Blockierungsreagenz für (PABB) dazugeben und mischen
h) 200 μl Immunomagnetische Kügelchen (z.B. MACS Bead ® anti-mouse-AK oder beispielsweise auch anti-rabbit, 16
-goat, -sheep, -pig (Kaninchen, Ziege, Schaf, Schwein) dazugeben und mischen (Cytokeratin- Markierung für die Färbung
i) 45 min inkubieren bei RT
j) 4 ml Fixierungs-Lösung dazu geben, mischen, zentrifugieren (10 min, 1200 rpm') , Überstand verwerfen
k) Pellet in ca. 1 ml PBS/BSA aufnehmen, zum Aufheben fixieren in ca. 1 ml PFA 4%
MagnetSeparation
1) die in 4% PFA-fixierte Monozytenfraktion (incl. Tumorzellen) zentrifugieren, 10 min 1200 rpm Überstand verwerfen
m) die Säule mit 3 ml PABB absättigen (spülen von oben mit Pipette)
n) das Pellet zunächst in mindestens 12 ml PBS/BSA (je nach Pelletgrδße individuell anpassen) aufnehmen (waschen) , dabei schrittweise verdünnen, anfangen mit 3 ml im PP-Röhrchen, dann durchmischen, anschließend nach und nach auf die Säule geben (weitere Verdünnung also direkt auf die Säule) , dabei die Negativfraktion als Negativkontrolle auffangen. Die Fließgeschwindigkeit muß konstant bleiben!
o) mit Hilfe einer 10 ml Einwegspritze und eines darauf installierten Dreiwegehahns blasenfrei ca. 3 ml PBS/BSA von unten durch die Säule spülen, so daß Zellen erneut die Säule passieren können. Wiederum als Negativkontrolle auffangen. Falls die 1 Säule verstopft, d.h. die Fließgeschwindigkeit geringer wird, sofort die Säule mit PBS/BSA von unten durchspülen und das übrige Probenmaterial auf eine neue 17
Säule geben.
p) die Säule mit weiteren 5-10 ml PBS/BSA nach und nach spülen und in der Negativkontrolle auffangen (alle Negativzellen sollten jetzt runtergespült worden sein. Die Positivzellen sollten dagegen in der Säule hängengeblieben sein. Sie sind durch die Bindung eines anti-Zytokeratin-Antikörpers und eines mageti- sierbaren Kügelchens magnetisierbar geworden.
q) bei langsamer Durchlaufgeschwindigkeit die Säule erneut von unten mit PBS/BSA durchspülen
r) die Säule vorsichtig aus dem Magneten nehmen und zunächst ohne Stempel die Positivfraktion (+) mit 5-6 ml PBS/BSA ausspülen
s) erneut die Säule mit 3-4 ml PBS/BSA füllen und mit dem Stempel die Positivfraktion (++) durch die Säule drücken
PABB: 5 ml AB-Serum 10% (v/v) + 50μl BSA-C 0,1% (v/v) + 45 ml PBS
PBS/BSA: 1 g BSA auf 100 ml PBS, pH 7 , 4 = -> 1% (v/v) 0,1 % Triton: Triton X100 mit PBS pH 7,4 1:1000 verdünnen,
In der Regel ist im Vergleich in der ersten Positivfraktion (+) das Verhältnis Tumorzellen/Monozyten deutlich verschoben, häufig finden sich nur noch einzelne Monozy- ten und damit ein hoher Reinheitsgrad der Tumorzellen.
t) Abzentrifugieren und Zellpellet in 1-2 ml PBS aufnehmen 18
3. Cytospins für die Färbung
a) 200 μl verdünnte Probe/Spin auf Objektträger aufbringen (Pipette, Filter, Trichter, leere Referenz) : +- und ++-Kontrollen auf einen Objektträger, Negativ (-) -Kontrolle auf einen weiteren Objektträger aufbringen, jeweils zwei von jedem zur Kontrolle, falls die Färbung nicht funktioniert, Objektträger beschriften (+, ++, -, Datum, Name Patient, vor Mgnetseparation)
b) Zentrifugieren 8 min, (400 Umdrehungen )
c) Spot mit Fettstift umzeichnen,
Zellen auf Objektträger werden mit 30 μl PFA/Spot für ca. 20 min fixiert.
d) 10 min mit 30 μl pro Spin mit PBS/BSA waschen, abklopfen, bei 4 °C aufbewahren
e) die restlichen verdünnten Proben abzentrifugieren (10 min, 1000 rpm) , Überstand verwerfen, Pellet zur Fixierung in ca. 2 ml PFA aufnehmen und bei 4 °C aufbewahren
4. Färbung (mit Streptavidin, mit Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert Alexa-488/584 , FITC, RPE etc.)
a) die fixierten Pellets auf dem Objektträger (s. letzter Punkt in 3. Cytospin) mit 0,1% Triton pro Spin für 10 min in Feuchtekammer permeabilisieren
b) 20 min mit PABB absättigen
c) 15 μl sekundärer Antikörper (Alexa 594 Streptavidin) pro Spin für 30 min (verdünnen 1:100 mit PABB in Ep- pendorf, z.B. 396 + 4/99 + 1 etc.), abklopfen 19
d) 2 x je 5 min (oder 1 x 10 min) mit 30 μl PBS/BSA pro Spin waschen, abklopfen
e) 20 min mit 20 μl PABB absättigen, abklopfen
f) 45 min versetzen mit 15 μl PSA (Antikörper DP033, verdünnen 1: 100), abklopfen
g) waschen mit PBS 10 min
h) 30 min mit 15 μl sekundärer Antikörper (Alexa 488 goat anti rabbit 11008, verdünnen 1: 100) inkubieren, abklopfen
i) waschen mit PBS 10 min
j) 30 min waschen mit 30 μl H20bidest abklopfen
IV. Isolierung von Zellen eines Tumors aus Urinproben
Hierzu wurden die nachfolgend genauer erläuterten Schritte durchgeführt :
1. Urinproben nehmen
2. Dichtebestimmung, Mengenbestimmung (ml), zentrifugieren und Pelletgröße bestimmen
3. Cytospins für die PAP-Färbung
4. PAP-Färbung
5. ggf . Magnetseparation a) Vorbereitung b) Säulen
6. Cytospins für die Antikörper-Färbung 2 0
7 . Cytokerat in- Färbungen
1. Probennahme
2. Dichtebestimmung, Mengenbestimmung
a) Urin in PP-Röhrchen umfüllen
b) Urin in Messzylinder umfüllen, Dichte bestimmen, extra protokollieren
c) Zentrifugieren in PP-Röhrchen (10 min bei 1.000 Umdrehungen = rpm) , Überstand verwerfen
d) Pelletgrδße schätzen
e) zum Aufbewahren Pellet in ca. 2 ml PFA aufnehmen (fixieren) je nach Größe des Pellets auch mehr PFA
3. Cytospins für PAP-Färbung
a) Pellet mit PBS/BSA verdünnen (keine Trübung) , mit ca. 3 ml je nach Größe des Pellets, anfangen
b) 200 μl verdünnte Probe/Spin auf Objektträger aufbringen (Pipette, Filter, Trichter)
c) Zentrifugation 8 min, (400 U/min) 2 x g
d) Spin anschauen, ob die Zellen einzeln auf dem Objektträger liegen, sonst Probe weiter verdünnen und c) wiederholen
e) Zellen auf Objektträger fixieren (Fettstift großzügig umkreisen) , 30 μl PFA/Spin (Pipette) für ca, 20 min (Deckel zu) , abklopfen, kühl lagern oder weitergeben (Punkt 4) 21
f) die restlichen verdünnten Proben abzentrifugieren
(10 min, 1000 rpm) , Überstand verwerfen, Pellet zur
Fixierung in ca . 2 ml PFA
(Paraformaldehyd+Formalin) aufnehmen und aufbewahren bei 4 °C
PFA: Paraformaldehyd + 37 % Formalin 1:10 oder mit PBS verdünnen
PBS/BSA: 1 g BSA (Bovine Albumine) /100 ml PBS
4. PAP-Färbung und erste Charakterisierung (Kontrollfärbung)
a) Zellen auf dem Objektträger nach Paparicolaau färben . oder andere Kontrollfärbungen
5. Magnetassoziierte ZeilSortierung mit magentisierba- ren Mikrobeads korrigiert auf Anti-Maus-Antikörper
Immer nur mit dem Pellet arbeiten, Überstand nach jedem Waschvorgang verwerfen!
Vorbereitung
a) das mit PFA verdünnte Pellet abzentrifugieren, Überstand verwerfen, 2 ml/PBS/BSA zum Pellet geben, zentrifugieren (7 x g 10 min, ca. 900 rpm) , Überstand abheben
b) Dilutionspuffer lx (Waschpuffer) vorbereiten
(36 ml H2Odest + 4 ml Dilutions Buffer 10 x = Diluti- onspuffer 1 x)
c) Pellet in 5 mL PBS/BSA aufnehmen, dann 35 mL Diluti- onspuffer dazugeben, anschließend 5 mL P-Lösung dazu, 5 min stehenlassen, vorher 1-2 x schwenken, auf drei 15 ml-PP-Röhrchen (z.B. Greiner Cell Star) verteilen, zentrifugieren 22
(10 min, 900 rpm) , Überstand verwerfen
d) 5 ml F-Lösung (entspricht PABB, + 45 ml PBS (= Markierungslösung) ) , 30 ml abnehmen, davon insgesamt 1- 5 ml zum Auflösen des Pellets verwenden, in ein Röhrchen bringen, dann mit den restlichen 25 ml suspendieren, umfüllen in zwei 15 ml-PP-Röhrchen, zentrifugieren (10 min, 900 rpm) , Überstand verwerfen
e) Pellet in insgesamt 10 ml F-Lösung resuspendieren, erneut zentrifugieren (7 x g 10 min, 900 rpm) , Überstand verwerfen
f) Pellet in 500-1000 μl (Minimum: 200 μl) verdünntem Cytokeratin 7 aufnehmen (1:50 mit PABB verdünnen
(z.B. 490 μl PABB + 10 μl Zytokeratin 7), 30 min inkubieren, zentrifugieren (10 min, 900 rpm 7 x g) , Überstand abheben
g) mit 5-10 ml PABB waschen, zentrifugieren (10 min, 900 rpm) , Überstand verwerfen
h) Pellet in 600 μl F-Lösung resuspendieren
i) 200 μl FCR-Blockierungs-Reagenz unverdünnt dazugeben und mischen
j) 200 μl magnetisierbare Mikro-Beads konjugiert mit Anti-Maus-Antikörper unverdünnt dazugeben und mischen
k) 45 min inkubieren bei Zimmertemperatur
1) 4 ml F-Lösung dazu geben, mischen, zentrifugieren (10 min, g 900 rpm) , Überstand verwerfen
m) Pellet in ca. 1 ml PBS/BSA aufnehmen, Aufbewahrung 23
der Zellen ca. 1 ml PBS 4% bei 4 °C
Modifizierte Zellseparation mit Trennsäulen
a) die in 4% PFA-fixierte oder in PBS/BSA-aufgenommene Monocytenfraktion (incl. Tumorzellen) zentrifugieren
(10 min, 900 rpm) , Überstand verwerfen b) die Säule mit 3ml PABB absättigen (PABB von oben mit Pipette auf die Säule geben)
c) das Pellet in PBS/BSA schrittweise verdünnen, anfangen mit 10 ml im PP-Röhrchen, dann durchmischen, anschließend nach und nach auf die Säule geben, dabei durchlaufende Suspension als Negativkontrolle auffangen.
d) mit Hilfe einer 10 ml Einwegspritze und eines darauf installierten Dreiwegehahns blasenfrei ca. 3 ml PBS/BSA von unten durch die Säule spülen, so daß
'Zellen erneut die Säule passieren können. Wiederum durchlaufende Suspension als Negativkontrolle auffangen.
e) die Säule mit weiteren 5-10 ml PBS/BSA nach und nach spülen und in der Negativontrolle auffangen (alle Negativzellen sollten jetzt abgespült, die Positivzellen dagegen in der Säule hängengeblieben sein. Zellen, die durch Anti-Zytokeratin-Antikörper und magnetisches Mikrobead magnetisierbar sind, bleiben in der Säule hängen)
f) bei langsamer Durchlaufgeschwindigkeit die Säule erneut von unten mit PBS/BSA durchspülen
g) die Säule vorsichtig aus dem Magneten nehmen und die erste Positivfraktion (+) mit 5-6 ml PBS/BSA aus der Säule spülen in ein PP-Röhrchen 24
h) erneut die Säule mit 3-4 ml PBS/BSA füllen und mit einem Stempel durch die Säule drücken. Man erhält die zweite Positivfraktion (++) , die in einem zweiten PP-Röhrchen aufgefangen wird.
In der Regel finden sich im Vergleich zu der ersten Positivfraktion (+) in der (++) Fraktion nur noch Tumorzellen und nur noch einzelne Leukozyten, E- rythrozyten, Urothelzellen.
i) zentrifugieren (10 min, 900 rpm) , Überstand verwerfen,
6. Cytospins für die Antikörper-Färbung
a) Pellets aus 5 PBS/BSA verdünnen. Je nach Umfang des Pellets in 400 μl bis 2000 μl
b) 200 μl verdünnte Positiv-Fraktionen mittels Zytro- zentrifuge ebenfalls auf Objektträger aufbringen. Negativ (-) -Kontrolle ebenfalls auf einen Objektträger zentrifugieren
c) Zentrifugationsbedingungen:
8 min (set time 8/enter) , 400 Umdrehungen = 2 x g (set speed 40/enter, Start) zentrifugieren
d) Zellen auf Objektträger mit 30 μl PFA pro Spot für ca. 20 min in Feuchtekammer fixieren. Anschließend abklopfen, ggf. kühl aufbewahren
7. Färbung der Zytokeratine
Reagenzien:
4 % PFA (Paraformaldehyd: 37 % Formalin + PBS 1:10 verdünnen)
0.1 % Triton X 100 (in PBS) 25
10% AB-Serum (5 ml AB-Serum Biotest AG + 50 μl BSA-c + 45 ml PBS/BSA) 1 % PBS/BSA
1.Antikörper : Maus-Anti-Zytokeratin-Antikδrper Arbeitskonzentration 1:50 (in PABB) (C7, C20 oder PAN) sekundärer Antikörper: Anti-Maus Alexa 594- Antikörper Arbeitskonzentration 1:100 (in PABB) Isotypenkontrolle in 10% AB-Serum
evtl. bei Protatakarzinompatienten:
1. Antikörper: Anti-PSA-Antikörper Arbeitskonzentration 1:50 (in PABB) sekundärer Antikörper: Anti-Rabbit Alexa 488- Antikörper Arbeitskonzentration 1:100 (in PABB)
a) die fixierten Pellets auf dem Objektträger (s. letzter Punkt vom Cytospin) mit 30 μl 0.1 %Triton X 100 pro Spin für 10 min permeabilisieren, anschließend abklopfen
b) mit 30 μl 10% PABB-Serum für 20 min blockieren, abklopfen
c) 15 μl verdünnter 1.Antikörper (Maus Anti-Zytokera- tin-Antikörper : gilt für die Spezifitäten C7, C20, PAN) pro Spin für 30 min, anschließend abklopfen
d) waschen mit 30 μl PBS/BSA pro Spin für
10 min, abklopfen, Vorgang zweimal wiederholen
e) 15 μl verdünnter sekundärer Antikörper (Anti-Maus Alexa 594, Antikörper) pro Spin für 30 min abklopfen
f) waschen mit 30 μl PBS/BSA pro Spin für 10 min, abklopfen, Vorgang zweimal wiederholen 26
V. Herstellung von Zellsuspensionen aus solidem humanem Tumorgewebe (zum Beispiel eines Mamma- oder Prostatakarzinoms)
Reagenzien:
Invasionsmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 1% (v/v) 2 mM L-Glutamin
1% (v/v) Antibiotic/antimycotic Solution 0,1% (w/v) bovines Rinderserumalbumin (BSA) im Invasionsmedium Trypanblau-Lösung (0,4 % (Gew/Vol) Fa. Sigma, Deisenhofen
Durchführung :
Gewebestückchen von frisch operierten Mammakarzinomen, benignen Brusterkrankungen bzw. Prostatakarzinomen werden vom Operateur in sterile Röhrchen mit Standardmedium gegeben und bis zur Disaggregation (spätestens 4 h nach der Entnahme) auf Eis gestellt. Von jedem Gewebestück wird ca. die Hälfte für die spätere Expressionsanalyse) abgetrennt und in flüssigem Stickstoff konserviert. Die andere Hälfte wird mit einer mechanischen Methode disaggre- giert . Dazu wird eine Medimachine (Firma Dako, Hamburg) verwendet. Zur Disaggregation wird das Mammagewebe mit einem Skalpell in 3 bis 10 mm2 große Stücke geschnitten und zusammen mit 1,5 ml Invasionsmedium in ein Medicon gegeben. Das Gewebe wird dann innerhalb der Medimachine in 2 bis 3 min zu einer Zellsuspension dlsaggregiert, die Einzelzellen und Zellaggregate (Zellhaufen) von bis zu ca. 30 Zellen enthält. Die Zellen werden in einer Neubauer-Zählkammer mikroskopisch ausgezählt und die Lebendzellzahl mit Hilfe des Trypanblau-Exklusionstests bestimmt, der darauf beruht, daß bei lebenden Zellen bestimmte Farbstoffe (z.B. Trypanblau) nicht in das Zellinnere gelangen können, während tote Zellen sich mit dem betreffenden Farbstoff anfärben (Kaltenbach et al . , 1958; Lindl und Bauer, 1994) . 27
Nach Durchführung der so dargestellten Zellisolierungen erfolgt nun die Genotypisierung der isolierten Zellhaufen zum Zwecke ihrer Zuordnung zu Bereichen im Primärtumor mittels PCR.
Im folgenden wird beispielhaft die Nukeinsäureisolierung aus verschiedenen verwendeten Zellmaterialien beschrieben.
1. DNA von aus peripherem Blut isolierten Zellhaufen und mikrodisektierten entparafinierten fixierten- gefärbten Tumorgewebeschnitten
Auf einem inversen Lichtmikroskop (Leitz Diavert) werden die PSA und Cytokeratin positiven Tumorzellen und Tumor- zellkluster sowie nicht positive Monozyten als Negativkontrolle (bzw. Referenz für die LOH-Berechnung) mit einer sterilen feinen Nadel mikrodissektiert und in je 1,5 ml sterile Reaktionsgefäße (Eppendorf Biopure) überführt. Bei kleinen multifokalen Tumorarealen können nach der gleichen Vorgehensweise auch verschiedene Foci multifokaler Tumore aus bereits gefärbten und pathologisch untersuchten Schnitten einzelner Areale vom Objektträger mikrodisektiert werden. Je nach Zellzahl (ca. 50-1000 Zellen) werden die Zellen in 10-200 μl LTEPuffer (10 mM Tris/HCI, 1 mM EDTA, pH 7,5) aufgenommen und mit 1-20 μl Proteinase K (>600mAU/ml) im Thermoblock oder Wasserbad bei 50-56 °C für 1-10 h inkubiert und anschließend für 5 min auf Eis gestellt. Anschließend werden die Proben für 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert . Daraufhin werden die Proben mit 99,8% Ethanol p.a. (Roth) auf eine 70%ige Lösung eingestellt. Nach kurzem vortexen werden die Proben bei 15000 rpm für 20 min abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das DNA-Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wird anschließend in 10-200 μl LTE-Puffer oder doppelt destillierten Wasser resuspendiert, bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert (Rehydratisierung) und bis zur Durchführung der PCR bei -20 °C tiefgefroren. 28
2. DNA aus konserviertem Tumorgewebe mit mono- und multifokalen Herden
Die DNA-Isolierung aus frischem sowie formalinfixiertem bzw. in Parafin eingebettetem Gewebe der Primärtumore einer oder mehrerer Foci erfolgt nach den Protokollen des kommerziell erhältlichen QIAmp DNA Mini Kit (Fa. Qiagen, Hilden) oder einem vergleichbaren System anderer Hersteller. Dieser Kit enthält QlAamp DNA Mini Spin Columns (Säulen) , Proteinase K für den proteolytischen Verdau des Gewebes, die Lysispuffer AL und ATL, die Ethanol enthaltenden Waschpuffer AW1 und AW2 und den Elutionspuffer AE . Frisches Gewebe eines Primärtumores wird vor der Gewebe- lysis mechanisch mit einem Skalpell oder dafür vorgesehene Gewebezerkleinerungsmaschienen (z.B. Medimaschine, DA- KO) aufgeschlossen. Für die in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte wird vor der eigentlichen DNA-Isolierung eine Entparaffinierung mit 100% Xylol vorgenommen. Dazu werden die Proben zunächst in 1 ml Xylol in 1,5 ml Eppen- dorf-Reaktionsgefäßen in einem handelsüblichen Thermoblock auf 70 °C für 1 h inkubiert. Anschließend für 3 min zentrifugiert der Überstand verworfen und dieser Prozess zwei Mal wiederholt. Anschließend wird das Gewebe drei Mal mit 99,8 % Ethanol (Roth) gewaschen, anschließend getrocknet und in den Lysispuffer überführt. Danach erfolgt die Isolation nach den Protokollen der Hersteller.
Die DNA-Isolierung aus EDTA-antikoaguliertem Vollblut erfolgt mit dem QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden) nach den bekannten Protokollen oder vergleichbaren Verfahren anderer Hersteller.
Wenn nötiq wird das Vollblut für 10 min mit Puffer AL und Proteinase K zur Lyse der Zellen bei 54 °C im Thermoblock inkubiert, anschließend mit Ethanol versetzt und das Gemisch auf die Säule (QIAmp DNA Mini Spin Columns) gegeben. Die Proben werden mit AW1 und anschließend mit AW2 gewaschen und mit dem Elutionspuffer AE eluiert . Die DNA- 29
Lösungen werden zur Konzentrationsbestimmung photometrisch bei 260, 280 und 320 nm gemessen auf 10 ng/μl eingestellt und bei -20 °C eingefroren.
3. Isolierung RNA von aus peripherem Blut isolierten Zellen
Auf einem inversen Lichtmikroskop (Leitz Diavert) werden die PSA- und Cytokeratin-positiven Tumorzellen und Tumor- Zellhaufen mit einer sterilen feinen Nadel mikrodissek- tiert und in ein 1,5 ml steriles Reaktionsgefäß (Eppen- dorf Biopure) überführt. Die RNA- Isolierung wird strikt nach den Protokollen des RNeasy Purification Kit for total RNA minipreparation (Fa. Qiagen, Hilden) durchgeführt, bestehend aus: RNeasy Mini Spin Colums, Collection tubes 1,5 und 2 ml, Puffer RTL, Puffer RWI , Puffer RPE und RNase-freiem Wasser) .
Im folgenden wird nun beispielhaft die erfindungsgemäße Detektion karzinom-spezifischer, genetischer Veränderungen und mRNA-Expressionen mittels Mikrosatelliten-PCR, Multiplex Mikrosatelliten-PCR und TaqMan™ RT-PCR beschrieben.
4. Mikrosatelliten- und Multiplex-Mikrosatelliten-PCR
Insgesamt werden drei Multiplex-PCRs verwendet, die aus den Mikrosatellitenkombinationen Nr. 1: D7S522 D8S258, D16S400, Nr.2: NEFL, D13S153, D17S855 und Nr.3 D10S541, D16S402, D16S422 bestehen. Das Prinzip dieser PCRs beruht auf der Coamplifikation verschiedener DNA-Abschnitte in einem Reaktionsgefäß. Dabei wurden die Primersequenzen derart gesetzt, dass in der kapillarelektrophoretischen Trennung keine Überschneidungen der Längen der Amplifika- tionsprodukte auftreten. Alle Primer sind mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, die bei 488 nm angeregt werden (siehe Tabelle 3) . Alle anderen handelsüblichen Fluoreszenzmarkierungen sind ebenfalls anwendbar. Des weiteren 30
wurden die PCR-Reaktionsbedingungen für 10 CA-repeats innerhalb des EGFR-Gens und ein CA-repeat innerhalb des p53 Gens neu entwickelt und optimiert .
Alle PCRs können in handelsüblichen 0,2 ml oder 0,5 ml Reaktionsgefäßen oder in 96-Well-Platten verschiedener Hersteller (z.B. Eppendorf, Hamburg) auf einem Eppendorf Mastercycler, Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) , einem Gene AmpR PCR System 9700 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) oder einem handelsüblichen, vergleichbaren Thermocycler anderer Hersteller durchgeführt werden .
Das Reaktionsvolumen kann 12 μl bis 100 μl betragen. Das PCR Reaktionsgemisch besteht aus 5U/100 μl AmpliTaq Gold™ oder einer qualitativ vergleichbaren Polymerase und (bewährt haben sich hot start Polymerasen) 1 x Ge- neAmpR dNTP, 2 mM MgCl2, 30pM von jedem Primer, 200 μM Ge- neAmpR buffer (alle Reagenzien von PE Applied Biosystems, Weiterstadt) und 500 pg bis 200 ng genomischer DNA. Für die PCR werden folgende Themperaturgradienten gefahren. Begonnen wird mit einem 95 °C Denaturierungsschritt , gefolgt von 30-45 Zyklen bestehend aus einem 95 °C Denaturierungsschritt für 30s, einem 56 °C-62 °C Annea- lingschritt (je nach Primer, alle Multiplex-PCRs werden einheitlich mit 56 °C durchgeführt) und einem Elongati- onsschritt bei 72 °C. Nach diesen Zyklen wird ein 72 °C Extensionsschritt für 7 min angeschlossen und anschließend die Proben bei 4 °C bis zur Probenentnahme gekühlt aufbewahrt .
Für den Mikrosatelliten p53 werden die gleichen Reaktionsbedingungen und Thermozyklen benutzt wie für die Multiplex-PCRs (siehe Tabelle 2) .
Die Mikrosatellitenanalyse erfolgt auf den Kapillarelektrophoresegeräten (four colorlaser-induced fluorescen- ce capillary electrophoresis System) ABI Prism 310 Gene- 31
tic Analyzer oder ABI 3700 DNA Analyser (PE Applied Bio- systems, Weiterstadt) oder einen vergleichbaren Genetic Analyzer anderer Hersteller. Als Trennmedium dienen die Polymere POP4 , POP5 und POP6 die für die entsprechenden Geräte geeignet sind. Als Längenstandard dient Genescan- 500TM TAMRA 500 oder ein vergleichbarer Längenstandard, der für die genannten Kapillarelektrophoresegeräte geeignet ist. Die Analyse und Auswertung erfolgte mit der Genescan Software.
Verwendete
Reagenzien: Volumen :
Wasser bis zu 25pl 10*PCR Puffer II (PE) 2 , 5pf
25mM MgCl2 Lösung (PE) 2 μl dATP, 10 mM (PE) 0,25 μl dCTP, 10 mM (PE) 0,25 μl dGTP, 10 mM (PE) 0,25 μl dTTP, 10 mM (PE) 0,25 μl
5' -3' -Primer 10 μM 0,5 μl 1
3' -5' -Primer 10 μM 0 , 5 μl
AmpliTaq Gold (PE) oder 0,25 μl
AmpliTaq DNA Polymerase 0,25 μl
Total: 25 μl
Thermocycler: PE 9700,
Gefäße: 0,2 ml Gefäße jeder Hersteller, für PCR-Maschinen geeignet 32
Tabelle 2 :
Temperaturzyklen für die Mikrosatelliten-PCR:
Für D7S2429, BBl/2, CAII, D7S2550, CAIII, CAIV, CAVI,
D7S2467, D7 D7S2552 :
95 °C - 4 Min.
62 °C - 1 Min.
72 °C - 1 Min.
95 °C - ■ 1 Min.
31 Zyklen 62 °C ■ - 1 Min.
72 °C - - 1 Min.
72 °C - 8 Min.
4 °C - ■ unendlich
Für D7S494 :
95°C - 4 Min. 58 °C - 1 Min. 68 °C - 1 Min.
95 °C - 1 Min.
31 Zyklen 58 °C - 1 Min.
68 °C - 1 Min.
68 °C - 8 Min. 4 °C - unendlich
Für D7S499:
95 °C - 4 Min. 56 °C - 1 Min. 68 °C - 1 Min.
95 °C - 1 Min.
31 Zyklen 56 °C - 1 Min. 68 °C - 1 Min.
68 °C - 8 Min. 4 °C -unendlich 33
Tabelle 3 :
Probenvorbereitung ABI Prism 3700: Fragmentanalyse (Ge- neScan)
Pipettierschema :
Standard: GeneScan-500 TAMRA Size Standard PE Biosystems
Proben denaturieren: im Thermoblock für 2 Min. bei 80- 90 °C
34
Tabelle 4 Sequenzen der verwendeten Primer, Genloci und Fragmentlänge des PCR-Produktes
35
5. TaqMan® RT-PCR
Auf einem inversen Lichtmikroskop (Leitz Diavert) werden die PSA- und Cytokeratin-positiven Tumorzellen und Tumor- Zellhaufen mit einer sterilen feinen Nadel mikrodissek- tiert und in ein 1,5 ml steriles Reaktionsgefäß (Eppendorf Biopure) überführt. Die RNA-Isolierung wird strikt nach den Protokollen des RNeasy purification kit for total RNA minipreparation ( Fa. Qiagen, Hilden) durchgeführt, bestehend aus: RNeasy Mini Spin Colums, Collection tubes 1,5 und 2 ml, Puffer RTL, Puffer RW1, Puffer RPE und RNase-freiem Wasser) . Die RNA wird in einer two-tube- Reaktion in cDNA umgeschrieben. Dies wird genau nach den Protokollen für den Omniscript Reverse Transcriptase Kit (Fa. Qiagen, Hilden) durchgeführt. Das Reaktionsvolumen beträgt 20 μl . Das Reaktionsgemisch besteht aus RT 1 x Puffer, dNTPs (je 0,5 mM) 1 μM Oligo-dT primer, 10 Einheiten RNase Inhibitor, 4 Einheiten Omniscript Reverse Transcriptase und RNase-freiem Wasser. Für die RT-PCR werden die RNA-Proben zunächst bei 65 °C für 5 min denaturiert und anschließend auf Eis gestellt.
Die RT-PCR kann auf einem Eppendorf Mastercycler, Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) , einem Gene Amp R PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) oder einem handelsüblichen, vergleichbaren Thermocycler anderer Hersteller durchgeführt werden. Die PCR besteht aus einem 37 °C Inkubationsschritt für 60 min gefolgt von einem 93 °C Denaturierungsschritt . Die RNA-Isolierungen und die RT-PCR können des weiteren mit allen handelsüblichen Verfahren durchgeführt werden, die für geringe Gewebemengen geeignet sind, z.B. dem ExpressDirect ™ Kit For mRNA Capture And RT System For RT-PCR (Pierce Rockford) .
Die Echtzeit PCR kann auf einem ABI Prism 9700 HT Sequen- ce Detection System (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) in 96 oder 384 well Platten, abgedichtet mit einer optisch durchlässigen Folie (ABI PRISM TM optical adhesive 36
Covers, Foster City) , durchgeführt werden. Die Reaktionen werden üblicherweise in Doppel- oder Dreifachbestimmungen nach den Vorschriften für TaqMan-PCR nach PE Applied Biosystems (Weiterstadt) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch besteht aus einem TaqMan R Universal PCR Master Mix, plus je
90 nM der beiden PSA spezifischen Primer (forward 5'- TTCACCCTCAGAAGGTGACCA- TaqMan-Sonde (5'-
CCAGCGTCCAGCACACAGCATGA) . Der Temperaturgradient besteht aus einem anfänglichen 50 °C Inkubationsschritt für 2 min gefolgt von einem 95 °C Denaturierungsschritt für 10 min; anschließend werden 40-60 Zyklen gefahren, die aus einem 95 °C Denaturierungsschritt für 15 sec und einem 60 °C Amplifikationsschritt für 1 min bestehen. Der Lauf und die Auswertung erfolgten mit der SDS-Software (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) . Primer und TaqMan-Sonde sowie der TaqMan Mastermix können von verschiedenen Anbietern genutzt werden.
Als Positivkontrolle und zur Etablierung der TaqMan-PCR wurde RNA aus Zellen einer LNCaP Zellkultur isoliert, die dafür bekannt ist, dass sie PSA exprimieren. Als Negativkontrolle dienen Lymphozyten von Frauen.
6. Beispiele für die Zuordnung der zirkulierenden Zellen zu Bereichen des Primärtumors
a) Untersuchung einzelner Patienten
Bei einzelnen Patienten wurde nach dem beschriebenen Verfahren die Mirkosatellitenmarker in der DNA von aus dem peripheren Blut isolierten PSA-positiven e- pithelialen Zellen und aus einzelnen Foci des Primärtumors bestimmt. Die Mikrosatellitenmarker wurden nach dem Protokoll wie unter 4. beschrieben aus DNA bestimmt, die nach den Protokollen 1 und 2 gewonnen wurde . Die Prostatapräparate wurden vor der DNA- Isolierung nach dem von Schmid et al . (Schmid HP et 37
al . , Akt Urologie 1993) beschriebenen Verfahren in Großflächenschnitten im Abstand von 3 bis 4 mm systematisch aufgearbeitet und eine detaillierte kartographische Erfassung der Karzinomausdehnung wurde erstellt. Hierbei wurde nach Farbmarkierung des operativen Schnittrandes die Tumorgröße, die Lage des Tumors im Verhältnis zur Pseudokapsel der Prostata (Infiltration oder Penetration der Kapsel) und das Heranreichen oder Überschreiten der operativen Schnittränder in der durch das Karzinom dokumentiert. Histologisch gesichertes Tumorgewebe wurde dann aus dem paraffineingebetteten Material des Primärtumors gewonnen. Die Fig. 7 zeigt eine sogenannte Tumorlandkarte in der die Entnahmeorte markiert sind.
Das Alter der Patienten, das Stadium und histopatho- logische Parameter des Tumors sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt :
38
Tabelle 5: Vergleich der genetischen Alterationen zwischen verschiedenen Foci eines Primartumores und den aus Blut isolierten zirkulierenden Tumor-Zellhaufen
hom. = Homozygot AI Allel 1
LOH = Loss of Heterozygosity A2 Allel 2 39
Damit ist nachgewiesen, daß mittels der Analyse von Mikrosatelliten DNS zirkuliertende Zellen bestimmten Foci eines Primärtumors unmittelbar zugewiesen werden können.
Damit ist es auch möglich, durch Untersuchung der im Blut zirkulierenden Tumorzellhaufen zu ermitteln, in welchem Stadium sich der Primärtumor befindet bzw. welchen Verlauf die Erkrankung bzw. eine therapeutische Maßnahme nimmt .
b) Untersuchung eines Patientenkollektivs
Weiterhin wurde die DNA des organbegrenzt-wachsenden Prostatakarzinoms von 204 Patienten mittels der dargestellten Verfahren zur Bestimmung von Veränderungen in polymorphen DNS-Sequenzen untersucht. Eine Kopplung zwischen der Veränderung in einem polymorphen Marker und einem Funktionsgenen konnte gezeigt werden. Es wurde daher in Prostatakarzinomen die Marker D7S522, p 53, D8S522, NEFL, D10S541, D13S153, D16S400, D16S402, D16S422, D17S855 aus 6 chromosomalen Lokalisationen untersucht. Mit Hilfe einer non-parametrisehen multivariaten statistischen Methode (hierarchic-agglomerative cluster analy- sis) wurden Klassen von Tumoren mit spezifischen MS Mutationen gebildet („pattern recognition") (Fig. 2) .
Durch die mathematische Clusteranalyse wurden 3 Subgrup- pen mit bis zu 4 spezifischen DNS-Veränderungen herausgearbeitet: 1. p53, D16S402 oder D16S400 (n=10) ; 2. D8S258 und/oder NEFL, D13S153, D16S402 (n=9) 3. D10S541, D7S522, D13S153, D16S400 (n=ll) . Eine eher seltene Kombination aus p53 und D13S153 (n=6) wurde in Tumoren Patienten mit signifkant früherem Erkrankungsalter im Vergleich zu allen anderen Patienten gefunden (X=59 Jahre; STD=4 ; X=64 Jahre; STD=4 ; p=0.02). Die meisten Rezidive wurde hingegen in der Subgruppe 3 gefunden (4/9) . 40
Man kann zusammenfassend sagen, dass multiple genetische Entwicklungs- und Progressionswege für das Prostatakarzinom existieren müssen, die sich mit Hilfe der Kombination der untersuchten Marker indizieren lassen (Fig. 3) . Es ist festzuhalten, dass die Tumorprogression mit einer absoluten Zunahme an DNS-Veränderungen in polymorphen Sequenzen einher geht. Trotzdem läßt sich an Hand der vorliegenden Studienergebnisse eine Hierarchie der Genmutationen ableiten, die zur Ausbildung klinisch bestimmbaren Subtypen des Prostatakarzinoms führen (Fig. 3) . So kann man bei p53, D10S541 und NEFL bzw. D8S258 von Initiationsmutationen sprechen und bei denen auf Chromosom 16q und 13q von Verstärkermutationen, die nicht primär eine Tumorprogression einleiten.
Dieser Ansatz wurde auf den Vergleich der Veränderungen von polymorphen DNS-Sequenzen zwischen dem Primärtumor und den zirkulierenden Zellen an 24 Patienten übertragen
(Fig. 4) . Dabei wurde gefunden, daß die Freisetzung von Tumorzellen aus dem primären Tumor mit bestimmten Veränderungen in den polymorphen DNS-Sequenzen verbunden ist
(Fig. 5) . Der Cluster mit dem Marker D10S541, der mit einer frühen Metastasierung in Zusammenhang steht wird auch bevorzugt in den Zellhaufen des Blutes gefunden. Dagegen stehen Veränderungen in dem Marker D8S258 einer Aussaat der Zellen in das periphere Blut entgegen (Fig. 6) . Die Auswertung des krankheitsfreien Intervalls zeigt, das eine Veränderung dieses polymorphen DNS-Markers mit einer guten Prognose assoziiert ist (Fig. 6) .
c) Beispiele für den Nachweis eines Prostatakarzinoms über den Nachweis von Zellclustern im peripheren Blut der Patienten und die Vorhersage des Ergebnisses einer Prostatabiopsie
Bei 19 Patienten wurden vor transrektal-sonographisch gesteuerte Prostatabiopsie je 50 ml Blut entnommen. Nach dem hier beschriebenen Verfahren wurden Zytokeratin- und 41
PSA-positive intakte kleinzellige Zellhaufen isoliert.
Bei 8 Patienten ergab die Biopsie ein Prostatakarzinom (PCa) und bei 11 benignes Prostatagewebe (BPH) . Die Patienten wiesen folgende Serum-PSA und Prostatavolumina auf:
Während t-PSA und f/t-PSA im Serum keine sichere Vorhersage des Biopsieergebnisses erlaubten, ermöglichte die Untersuchung der Zellhaufen eine korrekte Vorhersage in 14 von 19 der untersuchten Patienten (Effizienz der Untersuchung 74%) .

Claims

42
Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung von Primärtumoren bzw. einzelner Bereiche von Primärtumore , dadurch • g e k e n n z e i c h n e t , daß aus Probenmaterial darin befindliche Zellhaufen von Tumorzellen isoliert bzw. angereichert und anschließend genetische Veränderungen der isolierten Zellhaufen analysiert werden.
2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß als Probenmaterial Zellkulturen, Blut, Urin, Nippleaspiratflüssig- keit der weiblichen Brust oder Gewebeproben aus
■ Primärtumoren verwendet werden.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß polymorphe DNS des Primärtumors oder einzelner Bereiche des Primärtumors bzw. Veränderungen hiervon erfaßt und mit entsprechender polymorpher DNS der Zell- haufen bzw. Änderungen hiervon verglichen werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNS der polymorphen Sequenzen D7S522, D8S133, D8S258, D8S298, D8S265, NEFL, D10S541, D10S1765,
'D10S579, D13S153, D16S400, D16S402, D16S413, D16S422, p53, BB1, BB2 , CAII, CAIII, CAIV, CAV und/oder D17S855 analysiert werden. 43
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die polymorphe DNS vor der Analyse vervielfältigt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die polymorphe DNS jeweils dreier polymorpher Sequenzen D7S522, D8S258, D16S400 oder NEFL, D13S153, D17S855 oder D10S541, D16S402, D16S422 gemeinsam analysiert und/oder vervielfältigt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die polymorphe DNS vor der Analyse mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die polymorphen DNS unter Verwendung der folgenden Primerpaare vervielfältigt wird:
GCAGGACATGAGATGACTGA und GTTATGCCACTCCCTCACAC ( für D7S522) ;
GTTTGAAGAATTTGAGCCAACC und TTCTTCTGCACACTTGGCAC ( für BB1+2) ;
CTCGAGGTCTCATCCTCTTTCC und GCAGAGGTGCACAAAGGAGTAA ( für CAII) ;
AGGCCCACAGAGGAGATAACAG und CAGGTGTGGTAGATGCCAAAGA (für CAIII) ;
GCAACTTATCCAAACCCTGACC und AGAGTGGACTAGGAAATGCTAGGAG (CAIV) ;
AGTTCCTGACTGGGAATTCGAT und TTGGCCAAATTACACACCTTTG (für CAV) ;
TTCCATTTGTCTCGGTT und AGTCTCCTCGTCTCACACCT (für D7S2550) ; CAGTGCTGGAGTTGTTCAAG und CTGGGAGTCAAGTGTTTTGG (für 44
D7S2429 ) ;
TGCTAAGTCTTGATTTTGCC und AACGGTCATCTGTGTTCG (für D7S2467) ;
GGTGTTTGTGTCATTACGCT und TTTGCTGTAGAGGATGCAAT (für D7S478) ;
TTCGGGCTCTCTGTTATAAA und CCGAAGCAGGATTTTATTTC (für D7S670) ;
AGCTGCCAGGAATCAACTGAGAG und GATGCTCACATAAAGGAGGGAGG (für D8S258) ;
CCAATACCTGCAGTAGTGCC und GAGCTGCTTAACACATAGGG (für NEFL) ; CACCACAGACATCTCACAACC und CCAGTGAATAGTTCAGGGATGG (für D10S541) ;
AGGGTTATGTATAACCGACTCC und GTCTAAGCCCTCGAGTTGTGG (für D13S153) ;
GGTTCACAATTGGACAGTAT und GAACCCTCCATGCTGACATT (für D16S400) ;
GTACCCATGTACCCCCAATA und CAAAGCACCACATAGACTAA (für D16S402) ;
GAGAGGAAGGTGGAAATACA und GTTTAGCAGAATGAGAATAT (für D16S422) ;
AATAAATTCCCACTGCCACTC und ATCCCCTGAGGGATACTATTC (für' p53) ; ' GGATGGCCTTTTAGAAAGTGG und ACACAGACTTGTCCTACTGCC (für D17S855) .
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die erzeugten vervielfältigten DNS-Fragmente mittels Kapillarelektrophorese getrennt und analysiert werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Isolierung bzw. Anreicherung von Tumorzellen aus dem Probenmaterial Cytokeratin-positive und/oder für gewebsspezifische Proteine positive epitheliale 45
Zellen isoliert bzw. angereichert werden.
11. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, aus dem Probenmaterial, gegebenenfalls nach Homogenisierung in einem Lösungsmittel , mittels Dichtegradientenzentrifugation epitheliale Zellen angereichert werden und von den angereicherten Zellen mittels immuno- magnetischer Zellisolierung Cytokeratin-positive und/oder für gewebsspezifische Proteine positive Zellhaufen abgetrennt werden.
12. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß als Medium für die Dichtegradientenzentrifugation ein hyperosmola- res Medium verwendet wird .
13. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß als hyperosmolarer Puffer mindestens eines der folgenden Medien 13,8 % (Gew/Vol) Natriumdiatrizoat und 8 % (Gew/Vol) Dextran 500 in H20 (Polymorphprep) o- der
13 % (Gew/Vol) Nycodenz, 0,58 % (Gew/Vol) NaCl und 5 mM Tricine-NaOH pH 7,4 in H20 (NycoPrep) verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die genetischen Veränderungen der isolierten Zellhaufen mittels Clusteranalyse analysiert werden.
15. Verwendung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur molekularen Charakte- 46
risierung von Tumoren oder Tumorbereichen oder zur Bestimmung der Klonalität von aus Probenmaterial isolierten Zellhaufen sowie zum Nachweis eines Tumors zur Bestimmung des Tumorstadiums , des Metastasierungspotentials, der Therapiebedürftigkeit, der Therapierbarkeit eines Tumors oder eines Bereiches eines Tumors sowie der Verlaufsprognose der Erkrankung bzw. einer Therapie .
16. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zum Nachweis und/oder zur Charakterisierung von Tumoren oder Tumorbereichen von Mammakarzinomen, Ovarialkarzinomen, Kolonkarzinomen, Magenkarzinomen, Prostatakarzinomen und/oder Blasenkarzinomen.
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