EP0862427A1

EP0862427A1 - Ultramikroemulsionen aus spontan dispergierbaren konzentraten mit antitumoral, antiviral, viruzid und antiparasitär wirksamen estern von bioflavonoid-verbindungen

Info

Publication number: EP0862427A1
Application number: EP97917205A
Authority: EP
Inventors: Carl Eugster; Conrad Hans Eugster
Original assignee: Marigen SA
Current assignee: Marigen SA
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-04-28
Publication date: 1998-09-09
Also published as: EP0863746A1; WO1998011889A1; WO1998011876A1

Abstract

Spontan dispergierbare Konzentrate mit antitumoral, antiviral, viruzid und antiparasitär einsetzbaren Estern von Bioflavonoid-Verbindungen, wässerige Ultramikroemulsionen aus solchen Konzentraten, neue Ester von ausgewählten Bioflavonoid-Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellund und Aufbereitung, sowie ihre Verwendung als Mittel zur Herstellung von Heilmitteln mit Wirksamkeit gegen virale und parasitäre Erkrankungen, gegen Tumore, Ekzeme und Psoriasis, zur anhaltenden Tumor-Prophylaxe und zur verstärkten Aufnahme von exogenen Aktivatoren, metabolischen Modulatoren und Regulatoren werden beschrieben.

Description

ULTRAMIKROEMULSIONEN aus

SPONTAN DISPERGIERBAREN KONZENTRATEN mit ANTITUMORAL, ANTIVIRAL, VIRUZID und ANTIPARASITÄR

WIRKSAMEN ESTERN von BIOFLA VONOID-VERBINDUNGEN

EINLEITUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Ultramikroemulsionen aus spontan disper- gierbaren Konzentraten mit lipophilen, aliphatischen Estern von ausgewählten, natürlich vorkommenden Flavonoiden (ohne Anthocyanine und Chalco- ne), neue Ester dieser Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Aufarbeitung, die Verwendung der Ester-haltigen, spontan dispergieraren Konzentrate zur Herstellung von Heilmitteln mit antitumoraler, antiviraler, direkt viruzider und/oder antiparasitärer Wirksamkeit, zur Bekämpfung von Ekzemen und Psoriasis, sowie zur Tumorprophylaxe und Tumortherapie, wie auch zur verstärkten Aufnahme von exogenen Aktivatoren, metabolischen Modulatoren und Regulatoren.

Die Ester dieser Bioflavonoid-Verbindungen haben überraschenderweise eine sehr gute antitumorale, antivirale, direkt viruzide, sowie teilweise auch eine antiparasitäre Wirkung, und sie eignen sich auch zur Behandlung von Ekzemen und Psoriasis und zur Stimulierung von Immunantworten. Die therapeutischen Eigenschaften derartiger Ester treten dann bedeutend verstärkt auf, wenn sie in spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet und darauf mit destilliertem Wasser oder 5%-Glucoselösung oder auch mit physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt worden sind, wobei sich thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergeben, mit Mizellen von einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm.

Die stark erhöhte, anhaltende biologische Wirksamkeit der neuen Flavonoid- perester und ihrer Darreichung in erfindungsgemässer Konzentrat- und Ultra- mikroemulsionsform stützt sich auf folgende Faktoren:

- die Veresterung der ausgewählten Flavonoide mit mittel- und langkettigen Fettsäuren führt zu einer ausserordentlich gesteigerten Lipophilie und damit zu einer Inversion der ursprünglichen Eigenschaft der Grundkörper. Zusammen mit der massgeblichen Anhebung des Wanderungs- und Spreitungs- Vermögens der ultrafeinen Mizellen bewirkt dies eine rasche Permeation von hydrophoben Membranen;

- die Flavonoidperester sind als "aktivierte Ester" zu betrachten. Sie haben die Fähigkeit, Acylgruppen auf geeignete nucleophile Gruppen zu übertragen, was insbesondere auf die Acylgruppe an C-5 des Flavonoid-Grundgerüstes zutrifft. Diese Aktivierung ist bei Verwendung von solvolytischen Lösungsmitteln leicht in 1 H-NMR-Spektren zu erkennen: die typische Wasserstoffbrücke zwischen OH-C-5 und dem Carbonyl an C-4 tritt bei ca. 12-13 ppm rasch in Erscheinung. Daraus kann geschlossen werden, dass eine Acy- lierung von (R)₃-C-SH-, R-CH₂OH- und R-NH₂-Gruppen, sowie eventuell auch von sekundären Alkoholen und sekundären Aminen, welche in den Zellkomponenten vorhanden sind, rasch erfolgen dürfte;

- die Freisetzung der intramolekularen Wasserstoffbrücke zwischen OH-C-5 und dem Carbonyl an C-4 an geeigneter Stelle der Zelle eröffnet das inhärente Chelierungspotential der Flavonoide für verschiedene Kationen mit den Koordinationszahlen 4 und 6. Seit altersher wurde dieser Umstand der starken Chelierung von Kationen in wässerigem Milieu zum Färben von Cellulo- segeweben (Hanf, Flachs, Baumwolle, usw.) ausgenutzt;

- die Labilität, vorab der C-5-Acylgruppe, verbietet die Aufarbeitung der Veresterungsansätze mit wässerigen Basen, wie auch die Säulenchromatographie an Materialien mit nucleophilen Haftstellen. Die Veresterung muss demnach mit einem Minimum an Reinigungsschritten durchgeführt werden .

BESCHREIBUNG der Erfindung

Die Ester von Bioflavonoidverbindungen haben als Grundkörper die allgemeinen Formeln (I) bis (IV): Flavone:

R = OH, OCH₃, in verschiedenen Stellungen, wie z.B. Chrysin mit OH an (C-5,7) oder Apigenin mit OH an (C-5, 7, 4') Flavonole:

mit R wie oben, z.B. Kampferöl mit OH (C-5, 7, 4'), Quercetin mit OH (C- 6,7_I3\4^,)_I Morin mit OH (C-5, 7, 2', 4'),

Flavanole (2,3-Dihydroflavanole):

mit R wie oben, z.B. (+)-Catechin mit OH (C-5, 7, 3', 4')

Isoflavonole:

mit R wie oben, z.B. Genistein mit OH (C-5, 7, 4') wobei in den Formein (I) bis (IV) R für Hydroxyl, eine C₆-₃₁ -Alkyl-, eine C₉.₃1 - Alkenyl- oder eine C₉.₃₁ -Alkapolyengruppe steht.

Die Veresterung der genannten Grundkörper kann nach einem an sich bekannten Verfahren vorgenommen werden :

Bildung des Chlorides einer Verbindung der Formel (V) :

R ¹ COOH _(V) worin R für eine Cβ-₃₁ -Alkyl-, eine Cg.₃ -Alkenyl- oder eine C₉_₃₁ -Alkapolyen- gruppe steht, mit einem Chlorierungsmittel , wie z.B. Thionylchlorid oder Oxa- lylchlorid, und anschliessende Umsetzung mit einer Verbindung der Formein (I) bis (IV) bei einer Temperatur von 0 bis 60°C, unter Schutzgaszuleitung, in einem indifferenten Lösungsmittel, wie z.B. Toluol oder Tetrahydrofuran, und in Gegenwart eines Katalysators, wie z.B. Dimethylformamid und/oder p-Di- methylaminopyridin.

Die Ester der Bioflavonoid-Verbindungen gemäss den Formeln (I) bis (IV) haben überraschenderweise eine ausgezeichnete antitumorale, antivirale, viruzide, sowie auch antiparasitäre Wirkung, und sie eignen sich überdies zur Bekämpfung von Ekzemen und von Psoriasis und zur Ausgleichung meta- bolischer Störungen. Diese Wirkungen treten vornehmlich dann ein, wenn sie in erfindungsgemässe, spontan dispergierbare MARIGENOL®-Konzentrate eingearbeitet worden sind, welche mit destilliertem Wasser, 5%-iger Gluco- selösung oder auch Ringerlösung verdünnt, thermodynamisch stabile Oel-in- Wasser Ultramikroemulsionen ergeben.

Derartige Ultramikroemulsionen weisen kugelförmige Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius auf von 2.2 bis 3.0 n . [Messungen mit QLS = quasielastischer, dynamischer Lichtstreuung wurden durchgeführt an der E.T.H., Zürich, Institut für Polymere (Prof.Dr. Pier Luigi LUISI und Prof.Dr. Peter SCHURTENBERGER)].

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind vorab spontan dispergierbare Konzentrate mit antitumoral, antiviral, viruzid oder antitrypanosomal wirksamen Estern der Formeln (I) bis (IV). Diese Ester sind nahezu wasserunlösliche und hoch agglomerierte Verbindungen . Damit solche Verbindungen aber durch die Membranbarriere der Tumor-, bzw. Wirtzellen oder auch durch die Proteinhülle von Viren diffundieren und im Innern der Zelle, bzw. des Virus wirksam werden können, müssen sie zuvor in geeigneter Weise im wässerigen Medium solubilisiert worden sein. Im Wege der Bildung von spontan dispergierbaren Konzentraten und daraus hergestellten, thermodynamisch stabilen Oel-in-Wasser Ultramikroemulsionen gelingt es, einen optimalen Solubilisierungsgrad der neuen Ester zu erzielen. Dazu werden einerseits ausgewählte Cotenside oder Lösungsvermittler und anderseits geeignete, oberflächenaktive Verbindungen (Tenside) eingesetzt und zu einem ausgewogenen System vereinigt und dann verdünnt.

Alle experimentellen Beobachtungen an dergestalt ausgebildeten, wässerigen Ultramikroemulsionen lassen sich einheitlich durch die Annahme deuten, dass die ausgewählten Cotenside und Tenside in der wässerigen Phase organisierte Aggregate, sog . Mizellen bilden. Diese besitzen mehr oder weniger kugelförmige Gestalt, mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm. Die Tenside und die Hydrotrope (Cotenside) lassen zwischen der äusse- ren, wässerigen Phase und der inneren, öligen Phase der Mikroemulsion [enthaltend einen Ester der Formeln (I) bis (IV), gelöst im biotensiden Lösungsvermittler] eine Grenzschicht entstehen, wod urch die Durchmischung dieser beiden Phasen unterbleibt. In der öligen, inneren Phase der Mizellen, dem mizellaren Kern, liegen dann die Moleküle des Bioflavonoid-Esters in monomerer oder in oligomer agglomerierter Form vor.

Die Mizellen der inneren Phase derartiger Ultramikroemulsionen sind demnach an ihrer Oberfläche mit einem elastischen Tensidmantel geschützt, was sie instand setzt, leicht durch die Zellmembran ins Innere der Tumor- oder Wirtzelle, bzw. durch die Proteinhülle von Viren zu diffundieren. Die Diffusion durch die Plasmamembran von Tumor- oder Wirtzellen oder durch das Capsid von Viren erfolgt ausschliesslich aufgrund thermischer Molekularbewegungen.

Die Richtung , die ein konkreter Diffusionsvorgang einschlägt, wird vom Konzentrationsunterschied bestimmt, welcher an der Plasmamembran zwischen ausserhalb und i nnerhal b der Tumor- oder Wirtzelle , bzw. an der Proteinhülle besteht. Die Diffusion verläuft solange entlang dem Konzentrationsgefälle, bis es abgebaut ist. Zwischen der extrazellulären Zone und dem Inneren der ei nzelnen Tumor- oder Wirtzelle oder eines Virus wird die Konzentration an Wirksubstanz, bzw. eines Wirkstoffsystems ausgeglichen, wobei auch verzögerte Abgabeeffekte auftreten können. Derartige Diffusionsvorgänge verlaufen unabhängig von jeglicher Energiezufuhr. Sie haben keinen Bezug auf die zelluläre Stoffwechselenergie.

Die Geschwindigkeit des Diffusionsvorganges, bzw. die Stärke des Wirkstofftransportes durch die Membran der Tumor- oder Wirtzelle werden bestimmt:

1 . vom Konzentrationsunterschied in den beiden Kompartimenten

2. vom Teilchenradius des diffundierenden Wirkstoffmoleküls oder

Wirkstoff Systems

3. von der Viskosität der diffundierenden, wässerigen Lösung

(Emulsion)

4. von der Temperatur.

Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, hat eine globuläre "Mizelle" mit einem hydrodynamischen Radius von einem Centimeter ein Volumen von 4,189 cm³ und eine Phasenoberfläche von 12,564 cm2. Demgegenüber weisen 1018 Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von nur 10-6 _Cm ( 10 nm), welche zusammen das gleiche Volumen von 4,189 cm³ ausmachen, schon eine Gesamt-Phasenoberfläche von 1 '256,4 m2 auf. MIZELLEN: VERHÄLTNIS VOLUMEN ZU GESAMTOBERFLÄCHE

Kugelvolumen = — π r3 3

Kugeloberfläche = 4 π r2

Fazit: Durch die grosse Phasenoberfläche, welche die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm in Ultramikroemulsionen ausbilden, wird zusätzlich zu deren gesteigertem Diffusionsvermögen die rheo- logische Verteilung ("spreading ") und somit die Bioverfügbarkeit und Bioreaktivität der Wirkstoffe, welche im Kern der Mizellen in monomer oder oli- gomer agglomerierter Form vorliegen, ebenfalls stark verbessert. Deren Abgabe als Feinstmizellen kann eine beträchtliche Ermässigung der phar- makologisch kritischen Dosierung erlauben und damit unerwünschte Nebenwirkungen vermeiden oder wenigstens verringern helfen.

Die "Packungsdichte" eines spontan dispergierbaren , stabilen MARIGENOL®- Konzentrates nimmt in exponentieller Funktion mit der kleiner werdenden Teilchengrösse der Mizellen zu. Entscheidend sind die richtige Ausbildung der inneren Phase, ihr ausgewogenes Verhältnis zum Gesamtkonzentrat und die Auswahl der je dazu passenden Tenside.

Die erfindungsgemäss spontan dispergierbaren Konzentrate enthalten: 0,1 bis 5 Gewichts-% einzelner Ester der Formeln (I) bis (IV), bzw. eine Kombination solcher Ester, sowie 5 bis 25 Gewichts-% eines als Hydrotrop, d.h. als Coemulgator dienenden, pharmaverträglichen Lösungsvermittiers oder Lösungsmittelgemisches,

5 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidge- misches, sowie wahlweise

0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins,

0 bis 10 Gewichts-% eines Stabilisators, Radikalfängers oder Penetrations- verbesserers.

Die erfindungsgemäss anwendbaren Öl-in-Wasser Ultramikroemulsionen enthalten:

0,01 bis 5 Gewichts-% eines spontan dispergierbaren Konzentrates wie oben beschrieben,

85 bis 99,99 Gewichts-% destilliertes Wasser, 5%-ige Glucoselösung oder physiologische Kochsalzlösung (Ringerlösung),

0 bis 10 Gewichts-% pharmazeutische Träger- oder Zusatzstoffe und/oder Hilfsmittel.

Solche wässerigen Ultramikroemulsionen weisen eine ermässigte Oberflächenspannung von 28 bis 32 mNm-¹ auf und einen niedrigen, inneren Widerstand (d.h. eine dynamische Viskosität η bei 20^CC) von ca. 1.0 cP = 10-3 Pa.s.

Die erfindungsgemäss einzusetzenden Tenside oder Tensidgemische können anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sein. Bevorzugt sind sie amphoter oder nicht-ionogen und haben ein HLB-Verhältnis (d.h. eine "hydro- philic-lipophilic balance") zwischen 2 und 18; vorzugsweise liegt es für Gemische zwischen 2 bis 6 einerseits und 10 bis 15 anderseits. HLB-Werte geben Auskunft über die hydrophilen und lipophilen Eigenschaften eines Em ulgators. Vgl . dazu "Hydrophile-Lipophile Balance: History and recent Developments" von Paul Becher im Journal of Dispersion Science and Technology 5 ( 1 ), 81 -96 (1984).

In hohem Masse bevorzugt zur Herstellung von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentraten sind einerseits Phosphorsäureestertenside, wie z.B. : das praktisch wasserfreie Tristyrylphenolpolyoxyethyien-18-phosphor- säureester-triethanolamin-Salz Tensid (TEA-Salz-Tensid) :

(Soprophor® FL, RHONE-POULENC);

Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), bzw. das identische Sermul® EA 1 88 (SERVO), ein Mischemulgator, bestehend aus je 50 % der beiden Verbindungen mit den

Formeln:

O

^C9 1 CH,

O CH,

Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), ein Alkylphenol Polyglycolether-Phos- phat-Tensid Tensid 508 (CIBA-GEIGY)

(Tensid 508, CIBA-GEIGY) ; Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-Ethoxy-Phosphorsäure- ester

Butyl-mono-4-Ethoxy-Phosphorsäureester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), bzw. CH₃-( CH₂ -CH-CH₂-O (-CH₂— CH--O ) "OCH₃

^ OCH₃

(Zerostat ® AN , CIBA-GEIGY) und anderseits Betainverbindungen, d.h . amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z.B. :

wori n Me[⁺] für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome und R_x für Cι .₃₂-Alkyl oder C₂.₃₂-Alkenylgruppen stehen .

Verwendung finden auch "Polysorbate"-Verbindungen, wie z.B. Tween® 20-85 (Atlas Chem. lnd.lnc ; bzw. ICI Speciaiity Chemicals) und sog. "multifunctio- nal glucose derivatives", wie z.B. Glucate® SS (Methyl-Glucose-Sesquistea- rat) und G lucamate® SS E-20 (PEG-20 Methyl-G lucose-Sesquistearat) von Amerchol, Edison, N.J., U.S.A.

Als Hydrotrop, d.h. als Coemulgator dienende, pharmaverträgliche Lösungsmittel lassen sich ei nsetzen, z.B. :

Ester eines aliphatischen Alkohols (C₃.₁₈) mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₁0.₂₂). wie etwa Isopropyliaurat, Hexyllaurat, Decyllaurat, Isopropyl- myristat, Isopropylpalmitat und Laurylmyristat; Kohlenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C_{1 2}.₃₂), welche mit 6 bis 16 Methylgruppen substituiert ist und 1 bis 6 Doppelbindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbutane und Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen. Mono-Ester aus Ethylenglykol oder Propylenglykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₆.₂₂), wie etwa Propylenglykolmonolaurat und Propylenglykol- monomyristat.

Ester aus einem aliphatischen Alkohol (Cι ₂.₂₂) mit Milchsäure, wie z.B. Myristyl- oder vorzugsweise Lauryl-Lactat; Mono-, Di- oder Triester des Gly- cerins mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₆.₂₂), wie z.B. Glyceryl-Capry- lat, oder Miglyol® 812 Neutralöl (Oleum neutrale).

Ester aus einem Poly(2-7)ethylenglykolglyzerinether mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6-22). wie z.B. aliphatische Alkohole (C_{1 2}.₂₂), somit u.a. Dodecanol , Tetradecanol, Oleyl- alkohol, 2-Hexyldecanol und 2-Octyldecanol.

Ester mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-10)glykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₆-₂2). Monoether aus einem Polyethylen- glykol mit einem aliphatischen Alkohol (Cι_-ιβ)_ι wie z.B. Polyoxyethylen (C₁₀)- octylether.

Heterocyclische Verbindungen, wie z.B. 1 -Methyl-2-Pyrrolidon . Zwitterionische Verbindungen (Good-Puffer) wie z.B.'ΗEPES" mit Formel: 4- (2-Hydroxyethyl)-piperazin-1 -ethansulfonsäure, oder "CHAPS" mit Formel: 3- [(3-Cholamido-propyl)-dimethyl-ammonio]-propansulfonat oder Bioten : worin R² eine aliphatische C₂.₃₁ -Alkyl, eine C₃-₃i -Alkenyl- oder Alkapolyen- gruppe ist und R³ Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeutet, sowie geradkettige Carbonsäureester von DL-α-Tocopherol, insbesondere das Undecenoat und das Laurat.

Alle technischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan dispergierbaren Konzentrate mittels Filtration, bzw. Chromatographie über neutralem Aluminiumoxyd mit einem inerten Lösungsmittel wie z.B. Tetrahydrofuran, Ethylalkohol oder Dichlormethan gereinigt.

Als Zusätze in die erfindungsgemässen spontan dispergierbaren Konzentrate eignen sich Vitamine und Provitamine (wie z.B. Vitamin A-Säure , Retinol, Tocopherole), sowie auch ausgewählte Penetrationsverbesserer ("Flux en- hancers") und Radikalfänger.

VERFAHREN für Bioflavonoid-Perester mit mittel- und langkettigen Carbonsäuren

1.0 Herstellung

1.1 Nach Vorschrift A: Aufarbeitung unter Verwendung von Wasser. Einen bei 150°C getrockneten Dreihalskolben geeigneter Gr sse mit Magnetrührer lässt man sich im N₂-Strom auf RT abkühlen. Dabei versieht man ihn gleichzeitig mit einem Ableitrohr und Gaszähler, einem Thermometer, sowie einem Sep- tum. Darauf gibt man 1 g wasserfreies Flavonoid zu und löst dieses in 10 ml abs. Pyridin, wenn notwendig durch kurzes Erhitzen über dem Infrarotbrenner. Hierauf Abkühlen auf RT und Verdünnen mit je 10 ml abs. Benzol und Dichlormethan. Anschliessend weiteres Abkühlen auf 0° bis -5°C. Nun werden mit einer Spritze via Septum die zur Erzielung einer vollständigen - 1 1 -

Veresterung notwendigen Äquivalente Säurechlorid tropfenweise und unter gutem Rühren zugegeben. Dabei bildet sich rasch ein weisser Niederschlag von Pyridinhydrochlorid. Vorteilhaft wird der Ansatz über Nacht weitergerührt, wobei man ihn auf RT kommen lässt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Zugabe von 50 ml verdünnter Sole (z.B. 5%-iger Kochsalzlösung) und 150 ml Lösungsmittel, einschiiesslich der zum Transfer in einen Scheidetrichter erforderlichen Menge. Je nach Löslichkeit besteht das Lösungsmittel aus Pe- trolether (30-60°) oder aus seinem Gemisch mit Benzol oder aus reinem Benzol. Nach Verwerfen der Hypophase wird mit vier weiteren Portionen zu je 50 ml gewaschen . Treten beim Ausschütteln Emulsionen auf, so ist es zweck- massig, diese durch Filtration durch eine Schicht von Celite zu brechen. Der erhaltene, meist blassgelb gefärbte Extrakt wird kurz über wasserfreiem Na₂S0₄ oder MgS0 getrocknet, dann filtriert und im Vakuum eingedampft. Das anfallende, ölige oder kristalline Produkt wird dann in ein geeignetes Kristallisationsgefäss übergeführt und aus 2-Propanol oder aus Benzol/Ace- tonitril oder aus Dichlormethan/Acetonitril umkristallisiert. Erhalten werden farblose bis schwach gelb gefärbte Perester der eingesetzten Flavonoide. Sie werden bei 40-55°C und 0,01 Torr getrocknet.

1.2 Nach Vorschrift B: Aufarbeitung unter wasserfreien Bedingungen.

Die Veresterung wird nach Vorschrift A ausgeführt. Die entstandene Suspension wird jedoch direkt auf eine trocken gestopfte Säule aus 100 bis 150 ml Kieselgel 60 (0,063-0,200 mm, Merck 7734), vorgewaschen mit Benzol/Aceton 99: 1 , gegeben und hierauf mit demselben Lösungsmittel entwickelt. Die rasch laufende, blass-zitronengelbe Hauptzone wird aufgefangen, im Vakuum eingedampft und der meist kristallin anfallende Rückstand wie unter 1.1 angegeben umkristallisiert.

1.3 Bemerkungen.

- Mit grösseren Ansätzen ist die Aufarbeitung nach Vorschrift A zweckmäs- sig, weil sie meist höhere Ausbeuten liefert und zudem kostengünstiger ist. Eine Aufarbeitung nach Vorschrift B vermeidet nicht nur lästige Emulsionen; sie bringt auch rascher reine Produkte und ist zeitsparend. Der Gehalt an Pyridin desaktiviert das Kieselgel und schont damit auch labile Ester an der HO-C(5).

- Die eingesetzten Flavonoide wurden bei 130°C/0,001 Torr während 20h getrocknet.

- Acylgruppen an HO-C(5) sind labil, vor allem solche mit relativ kurzen Ketten . Die Transacylierung tritt vornehmlic h mit primären Alkoholen rasch ein. Mit sekundären Alkoholen ist sie stark ermässigt. Deshalb kann 2-

Propanol zum Umkristallisieren verwendet werden. Der Nachweis einer freien

H-0-C(5) lässt sich bequem mit dem NMR anhand der Bande bei ca. 12,5 ppm führen.

- Zur groben Überprüfung der Reinheit der Flavonoid-Ester eignet sich die rasche Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel mit Cyclohexan/Aceton 17.5:2.5 und Detektion im kurz- und langwelligen UV. Die Perester zeigen hohe und relativ wenig unterschiedliche Rf-Werte; jedoch können polare Verunreinigungen leicht erkannt werden.

- Quantitative UV-Spektren wurden in Dichlormethan aufgenommen, angeführt sind λmax, nm- und ε -Werte. Die Extinktionen wurden mit dem MG der Perester berechnet.

- I R-Spektren wurden in CHCI₃ gemessen . Angegeben sind Banden im Fundamentalbereich bei cm^' ; ss = sehr stark, m = mittelstark, w = schwach mit qualitativer Abschätzung ihrer Intensität, bezogen auf die stärkste Bande.

- Massenspektren meist mit ESI (Elektrospray mit CHCI₃/Methanol + Nal), sonst Cl (chemische Ionisation mit NH₃); Auswahl von wichtigen Fragmentionen mit m/z und Intensität.

- 1 H-NMR-Spektren wurden in CDCI₃-Lösung bei 300 MHz aufgenommen, angegeben sind ausgewählte Signale und ihre < -Werte in ppm.

- S chmelzpunkte wurden im offenen Röhrchen bestimmt und sind nicht korrigiert. In mehreren Fällen werden Intervalle beobachtet, die offensichtlich auf Phasenumwandlungen zurückzuführen sind.

1 : R = (CH₂)₁₀CH₃

2 : R = (CH₂)14CH₃

2.1 Apiqenintrilaurat (1 )

C₅ι H₇₆0₈ (817,12); Ausbeuten: 80% nach Vorschrift A, 65% nach Vorschrift B; rahmweisse Kristalle aus Dichlormethan/Acetonitril ; Smp. 103.5-105.5°C.

UV : 230 (18*300), 275 (37*500), 303 (22'700), sh. 330 (14O00). _ \R : 2924 ss, 2856 s, 1398 m, 1760 s, 1657 ss, 1620 ss. MS : 657.5 (100%) [Dilaurat + Na]+.

NMR : 1.05 [t, <_ -CH₃); 1.44 (s, Ketten-CH₂); 1.93//2.75 (je m α-CH₂); 6.7-8.0

(Aromatenprotonen, darunter 6.85 s, H-C(3)); 12.7 (s, HO-C(5), Spur).

Verbren nunqsanalvse: Ber. C 74.96 H 9.38%

Gef. C 75.00 H 9.49%

2.2 Apiqenintripa Imitat (2.)

C₆₃Hι oo0₈ (985,43) ; Ausbeute 70% nach Vorschrift B ; nahezu farblose Kristalle aus Dichlormethan/Acetonitril ; Smp. 101 -102°C . UV : 232 (18*900), 276 (39*400), 303 (22*700), sh. 330 (14*900). 1R {CH2CI2) : 2926 ss, 2853 s, 1762 m-s, 1758 s, 1620 ss, 1597 m-s. NMR : 0.90 (f, ω-CH₃); 1 -29 (s, Ketten-CH₂); 1.8//2.6 (je m α-CH.); 6.6-7.9 (Aromatenprotonen, darunter 6.72 s, H-C(3)); 12.7 (s, HO-C(5), Spur).

3.0 Chrvsinperester

3 : R = (CH₂)₁₀CH₃

4 : R = (CH₂)i 4CH₃

3.1 Chrysindilaurat (3)

C₃₉H₅₄O₆ (61 8,82); Ausbeute 69% nach Vorschrift A; blassgelbe Kristalle aus

Benzol/CH₃CN; Smp. 134°C.

UV : 230 (16OO0), 270 (48'100),sh. 295 (24*600), 327 (15'700)

1R : 2925 ss, 2853 s, 1763 s, 1656 ss, 1619 ss, 1593 w, 1572 w (nur geringfügige Unterschiede zu Quercetinpentalaurat)

MS : 1333 (69%) [3 Monolaurat + Na]⁺; 1 260 (19%) [2 Dilaurat -1 1 8 + Na]+; 1078 (42%) [Dilaurat + Monolaurat + Na]⁺ ; 896 (100%) [2 Monolaurat + Na]+ ; 641 (44%) [Dilaurat + Na]+ ; 460 (98%) [Monolaurat + Na]+ ;

NMR : 0.94 (r, ω-CH₃); 1.34 (s, Ketten-CH₂); 1 .8/2.6 (je m, -CH₃); 6.6-7.9 (Aromatenprotonen, darunter 6.78 (s, H-C(3)); 12.8 (s, HO-C(5), Spur). Verbrennunosanalvse: Ber. C 75.69 H 8.80%

Gef. C 74.78 H 7.55%

C 74.37 H 7.32%

C 74.44 H 7.03%

C 76.29 H 7.78% Umkristallisation aus Benzol/2-Propanol liefert das Monolaurat.

Verbrennunqsanalvse: Ber. C 74.28 H 7.39%

Gef. C 74.18 H 7.1 6%

C 73.92 H 7.26%

C₄₇H70O₆ (731 .03) ; Ausbeute 70% nach Vorschrift A; blass-bräunlichgelbe Kristalle aus Benzol/0° oder aus Dichlormethan/Acetonitril; Smp. 104-105°C. UV : 230 (16^*800), 270 (43*500), sh. 296 (22*300), 327 (13*300) [R. : 2923 ss, 2856 s, 1765 s, 1648 ss, 1619 ss, sh. 1595 w, 1572 w (nur geringfügige Unterschiede zum Spektrum von Quercetinpentalaurat)

MS_ (CI mit NH₃) : 493.2 (100% [M+1 -126.6]

NMR : 0.87 (t, ω -CH₃); 1.25 (s, Ketten-CH₂); 1 .8/2.6 (je , α-CH₂); 6.5-7.9 (Aromatenprotonen, darunter 6.72 (s, H-C(3)); 12.7 (s, HO-C(5), Spur). Verbrennunqsanalvse: Ber. C 77.22 H 9.65%

Gef. C 77.36 H 9.60%

3.2 Chrvsindipalmitat (4)

C₃₉Hs₄0₆ (618,82); Ausbeute 69% nach Vorschrift A; blassgelbe Kristalle aus

Benzol/CH₃CN ; Smp. 131 .5-132.5°C.

UV : 230 (16*000), 270 (48*100), sh. 295 (24*600), 327 (15^*700)

IR_ : 2925 ss, 2853 s, 1763 s, 1656 ss, 16190 ss, 1593 w, 1572 w (nur geringfügige U ntersch iede zu Querceti npentalaurat)

MS : 1333 (69%) [3 Monolaurat + Na]+; 1260 (19%) [2 Dilaurat -118 + Na]⁺ ; 1078 (42%) [Dilaurat + Monolaurat + Na]⁺; 896 (100%) [2 Monolaurat + Na]⁺; 641 (44%) [Dilaurat + Na]+ ; 460 (98%) [Monolaurat + Na]+ ;

NMR : 0.94 (t, ω-CHj); 1.34 (s, Ketten-CH₂); 1.8/2.6 (je m, α-CH₃); 6.6-7.9 (Aromatenprotonen, darunter 6.78 (s, H-C(3)); 12.8 (s, HO-C(5), Spur). Verbrennunqsanalvse: Ber. C 75.69 H 8.80%

Gef. C 74.78 H 7.55%

C 74.37 H 7.32%

C 74.44 H 7.03% 4.0 Käm ferolperester

5 : R = (CH₂)ι₀CH₃

6 : R = (CH₂)ι₄CH₃

4.1 Kämpferoltetralaurat (5)

C₆₃H₉₈θ₁₀ (1015,41 ); Ausbeuten: 90% nach Vorschrift A, 70% nach Vorschrift

B; hellzitronengelbe Kristalle aus Et₂0/CH₃CN; Smp. 85.5-98°C

UV : 230 (25*700), 268 (36*000), 307 (21 *600), 338 (20*100).

IR. : 2930 ss, 2850 s, 1765 s, 1665 s, 1645 s, 1 617 s (Nur geringfügige

Unterschiede gegenüber Quercetinpentalaurat).

MS (Cl , NH3) : 833.2 (17%) [M+ 1 -x]+ ; 651 .2 (81 %) [M + 1 -2x]+ ; 469.2 (100%)

[M+1 -3x]+; 287.1 [M+1 -4x]+ ; x = m/z 182 (aus der α-Spaltung am Ester)

NMR : 0.81 (r, ω -CH₃); 1.19 (s, Ketten-CH₂); 1.7/2.5 (je m α-CH₂); 6.1 -7.8

(Aromatenprotonen); 12.1 (s, HO-C(5), Spur).

Verbrennunqsanalvse: Ber. C 74.51 H 9.73% Gef. C 74.62 H 9.59 %

4.2 Kämpf eroltetrapalmitat (6)

C₇₉H_{1 30}O₁₀ (1239,83); Ausbeute 75% nach Vorschrift B; hellgelbe Kristalle aus Benzol/Acetonitril; Smp. 105-110°C (aus 2-Propanol kristallisiert) UV : 230 (25'700), 268 (35'900), 307 (21 *600), 338 (20*100).

IR. (CH3CI2) : 2922 ss, 2850 m, 1765 m, 1654 m, 1617 s (nur geringfügige Unterschiede gegenüber Quercetinpentapalmitat).

MS : (DCI, NH₃): m/z 1239.8 (15%, M+ : daneben Peak mit M++1 , M+-1 , M+-2, sowie m/z 1001 .7 (15%), 763.5 (45%), 525.3 (100%), 287.3 (50%). Es handelt sich um die konsekutive Abspaltung von vier Pamitoylradikalen.

NMR : 0.83 (f, ω -CH₃); 1.20 (s, Ketten-CH₂); 1.7//2.5 (je α-CH₂); 6.1 -7.8 (Aromatenprotonen); 12.1 (s, HO-C(5), Spur). -- 1 6

3.0 Morinperester

7 : R = (CH₂)ι₀CH₃

8 : R = (CH₂)₁₄CH₃

5.1 Morinpentalaurat (7)

C ₅H_{1 20}Oι ₂ (1213,71 ); bräunliches, viskoses Öl, farblos nach Chromatographie an Kieselgel mit Benzol/Aceton 17:3; Ausbeute nach Vorschrift A 90% UV : 232 (30'800), 252 (30*400), sh.ca. 295 (16*500).

IR : 2923 ss, 2853 s, 1766 s, 171 2 w, 1640 m, 1622 m (nur geringfügige Unterschiede zu Quercetinpentalaurat).

MS : 1236 (81%, [Pentalaurat + Na]+; 1054 (100%), [Tetralaurat + Na]+ . NMR : 0.91 (., ω -CH₃); 1.28/1.30 (Ketten-CH₂); 1.64/1.78/2.6 ( α-CH₂); 6.60-7.6 (Aromatenprotonen); 12.14 (s, HO-C(5), Spuren).

5.2 Morinpentapalmitat (8)

C sHi₆oOι₂ (1494,23); fast farblose Kristalle aus Benzol/2-Propanol; Ausbeute nach Vorschrift A 90%; Smp. 57-57, 5°C.

UV : 232 (24*200), 248 (23*500), 286 (14*400), sh . 304 (13^*300). IR : 2921 ss, 2850 s, 1767 s, 1652 s, 1622 s (Nur geringe Unterschiede zum entsprechenden Quercetinderivat).

MS : 1517 (100%) [Pentapalmitat + Na]+ ; 1279 (31%) Tetrapalmitat +Na]+. NMR : 0.91 (t, ω-CHj); 1.30 (d, Ketten-CH₂); 1.66/1.78/2.6 (je m α-CH₂); 6.6-7.6 (Aromatenprotonen); 12.15 (s, HO-C(5), Spur). Verbrennunqsanalvse : Ber. C 76.35 H 10.79%

Gef. C 76.32 H 1 0.39 %

R = ω

10 : R = ψ 0)

CSJ— icπjt - -CH=CH

1 1 R = ω

CHj— (CH.)— -CH₃

12 R = ω

Quercetinpentacaproat (9 )

C₄5H_SoOι₂ (792,93); Ausbeute nach Vorschrift A 60%; umkristallisiert aus 2-

Propanol, rahmweisse Kristalle, Smp. 85-86°C.

UV : 231 nm (ε 23*900), 269 (37*600), 298 (21 *000), 333 (1 1 *600)

IR : 2962 ss, 2933 s, 2870 m, 1770 ss, 1657 s, 1616 ss.

MS_ : 717 (100 %), [Tetracaproat + Na]+

NMR : 0,89 (t, ω -CH₃); 1.352 und 1.714 (Ketten-CH₂); 2.52 (m, α-CH₂); 6.53 (d, J

= 1 ,8, H-C(6)) ; 6.79 (d, J = 1 ,7, H-C(8)); 7.25 und 7.65 (m, H-C(2',5',6')) ; 1 2.1 (s,

HO-C(5), deutlich).

Verbrennunqsanalvse : Ber. C 68,16 Ber. H 7,63%

Gef. C 68,04 Gef. H 7 ,70%

6.2 Quercetinpentaundecenoat (1 0)

C₇oHι ooOι ₂ (1133,50), Ausbeute nach Vorschrift A 75% ; umkristallisiert aus 2- Propanol, blassgebliche Kristalle, Smp. 63-64°C . UV : 230 (22*500), 373 (35*690), 292 (18'800), 339 (12*200). IR : 2930 ss, 2856 m, 1769 ss, 1650 s, 1639 s, 1620 s.

MS : 1156 (100%), [Pentaundecenoat + Na]⁺; 990 (32%) [Tetraundecenoat + Na]+

NMR (400 MHz) : kein ω-CH₃; 1.33/1.75/2.04/2.56/2.73 (je m, CH₂-Gruppen); 4.98 ( , 5ω-CH₂); 5,81 (m, ψ-CH); 6.58 (d, J = 2,2, H-C(6)); 6.84 ((/, J = 2,2, H- C(8)); 7.3/7.7 (je m, H-C(2',5*,6*)); 12.12 (HO-C(5), Spur). Verbrennunqsanalvse: Ber. C 74,17 Ber. H 8,89%

Gef. C 74,09 H 8,78% 6.3 Quercetinpentalaurat (11 )

C₇sHι₂oOi 2 (1213,71 ); Ausbeute nach Vorschrift A 75%; rahmweisse Kristalle aus 2-Propanol; Smp. 84,5-86°C. UV : 233 (20*900), 270 (29*200), 300 ( 18*200). UR : 2927 ss, 2855 s, 1770 SS, 1654 s, 1616 s.

MS : 1236 (25%), [Pentalaurat + Na]+; 1054 (100%) [Tetralaurat + Na]⁺ NMR : 0.93 (t, ω -CH₃); 1.318 (s. Ketten-CH₂); 2.6 (m α-CH2); 6.62 (d, J = 2,2, H- C(6)); 6.89 (d, J = 1 ,4 H-C(8)); 7.3 und 7.8 (je m, H-C{2',5',6')); 12.16 (HO-C/5), deutlich).

Verbrennunqsanalvse: Ber. C 74,21 Ber. H 9,97%

Gef. C 74,08 Gef. H 10,1 3%

6.4 Quercetinpentapalmitat (12)

C_₅H ₆oOι₂ (1494,23); Ausbeute nach Vorschrift A 80% ; fast farblose Kristalle aus 2-Propanol ; Smp. 90,5-91 ,5°C. UV : 233 ( 20'800), 262 (23^*800), 299 (19*900). iß. : 2929 ss, 2858 s, 1771 s, 1655 s, 1622 s.

MS : 1518 (100%), [Pentapalmitat + Na]+, 1278 (80%, [Tetrapalmitat + Na]+ NMR : 0.90 (r, ω -CH₃); 1 .29 (s. Ketten-CH₂); 2.6 (m α-CH₂); 6.60 (d, J = 2,2, H- C(6)) ; 6.86 (d, J = 2,1 H-C(8)); 7.3 und 7.7 (je m, H-C^' .δ'.β')). Verbrennunqsanalvse: Ber. C 76,35 Ber. H 10,79%

Gef. C 76,38 Gef. H 10,86%

7.0 Genisteinester

13a : R1 = R2 = CO(CH₂)10CH₃

13b : R2 = H , R = CO(CH₂)i oCH₃

14a : R1 = R2 = CO(CH₂)i 4CH₃

14b : R2 = H, R2 = C0(CH₂)14CH₃

7.1 Genisteindilaurat (13)

Zwar kann unter forcierten Acylierungsbedingungen ein Trilaurat (13a) erhalten werden , doch erweist sich dieses bei der Aufarbeitung als so labil, dass ein mehr oder weniger vollständiger Übergang in das 7,4'-Dilaurat (1 3b) eintritt.

C₃₉H₅₄O₇ (634,82; Ausbeute 70% nach Vorschrift A und Umkristallisation aus 2-Propanol; farblose Kristalle ; Smp. 96.5-97°C. UV : 232 (22*100), 252.5 (32*600), 324 (4'800). ]R : 2923 ss, 2855s, 1758s, 1650ss, 1620s.

MS (ESI): (839.6 [Trilaurat+ Na]+ ; 721.7 [Trilaurat-118+Na]+ ; 657.8 [Dilaurat+ Na]+

NMR : 0.81 (f, -CH₃); 1 .20 (s,Ketten-CH₂); 6.5-7.9 (Aromatenprotonen, darunter 7.89 (s, H-C(2)) ; 1 2.7 (s, HO-C(5), Verbren nunqsanalvse : Ber. C 73.78 H 8.57%

Gef. C 73.52 H 8.21%

7.2 Genisteindipalmitat ( 14b)

C₄₇H₇₀O₇ (747,03); Ausbeute 85% nach Vorschrift B; farblose Kristalle aus 2-

Propanol ; Sm p. 101 -102°C.

UV : 230 (15'600), 256 (36*000), 326 (5*300).

IR. (CH2CI2): 2928SS, 2855s, 1760s, 1652s, 1622m-s, 1 592m.

MS : (DCI, NH₃) : m/z 746.6 (M+-1 ) ; 507.4 (M+-Palmitoyl ; 85%) ; 269,1 (507,4-

Palmitoyl; 70% ). .

NMR : 0.91 (_, -CH₃); 1 .30 (s, Ketten-CH₂); 6.6-8.0 (Aromatenprotonen, darunter 7.99 (s, H-C(2)); 12.8 (s, HO-C(5). Verbrennunqsanalvse: Ber. C 76.56 H 9.4%

Gef. C 75.60 H 9.1 6%

8.0 ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren KONZENTRATEN, welche die Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IV) enthalten und welche, wenn sie mit Wasser oder 5%-Glucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt werden, thermodynamisch stabile ULTRAMIKROEMULSIONEN mit Mizellen ergeben, welche einen hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm aufweisen.

a) 0,1 bis 5 Gewichts-% eines oder mehrerer Ester von ausgewählten Bioflavanoid-Verbindungen der Formeln (I) bis (IV),

5 bis 25 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, CHAPS , HEPES oder Neutralöl, wie z.B. Miglyol® 812 (Dynamit Nobel oder Hüls), 0 bis 45 Gewichts-% eines Phosphorsäureester-Tensides, wie z.B. Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), Tensid 508 (CIBA-GEIGY), Zerostat® AN oder AT (CIBA- GEIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (RHÖNE-POULENC), 5 bis 90 Gewichts-% Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY) und/oder TWEEN®-20 bis TWEEN®-85 (ICI SPECIALITIES), und wahlweise 0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins,

0 bis 10 Gewichts-% eines Penetrationsverbesserers, Radikalfängers oder Stabilisators.

b) 0,5 bis 5 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IV),

0 bis 5 Gewichts-% CHAPS oder HEPES,

5 bis 25 Gewichts-% ei nes oder mehrerer biotensider Terpinylester der allgemeinen Formel (VI) :

2 3

R— COO— R _(vl) worin R eine C₂.₃ι -Alkyl-, eine C₃.₃ι -Alkenyl- oder eine C₃.₃₁ -Alkapolyen- gruppe ist und R³ Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeutet,

35 bis 45 Gewichts-% Invadin® JFC 800% und/oder TWEEN®-20, -80 oder -85,

35 bis 45 Gewichts-% Soprophor® FL oder Diphasol® 3873.

N.B.: INVADIN® JFC 800% (CIBA-GEIGY) ist ein wasserfreies tert. Octyl- phenylpolyoxyethylenether-Tensid mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen. SOPROPHOR FL (RHÖNE-POULENC) ist ein praktisch wasserfreies Tristyryl- polyoxyethylen-18-phosphorsäureester TEA-Salz-Tensid .

CHAPS (Fluka 26*680; Merck-Index 11.2034) ist eine zwitterionische Verbindung mit Formel : 3-[(3-Cholamido-propyl)-dimethylammonio]-propansulfonat. HEPES ist ein Good-Puffer: 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1 -ethansulfonsäure. TWEEN® 20 ist ein Polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monolaurat-Tensid (CAS-Nr. 9005-64-5). [Polysorbate 20 in der CTFA Classification].

TWEEN® 80 ist ein Polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monooleat Tensid (CAS-Nr. 9005-65-6). [Polysorbate 80 in der CTFA Classification].

TWEEN® 85 ist ein Polyoxyethylen-(20)-sorbitan-trioleat Tensid [Polysorbate 85 in der CTFA Classification].

9.0 BEISPIEL für die pharmazeutische Herstellung eines Systempräparates mit erfindungsgemässen Konzentraten in der Form von "multiple units". a) Granulierung

Metolose® 90 SH-4000 (Shin-Etsu Chemical) 90.0 g

Avicel® PH-101 80.3 g

Erfindungsgemässes MARIGENOL®-KONZENTRAT 139.4 g

Aerosil® 200 80.3 g

Σ 390.0 g

Granulieren/Formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 1 10 g Ethanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24h bei 40°C.

b) MSR- und RETARD-Ausrüstung im Rotationsbett mit AQOAT® AS-HG (Shin-Etsu Chemical) und Talk

c) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. Micropellets Kernmaterial 44 % Erfindungsgemässes MARIG ENOL®-KONZENTRAT 25 % MSR-Beschichtung 31 %

Σ 100 %

N.B. : MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemäss a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus AQOAT® (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) hergestellt sind, mit Aceton/Ethanol 1 :1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzögerten Abgabe (Retard) angemessen steuern. Biologische Prüfungen.

Die antitumorale Wirkung von spontan dispergierbaren Konzentraten gemäss den Zusammensetzungsbeispielen a) und b) wird anhand folgender Prüfungsergebnisse bestätigt:

1.0 In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Linien

Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikrotiter- platten und Verdünnungsreihen arbeitet. Angesetzt werden je 10 /ml Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum inaktiviert (GIBCO); sie werden so undicht ausgesät, dass sie während des Assays in nichtkonfluenten Monolayers wachsen können. Die Probenzugabe erfolgt nach 6 bis 24 Stunden , mit 100 μl pro Reihe, die man im 1 . Loch mit 100 μl Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen und in das folgende Loch eingebracht, wieder mit 100 μl Medium versetzt, usf. Es entsteht eine geometrische Verdünnungsreihe nV_.

Die Proben werden im Plaque Assay während 3 bis 5 Tagen bei 37°C mit 3V_% C0₂ inkubiert. Anschliessend färben/fixieren mit 0, 1 % Kristallviolett (Fluka, Buchs) in einer Lösung von 70% Methanol , 1 % Formaldehyd, 29% Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen, Vergrösserung 300-fach. Man bestimmt die grösste cytotoxische Verdünnung. Die quantitative Auswertung lässt sich auch m ittels Scanning und Absorptionsmessung am Spektrophoto- meter vornehmen.

2.0 Prüfung auf Zelltoxizität

2.1 Zelltoxizität der MARIGENOL®-KONZENTRATE geprüft an Py6-Zellen (Polyoma Virus transformierte 3T3 Maus-Fibroblasten)

Py6 Zytotoxizitäts-Test 24. - 28.4.1995

2%-Konzentrate 24 h 48 h 72 h mit QUERCETIN- Exposition Exposition Exposition PENTA-ESTERN Konzentrat Konzentrat Konzentrat

W.S. W.S. W.S.

(C₆:θ)₅ " 64^*000 128*000 256*000

QUERCETIN 3.2 Mio. 6.4 Mio. 2.8 Mio.

(Cn:l)5 - 128*000 512*000 512*000

QUERCETIN 6.4 Mio. 25.6 Mio. 25.6 Mio.

(Cn:l)5 -

QUERCETIN 256*000 512O00 1O24O00 Analysenrein 12.8 Mio. 25.6 Mio. 51.2 Mio.

(Ci2;θ)5 - 128*000 256*000 1*024*000

QUERCETIN 6.4 Mio. 12.8 Mio. 51.2 Mio.

(Cl6:θ)δ ^■ 256O00 512O00 1*024*000

QUERCETIN 25.6 Mio. 51.2 Mio.

Grösste zytotoxische Verdünnung: auf Konzentrat-, bzw. W.S. -Gehalt berechnet.

Zu den eternalisierten Py6-Zellen vgl.: "Biochemistry", Coordinating Editor Geoffrey L. Zubay, Addison-Wesley Publishing Company, 1983, p.1079. Vgl. auch "Molecuiar Cell Biology", second Edition, by J. Darneil, H. Lodish, D. Baltimore; Scientific American Books, Chapter 5: Viruses, Structure and Functions, pp. 177-188. New York, 1990 (W.H. Freeman & Co.) 2.2 Zelltoxizität der MARIGENOL®-KONZENTRATE / FORTSETZUNG geprüft an Py6-Zellen (Polyoma Virus transformierte 3T3 Maus-Fibroblasten)

Py6 Zytotoxizitäts-Test Juli 1995

1 %-Konzentrate 24 h 48 h 72 h mit FLAVONOID- Exposition Exposition Exposition

ESTERN M.E. 1 : 100 M.E. 1 : 100 M.E. 1 : 100

W.S. W.S. W.S.

APIGENIN- 32O00 128*000 —

TRIPALMITAT 3.2 Mio- 12.8 Mio.

CHRYSIN- 128O00 512*000 1 Mio.

DILAURAT 12.8 Mio. 51 .2 Mio. 100 Mio.

CHRYSIN- 128*000 512O00 512O00

DIPALMITAT 12.8 Mio. 51 .2 Mio. 51.2 Mio.

GENISTEIN- 32*000 256*000 —

DIPALMITAT 3.2 Mio. 25.6 Mio.

KÄMPFEROL- 32*000 128*000 --

TETRAPALMITAT 3.2 Mio. 12.8 Mio.

MORIN- 1 28*000 1 Mio. 1 Mio.

PENTALAURAT 12.8 Mio. 100 Mio. 100 Mio.

MORIN- 64*000 512O00 51 2^*000

PENTAPALMITAT 6.4 Mio. 51 .2 Mio. 51 .2 Mio.

Grösste zytotoxische Verdünnung: auf Mikroemu lsion , bzw. W.S. -Gehalt berechnet.

2.3 In-vitro-Prüfung an humanen Tumorzell-Linien (Dosis-Abhängigkeit)

VITALITÄTSTEST QUERCETIN-PENTA-10-UNDECENOAT 1 x 104 Zellen pro Loch

Proliferationstest (Tritium: 1 μCi/well H⁺)

ZELL-LINIE LC 89 U 937 VERDÜNNUNGEN cpm % cpm %

10-2 = 1 _: 100 470 16 788 0.4

10-3 = 1 _: V000 628 21 838 0.4

10-4 = 1 _: 1 0O00 10*064 347 79*515 40.7

10-5 = 1 _: 100*000 3'506 120 204'835 104

10-6 = 1 _: 1 'OOOOOO 3*465 119 197*321 101

10-7 = 1 _: 1 *000*000 4*098 141 199'231 102

Kontrollen : 2*906 cpm 195'1 25 cpm

LC 89 : Lungen-Adenokarzinom

U 937 : Akute mieloide Leukämie

Arbeiten durchgeführt von Dottoressa Anna Rita GUARINI, Universitä degli

Stud i di Torino, Clinica medica, 1 3. bis 16.6.1995 .

AUSWEIS : %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2%-MARIG ENOL®-KONZENTRA- TEN , als wässerige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Verdünnung 1 :10 = 10*000 ppm Konzentrat, 200 ppm Wirksubstanz; etc.

2.4 In-vitro-Prüfung an humanen Tumorzell-Linien (Dosis-Wirkungs-Beziehung)

VITALITÄTSTEST / 1%-MARIGENOL-KONZENTRATE Erythrozyten-LEUKÄMIE K 562 1 x 104 Zellen pro Loch

Proliferationstest (Tritium : 1 μCi/well H⁺)

PRÄPARAT 10-3 10-4 10- ■5

VERDÜNNUNG cpm % cpm % cpm %

MORIN- 448 0.8 1 '083 2.1 14'818 29.6

PENTALAURAT

MORIN- 544 1.0 899 1 .7 23*666 47.2

PENTAPALMITAT

CHRYSIN- 498 0.9 601 1 .2 16*532 33.0

DILAURAT

CHRYSIN- 484 0.9 492 0.9 3*928 7.8

DIPALMITAT

QUERCETIN392 0.7 536 1 .0 2^*745 5.4

PENTALAURAT

Arbeiten durchgeführt von Dottoressa Anna Rita Guarini, Universita degli Studi d i Torino, Clinica medica, 21 . bis 24.8.1 995. Kontrollen 50*037 cpm. Testanlage wie bei 2.3

AUSWEIS : %-Vitalitat nach 48 Stunden mit 1 % MARIGENOL®-KONZENTRA- TEN, als wässrige U ltrami kroemulsion dem Medium ei nmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h . Verdünnung 10^~3 = 1 *000 ppm Konzentrat, 10 ppm Wirksubstanz; etc .

2.4 In-vitro-Prüfung an humanen Tumorzell-Linien (Dosis-Wirkungs-Beziehung)

VITALITÄTSTEST / 1%-MARIGENOL-KONZENTRA TE LEUKÄMIE DAUDI-LINIE 1 x 10⁴ Zellen pro Loch

Proliferationstest (Tritium : 1 μCi/well H⁺)

s

PRÄPARAT 10^"3 10-⁴ 10

VERDÜ NNUNG cpm % cpm % cpm %

MORIN- 393 1.7 463 2.0 12'508 54.1

PENTALAURAT

MORIN- 374 1.6 632 2.7 15*234 65.9

PENTAPALMITAT

CHRYSIN- 271 1.1 574 2.4 10'286 44.5

DILAURAT

CHRYSIN- 401 1.7 624 2.7 9' 173 39.7

DIPALMITAT

QUERCETIN353 1 .5 384 1.6 9'541 41 .3

PENTALAURAT

Arbeiten durchgeführt von Dottoressa Anna Rita GUARINI, Universita degli Studi di Torino, Clinica medica, 21 . bis 24.8.1995. Kontrollen 23O90 cpm . Testanlage wie bei 2.3

3.0 Prüfung auf MT4-Zellen, infiziert mit dem AIDS-VIRUS

Tests durchgeführt von Prof.Dott. Alberto BIGLINO, Direttore deM'Ospedale Generale di Asti, am istituto delle Malattie Infettive, Universita degli Studi di Torino (Direttore: Prof.Dr. P. Gioan nini), Assistenz: Dotta. Brunella FORNO und Dotta. Annamaria POLLONO. März bis April 1995.

3.1 Schutzeffekt auf die Wirtzelien (MT4-Lymphozyten)

Der HIV III B-Komplex wurde während 4 Tagen in einer Konzentration von 10 CCID₅₀/Kultur und well ("CCID₅₀/ml = 50% cell c_ulture mfective dose") angewandt. Die beste Schutzwirkung wurde bei einer Konzentration des geprüften MARIGENOL®-Konzentrates von 10^'4 erzielt (= 100 ppm Konzentrat i n wässeriger Mikroemulsion) von Quercetinpenta-10-undecenoat. 3.2 Direkte antivirale Wirkung, bzw. therapeutischer Effekt gegen die sog. erworbene Immunschwäche, das humane "Aq uired Immuno-Deficiency Syn- drome: AIDS ", bzw. gegen pathologisch wirksame Prionen.

Anwendung des HIV I II B-Komplexes bei einer mittleren Konzentration von 300 CCIDso/rnl. Inkubation während 3h bei 4°C, in Gegenwart der antiviral, bzw. viruzid wirksamen Mikroemulsion . Dann Übertragung auf die MT4-Zellen. Gegenüber den nicht infizierten Kontrollen kann eine klare, Dosis-abhängige Hemmwirkung nachgewiesen werden.

Für die angewandte Prüfmethodik vgl. u.a. : Rudi Pauwels, Erik De Clercq et ai.: Sensitive and rapid assay on MT4 cells for detection of antiviral compounds against the AIDS virus. Rega Institute for Medical Research, Katho- lieke Universiteit Leuven, 3000 Leuven, Belgium, Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 1987 (0166-0934/87/503.50); J.Virol . Methods 1987: 16, 171 -85.

Cf. auch : A. Bergamini, CF. Perna, et al. : A tetrazolium-based colorimetric assay for quantification of HlV-induced cytopathogenicity in monocyte- macrophages exposed to macrophage colony-stimuiating factor. J.Virol. Methods, 1992: 40(3), 275-86.

Jay A. Levy: "HIV research : a need to focus on the right target", The Lancet, Vol. 345, June 24, 1995, pp. 1619-21 .

Molecuiar Cell Biology, second Edition, by J . Darneil , H. Lodish, D. Baltimore; Scientific American Books, Chapter 5 : Viruses, Structure and Func- tions, pp. 177-1888. New York, 1 990 (W.H. Freeman & Co.)

4.0 Andere Viren

4.1 Cytomegalie-Virus (CMV)

Die Prüfung wurde mit humanen , embryonalen Lungenfibroblasten als Wirtzellen vorgenommen, die dann mit dem CMV-Stamm AD 169 infiziert wurden. Der Stamm "CVM umano AD169" wurde während 4h bei +4°C mit unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz C_{1 6} o-p-Sitosterylester, formuliert als 1 %-iges Konzentrat und dan n verdünnt zu einer wässerigen Mikroemulsion 10^'3, 10^'4 und 10 ^s, inkubiert und daraufhin als vorbehandelte Virus- S uspensionen auf Kulturen von menschlichen, embryonalen Lungenfibroblasten überimpft. Ansatz als konfluente Kultur mit 1 20^*000 Zellen pro shell- vial. Die Infektion wurde mittels Zentrifugation während 45 Minuten bei 1 500 rpm und bei RT vollzogen , worauf die Injektionssuspension entfernt und 1 ml Kulturmedium MEM mit 2% fötalem Kalbserum (wie bei der Anzucht) beige- geben wurde; die infizierten Zellen wurden sodann während 20h bei 37°C und unter 5%-iger C0₂-Atmosphäre gehalten .

Am Schluss der Inkubation wurde das Medium entfernt, die Zellen gesammelt, mit 2% Aceton-Methanol (2: 1 ) fixiert und 3 Mal mit PBS gewaschen. Die Quantifizierung erfolgte mittels Immunofluoreszenz-Messung . Die Vials wurden mit dem monoklonalen Antikörper "Anti-P-72 CMV" (einem unmittelbaren Vorläuferprotein des CMV, das schon nach 6 h in den infizierten Zellen nachgewiesen werden kann) versetzt und während 30 Minuten bei 37°C in feuchter Atmosphäre inkubiert.

Es folgten 3 Waschungen in PBS , eine zweite Inkubation mit dem Fluoreszenz-markierten Antikörper IgG Ziege anti-IgG Maus. Es schliesst sich eine nochmalige Inkubation während 30 Minuten bei 37°C, wie oben angegeben, an, gefolgt von einer 3-maligen Waschung mit PBS . Die Proben werden dann mit 50% Giycerol in PBS auf Glasträger montiert.

Gleichzeitig wurden Kontrollen aufbereitet mit infizierten Zellen, die unter gleichen Bedingungen, aber ohne Vorbehandlung mit der Prüfsubstanz aufbereitet worden sind.

Gezählt werden die für das CMV-spezifische Antigen positiven Nuclei, mith ilfe eines Fluoreszenz-Mi kroskopes bei 25-facher Vergrosserung in wässeriger Phase.

Es lässt sich ganz eindeutig eine Dosis-abhängige, direkt viruzide Wirkung feststellen. Das Virus ist nicht mehr virulent genug, um die empfindlichen Wirtzellen zu infizieren .

ERGEBNIS :

VIRUZIDE WIRKUNG des ß-SITOSTERYL-PALMITATES

(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)

KONTROLLEN : KONZENTRATION KONZENTRATION KONZENTRATION Anzahl der Anti- MIKROEMULSION MIKROEMULSION MI KROEMULSION gene (anti P-72) 1 : 1 '000 1 :10*000 1 : 100*000

1 15*000 0 2 82^*000

Anzahl der "Nuclei positivi" per P-2

Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universitä degli Stud i di Torino, Jul i-November 1 995. 4.2 Herpes-Virus (Herpes Simplex, HSV)

Die antivirale Wirkung einer wässerigen Mikroem ulsion von geeigneten MARIGENOL®-Konzentraten wird mithilfe einer konfluenten Kultur von VERO- Zellen (d.h. "African green monkey kidney cells") festgestellt. Die Wirtzellen werden während 3h bei 4°C mit der Mikroemulsion vorbehandelt und dann mit einer konstanten Dosis von 10 Herpes Sim plex Viren, sog. "plaque forming units" = PFU infiziert. Dauer der Virus-Absorption 1 h. Dann Zugabe von 2% Methylcellulose zur Verhinderung der Spreitung des Virus; es entsteht ein elastisches Vlies im Kulturmedium MEM + 2% fötalem Kalbserum. Anzüchtung während 48 h, dann Fixieren u nd Färben der Monolayers m it 1 % Kristallviolett i n Methanol.

Die antivirale Wirkung korreliert mit der Zahl von "plaques" von mit einer Prüfsubstanz behandelten , lysierten Zellen, die sich im Kulturmedium MEM + 2% FCS noch bi lden. Die Herabsetzung des viralen Titers wird im %-Verhält- nis zu den Kontrollen (21 Plaques pro Zelle) angegeben.

Als Prüfsubstanzen wurden folgende Konzentrate i n wässeriger Verdünnung (ausgehend von einer Mikroemulsion 1 :100) eingesetzt:

1 % C_20:o-ß -SITOSTERYL-ESTER

1 % QUERCETIN-PENTA-10-UNDECENOAT

1 % C_{1 6 :}o-ß-SITOSTERYL-ESTER

1 % C_{i 2 :0}-ERGOSTERYL-ESTER Auswertung :

C₂o o-ß- QUERCETIN- Cι β:0-ß - i _{2 :}o-ER-

VERDÜNNUNG SITO-ESTER: PENTA-10- SITO-ESTER GO-ESTER:

(ARACHIDAT) UNDECENOAT (PALMITAT) (LAURAT)

1 : 1 0*000 76 % 48 % 24 % 62 %

1 : 100*000 5 % 0 % 0 % 0 %

Die Ergebn isse zeigen eine deutliche direkte Wirkung auf die HS-Virus-

•4 infizierten VERO-Wirtzellen. Bei einer Konzentration von 10 ß-S itosterylara- chidat erscheint die Zahl der Plaques, im Vergleich mit den Kontrollen, um 76% herabgesetzt; für das Quercetinpenta-1 0-undecenoat liegt dieser Wert bei 48%. Der HSV-Titer ist deutlich vermindert.

Bei dieser Konzentration der geprüften Substanzen findet auch keine Lysierung , weder von eternalisierten Lymphozyten vom Typus MT4, noch der VERO-Zellen selber statt. (MT4-Lymphozyten sind eine humane, Leukämietransformierte T -Zeil-Linie). Wiederholung der Prüfung mit Fluoreszenz-Markierung wie beim CMV- Versuch. Vgl. oben 4.1

VIRUZIDE WIRKUNG des ß-SITOSTERYL-ARA CHIDA TES

(als MARIGENOL®-KONZENTRA T formuliert)

KONTROLLEN : KONZENTRATION KONZENTRATION KONZENTRATION Anzahl der MIKROEMULSION MIKROEMULSION MIKROEMULSION infizierten Zellen 1 : 1 *000 1 : 10*000 1 :100*000

38 0 0 20

Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, U niversitä degli Studi di Torino. Juli und November/Dezember1995.

4.3 Hepatitis-B Virus (HBV)

Die Tests wurden mit immortalisierten Leberhämatom-Zellen vorgenommen , die nach Infektion mit dem Hepatitis-B Virus die beiden Antigene Hbs Ag (ein "surface antigen" aus der äusseren Hülle des Virus) und Hbe Ag (ein "core antigen" aus dem Kern des DNA Virus) sezernieren. Orientierende Versuche in-vitro wurden mit je einem 1 %-igen Konzentrat der drei Prüfsubstanzen ß- Sitosteryl-Palmitat, ß-Sitosteryl-Arachidat und Ergosteryl-Isovalerat von Prof. Dott. Antonio Ponzetto und von Dotta Rossana Cavallo, Universitä di Torino, durchgeführt .

Bei einer Verdün nung von 10^' und I nkubation über 72h zeigte bislang das ß- Sitosteryl-Palmitat Konzentrat die stärkste Wirksamkeit. Die Ergebnisse sind deutlich Dosis-abhängig und variieren auch mit der Inkubationszeit. Besonders ausgeprägt tritt die Wirkung beim Oberfiächen-Antigen Hbs Ag in Erscheinung. HEPATITIS-B

Sezernierte Antigene

PRÄPARAT Hbs Ag Hbe Ag

KONTROLLEN in Medium 1 :4 17.97 pos. 1 8.707 pos. Titerbestimmung ß-SITOSTERYL-PALMITAT 1 .47 neg. 1 .777 neg. ß-SITOSTERYL-ARACHIDAT 3.76 pos. 3.935 pos.

ERGOSTERYL-ISOVALERAT 5.78 pos. 6.27 pos.

5.0 Analytischer Nachweis

5.1 Identifikation von Flavonoid-Ester-Wirksubstanz

Kapillarzonen-Elektrophorese mit einem Gerät P/ACE 2100 von Beckman Instruments, bzw. einem BioFocus Integrator von BIO-RAD Laboratories. Bedingungen: Puffer pH = 9.0 Na-tetra-Borat; 50 mM SDS

Injektion: 20 psi*sec. Run 15 kV, Messung bei 192 nm Der Wirksubstanz-Peak erscheint nach ca. 5 Minuten. Sehr hohe Auflösung

5.2 Identifikation der Konzentrat-Mizellen in der wässerigen Mikroemul- sion/bzw. im gereinigten und hochzentrifugierten Überstand des Zellplasmas der Tumorzellen .

Gleiche Methodik wie 5.1.

Der charakteristische Peak erscheint nach ca. 5 Minuten.

5.3 Nachweis der Membran-Penetration an der Tumorzelle

Am Lichtm ikroskop (wie auch am Elektronenmikroskop) lässt sich aufzeigen , dass wenige Stunden nach der Inkubation (Beispiel Py6-Zellen = Polyoma- Virus transformierte 3T3-Mausfibroblasten; dünn ausgesät, mittlere Verdünnung der Wirkstoff-Konzentrate) sich ein Kranz von Vakuolen um den Zellkern herum ausbildet. Als Markiersubstanz kann dem Konzentrat eine kleine Menge Caπthaxanthin beigegeben werden, das eine deutliche Fluoreszenz besitzt. Es eignen sich auch Phenosafranin, Tinopal® GS oder Uvitex® CF, bzw. EBF. Der analytische Nachweis, dass diese Vakuolen die Flavonoidester als Wirksubstanz enthalten, erfolgt ebenfalls mittels mizellarer Kapillar-Zonen-Elek- trophorese "MECC", (Beckman I nstruments, P/ACE System 2100 oder dem Bio Focus I ntegrator von Bio-Rad). Vgl. im übrigen : Koji Otsuka et al. : "Separation of iipophile compounds by micellar electrokinetic chromatography with organic modifiers", Electropho- resis, 1994, 15, 1280-83 (VCH Verlagsgesel lschaft mbH , Weinheim).

6.0 Allgemeine Verträglichkeit der MARIGENOL®-Präparate

A USWIRKUNG auf das BLUTBILD

TOXIZITÄT von MARIGENOL®-KONZENTRATEN an der BALB/c-Maus

%-Anteil der Blutkörperchen

Präparat L M N E B

G 17 10-7 70 ± 6 1 1 + 3 13 ± 4 6 + 4 0 10-5 77 ± 6 6 ± 3 1 1 ± 4 5 + 4 1 ± 1 10-3 69 + 10 7 + 5 22 ± 8 2 ± 2 0

G 41 10-7 77 ± 6 6 ± 3 1 3 ± 5 3 ± 3 0 10-5 78 ± 4 10 ± 2 10 ± 4 1 + 1 1 ± 1 10-3 80 + 6 8 ± 2 10 ± 6 12 ± 1 0

G 44 10-7 74 ± 17 10 ± 1 20 ± 9 1 ± 1 0 10-5 74 ± 6 9 + 4 14 ± 7 4 ± 3 0 10-3 76 ± 5 6 ± 4 16 ± 8 2 ± 1 0

G 55 1 0-7 78 ± 4 10 ± 4 10 + 4 2 + 1 0 10-5 69 + 10 11 + 3 18 ± 4 1 ± 1 0 10-3 77 + 5 6 ± 4 14 + 2 2 + 1 1 ± 1

KONTROLLEN 76 ± 5 8 ± 2 15 ± 4 1 ± 1 0 (Phys. Puffer)

G 17 2%-Konzentrat mit C_{5 0}-CHOLESTERYL-ESTER

(Cholesteryl-iso-Valerat)

G 41 2%-Konzentrat mit C_{1 1 :1}-ERGOSTERYL-ESTER

(Ergosteryl-10-Undecenoat)

G 44 2%-Konzentrat mit C_{1 8 :2}-CHOLECALCIFERYL-ESTER

(C_{1 8 :2}-D₃ ; Vitamin-D₃-Linolat)

G 55 2%-Konzentrat mit C_{4: 1} -CHOLECALCIFERYL-ESTER

(C _{: 1} -D₃ ; Vitamin-D₃-Crotonat)

Verdünnungen: 10-7 = o,1 ppm Konzentrat; 0,002 ppm Wirksubstanz

10-5 = 10 ppm Konzentrat; 0,200 ppm Wirksubstanz 10-3 = 1 O00 ppm Konzentrat; 20,000 ppm Wirksubstanz (auf die wässerige Mikroemu lsion berechnet)

Legende :

L = Lymphocyten

M = Monocyten (Makrophagen )

N = Neutrophile Granulocyten

E = Eosinophile Granulocyten

B = Basophile Granulocyten

Durchführung der Proben : Prof. Dott. G uido FORNI, Dotta Stefania VAI, Universitä degl i Stud i d i Torino, Dipartimento d i Scienze Cliniche e Biolo- giche, Ospedale San Luigi Gonzaga, 1-10^*043 ORBASSANO (TO), August/ September 1993.

Test mit normalen 8-wöchigen weiblichen BALB/c nAncr (H-2d)-Mäusen, geliefert von Charles River Laboratories, Calco (Italien ). Während 4 Wochen täglich zweimalige Injektion i .v. von je 0,250 ml wässriger Mikroemulsion, gebildet aus den angegebenen Konzentraten, bzw. mit physiologischem Puffer für die Kontrollen. Färbung mit May Grünwald-Giemsa.

Zeit der Behandlung : 28 Tg .

Blutanalyse: nach der letzten Injektion

Anzahl Tiere: 1 3 Gruppen zu 5 je Tieren

RESULTAT: Es treten keine signifikanten Unterschiede auf zu den Kontrollen. Es konnte keine Toxizität der Konzentrate auf die Leukozyten-Population festgestellt werden. Auch die Erythrozyten-Population zeigte normale Werte. Alle Tiere waren und blieben gesund bis zum Schluss der Versuche. 6.1 UNTERSUCHUNG des BLUTBILDES

Auswirkung der MARIGENOLΘ-KONZENTRATE auf normale humane Lymphomonocyten

Zellen: normale humane phagozytische weisse Blutzellen

(Macrophagen); 2 x 105 Zellen pro well

Stimulation der Kontrollen: 1 % PHA (Phytohemagglutinin)

PRÄPARAT VERDÜNNUNG TEST 1 TEST 2 TEST 3 cpm cpm cpm

KONTROLLEN 2682 3386 3386

PHA 1% (stimuliert) 80^*981 61 ^*966 61 *966

KONZEN10-1 1076 3826 3936

TRATE als 10-2 1396 3726 3845 wässrige 10-3 1431 2141 2939

MIKROEMUL¬

SIONEN 10-4 1386 3221 2752

10-5 1656 2888 3093

10-6 2536 2105 3046

Test 1 2%-Konzentrat enthaltend Cι_2:o-Cholesteryl Ester Test 2 2%-Konzentrat enthaltend Cι _{6 :}o-Ergosteryl Ester Test 3 2%-Konzentrat enthaltend C_ε:0-Cholecalciferyl Ester (Vitamin D₃-iso-Valerat)

Tests durchgeführt von Dottoressa Anna Rita GUARINI, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica, 1-10^*126 TORINO, 21. bis 24. März 1994.

7.0 Antiparasitäre Wirkung

Schweizerisches Tropeninstitut, Basel In-vitro Versuche, WHO-screening as SOP

Parasite Strain Stage Standard Test N"

T.b.rhodesiense STIB 900 trypomastigotes Melarsoprol T961 1

L.donovani MHOM-ET- amastigotes Pentostam L9604/05 67/L82

T.cruzi MHOM/Br/00/Y trypomastigotes Benznidazol C0606/08

Alle Werte : μg/ml Legende* r = active on T.b.rhodesiense d = active on L. donovani t = cytotoxic on mammaiian cells c = active on T. cruzi - = inactive or low activity

MIC = minimum inhibitory concentration ICβo = 50% killing rate concentration

T.b. rhodesiense T. cruzi L. Cytotoxicity Test donovani score *

TDR-Code L-6 Macroph r.d.c.

MIC IC.0 MIC ICβo MIC MIC t.-,

Standards 0.011 0.0004 3.7 30 >100 >90

EP1 100 . 100 20 >100 90 d

EP2 100 - 100 20 >100 90 d

EP4 100 - 100 20 >100 90 d

EP5 100 - 100 <30 100 90 d

EP10 100 100 <30 100 90 d

EP17 100 - 100 20 >100 90 d

EP19 100 - 100 20 >100 90 d

4 N 33 17 100 20 >100 >90 d

7N 11 6,9 33 8 100 90 d

T1 >100 18,0 100 <30 100 90 d

T5 100 17 100 6 100 90 d

T6 100 17 100 <30 100 90 d

T7 100 16 100 <30 100 90 d

T9 100 16 100 <30 100 90 d

T10 100 16 100 <30 100 90 d

T11 100 18 100 <30 100 90 d

T12 100 20 <30 90 d

EP 1 1 %-Konzentrat CHOLESTANYL-ISOVALERAT

EP 2 1 %-Konzentrat CHOLESTANYL-10-UNDECENOAT

EP 4 1% -Konzentrat CHOLESTERYL-n-VALERAT

EP 5 1 %-Konzentrat CHOLESTERYL-LAURAT

EP 10 1%-Konzentrat p-SITOSTERYL-BEHENAT

EP 17 1%-Konzentrat VITAMIN Dj-UNDECENOAT

EP 19 1 %-Konzentrat VITAMIN Dj-OLEAT

4N 1 %-Konzentrat QUERCETIN-OCTALAUROYL-GLUCOSID

7N 1 %-Konzentrat Z-Gly-Phe-VITAMIN D₃-ESTER

T1 1 %-Konzentrat COEMULGATOR + TENSIDE

T5 1 %-Konzentrat 14-OH-10-DEACETYLBACCATIN-III T6 1 %-Konzentrat 3,28-LAUROYL-BACCATIN-ll l

T7 1 %-Konzentrat QUERCETIN-PENTALAURAT

T9 1 %-Konzentrat DECALAUROYL-RUTINOSID

T10 1 %-Konzentrat ß -SITOSTERYL-PALMITAT

T11 1 %-Konzentrat ß-SITOSTERYL-ARACHIDAT

T12 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-LAURAT

Die Versuche wurden unter der Leitung von Prof. Dr. Ronald Kaminsky von Frau Yvonne Grether durchgeführt.

Ergebnis : eine beachtliche antiparasitäre Wirkung zeigte sich mit ausgewählten Cholestanyl- and Bioflavonoidester-Konzentraten, wie auch mit dem Z- Gly-Phe-D₃-ester Konzentrat. Die Tests wurden bei einer Konzentration durchgeführt, welc he keine basale Zytotoxizität bei murinen Muskelzellen oder bei Macrophagen hervorruft. Die Wirkung ist spezifisch gegen Leishmania donovan i.

Claims

PA TE N TA N S PR Ü C H E

1. Spontan dispergierbares Konzentrat, welches mit Wasser, mit 5%-iger

Glucoselösung oder mit Ringerlösung verdünnt, thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergibt, die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass es pharmazeutisch verwendbar ist und aus folgenden Bestandteile besteht: 0,1 bis 5 Gewichts-% einzelner oder mehrerer Ester von ausgewählten Bioflavonoid-Verbindungen laut den Formeln (I) bis (IV), bzw. einer Kombination solcher Wirkstoffe:

R = OH, OCH₃,

R = OH, OCH3,

R = OH, OCH₃, wobei in den Formeln (I) bis (IV) R für Hydroxyl, eine C₆-₃₁ -Alkyl-, eine C₉.31 -

Alkenyl- oder eine Cg.₃i -Alkapolyengruppe steht,

5 bis 25 Gewichts-% eines als Coemulgator dienenden, pharmaverträglichen

Lösungsvermittlers oder Lösungsmittelgemisches,

5 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidgemi- sches, und wahlweise

0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins,

0 bis 10 Gewichts-% eines Stabilisators, Radikalfängers oder Penetrations- verbesserers .

2. Pharmazeutisch verwendbares Kombinationspräparat, das aus 90 Gewichts-% des spontan dispergierbaren Konzentrates gemäss Anspruch 1 und 10 Gewichts-% pharmaverträglichen Zuschlag- oder Trägerstoffen und/oder Lösungsvermitteln besteht.

3. Spontan dispergierbares Konzentrat, enthaltend eine oder mehrere Verbindungen der Formeln (I) bis (IV) gemäss Anspruch 1 , als Mittel zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates hoher Bioverfügbarkeit und mit Wirksamkeit gegen Tumore, Ekzeme und Psoriasis, sowie zur verstärkten Aufnahme von exogenen Aktivatoren, metabolischen Modulatoren und Regulatoren.

4. Spontan d ispergierbares Konzentrat, enthaltend eine oder mehrere Verbindungen der Formeln (I) bis (IV) gemäss Anspruch 1 , als Mittel zur Herstellung ei nes pharmazeutischen Präparates m it antiviraler, viruzider oder antiparasitärer Wirksam keit.

5. Spontan dispergierbares Konzentrat gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Bestandteile enthält:

0,5 bis 5 Gewichts-% eines oder mehrerer Ester von Bioflavonoid-Verbindungen der Formeln (I) bis (IV), 0 bis 5 Gewichts-% eines Good-Puffers,

5 bis 25 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalm itat, Neutralöl (Oleum neutrale), und/oder eines oder mehrerer biotensider Terpinylester der allgemeinen Formel (VI) : 2 3

R— COO— R _(V|) worin R² eine C₆-₃i -Alkyl-, eine C_β.₃₁ -Alkenyl- oder eine C₉.₃ι -Alkapolyen- gruppe ist und R³ Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeutet,

0 bis 45 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Phosphorsäureester-Tensides,

5 bis 90 Gewichts-% des wasserfreien tert. Octylphenylpolyoxyethylenether- Tensids mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen und/oder Polyoxyethylen-Sorbitan- Monolaurat.

6. Spontan dispergierbares Konzentrat gemäss Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Bestandteile umfasst:

0,5 bis 5 Gewichts-% eines oder mehrerer Ester von Bioflavonoid-Verbindungen der Formeln (I) bis (IV),

5 bis 25 Gewichts-% eines oder mehrerer biotensider Terpinylester der allgemeinen Formel (VI) :

R— COO— R ³ _(V|) worin R² eine C₆-₃i -Alkyl-, eine Cg.₃i -Alkenyl- oder eine C₉.₃i -Alkapoiyen- gruppe ist und R³ Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeutet, bis zu 10 Gewichts-% DL- -Tocopheryl-10-undecenoat oder DL-α-Tocopheryl- laurat, bis zu 25 Gewichts-% Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat, bis zu 45 Gewichts-% des wasserfreien tert. Octyl phenylpolyoxyethylenether

Tensids mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen,

35 bis 45 Gewichts-% ei nes Alkylphenolpolyglykolether Phosphat-Tensides oder des praktisch wasserfreien Tristyrylphenol-polyoxyethylen-18-phos- phorsäureestertriethanolaminsalz Tensides.

7. Therapeutisches Systempräparat, das bis zu 90 Gewichts-% aus dem spontan dispergierbaren Konzentrat gemäss einem der Ansprüche 1 , 2, 5 oder 6, sowie zu mindestens 10 Gewichts-% aus pharmaverträglichen Trägerstoffen , Zusatzstoffen und/oder einem Lösungsvermittler hergestellt ist und das in Dosis-Einheitsform als Micropellets, Granulat, Dragees, Supposi- torien, Ampullen oder Kapseln vorliegt.

8. Therapeutisches Systempräparat gemäss Anspruch 7, welches 64 Teile Kernmaterial für die Granulat-, oder Pellet-Bildung und 36 Teile des spontan dispergierbaren Konzentrates gemäss einem der Ansprüche 1 , 2, 5 oder 6 enthält und i n pharmazeutisch geeig nete Kapsein aus Hydroxylpropyl- Methylcellulose-Acetat-Succinat abgefüllt ist.

9. Ein Ester von Bioflavonoid-Verbindungen der Formeln (I) bis (IV) :

R = OH, OCH₃,

(II)

R = OH ,

R = OH, OCH3,

R = OH, OCH3, wobei i n den Formeln (I) bis (IV) R für eine C₆.₃₁ -Alkyl-, eine C₉.₃₁ -Alkenyl- oder eine C₉-₃i -Alkapolyengruppe steht.

10. Ein Verfahren zur Herstellung von Estern von Bioflavonoid-Verbindungen der Formeln (I) bis (IV) gemäss Anspruch 9, dadurch beschrieben , dass man eine Verbind ung der Formel (V) :

R ¹ COOH _(V) worin R¹ eine C₆.₃ι -Al kyl-, eine C₉.₃ι -Alkenyl- oder eine C₉.₃₁ -Alkapolyen- gruppe ist, mit einem Chlorierungsmittel umsetzt und anschliessend das entstandene Produ kt mit einer Verbindung der Formeln (I) bis (IV) verestert.

11 . Die Verwendung eines spontan dispergierbaren Konzentrates gemäss einem der Ansprüche 1 , 2, 5 oder 6 zur Herstellu ng eines Heilmittels mit prophylaktischer und therapeutischer Wirksamkeit gegen virale oder parasitäre Erkran kungen , gegen Tumore, Psoriasis und Ekzeme und zur verstärkten Aufnahme exogener Aktivatoren, metabolischer Modulatoren und Regulatoren.