DK174400B1 - Acylderivater af deoxyribonucleosider og farmaceutiske præparater indeholdende disse - Google Patents
Acylderivater af deoxyribonucleosider og farmaceutiske præparater indeholdende disse Download PDFInfo
- Publication number
- DK174400B1 DK174400B1 DK198903180A DK318089A DK174400B1 DK 174400 B1 DK174400 B1 DK 174400B1 DK 198903180 A DK198903180 A DK 198903180A DK 318089 A DK318089 A DK 318089A DK 174400 B1 DK174400 B1 DK 174400B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- acid
- acyl
- carbon atoms
- derivatives
- deoxyribonucleosides
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
- A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
- A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
- A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
- A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
- A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
- A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
- A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
- A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
- A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
- A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
- A61K31/708—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid having oxo groups directly attached to the purine ring system, e.g. guanosine, guanylic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
DK 174400 B1 i
OPFINDELSENS OMRADE
Denne opfindelse angår acylderivater af deoxyribonucleosider og anvendelsen af disse derivater til levering af exogene deoxyribonucleosider til dyrisk væv.
Mere specifikt angår opfindelsen acylderivaterne af 2'-deoxyadenosin, 2'-5 deoxyguanosin, 2'-deoxycytidin og 2'-deoxythymidin som kan anvendes til at levere deoxyribonucleosider til dyrisk væv og derved understøtte cellulære metaboliske funktioner. Endnu mere specifikt angår opfindelsen farmaceutiske præparater indeholdende de nye acylderivater hvilke præparater er egnet til behandling eller forhindring af en række forskellige af fysiologiske og patologiske 10 tilstande i cellevæv, herunder beskadigelse ved stråling, sollys, mutagener, sår og andre tilstande.
OPFINDELSENS BAGGRUND
Der er fundamentalt to mulige kemiske eller biokemiske metoder til dæmpning 15 af de skadelige virkninger af ioniserende stråling på organismer: (1) dæmpning af den oprindelige beskadigelse af biologiske strukturer, og (2) forbedring eller fremskyndelse af helbredelse.
Der kendes et antal forbindelser, som giver nogen beskyttelse mod ioniserende stråling, når de er tilstede i legemet under bestråling. Sådanne forbindelser er 20 typisk antioxidanter eller forbindelser, der fjerner frie radikaler og inaktiverer reaktive kemiske forbindelser dannet under bestråling inden disse kan beskadige vigtige biologiske strukturer. Fremtrædende eksempler på radioprotektive forbindelser omfatter cysteamin, 2-3-aminoethyl-isothiouronium-Br-HBr (AET) og S-2-(3-aminopropylamino)ethyl-phosphorthionsyre (WR-2721). Da disse forbin-25 delser skal indføres i organismen før eller under bestråling er de naturligvis ikke nyttige i situationer hvor påvirkningen er uventet eller skyldes et uheld. Endvidere er disse forbindelser toxiske for mennesker.
De vigtigste muligheder for effektiv kemisk terapi i organismer, hvor bestråling allerede har fundet sted, er: 30 (1) at fremskynde regenering og restituering af individuelle celler i organis men, eller DK 174400 B1 2 (2) at fremskynde eller forøge proliferation og/eller differentiation af overlevende stamceller.
Knoglemarv og intestinalt epithel er blandt de væv der er mest følsomme for strålingsbeskadigelse; forsøg på at fremme restituering efter bestråling må fo-5 kusere på stamcellerne i disse væv.
Der eksisterer adskillige midler, som kan forbedre overlevelsen af bestrålede pattedyr ved administrering efter bestråling. Disse omfatter det gærfremstillede polysaccharid glucan, og polypeptid-cytokiner, såsom interleukin-1, granulocyt-koloni-stimulerende-faktor og granulocyt/makrofag-koloni-stimulerende faktor; 10 alle disse midler forbedrer knoglemarvstamcelle-formering eller -differentiering. Imidlertid er deres virkning beskeden med frembringelse af dosisreduktionsfaktorer mindre end 1,1 ved administrering efter at bestråling allerede har fundet sted, og deres anvendelse kompliceres af bivirkninger. Endvidere er de alle makromolekyler, som kun kan administreres parenteralt.
15 Der eksisterer et behov for forbindelser, som effektivt fremmer restituering ved administrering efter udsættelse for ioniserende bestråling, og som har vigtige farmaceutiske kvaliteter, såsom ikke-toxicitet og aktivitet efter oral administrering. Sådanne midler ville være nyttige i tilfælde af udsættelse for ioniserende stråling ved uheld, og også i forbindelse med strålingsterapi for cancer, med 20 henblik på at fremme restituering af normalt væv efter bestråling. Sådanne midler kan også forbedre restituering efter visse former for kemisk beskadigelse, f.eks. knoglemarvsbeskadigelse efter udsættelse ved uheld eller terapeutisk for forbindelser som cyclophosphamid eller busulfan, som begge anvendes i cancerkemoterapi.
25 Det er påvist, at administrering af exogen deoxyribonucleinsyre (DNA) til forsøgsdyr efter udsættelse for ioniserende bestråling kan resultere i forbedret overlevelse og funktionel restituering. Kanazir et al., Bull. Inst. Nuc. Sci. "Boris Kidrich" 9:145 (1959); Wilczok, T„ et al., Int. J. Rad. Biol. 9:201-211 (1965),
Golba, S., et al., Int. J. Rad. Biol. 13:261-268 (1967), US patentskrift nr.
30 3 803 116.
Studier af cellekulturer in vitro tyder på, at de faktiske restaurerende midler er deoxyribonucleosider, de enzymatiske nedbrydningsprodukter af DNA. Petrovic, DK 174400 B1 3 D. et al., Int. J. Rad. Biol. 18:243-258 (1970). Imidlertid var depolymeriseret DNA eller deoxyribonucleosider administreret til dyr ineffektive til fremme af overlevelse eller restituering efter bestråling. Kanazir et al., Bull. Inst Nuc. Set. "Boris Kidrich" 9:145-153 (1959). Der er grund til at antage at denne tilsynela-5 dende modsigelse skyldes den hurtige katabolisme af deoxyribonucleosider in vivo af enzymerne i plasma og forskellige organer. Efter administrering af deoxyribonucleosider til gnavere udsættes vævene således for effektive koncentrationer i mindre end 5 minutter. Beltz et al., Bioch. Biophys. Acta 297:258-267 (1973). I cellekulturer, fandtes optimal overlevelse efter bestråling når deoxyri-10 bonucleosider var tilstede i dyrkningsmediet i mindst 3 timer. Når DNA administreres parenteralt, depolymeriseres det muligvis gradvis resulterende i en langvarig frigivelse af frie deoxyribonucleosider til cirkulation.
Der kan forekomme andre fysiologiske eller patologiske tilstande i pattedyrsvæv, hvor forsyning med exogene deoxyribonucleosider kan have terapeu-15 tiske anvendelser. Newman et al., Am. J. Physiol. 164:251-253 (1951), beskriver en undersøgelse af rotter underkastet partiel hepatektomi. Forløbet af leverregenerering fulgtes i 11 dage. Levere fra rotter behandlet med DNA regenererede signifikant hurtigere end levere fra ubehandlede dyr. Det er sandsynligt at deoxyribonucleosider var de faktiske aktive midler i dette forsøg, idet DNA er et 20 stort molekyle, som ikke optages effektivt af pattedyrceller. Ligeledes har DNA anvendt på dermale sår vist sig at accelerere visse dele af helingsprocessen, f.eks. dannelse af granulationsvæv: Dumont, Ann. Surg. 150:799-807 (1959); Marshak et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 58:62-63 (1945); Nicolau et al., Der Hautartzt 17:512-515 (1966). Yane and Kitano, US Patentskrift nr. 4 656 896, 25 beskriver indikationen for gunstige virkninger af parenteralt administreret DNA i behandlingen af mavesår hos rotter.
I disse eksempler er det sandsynligt, at virkningen af DNA skyldtes dets gradvise nedbrydning resulterende i frigørelse af deoxyribonucleosider over en forlænget periode. DNA er imidlertid ikke et egnet farmaceutisk middel at admini-30 strere til mennesker, hverken oralt eller parenteralt. I tilfælde af oral administrering vil nucleosider frigjort fra DNA hovedsageligt blive nedbrudt af enzymer i tarmhulrummet, i tarmvæggene, i plasma og i leveren, fremfor at være tilgængelige for vævene. Problemer med parenteralt administreret DNA omfatter mulig antigenicitet (forværret af vedhæftende proteiner, som er vanskelige at fjerne 4 DK 174400 B1 under ekstraktionen), uensartethed af charger og mulige uønskede virkninger, som er uden forbindelse med nucleosidfrigørelse, f.eks. forøgelse af interferonfrigørelse fra lymphocyter, som er en kendt effekt af dobbeltstrenget nucleinsy-re.
5 Administrering af deoxyribonucleosider har hidtil været anvendt til afbødning af tydelige mangler på deoxyribonucleosider (f.eks. thymidin-administrering for at afbøde toxicitet forårsaget af methotrexat, et antineoplastisk middel som inhibe-rer thymidinnucleotidbiosyntese, administrering af deoxycytidin for at afbøde arabinosylcytosin-toxicitet, eller hos personer med mangel på specifikke enzy-10 mer (f.eks. purinnucleosidphosphorylase) som til sidst resulterer i nedsat deoxy-ribonucleotidsyntese). Thymidinadministrering har også været overvejet som en antineoplastisk behandling, idet thymidin i høje koncentrationer har cytostatiske eller cytotoxiske egenskaber.
Imidlertid vedrører den foreliggende opfindelse erkendelsen af, at uventet gun-15 stige virkninger kan opnås efter administrering af suprafysiologiske mængder af blandinger af deoxyribonucleosider på en sådan måde, at de er tilgængelige for vævene i en længere periode, dette mål kan bedst nås ved anvendelse af de omhandlede deoxyribonucleosidederivater. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
OPFINDELSENS FORMAL
2
Skønt strategien med at levere DNA og/eller deoxyribonucleosider til fysiologisk 3 eller patologisk beskadiget væv er erkendt, har der hidtil manglet tilfredsstillen 4 de metoder til at indføre deoxyribonucleosider i tilstrækkelig høje og pålidelige 5 mængder in vivo til vellykket behandling af de patologiske og fysiologiske til- 6 stande og til at fremme cellulære regenerering og overlevelse af dyret. Skønt 7 adskillige forbindelser er udviklet, som beskytter dyr mod nogle virkninger af io 8 niserende stråling eller kemiske mutagener, har deoxyribonucleosider leveret til 9 vævene i et tilstrækkeligt tidsrum det største kliniske potentiale for behandling 10 af sådan beskadigelse efter påvirkningen. Klinisk implementering af denne stra- 11 tegi, afventer imidlertid udvikling af tilfredsstillende og hensigtsmæssige metoder til levering af tilstrækkelige mængder deoxyribonucleosider til vævene in vivo. Ligeledes afventer den fundstændige accept og kliniske implementering af DK 174400 B1 5 kapaciteten af deoxyribonucleosider til fremme af sårheling eller vævsregulering udvikling af tilfredsstillende metoder for deres levering til væv in vivo.
Det er således et primært formål med opfindelsen at identificere farmaceutisk acceptable forbindelser, som effektivt kan anvendes til levering af farmakologisk 5 effektive mængder af deoxyribonucleosider eller deres respektive derivater til dyrevæv.
Det er et yderligere formål med opfindelsen at tilvejebringe en familie af deoxy-ribonucleosidderivater, som effektivt kan administreres oralt eller parenteralt, som har minimal toxicitet, og som kan administreres til dyr og mennesker til ef-10 fektiv fremme af cellulær regenerering ved et antal fysiologiske og patologiske tilstande og til fremme af dyrets overlevelse ved administrering efter at udsættelse for stråling har fundet sted.
Det er endnu et yderligere og beslægtet formål med opfindelsen at tilvejebringe visse derivater af 2'-deoxyadenosin, 2'-deoxyguanosin, 2'-deoxycytidin og 2'-15 deoxythymidin som, ved administrering til et dyr, vil levere disse deoxyribonucleosider til dyrevævet.
Det er et beslægtet formål med opfindelsen væsentligt at forbedre biotilgængeligheden af 2'-deoxyadenosin, 2'-deoxyguanosin, 2'-deoxycytidin og 2'-deoxythymidin ved forøgelse af transporten af disse deoxyribonucleosider gen-20 nem fordøjelseskanalen og andre biologiske membraner.
Det er endnu et yderligere og mere specifikt formål med opfindelsen at tilvejebringe en familie af deoxyribonucleosidderivater til behandling af en række forskellige tilstande i lever, knogler, hud og blod, og andre patologiske og fysiologiske tilstande.
25 Det er endnu et yderligere formål med opfindelsen at tilvejebringe deoxyribonucleosidderivater og metoder til anvendelse af disse derivater som er sikre og økonomiske, og som fremskynder de normale cellulære processer til regenerering og heling.
6 DK 174400 B1
SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN
Disse og andre formål med opfindelsen opnås ved administrering af visse acyl-derivater af 2'-deoxyadenosin, 2-deoxyguanosin, 2'-deoxycytidin og 2-deoxythymidin. Disse acylderivater kan anvendes til forhindring eller behandling 5 af strålings-, sollys- og cellulære beskadigelse, til forbedring af sårheling eller restituering af beskadigede væv og til behandling af andre fysiologiske og patologiske vævstilstande.
Skønt der i den kendte teknik beskrives nogle acylerede derivater af deoxyribo-nucleosider, var deres substituenter (f.eks. pivaloat, isobutyrat, benzoat eller io adamantoat) udvalgt efter egenskaber med hensyn til anvendelighed som beskyttelsesgrupper i kemisk syntese (f.eks. af oligonucleotider), og de er ikke generelt acceptable til administrering til dyr. De nye forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse er foretrukne på grund af deres ikke-toxiske substituenter.
Disse udgør en minimal risiko for den organisme hvortil de administreres og kan 15 udvælges til opnåelse af ønskelige farmaceutiske og farmakologiske egenskaber uden alt for meget eksperimentering.
Acylerede derivater af nogle antineoplastiske og antivirale nucleosidanaloger har været udnyttet som "prodrugs" for disse cytotoxiske midler. Imidlertid er meget forskellige biokemiske og fysiologiske problemer involveret i forbedring af 20 det terapeutiske index af toxiske nucleosidanaloger i sammenligning med levering af de ikke-toxiske deoxyribonucleosider i passende mængder og kombinationer til forbedring af vævsrestitution eller regenerering, som i den foreliggende opfindelse.
Et karakteristisk træk ved opfindelsen er erkendelsen af, at acylderivater af 25 deoxyribonucleosider, især når derivater af to eller flere deoxyribonucleosider er kombineret, har uventede terapeutiske egenskaber. Dette fremgår af de data, der vedrører overlevelse af bestrålede mus. Opfindelsen omfatter også nye klasser af derivater som er særlig ønskelige med hensyn til både effektivitet og sikkerhed. 1 I bred forstand tilvejebringer opfindelsen (1) acylderivater af 2'-deoxyadenosin med formlen (I) DK 174400 B1 7 NHR-3 r n
HC^ X. XH
N N
R]0\ ch2„
HC CH
V V
(j:H«CH2 or2 (i) hvori Ri, R2 og R3 er ens eller forskellige og hver er H eller en acylgruppe afledt af 5 (a) en uforgrenet fedtsyre med 3-22 carbonatomer (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, forudsat at R2 ikke er afledt fra leucin, og R3 ikke er afledt fra glycin eller threonin, 10 (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, forudsat at Ri, R2 og R3 ikke alle er H, og hvis R3 ikke er H, kan Ri og/eller R2 også være acetyl, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
(2) acylderivater af 2'-deoxyguanosin med formlen (II) 8 DK 174400 B1
O
HN^ -N
h I II II
R3N-/Cv /CH
Λ Λ N N RiO\ H^CH V i <j:H"CH2 or2 (il) hvori Ri, R2 og R3 er ens eller forskellige og hver er H eller en acylgruppe afledt af 5 (a) en uforgrenet fedtsyre med 3-22 carbonatomer, idet Ri og R2 ikke begge er afledt af N-betulinsyre når R3 er H, (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, 10 (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, forudsat at Ri, R2 og R3 ikke alle er H, og hvis R3 ikke er H, kan Ri og/eller R2 også være acetyl, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
(3) acylderivater af 2'-deoxycytidin med formlen (III) DK 174400 B1 9 NHR-3
/CH
O N
RiO\ I
CH2
i I
HC CH
V 4 yH"CH2 OR2 (III) hvori Ri, R2 og R3 er ens eller forskellige og hver er H eller en acylgruppe afledt af 5 (a) en uforgrenet fedtsyre med 3-22 carbonatomer, (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller 50 |d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, torudsat at R1t R2 og R3 ikke alle er H, og hvis R3 ikke er H, kan Ri og/eller R2 også være acetyl, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
10 DK 174400 B1 (4) acylderivater af 2'-deoxythymidin med formlen (IV)
O
RjljT ^-CH,
/CH
„ Λ O N
RiO\ cn2n HC CH2
V 4 CH-CH
or2 (IV) hvori R2 og R3 er H, og Ri er en acylgruppe afledt af (a) en uforgrenet fedtsyre med 18-22 carbonatomer, 5 (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, 10 og farmaceutisk acceptablet salte deraf.
DK 174400 B1 (5) acylderivater af 2‘-deoxythymidin med formlen (IV) li | R3N^ CH3
JcH
„ Λ O N
Ri CK
o-b HC CH2
V 4 CH*CH
or2 (IV) hvori Ri og R3 er H, og R2 er en acylgruppe afledt af (a) en uforgrenet fedtsyre med 3-13 eller 15-22 carbonatomer, 5 (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, 10 og farmaceutisk acceptable salte deraf.
12 DK 174400 B1 (6) acylderivater af 2'-deoxythymidin med formlen (IV)
O
R3y jpCHj /CH
Λ Λ (T N
Ri CH2 n I /0\ HC CH, V 4 ‘
CH"CH
or2 (IV) hvori R3 er h, og Ri og R2 er ens eller forskellige og hver for sig er en acylgrup-pe afledt af 5 (a) en uforgrenet fedtsyre med 5-22 carbonatomer, (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller 10 (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
(7) acylderivater af 2'-deoxythymidin med formlen (IV) 13 DK 174400 B1 i
Rii \i ~CH'
/CH
„ Λ O N
RlO-\ ΧΗ2λ
i I
HC CH2 V 4
CH*CH
or2 (IV) hvori Ri og R2 er ens eller forskellige og hver for sig er en acylgruppe afledt af (a) en uforgrenet fedtsyre med 2-22 carbonatomer, 5 (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer; 10 forudsat at Ri og R2 ikke begge er valgt fra (a), og R3 er en acylgruppe afledt af nicotinsyre, benzoesyre eller p-aminobenzoesyre, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
14 DK 174400 B1
Opfindelsen omfatter også farmaceutiske præparater indeholdende et eller flere af de omhandlede acylderivater af deoxyribonucleosider sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.
I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen anvendes en blanding af mindst 5 to af de omhandlede acylderivater af 2'-deoxyadenosin, 2'-deoxyguanosin, 2’-deoxycytidin og 2'-deoxythymidin. De nævnte præparater indeholder en effektiv mængde af hver af mindst to forbindelser valgt blandt mindst to af grupperne af forbindelser med formlerne I, II, III og IV som vist ovenfor.
I en anden foretrukken udførelsesform af opfindelsen anvendes et præparat in-10 deholdende en blanding af en effektiv mængde af mindst tre forbindelser valgt blandt mindst tre af grupperne af forbindelser med formlerne l-IV, som er vist ovenfor. I en yderligere foretrukken udførelsesform anvendes et præparat indeholdende en blanding af en effektiv mængde af mindst fire forbindelser valgt blandt mindst fire af grupperne af forbindelser med formlerne l-IV, som er vist 15 ovenfor.
Yderligere væsentlige fordele kan opnås, især når de omhandlede præparater anvendes til bedring af virkninger af stråling, hvis en radioprotektiv forbindelse er inkluderet sammen med et eller flere af acyldeoxyribonucleosiderne. De ra-dioprotektive forbindelser kan være sådanne valgt blandt WR-2721, NAC, DDC, 20 cysteamin, 2-mercaptoethanol, mercaptoethylamindithiothreitol, glutathion, 2-mercaptoethansulfonsyre, WR-1065, nicotinamid, 5-hydroxytryptamin, 2-β-aminoethyl-isothiouronium-Br-HBr, glucaner, GLP/B04, GLP/B05, OK-432,
Biostim, PSK, Lentinan, Schizophyllan, Rhodexman, Levan, Mannozym, MVE-2, MNR, MMz, IL-1, TNF, thymic faktor TF-5, glutathionperoxidase, superoxid-25 dismutase, katalase, glutathionreduktase, glutathiontransferase, selen, CdCI2, MnCh, Zn-acetat, Vitamin A, β-caroten, prostaglandiner, tocopherol, methylen-blåt og PABA.
Desuden kan kendte acetylderivater af 2'-deoxyadenosin, 2'-deoxyguanosin, 2'-deoxycytidin og 2'-deoxythymidin såvel som fedtsyrederivaterne af thymidin, 30 hvori acylgruppen indeholder 3 eller 4 carbonatomer, anvendes i kombination med en eller flere af de nye forbindelser i de omhandlede farmaceutiske præparater. Præparatet kan yderligere omfatte en radioprotektiv forbindelse som be- DK 174400 B1 15 skrevet. Præparaterne kan have form af en væske, en suspension, en tablet, en dragee, en injektionsopløsning, en topisk opløsning eller et suppositorie.
En hudlotion kan med fordel fremstilles ved kombination af en effektiv mængde af et eller flere af acyldeoxyribonucleosiderne ifølge opfindelsen sammen med 5 en egnet bærer. En sådan hudlotion indeholder med fordel fra 0,1 til 5 vægt-% af deoxyribonucleosiderne og om ønsket den radioprotektive forbindelse.
De omhandlede farmaceutiske præparater kan også være indeholdt i bionedbrydelige mikrokapsler, hvorved mikrokapslerne fortrinsvis vælges blandt polya-cetat eller lactat-glycolat-copolymerer.
10 Det antages, at leveringen af exogene deoxyribonucleosider til dyrisk væv kan opnås effektivt ved administrering til dyret af en effektiv mængde af et acylderi-vat af et deox-yribonucleosid med en af formlerne l-V. Ved forøgelse af leveringen af exogene deoxyribonucleosider, og derved forøgelse af deres biotilgængelighed kan det være muligt at behandle fysiologiske eller patologiske tilstande 15 i dyrets væv, i det væsentlige ved at støtte nogle af dets metaboliske funktioner. Uden dog at være bundet af teorien er det muligt, at opfindelsen også vil fungere ved forøgelse af biotilgængeligheden af nucleosidanaboliter, f.eks. nucleoti-der eller nucleotidafledte cofaktorer. Administrering af nucleosider per se forøger deres biotilgængelighed men, som følge af hurtig ektracellulær katabolis-20 me, behøver dette ikke at resultere i langvarig forhøjelse af de cellulære nucleo-tidniveauer. Ved lavere nucleosidniveauer er der hurtig optagelse og udnyttelse i cellerne, mens der ved højere niveauer sker mætning, og overskuddet nedbrydes. Opfindelsen antages af fungere ved levering af en vedvarende forsyning af nucleosid i lavere niveauer.
25 De specifikke betingelser, hvorved der kan opnås fordele ved anvendelse af forbindelserne, præparaterne og fremgangsmåderne ifølge opfindelsen omfatter situationer hvor forbedring af DNA, restituering eller forbedring af stamcellediffe-rentiering og proliferation er nyttige. Sådanne betingelser omfatter især: (1) behandling eller forebyggelse af beskadigelse som følge af ioniserende eller ultra-30 violet bestråling; (2) forbedret restaurering af hematopoieses i tilfælde af formindsket knoglemarvsfunktion som følge af ioniserende stråling, kemisk beskadigelse (f.eks. bivirkninger af anticancer- eller antiviral-behandlinger) eller sygdomme, og (3) fremskyndelse af regenerering og restituering af forskellige be- 16 DK 174400 B1 skadigede væv, f.eks. i heling af sår og forbrændinger, eller til fremme af regenerering af beskadigede levervæv. Til behandling af alle disse tilstande administreres en omhandlet forbindelse, med eller uden yderligere bærere, radiopro-tektive forbindelser og andre adjuvanser til et dyr, især et menneske.
5 Administrering af de acylerede derivater indebærer visse fordele i sammenligning med de ikke-derivatiserede forbindelser. Acylsubstituenterne kan udvælges til forøgelse af I i poph i I iciteten af nucleosidet og forbedrer således dets transport fra fordøjelseskanalen ind i blodstrømmen. De acylerede derivater er effektive, når de administreres oralt og kan applikeres topisk i nogle situationer.
10 De acylerede derivater er resistente mod katabolisme med nucleosiddeamina-ser og nucleosid-phosphorylaser i tarmen, leveren, andre organer og blod-strømmen. Således tillader administrering af de acylerede derivater ifølge opfindelsen enten oralt, parenteralt eller topisk langvarig levering af ønskelige kombinationer og mængder af deoxyribonucleosider til dyrisk væv, idet acyl- 15 substituenterne fjernes gradvis af enzymer (esteraser og peptidaser) i plasma og væv, hvilket frigør frie deoxyribonucleosider over et tidsrum.
BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE
Fig. 1 er en kurve, der illustrerer nedbrydningshastighederne for deoxyribo- 20 nucleosider i plasma. De følgende forkortelser er anvendt: dT = 2'-deoxythymidin dC = 2’-deoxycytidin dG = 2'-deoxyguanosin dA = 2'-deoxyadenosin 25 Fig. 2 er kurver, der illustrerer den hurtige katabolisme af deoxyadenosin og den gradvise deacylering af adenosinderivater (til dannelse af deoxyadenosin) i plasma.
Fig. 3 er kurver, der illustrerer den hurtige katabolisme af deoxyadenosinderiva-ter til dannelse af deoxyadenosin) i leverekstrakt.
30 Fig. 4 er kurver, der illustrerer plasma-thymidin-koncentrationer efter oral administrering af thymidin eller di-O-acetylthymidin til rotter.
DK 174400 B1 17
BESKRIVELSE AF DE FORETRUKNE UDFØRELSESFORMER
En "metabolit" er en kemisk forbindelse, som er dannet ved, eller deltager i, en metabolisk reaktion. I forbindelse med den foreliggende opfindelse omfatter me-taboliter ikke blot carboxylsyrer, som vides at blive syntetiseret i det menneske* 5 lige legeme, men også naturligt optrædende (men muligvis syntetiserede snarere end ekstraherede) carboxylsyrer, som måtte være afledt fra andre dyre- eller plantekilder. De begrænsende kriterier er, at forbindelsen skal være i det væsentlige ikke-toxisk og biokomptatibel, og at den let skal indgå i metaboliske synteseveje in vivo, således at den viser i det væsentlige ingen toxicitet under 10 langvarigt forbrug i de foreslåede doser. Det foretrækkes, at forbindelserne me-taboliseres snarere end ekstraheres intakt (eller konjugeret ved detoxiticerings-reaktioner), da koncentrationen af carboxylsyrer i nyren kan føre til uønsket høj aciditet. Derfor er carboxylsyrer, som normalt eller let deltager i den intermediæ-re, kataboliske eller anaboliske metabolisme foretrukne substituenter.
15 Udtrykket "farmaceutisk acceptable salte" betyder salte med farmaceutisk acc-petable syreadditionssalte af deoxyribonucleosidderivaterne, som omfatter, men ikke er begrænset til svovlsyre, saltsyre eller phorphorsyre.
Udtrykket "coadministreret" betyder, at mindst to af de acylerede derivater ifølge opfindelsen administreres indenfor en tidsramme, hvori de respektive perioder 20 af farmakologisk aktivitet overlapper.
"Acylderivater" betyder derivater af et 2'-deoxynbonucleosid, hvori en i det væsentlige ikke-toxisk organisk acylsubstituent afledt af en carboxylsyre er forbundet til en eller flere af de frie hydroxylgrupper i ribosedelen i deoxyribonucleosi-det med en esterbinding og/eller hvori en sådan substituent er forbundet til en 25 primær eller sekundær amin i pyrimidinringen i deoxycytidin eller deoxythymi-din, eller i purinringen i deoxyadenosin eller deoxyguanosin med en amidbinding. Sådanne acylsubstituenter er afledt af carboxylsyrer, som omfatter, men ikke er begrænset til forbindelser valgt blandt mælkesyre, en aminosyre, en fedtsyre, nicotinsyre, dicarboxylsyrer, p-aminobenzoesyre og orotsyre. Fortruk-30 ne acylsubstituenter er forbindelser, som normalt er tilstede i legemet, enten som fødebestanddele eller som intermediære metaboliter, som er i det væsentlige ikke-toxiske når de fraspaltes fra deoxyribonucleosidet in vivo.
18 DK 174400 B1 "Aminosyrer" omfatter, men er ikke begrænset til glycin, L-formeme af alanin, valin, leucin, isoleucin, phenylalanin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threo-nin, cystein, cystin, methionin, tryptophan, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidln, ornithin. hydroxylysin, carnitin og andre naturligt forekommende 5 aminosyrer.
"Fedtsyrer" er alifatiske carboxylsyrer med 2-22 carbonatomer. Sådanne fedtsyrer kan være mættede, delvis mættede eller polyumættede.
"Dicarboxylsyrer" er fedtsyrer med en anden carboxylsyresubstituent.
Foretrukne acylderivater er 2-deoxyribonucleosider til forøgelse af transporten 10 gennem biologiske membraner er sådanne, som er mere lipophile end stam-nucleosiderne. Generelt har lipophile acylnucleosidderivater acylsubstituenter, som er upolære (bortset fra carboxylatgruppen). Lipophile acylsubstituenter omfatter især grupper afledt af fedtsyrer indeholdende 2-22 carbonatomer. En fagmand kan fastslå, hvorvidt et specifikt acyl-substituere nucleosidderivat er 15 mere lipophilt end det uderivatiserede nucleosid under anvendelse af standard-teknikker, dvs. sammenligning af fordelingskoefficienterne bestemt i vand-octanol-blandinger.
Efter passage af det acylerede nucleosidderivat fra fordøjelseskanalen ind i blodstrømmen eller gennem andre biologiske membraner, bliver acylsubstituen-20 terne spaltet af plasma- og vævsesteraser (eller amidaser) til dannelse af de frie nucleosider. De foretrukne acylgrupper ifølge opfindelsen er naturligt forekommende metaboliter i legemet, eller de er forbindelser, som let indgår i interme-diære metaboliske synteseveje. De indebærer således af toxicitet ved frigøelse in vivo endogene esteraser eller amidaser.
25 Det er også muligt at fremstille acylnucleosidderivater, som indeholder både polære og upolære acylsubstituenter. Den polære acylgruppe vil tilbageholde passage af nucleosidderivatet fra fordøjelseskanalen, hvilket tillader en mere langvarig levering af forbindelsen til blodstrømmen efter en enkelt dosis. Den polære gruppe kan spaltes af esteraser, amidaser eller peptidaser som er tilstede i 30 fordøjelseskanalen, hvilket giver et nucleosid med en upolær acylsubstituent, som derefter kan indgå effektivt i cirkulationen. Polære acylsubstituenter kan vælges af en fagmand uden unødig eksperimenteren, og de spaltes med en DK 174400 B1 19 større hastighed end upolære acylsubstituenter. Sådanne substituenter er fortrinsvis basiske aminosyrer (lysin eller arginin), sure aminosyrer (glutamat eller aspartat) eller dicarboxylsyrer.
Til parenteral injektion, kan acylderivater med polære substituenter, som derfor 5 er vandopløselige men alligevel resistente til for tidlig nedbrydning eller eliminering også anvendes med fordel.
FORETRUKNE FORBINDELSER IFØLGE OPFINDELSEN
De foretrukne acylderivater af 2'-deoxyadenosin er sådanne med formlen (I) 10 hvori Ri er en acylgruppe afledt af en uforgrenet fedtsyre med 6-16 carbonato-mer, R2 er H eller en acylgruppe afledt af en uforgrenet fedtsyre med 6-16 car-bonatomer og R3 er H eller en acylgruppe afledt af en aminosyre med en sur eller basisk sidekæde.
De foretrukne acylderivater af 2'-deoxyguanosin er sådanne med formlen (II) 15 hvori Ri er en acylgruppe afledt af en uforgrenet fedtsyre med 6-16 carbonato-mer, R2 er H eller en acylgruppe afledt af en uforgrenet fedtsyre med 6-16 car-bonatomer eller en aminosyre med en sur eller basisk sidekæde, og R3 er H eller en acylgruppe afledt af en aminosyre med en sur eller basisk sidekæde.
De foretrukne acylderivater af 2'-deoxycytidin er sådanne med formlen (III) hvori 20 Ri er en acylgruppe afledt af en uforgrenet fedtsyre med 6-16 carbonatomer, R2 er H eller en acylgruppe afledt af en uforgrenet fedtsyre med 6-16 carbonatomer, og R3 er H eller en acylgruppe afledt af en aminosyre med en sur eller basisk sidekæde.
De foretrukne acylderivater af 2’-deoxythymidin (5) er sådanne med formlen (IV) 25 hvori R2 er en acylgruppe afledt af en uforgrenet fedtsyre med 16 carbonatomer.
De foretrukne acylderivater af Z-deoxythymidin (6) er sådanne med formlen (IV) hvori Ri og R2 er ens eller forskellige og hver er en acylgruppe afledt af en uforgrenet fedtsyre med 6-16 carbonatomer.
20 DK 174400 B1
De foretrukne acylderivater af 2'-deoxythymidin (7) er sådanne med formlen (IV) hvori Ri og R2 er ens eller forskellige og hver er en acylgruppe afledt af en ufor-grenet fedtsyre med 6-16 carbonatomer, og R3 er en acylgruppe afledt af nico-tinsyre, benzoesyre eller para-aminobenzoesyre.
5
TERAPEUTISKE ANVENDELSER
De lipophile acyldeoxyribonucleosidderivater ifølge opfindelsen er nyttige til forøgelse af transporten af deoxyribonucleosider gennem biologiske membraner, herunder fordøjelseskanalen, i dyr og forøger derved biotilgængeligheden af IO deoxyribonucleosideme. Fremtrædende blandt sådanne dyr er mennesker, imidlertid er opfindelsen ikke begrænset hertil, idet opfindelsen omfatter behandling af de dyr, der opnår en gunstig virkning ved administrering af acyldeo-xyribonucleosiderne ifølge opfindelsen.
Præparaterne ifølge den foreligende opfindelse kan administreres til et dyr en-15 ten før eller efter udsættelse for stråling, sollys eller mutagener. Acylderivatfor-men af deoxyribonucleosideme udgør et oralt effektivt middel til levering af deoxyribonucleosider til væv. Disse derivater kan også indgives parenteralt eller topisk. Administrering af derivaterne løser problemet med hurtig katabolisme forårsaget af enzymer i fordøjelseskanalen, leveren og plasmaet.
20 Som vist i fig. 1 nedbrydes frit deoxyguanosin (dG) og deoxyadenosin (dA) ekstremt hurtigt i plasma.
Koncentrationsændringerne af deoxyadenosin, 5'-0-acetyldeoxyadenosin, og 5'-0-valeryldeoxyadenosin i plasma er vist i fig. 2. Hver af disse forbindelser blev sat til separate aliquoter af rotteplasma i begyndelseskoncentrationer på 20 25 mikromolær. Der blev udtaget prøver af plasmaet på forskellige tidspunkter, og de ønskede forbindelser blev påvist ved væskekromatografi.
Deoxyadenosin (dA) nedbrydes meget hurtigt i plasma, og forsvinder i løbet af 10 minutter. Administrering af denne forbindelse til et dyr eller menneske ville kun gøre deoxyadenosin tilgængeligt for vævene i et meget kort tidsrum. 5'-0-30 acetyldeoxyadenosin og 5'-0-valeryldeoxyadenosin bliver imidlertid deacyleret i plasmaet (til dannelse af deoxyadenosin) over en periode på adskillige timer.
DK 174400 B1 21
Derfor vil administrering af en af disse forbindelser resultere i forlænget tilgængelighed af deoxyadenosin for vævene.
Koncentrationsændringerne af deoxyadenosin, 5'-0-acetyldeoxyadenosin og 5'- O-valeryldeoxyadenosin i leverekstrakt er vist i fig. 3. Hver af disse forbindelser 5 blev sat til separate aliquoter af en vandig ekstrakt af rottelever, ved begyndelseskoncentrationer på 20 mikomolær. Der blev udtaget prøver af ekstrakten på forskellige tidspunkter, og de ønskede forbindelser blev påvist ved væskekromatografi.
Deoxyadenosin (dA) nedbrydes ekstremt hurtigt i plasma, og forsvinder i løbet I0 af 1 minut. Det første nedbrydningsprodukt er deoxyinosin, som ikke kan udnyttes direkte af vævene. Administrering af deoxyadenosin per se til et dyr eller menneske ville kun gøre deoxyadenosin tilgængeligt for vævene i et meget kort tidsrum. 5'-0-acetyldeoxyadenosin og 5'-0-valeryldeoxyadenosin bliver imidlertid deacyleret i leverekstrakt (til dannelse af deoxyadenosin) over en periode på 15 mere end 1 time. Derfor vil administrering af en af disse forbindelser resultere i forlænget tilgængelighed af deoxyadenosin for leveren eller andre organer.
Således kan en blanding af flere forskellige acylderivater af hvert deoxyribo-nucleosid i en administreret dosis udvælges til opnåelse af optimal biotilgængelighed. Et præparat indeholdende 3',5'-diacetyl-2'-deoxycytidin og 5'-palmitoyl-20 2'-deoxycytidin (og tilsvarende derivater af andre deoxyribonucleosider) tilvejebringer en mere forlænget biotilgængelighed af nucleosider efter en enkelt dosis end administrering af et enkelt acylderivat af hvert nucleosid. Efter administrering af den ovenfor beskrevne blanding deacetyleres den acetylerede forbindelse relativt hurtigt, hvilket giver frit deoxycytidin (eller andre ønskede deoxyribo-25 nucleosider) kort efter administrering. 5'-palmitoylderivatet deacyleres langsommere, hvilket giver yderligere deoxycytidin efter at deoxycytidinet afledt af 3',5'-diacetyl-2'-deoxycytidin er blevet metaboliseret af vævene.
Acyldeoxyribonucleosidpræparatet kan formuleres som en del af en sollotion som kan påføres før eller efter udsættelse for sollys. Sollotionen kan også om-30 fatte et eller flere solfiltre, såsom PABA, estere af PABA og andre ikke-PABA kemiske solfiltre. Acyldeoxynucleotiderne absorberes af huden og optages af cellerne. Acyldeoxyribonucleosiderne spaltes derefter af vævsesteraser til dannelse af frie deoxyribonucleosider i effektive mængder til modvirkning af sollys- 22 DK 174400 B1 induceret beskadigelse. Kombinationen af acyldeoxyribonucleosidpræparaterne og et solfilter såsom PABA giver maksimal beskyttelse af huden mod solen.
Acyldeoxyribonucleosidpræparaterne ifølge opfindelsen finder også anvendelse til forbedring af visse virkninger af ældning ved tilvejebringelse af et højt og 5 vedvarende niveau af deoxyribonucleosider til forøgelse af de naturlige DNA-reparationsprocesser i celler, og behandler derved den naturligt optrædende progressive akkumulering af beskadiget DNA, som optræder ved ældning. Præparater til behandling eller forbedring af virkningerne af ældning kan påføres topisk i form af en hudlotion, eller kan administreres oralt eller parenteralt.
10 Der findes andre tilstande end strålingsbeskadigelse, hvori exogene deoxyribonucleosider eller derivater deraf har nyttige terapeutiske anvendelser.
Deoxyribonucleinsyre har været anvendt til fremskyndelse af sårcicatricering eller heling, og fremskynder også leverregenerering hos forsøgsdyr. I disse situationer såvel som i de situationer, hvor DNA anvendes til at fremme overle-15 velse efter bestråling af dyr, er det sandsynligt, at DNA tjener som et depot for deoxyribonucleosider, som gradvis frigør deoxyribonucleotiderne og deoxyribo-nucleosiderne under enzymatisk nedbrydning.
Administrering af acylerede deoxyribonucleosider som beskrevet her, er en metode til levering af deoxyribonucleosider til væv, som foretrækkes frem for ad-20 ministrering af fremmed DNA med henblik på forbedring af sårheling eller vævs-regenerering. Ulig DNA er acylerede deoxyribonucleosider effektive efter oral administrering, de er også ikke-antigene og er meget lettere at rense end DNA.
Præparater ifølge den foreliggende opfindelse kan også administreres til forøgelse af helingen af beskadiget væv.
25 Sådant beskadiget væv omfatter hudsår (f.eks. punkturer, lacerationer, afskrabninger, etc.), forbrændt væv (hud, etc.), en syg eller beskadiget lever (fra kirurgi eller andre sår i leveren eller fra cirrhose eller diabetes, etc.), beskadiget hjertemuskel (f.eks. forbedres ardannelse efter myocardial infarct), og beskadiget knoglemarv (f.eks. efter strålingsbehandling eller kemoterapi).
DK 174400 B1 23
Med henblik på behandling af hudsår efter forbrændinger kan præparaterne applikeres topisk som en del af en hudlotion eller -creme, eller som en del af en bionedbrydelig polymer.
Foretrukne acyl-substituent-grupper på hydroxylgrupperne på deoxyriboserin-5 gen i 2’-deoxyadenosin, 2'-deoxycytidin, 2'-deoxyguanosin og thymidin er fedtsyrer med 6-16 carbonatomer eller dicarboxylsyrer med 4-6 carbonatomer, f.eks. rav-, glutar- eller adipinsyre. Foretrukne substituenter på de exocycliske amingrupper i deoxycytidin, deoxyadenosin og deoxyguanosin er aminosyrer med basiske sidekæder, f.eks. lysin eller arginin. Foretrukne substituenter på 10 den sekundære amingruppe i thyminringen i thymidin er nicotinsyre eller para-aminobenzoesyre.
Foretrukne deoxyadenosinderivater omfatter N6-lysyl-5'-palmitoyl-deoxyade-nosin, 5'-palmitoyladenosin, N6-lysyl-5'-dodecanoyl-deoxyadenosin, 5-dode-canoyl-adenosin og N6-lysyl-3',5'-diacetyldeoxyadenosin.
15 Foretrukne deoxyguaosinderivater omfatter N2-lysyl-5'-palmitoyl-deoxygua-nosin, 5'-dodecanoyl-deoxyguaosin og N^lysyl-S’.S'-diacetyl-deoxyguaosin.
Foretrukne deoxycytidinderivater omfatter N4-lysyl-5'-palmitoyl-deoxycytidin, 5'-palmitoyldeoxycytidin, N4-lysyl-5'-dodecanoyl-deoxycytidin, 5-dodecanoyl-deoxycytidin og N^lysyl-S'.S'-diacetyldeoxycytidin.
20 Foretrukne thymidinderivater omfatter N3-nicotinoyl-5'-palmitoyl-tymidin, 5‘-pal-mitoylthymidin, N3-nicotinoyl-5'-dodecanoyl-thymidin, 5’-dodecanoyl-thymidin og N3-nicotinoyl-3’,5'-acetylthymidin.
Præprater inden for opfindelsens omfang omfatter sådanne, som indeholder blandinger af acyIderivaterne af deoxyribonucleosiderne i effektive mængder til 25 opnåelse af det tilsigtede formål. Sådanne præparater kan indeholde 0-50 mol-% af acylderivatet af deoxycytidin, 0-50 mol-% af acylderivatet af deoxyguanosin, 0-50 mol-% af acylderivatet af deoxythymidin og 0-50 mol-% af acylderivatet af deoxyadenosin, forudsat at det samlede totale indhold af acyldeoxyribo-nucleosideme er 100 mol-%.
24 DK 174400 B1
Et foretrukket præparat indeholder 25 mol-% af acylderivatet af deoxycytidin, 25 mol-% af acylderivatet af deoxyguanosin, 25 mol-% af acylderivatet af deoxy-thymidin og 25 mol-% af acylderivatat af deoxyadenosin.
Til behandling af strålingsinduceret cellulær beskadigelse eller solskoldning, el-5 ler til forøgelse af sårheling omfatter foretrukne doseringer acylderivaterne i mængder, der er ækvivalente med 10-1000 mg 2'-deoxyadenosin, 10-1000 mg 2'-deoxyguanosin, 10-1000 mg 2'-deoxycytidin og 10-1000 mg 2'-deoxythymi-din. Præparatet kan f.eks. indeholde 13-1330 mg 3',5'-diacetyl-2'-deoxyadeno-sin, 13-1310 mg 3',3’-diacetyl-2'-deoxyguanosin, 14-1370 mg S'^’-diacetyl^’-10 deoxycytidin og 14-1350 mg S'.S'-diacetyl^'-deoxythymidin. Som det er velkendt i teknikken ved beregning af sådanne doseringer tages kun mængden af 2'-deoxyribonucleosidet i betragtning, dvs. at acylsubstituenten og syreadditionsdelen af ethvert farmaceutisk acceptabelt salt ikke omfattes af beregningen.
15 Til en sollotion kan 0,1-5 vægt-% af de ovenstående præparater tilsættes. Til dette formål vil acylderivaterne generelt foreligge i form af de frie acyldeoxyri-bonucleosider og ikke som de farmaceutisk acceptable salte.
Der er nogle situationer, hvori det er nyttigt at levere et enkelt deoxyribonucleo-sid til vævene, f.eks. deoxycytidin til behandling af toxicitet forårsaget af det an-20 tineoplastiske lægemiddel arabinosylcytosin eller thymidin til behandling af toxicitet forårsaget af methotrexat. I sådanne tilfælde kan acylderivater af et enkelt deoxyribonucleosid administreres.
FREMSTILLINGSMETODER
25 Når syrekilden til det ønskede acylderivat har grupper som interfererer med acy-leringsreaktionerne, f.eks. hydroxyl- eller aminogrupper, kan disse grupper blokeres med beskyttelsesgrupper, f.eks. t-butyldimethylsilylethere henholdsvis t-BOC-grupper før fremstilling af anhydridet. F.eks. kan mælkesyre omdannes til 2-t-butyldimethylsiloxypropionsyre med t-butyldimethylchlorsilan, efterfulgt af 30 hydrolyse af den resulterende silylester med vandig base. Anhydridet kan dannes ved omsætning af den beskyttede syre med DCC. Med aminosyrer kan N-t-BOC-derivatet fremstilles under anvendelse af standardteknikker og dette om- DK 174400 B1 25 dannes derefter til anhydridet med DCC. Ved syrer indeholdende mere end én carboxylatgruppe (f.eks. rav-, fumar- eller adipinsyre) omsættes syreanhydridet af den ønskede dicarboxylsyre med et 2'-deoxyribonucleosid i pyridin.
3',5'-diacyldeoxythymidin kan fremstilles ifølge metoderne beskrevet af Nishi-5 zawa et al., Biochem. Pharmacol. 14:1605 (1965) ved behandling af deoxythy-midin med 2,1 ækvivalenter af et syreanhydrid af den ønskede acylforbindelse i pyridin efterfulgt af opvarmning til 80-85 °C i mindst 1 time. Alternativt kan deo-xythymidin behandles med 2,1 ækvivalenter af et syrechlorid i pyridin ved stuetemperatur (se eksempel 1).
10 S'-hydroxylgruppen i deoxythymidin kan acyleres selektivt med 1 ækvivalent af syreanhydridet af den ønskede acylforbindelse i pyridin, som opvarmes til 80-85 °C ifølge Nishazawa et al. Alternativt kan syrechloridet (1 ækvivalent) omsættes med deoxythymidin i pyridin og DMF ved stuetemperatur ifølge Baker et al., J.
Med. Chem. 21.:1218 (1978). (Se eksempel 2).
15 3'-hydroxylgruppen i deoxythymidin kan acyleres selektivt ved selektiv dannelse af 5'-0-t-butyldimethylsilyl-derivatet med 1,2 ækvivalenter t-butyldimethylchlor-silan i DMF indeholdende imidizol efterfulgt af acylering af 3'-hydroxylgruppen med det egnede syreanhydrid og spaltning af 5'-t-butyldimethylsilyletheren ifølge Baker et al. (se eksempel 3).
20 S'.S'-diacyldeoxycytidin kan fremstilles ved en metode ifølge Gish et al., J. Med. Chem. 14:1159 (1971), ved behandling af deoxycytidinhydrochlorid med 2,1 ækvivalenter af det egnede syrechlorid i DMF (se eksempel 5).
5'-hydroxygruppen i deoxycytidin kan acyleres selektivt ved behandling af deo-xycytidin-hydrochlorid med 1,1 ækvivalenter af det egnede syreanhydrid i DMF.
25 Gish et al. (se eksempel 6).
3', 5*-d i acy I deri vatet af deoxyadenosin kan fremstilles ved behandling med 2.1 ækivalenter af det egnede syrechlorid i DMF. (ifølge Gish et al., se eksempel 7).
5’-hydroxylgruppen i deoxyadenosin kan acyleres selektivt ved behandling af deoxyadenosin hydrochlorid med 1,1 ækvivalenter af det ønskede syrechlorid i 30 DMF. (Ifølge Gish et al., se eksempel 8).
26 DK 174400 B1 S'.S'-diacyl-Z’-deoxyguanosin kan fremstilles ved behandling af deoxyguanosin-hydrochlorid med 2,1 ækvivalenter af det egnede syrechlorid i DMF. (Ifølge Gish et al., se eksempel 9).
5'-hydroxylgruppen i deoxyguanosin kan acyleres selektivt ved behandling af 5 deoxyguaosin-hydrochlorid med 1,1 ækvivalenter af det egnede syrechlorid i DMF. (Ifølge Gish et al., se eksempel 10).
Aminosyrer kan kobles til de exocycliske aminogrupper i deoxyadenosin, deo-xycytidin og deoxyguanosin (eller 3' eller 5’ acylderivater deraf) ved standardmetoder under anvendelse af dicyclohexylcarbodiimid. (Se eksempel 11).
10 Disse acylpræparater kan administreres vedvarende til et dyr, som risikerer at blive udsat for enten stråling, sollys eller kemiske mutagener. Acylpræparaterne ifølge opfindelsen kan også administreres efter udsættelse for stråling, sollys eller kemiske mutagener eller efter et sår er opstået, at forøge reparationen af DNA og derved bedre beskadigelsen og fremme dyrets overlevelse. De om-15 handlede forbindelser kan med fordel administreres før eller efter radioterapi eller kemoterapi til bedring af uønskede bevirkninger af behandlingen.
De omhandlede acylpræparater kan også coadministreres med andre radiopro-tektive forbindelser, såsom WR-2721, NAC, DDC, cysteamin, 2-mercaptoetha-nol, mercaptoethylamin, dithiothreitol, glutathion, 2-mercaptoethansulfonsyre, 20 WR-1065, nicotinamid, 5-hydroxytryptamin, 2-beta-aminoethyl-isothiouronium-
Br-Hbr, glucaner, GLP/B04, GLP/B05, OK-432, Biostim, PSK, Lentinan, Schi-zophyllan, Rhodexman, Levan, Mannozym, MVE-2, NMR, MMZ, IL-2, TNF, thymin faktor TF-5, glutathionperoxidase, superoxiddismutase, katalase, glu-tathion-reduktase, glutathiontransferase, selen, CdCI2, MnCI2, Zn-acetat, vita-25 min A, β-caroten, prostaglandiner, tocopherol og methylenblåt. Administrering af disse beskyttelsesforbindelser sammen med acylderivaterne ifølge opfindelsen giver en større beskyttelse end hvis acylderivaterne eller de andre midler blev indgivet alene.
De farmakologisk aktive acylderivater kan kombineres med egnede farmaceu-30 tisk acceptable bærere omfattende excipienser og hjælpestoffer som letter behandlingen af de aktive forbindelser. Disse kan administreres som tabletter, drageer, kapsler og suppositorier. Præparaterne kan administreres oralt, rectalt, DK 174400 B1 27 vaginalt eller frigives fra mundhulen (buccalt) og kan anvendes i form af en opløsning ved injektion, oralt eller ved topisk administrering. Præparaterne kan indeholde fra ca. 0,1 til 99%, fortrinsvis fra ca. 50 til 90% af de(n) aktive forbindelseir) sammen med excipienset/excipienserne.
5 De farmaceutiske præparater ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles på i og for sig kendt måde, f.eks. ved hjælp af konventionelle blandings-, granulerings-, dragee-fremstillings-, opløsnings- eller lyofiliserings-processer. Således kan farmaceutisk præparater til oral anvendelse opås ved at kombinere den/de aktive forbindelse(r) med faste excipienser, eventuelt formaling af den resulte-10 rende blanding og forarbejdning af blandingen af granuler, efter tilsætning af egnede hjælpestoffer, om ønsket eller nødvendigt til opnåelse af tabletter eller dragee-kerner.
Egnede excipienser omfatter fyldstoffer, såsom sukkerarter, f.eks. lactose, sucrose, mannitol eller sorbitol, cellulosepræparater og/eller calciumphoshater, 15 f.eks. tricalciumphosphat eller calciumhydrogenphosphat, såvel som bindemidler, såsom stivelsespasta, under anvendelse af f.eks. majsstivelse, hvedestivelse, risstivelse eller kartoffelstivelse, gelatine, tragacanth, methylcellulose, hy-droxypropylmethylcellulose, natriumcarboxymethylcellulose og/eller polyvinyl-pyrrolidon.
20 Hjælpestoffer er fremfor alt strømningsregulerende midler og smøremidler, f.eks. silica, talkum, stearinsyre eller salte deraf, såsom magnesiumstearat eller calciumstearat og/eller polyethylenglycol. Dragee-kerner forsynes med egnede overtræk, der, om ønsket, er resistente overfor mavesaft. Til dette formål kan anvendes koncentrerede sukkeropløsninger, som eventuelt kan indeholde 25 gummiarabicum, talkum, polyvinylpyrrolidon, polyethylenglycol og/eller titani-umdioxid, lakopløsninger og egnede organiske opløsningsmidler eller opløsningsmiddelblandinger. Til fremstilling af overtræk, der er resistente over for mavesaft, anvendes opløsninger af egnede cellulosepræparater, såsom acetyl-cellulosephthalat eller hydroxypropylmethylcellulosephthalat. Farvestoffer eller 30 pigmenter kan sættes til tabletterne eller dragee-overtrækkene, f.eks. til identifikation eller for at karakterisere forskellige kombinationer af doser af forbindel ser.
28 DK 174400 B1
Andre farmaceutiske præparater, som kan anvendes oralt, omfatter "push-fit" kapsler fremstillet af gelatine, såvel som "soft-sealed"-kapsler fremstillet af gelatine og et plastificeringsmiddel, såsom glycerol eller sorbitol. "Push-fit"-kaps-lerne indeholder de(n) aktive forbindelse(r) i form af granuler, som kan være 5 blandet med fyldstoffer, såsom bindemidler, såsom stivelse og/eller smøremidler, såsom talkum eller magnesiumstearat. og eventuelt stabilisatorer. I bløde kapsler er de aktive forbindelser fortrinsvis opløst eller suspenderet i egnede væsker, såsom fede olier, flydende paraffin eller polyethylenglycoler. Desuden kan stabilisatorer være tilsat.
10 Mulige farmaceutiske præparater, som kan anvendes rektalt, omfatter f.eks. suppositorier, der består af en kombination af aktive forbindelser med en sup-positoriebasis. Egnede suppositoriebaser er f.eks. naturlige eller syntetiske triglycerider, paraffincarbonhydrider, polyethylenglycoler eller højere alkanoler. Desuden er det også muligt at anvende gelatine- rektalkapsler som består af en 15 kombination af de aktive forbindelser med en basis. Mulige basismaterialer omfatter f.eks. flydende triglycerider, polyethylenglycoler, eller paraffincarbonhydri der.
Egnede formuleringer til parenteral administrering omfatter vandige opløsninger af de aktive forbindelser i vandopløselig form, f.eks. vandopløselige salte. Des-20 uden kan suspensioner af de aktive forbindelser administreres som egnede oli-eagtige injektionsssuspensioner. Egnede lipophile opløsningsmidler eller vehikler omfatter fede olier, f.eks. sesamolie eller syntetiske fedtsyreestere, f.eks. ethyloleat eller triglycerider. Vandige injektionssuspensioner kan omfatte stoffer, som forøger viskositeten af suspensionen, og omfatter f.eks. natriumcarboxy-25 methylcellulose, sorbitol og/eller dextran. Eventuelt kan suspensionen også indeholde stabilisatorer.
Acyldeoxyribonucleosiderne kan formuleres som en del af af en hudlotion eller sollotion til topisk administrering. Egnede formuleringer til topisk administrering omfatter egnede oliesuspensioner eller opløsninger. Egnede lipophile opløs-30 ningsmidler eller vehikler omfatter fede olier, f.eks. sesamolie eller kokosnød-deolie eller syntetiske fedtsyreestere f.eks. ethyloleat eller triglycerider. Disse topiske formuleringer kan anvendes til behandling af beskadiget væv, såsom hudsår eller -forbrændinger, eller til behandling eller forebyggelse af sollysindu- DK 174400 B1 29 æret cellulær beskadigelse (solskoldning). Med henblik på forøgelse af sårheling kan de omhandlede præparater formuleres som en del af et plaster eller kan inkorporeres i bionedbrydelige mikrokapsler til topisk administrering. Sådanne mikrokapsler kan f.eks. omfatte polylactat eller lactat-glycolat-copoly-5 merer. Se Weise, D.L. et al., Drug Carriers in Biology and Medicine, Gregoria-dis, G. et al., Academic Press, NV p. 237*270 (1979).
De følgende eksempler belyser uden at begrænse fremgangsmåderne og præparaterne ifølge den foreliggende opfindelse. Andre egnede modifikationer og tilpasninger af de forskellige betingelser og parametre som normalt forekommer 10 i klinisk terapi og er indlysende for fagmanden, ligger inden for opfindelsens omfang.
EKSEMPLER PA FREMGANGSMADER TIL FREMSTILLING AF FORBINDELSER IFØLGE OPFINDELSEN
15 Eksempel 1
Fremstilling af S'.S’-diacvl^'-deoxvthvmidin ud fra svreanhvdrider 2'-Deoxythymidin opløses i vandfrit pyridin ved stuetemperatur. 2,1 molækvivalenter af syreanhydridet af den ønskede acylforbindelse (f.eks. eddikesyrean-hydrid, mælkesyreanhydrid, smørsyreanhydrid, etc.) tilsættes derefter. Reakti-20 onsblandingen opvarmes derefter til 80-85 °C i 1-4 timer, afkøles, hældes i isvand, og esterne udvindes ved ekstraktion med chloroform eller et lignende opløsningsmiddel. Chloroformet vaskes derefter med iskold 0,01 N svovlsyre, 1% vandigt natriumhydrogencarbonat og til slut vand. Efter tørring med natriumsulfat, afdampes chloroformet og den/de tilbageblivende olie(r) eller krystaller un-25 derkastes kromatografi (ifølge Nishizawa et al., Biochem. Pharmacol 14:1605 (1965)).
Ud fra svrechlorider
Til 2’-deoxythymidin opløst i vandfrit pyridin sættes ved 5 °C 2,1 molækvivalenter af syrechloridet af den ønskede acylforbindelse (f.eks. palmitoylchlorid, ace- 30 DK 174400 B1 tylchlorid, etc.). Blandingen opbevares ved stuetemperatur natten over, sættes til isvand og oparbejdes som angivet ovenfor (ifølge Nishizawa).
Eksempel 2
Fremstilling af S’-acvl^’-deoxvthvmidin 5 Til 2'-deoxythymidin opløst i vandfrit pyridin sættes ved stuetemperatur 1,0 molækvivalent af syreanhydridet af den ønskede acylforbindelse. Reaktionsblandingen opvarmes derefter til ca. 80-85 °C i adskillige timer, afkøles og hældes i isvand, og esterne udvindes ved ekstraktion med chloroform eller et lignende opløsningsmiddel. Chloroformet vaskes derefter i iskold 0,01 N svovlsyre, 1% 10 vandigt natriumhydrogencarbonat og endelig vand. Efter tørring med natriumsulfat, afdampes chloroformet og den/de tilbageblivende olie eller krystaller underkastes kromatografi. Hovedproduktet som isoleres ved kromatografi er den 5'-substituerede ester (ifølge Nishizawa et al.).
Alternativt kan selektiv 5'-acylering af deoxythymidin gennemføres ved suspen-15 dering af 2'-deoxythymidin i en blanding af pyridin og Ν,Ν-dimethylformamid af kølet til 0 °C i et isbad. 1,0 molækvivalent af syrechloridet af den ønskede acylforbindelse sættes dråbevis til blandingen, som omrøres ved 9 °C i 12-24 timer. Derefter tilsættes vand for at stoppe reaktionen og opløsningsmidlerne afdampes derpå i vakuum ved 50 °C. Remanensen opløses i methanol og renses ved 20 kromatografi på silicagel (ifølge Baker et al., J. med. Chem. 21.:1218 (1978)).
Eksempel 3
Fremstilling af 3'-acvl-2'-deoxvthvmidin
Til en omrørt suspension af 2'-deoxythymidin i tørt Ν,Ν-dimethylformamid sættes 2,4 molækvivalenter imidazol efterfulgt af 1,2 molækvivalenter t-25 butyldimethylchlorsilan. Blandingen omrøres under beskyttelse mod fugtighed ved stuetemperatur i 20 timer, hvorefter opløsningsmidlet flernes ved 50 °C i vakuum. Remanensen opløses i 15 ml ethylacetat, vaskes og inddampes til opnåelse af en sirup, hvorfra der ved krystallisation fra varmt chloroform ved tilsætning af hexan til begyndende opalescens, opnås 5'-(t-butyldimethylsilyl)-2'-30 deoxythymidin.
DK 174400 B1 31
Til en omrørt suspension af 5’-(t-butyldimethylsilyl)-2'-deoxythymidin i tørt pyri-din afkølet til O °C sættes 1,1 molækvivalenter af et egnet syreanhydrid af den ønskede acylforbindelse, og blandingen omrøres under beskyttelse mod fugtighed i 20 timer ved 0-5 °C, hvorefter reaktionen afsluttes ved tilsætning af nogle 5 få ml vand. Opløsningsmidlet afdampes, og remanensen ekstraheres og inddampes til opnåelse af en tyk klar sirup, som derefter tørres i vakuum ved 25 °C.
t-Butylmethylsilylgruppen fjernes med iseddikesyre og tetrabutylammoniumfluo-rid i tetrahydrofuran, hvilket giver det ønskede 3’-acyl-2'-deoxythymidinderivat 10 (ifølge Baker et al.).
Eksempel 4
Fremstilling af N3-acvl-2'-deoxvthvmidin
Acyleringen af den sekundære amin i 3-stillingen i pyrimidinringen gennemføres ved omsætning af 3',5'-diacyldeoxythymidin med 1,1 molækvivalenterer af syr 15 rechloridet af den ønskede acylsubstituent i et aprotisk opløsningsmiddel (såsom ether, dioxan, chloroform, ethylacetat, acetonitril, pyridin, dimethylformamid og lignende) under tilstedeværelse af 1-5 molækvivalenterer af en organisk base (især aromatiske aminer, såsom pyridin, trialkylaminer eller N,N-dialkylaniliner) (ifølge Fuji et al., U.S. patent nr. 4 425 335). Acylsubstituenten 20 på den sekundære amin kan være den samme som eller forskellig fra substi-tuenterne på hydroxylgrupperne i ribosedelen.
Eksempel 5
Fremstilling af S'.S'-diacvl^'-deoxvcvtidin 2-Deoxycytidinhydrochlorid opløses i N,N-dimethylformamid, 2,1 molækvivalen-25 terer af syrechloridet af den ønskede acylsubstituent tilsættes, og blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres i vakuum til en olie og tritureres med en blanding af ethylacetat og diethylether eller lignende opløsningsmidler. Olien tritureres derefter med 1N natriumhydro-gencarbonat. Det krystallinske faste stof opsamles, vaskes med vand, tørres og 30 omkrystalliseres (ifølge Gish et al., J. Med. Chem. 14:1159 (1971)).
32
Eksempel 6 DK 174400 B1
Fremstilling af 5’-acvl-2'-deoxvcvtidin 2-Deoxycytidinhydrochlorid opløses i Ν,Ν-dimethylformamid. 1,1 molækvivalenter af syrechloridet af den ønskede acylsubstituent tilsættes og blandingen om-5 røres natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres i vakuum til en olie og tritureres med en blanding af ethylacetat og diethylether eller lignende opløsningsmidler. Olien tritureres derefter med 1N natriumhydrogen-carbonat. Det krystallinske faste stof opsamles, vaskes med vand, tørres og omkrystaltiseres (ifølge Gish et al.).
10 Eksempel 7
Fremstilling af S'.S'-diacvl-^-deoxvadenosin 2’-Deoxyadenosin opløses i Ν,Ν-dimethylformamid og pyridin (1:1). 2,1 molækvivalenter af syrechloridet af den ønskede acylsubstituent tilsættes, og blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandignen koncen-15 treres i vakuum til en olie og tritureres med en blanding af ethylacetat og diethylether eller lignende opløsningsmidler. Olien tritureres derefter med 1 N na-triumhydrogencarbonat. Det krystallinske krystallinske faste stof opsamles, vaskes med vand, tørres og omkrystalliseres.
Eksempel 8 20 Fremstilling af S'-acvl^'-deoxvadenosin 2'-Deoxyadenosin opløses i Ν,Ν-dimethylformamid og pyridin (1:1). 1,1 molækvivalenter af syrechloridet af den ønskede acylsubstituent tilsættes, og blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres i vakuum til en olie, og tritureres med en blanding af ethylacetat og 25 diethylether eller lignende opløsningsmidler. Olien tritureres derefter med 1 N natriumhydrogencarbonat. Det krystallinske faste stof opsamles, vaskes med vand, tørres og omkrystalliseres.
Eksempel 9 33 DK 174400 B1
Fremstilling af 3'.5'-diacvl-2'-deoxvQuanosin 2'-Deoxyguanosin opløses i Ν,Ν-dimethylformamid og pyridin (1:1). 2,1 molækvivalenter af syrechloridet af den ønskede acylsubstituent tilsættes, og blan-5 dingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres i vakuum til en olie, og tritureres med en blanding af ethylacetat og diethylether eller lignende opløsningsmidler. Olien tritureres derefter med 1 N natriumhydrogencarbonat. Det krystallinske faste stof opsamles, vaskes med vand, tørres og omkrystalliseres.
10 Eksempel 10
Fremstilling af S'-acvl^'-deoxvauanosin 2'-Deoxyguanosin opløses i Ν,Ν-dimethylformamid og pyridin. 1,1 molækvivalenter af syrechloridet af den ønskede acylsubstituent tilsættes, og blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres i 15 vakuum til en olie, og tritureres med en blanding af ethylacetat og diethylether eller lignende opløsningsmidler. Olien tritureres derefter med 1 N natriumhydrogencarbonat. Det krystallinske faste stof opsamles, vaskes med vand, tørres og omkrystaliiseres (ifølge Gish et al.).
Eksempel 11 20 Syntese af N-lvsvl-5'-0-palmitovl-deoxvcvtidin 5'-0-palmitoyldeoxycytidin syntetiseres ved omsætning af deoxycytidinhydroch-lorid med 1,1 ækvivalenter palmitoylchlorid i tørt dimethylformamid.
14 gram af 5'-0-palmitoyl-deoxycytidin opløses i 100 ml dimethylacetamid, 1 molækvivalent di-tert-butoxycarbonyl-lysin tilsættes, og blandingen afkøles i et 25 isbad. 1,2 molækvivalenter (7,4 g) dicyclohexylcarbodiimid tilsættes, og blandingen omrøres ved 4 °C i 90 timer. Bundfaldet (dicyclohexylurinstof) fjernes ved filtrering. 100 ml vand sættes til filtratet, efterfulgt af 1 liter ethylacetat.
34 DK 174400 B1 N4-(di-N-tert-butoxycarbonyl-lysyl)-5'-0-palmitoyl-deoxycytidin fraskilles fra uomsatte ragenser ved kromatografi på silicagel. t-Butoxycarbonylbeskyttel-sesgrupperne fjernes ved standardmetoderne til behandling med en syre, såsom trifluoreddikesyre.
5 Ligeledes kan 5-O-acyl-eller 3’,5’-0-diacylderivater af deoxycytidin, deoxyade-nosin eller deoxyguanosin generelt få koblet lysin eller arginin til deres exo-cycliske primære aminogrupper med dicyclohexylcarbodiimid.
EKSEMPLER PA BESKYTTELSE AF NUCLEOSIDER MOD ENZYMATISK 10 NEDBRYDNING VED ACYLERING
Deoxyribonucleosider nedbrydes hurtigt efter administrering til dyr. For vellykket udnyttelse af acylererde nucleosider til levering af nucleosider til væv er det vigtigt af acylering skal forhindre nedbrydning af nucleosiddelen af de enzymer som normalt nedbryder nucleosiderne. For hvert af de vigtigste deoxyribo-15 nucleosider er et specifikt enzym involveret i det første trin i nedbrydningen. Det første trin i nedbrydningen af deoxyadenosin er deaminering katalyseret af ade-nosindeaminase. Thymidin kataboliseres indledningsvis af thymidinphosphory-lase, deoxyguanosin af purinnucleosidphorphorylase og deoxycytidin nedbrydes af deoxycytidindeaminase.
20 Eksempel 12
Opløsninger (100 mikromolær i phosphatpufferholdigt saltvand) af hvert af deo-xyribonucleosideme eller deres acylerede derivater inkuberedes ved 37 °C med hvert af de fire enzymer: adenosindeaminase (ADA), cytidindeaminase (CDA), purinnucleosidphosphorylase (PNP) og thymidinphosphorylase (TP). Enzyma-25 tisk nedbrydning af forbindelserne bestemtes ved HPLC.
DK 174400 B1 35 TABEL 1
Beskyttelse af deoxyribonucleosider mod enzymer som katalyserer de indledende fra i nedbrydningen ved 5'*0-acylering _Enzvm_
5 Forbindelse_ADA CPA PNP TP
deoxyadenosin + - 3',5’-di-0-acetyldeoxyadenosin - 5'-0-palmitoyldeoxyadenosin - deoxycytidin -·*-- 10 3\5’-di-0-acetyldeoxycytidin - S'-O-palmitoyldeoxycytidin - deoxyguanosin - + 3',5'-di-0-acetyldeoxyguano$in - 5'-0-palmitoyldeoxyguaosin - 15 thymidin - + S'.S'-di-O-acetylthymidin - S'-O-valerylthymidin - 5’-0-octanoylthymidin - 5’-0~palmitoylthymidin - 20 5'-0-valerylthymidin - - - + angiver at forbindelsen var et substrat for enzymet - angiver at forbindelsen ikke var et substrat for enzymet 25 Disse data viser at 5'-0-acylering af deoxyribonucleosider beskytter dem mod de enzymer, som katalyserer de indledende trin i deres nedbrydning. Således vil nucleosiddelen i acylerede nucleosider forblive intakt in vivo indtil deacylering finder sted.
30 EKSEMPLER PA DEACYLERING AF ACYLEREDE DEOXYRIBONUCLEOSIDER I LEVEREKSTRAKTER
Acylerede deoxyribonucleosider inkuberedes med rotteleverekstrakter for at vurdere de realtive hastigheder for enzymatisk deacylering af derivater med forskellige substituenter og for at fastslå hvorvidt forskellige nucleosider med de 35 samme substituenter deacyleres med tilsvarende hastigheder. Deacylering af 36 DK 174400 B1 derivaterne ifølge opfindelsen in vivo resulterer i frigørelse af stamdeoxynucleo-siderne, som derefter kan udnyttes af cellerne.
Eksempel 13
Hele rottelevere homogeniseredes i phosphatpufferholdigt saltvand (10 ml pr.
5 gram lever) og centrifugeredes. Supernatanten fortyndedes til en slutkoncentra-tion på 50 ml puffer pr, gram lever, og lageropløsninger af acylerede deoxyribo-nucleosider tilsattes, således at forbindelserne var tilstede i koncentrationer på 100 mikromolær. 100 Mikroliter aliquoter blev fjernet periodisk til bestemmelse ved HPLC, at mængderne af frie nucleosider frembragt som funktion af tiden.
10 TABEL 2
Nucleosider frigjort (nanomol/ml) timer 15 Forbindelse 1 2 3 8 24 3',5'-di-0-acetyldeoxyadenosin 26 39 57 S’.S’-di-O-acetyldeoxycytidin 25 40 50 3',5’-di-0-acetyldeoxyguanosin 23 43 63 20 3',5'-di-0-acetylthymidin 19 40 63 5'-0-valerylthymidin 47 95 98 5'-0-octanoylthymidin 74 84 96 5'-0-acetyldeoxyadenosin 48 5'-0-valeryldeoxyadenosin 65 25 N-acetyldeoxycytidin 0 0 0 0 N-valeryldeoxyguanosin 0 0 0 0 N-palmitoyldeoxyguanosin 0 0 0 0 5’-0-palmitoyldeoxyadenosin 5 16 5‘-0-palmitoyldeoxycytidin 4 15 30 5'-0-palmitoyldeoxyguanosin 3 14 5’-0-palmitoylthymidin 4 14
Disse data indikerer, at i leverekstrakter deacyleres di-O-acetylderivater af hver aide fire deoxyribonucleosider med meget tilsvarende hastigheder. Dette er DK 174400 B1 37 også tilfældet for 5'-0'palmitoylderivater, selv om palmitoylsubstituenterne spaltes med meget lavere hastighed end acetatgrupperne. Dette tyder på, at hastigheden for deacylering af O-substituerede deoxyribonucleosider primært er en funktion af acylsubstituentens natur og ikke af 5 nucleosidet hvortil den er knyttet. Dette er vigtigt ved den praktiske udnyttelse af opfindelsen, idet nogle terapeutiske virkninger kun opnås, når derivater af mere end et nucleosid coadministreres. Det foretrækkes, at deacylering af forskellige nucleosider i en terapeutisk blanding sker ved tilsvarende hastigheder in vivo, fordi optimale mængdeforhold af nucleosider leveres til vævene, samtidigt. Den 10 store variation i deacyleringshastigheder nucleosider substitueret med kortkædede (acetyl) i sammenligning med langkædede (palmitoyl) fedtsyrer giver mulighed for udvælgelse af acylsubstituenter efter de deacyleringshastigheder (eller hastigheder for levering af nucleosid) der kræves i forskellige kliniske situationer. Fedtsyresubstituenter af middellængde (f.eks. valeryl og octanoyl) spaltes 15 hurtigere end kortere (acetat) eller længere (palmitat) substituenter.
I den samme leverekstrakt nedbrydes deoxyribonucleosider per se hurtigt f..eks. nedbrydes deoxyadenosin i en koncentration på 100 mikromolær fuldstændigt indledningsvis ved deaminering til dannelse af inosin, inden for 2 minutter. Det ses således, at efter administrering vil de O-acylerede deoxyribo-20 nucleosider ifølge opfindelsen gradvis frigives og tilvejebringe frie nucleosider for vævene i en langvarig periode, i sammenligning med den kortvarige tilgængelighed af nucleosid, der følger administrering af selve deoxyribonucleosider-ne. Fedtsyrer på de primære aminer i enten pyrimidinringen i deoxycytidin eller purinringene i deoxyguanosin fjernes ikke med betydende hastighed af leveren-25 zymer.
EKSEMPLER PÅ ORAL ADMINISTRERING AF ACYLEREDE NUCLEOSIDER
Til demonstration af levering af deoxyribonucleosider efter oral administrering af 30 acylerede nucleosider måltes plasmathymidinniveauer efter oral administrering af enten 3',5'-0-acetylthymidin eller thymidin.
38 DK 174400 B1
Eksempel 14
Han-F3443-rotter (350 g) implanteredes med fasle halsvenekatetere til blodprøveudtagning og restitueredes i 2 dage. En basal blodprøve blev udtaget og derefter blev 0,7 mollimol thymidin eller 3',5'-di-0-acetylthymidin (DAT) administre-5 ret ved gavage. Blodprøver blev udtaget 0,5,1, 2 og 4 timer efter administrering og centrifugeret, og supernatanten (plasma) deproteiniseredes med methanol. Koncentrationen af thymidin i plasmaprøverne bestemtes ved HPLC med UV-absorbanspåvisning.
Den basale plasma-thymidin-koncentration var 1 mikromolær. Efter oral admini-I0 strering af thymidin, nåede plasma-thymidin-niveauerne et maksimum på 9 mikromolær 1 time efter administrering og vendte tilbage til basale koncentrationer på 4 timer. Efter oral administrering af en ækvimolær dosis af 3',5'-di-0-acetyl-thymidin nåede plasma-thymidin-koncentrationen derimod et maksimum på 80 mikromolær inden for 30 minutter, og den var stadig hævet over basalværdier 4 15 timer efter administrering.
Således leverer oral administrering af di-O-acetylthymidin meget større mængder thymidin til vævene (med længere varighed) end administrering af det ikke-derivatiserede nucleosid som vist i fig. 4, hvori de sammenlignelige data er indtegnet.
20 EKSEMPLER PA KLINISK ADMINISTRERING Strålingspåvirkning
Tre situationer, hvori acylderivater af deoxyribonucleosider kan være klinisk nyttige til behandling af strålingsbeskadigelse er 1) udsættelse for ioniserende strå-25 ling ved uheld, såsom ved kernekraft, 2) udsættelse for røntgenstråling ved radiografi, og 3) radioterapi af cancer.
I det første tilfælde bør acyldeoxyribonucleosidderivater administreres i en formulering, der er egnet til parenteral injektion, efterfulgt af oral administrering flere gange dagligt af doser ækvivalent med 0,5-2 gram af hver af de fire betydeli- DK 174400 B1 39 ge deoxyribonucleosider. Det er vigtigt at derivaterne af alle nucleosiderne coadministreres.
I det andet tilfælde, udsættelse for røntgenstråling ved diagnostisk radiografi gives acyldeoxyribonucleosidderivater oralt før og efter udsættelse.
5 I det tredje tilfælde cancerradioterapi, er acyldeoxyribonucleosidderivaterne særlig nyttige til restaurering af knoglemarvsfunktionen efter dens uønskede men uundgåelige hæmning under bestråling. I formuleringer beregnet til selektiv levering af nucleosider til normale men ikke neoplastiske væv vil acyldeoxyribo-nucleosidderivateme endvidere forbedre det terapeutiske indeks (forhold mel-10 lem effektivitet og toxicitet) af strålingsbehandlingen. Lignende doser af deoxy-ribonucleosidderivater kan også anvendes tii behandling af knoglemarvshæmning forårsaget af antineoplastisk eller antiviral kemoterapi.
De følgende eksempler viser opfindelsens fordele ved behandlingen af bestrålede mus.
15 Fremgangsmåder
Balb/c+-mus underkastedes gamabestråling (Cobalt 60) i en dosis på 7,3 Rads/min. Feltet måltes to gange ved Fricke dosimetri for at sikre et ensartet felt og en konstant dosis for hver mus. Grupper på 15 mus modtog totale doser af gammabestråling på 675, 700, 725 og 750 R.
20 Musene inddeltes i fire behandlingsgrupper (5 mus for hver bestrålingsdosis), som modtog hver sin behandling efter bestråling.
Gruppe 1: 0,9% saltvand (kontrolgruppe),
Gruppe 2: en blanding af deoxyribonucleosider (ækvimolær blanding af deo- xyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytidin og thymidin), 25 Gruppe 3: en blanding af 3,5'-di-0-palmitoyldenvater af deoxyadenosin, deo xyguanosin, deoxycytidin og thymidin, ækvimolære med doserne af ikke-derivatiserede nucleosider.
40 DK 174400 B1
Gruppe 4: en blanding af 5'-0-acetylderivaterne af deoxyadenosin, deoxy- guanosin, deoxycytidin og thymidin. (Kun afprøvet ved 750 R).
Nucleosiderne eller di-O-acetylderivaterne administreredes ved intraperitoneal injektion (8 mikromol/0,2 ml fysiologisk saltvand fre gange dagligt (hver 8. time) 5 i 4 dage, begyndende 30 minutter efter bestråling). Mus i kontrolgrupperne modtog injektioner på 0,2 ml fysiologisk saltvand efter samme skema. Mus, som modtog 5'-0-palrmtoylnucleosidderivater blev givet 8 mikromol kun én gang pr. dag i de fire følgende dage efter bestråling; således modtog de kun en tredjedel af den molære mængde af nucleosider som blev givet til de mus, der modtog 10 enten ikke-derivatiserede eller acetylerede nucleosider.
Dødeligheden blev fulgt dagligt i 30 dage.
Resultater af diskussion LD 50/30 (den strålingsdosis som giver 50% dødelighed inden for 30 dage efter bestrålingen) i denne musestamme er ca. 650 R. Ved de afprøvede doser fandt 15 eventuelle dødsfald sted 12-20 dage efter bestråling, hvilket er karakteristisk for letal knoglemarvssvigt efter bestråling.
Ved den laveste strålingsdosis afprøvet i dette forsøg (675 R), overlevede kun 20% af de saltvandsbehandlede kontrolmus; ingen kontroldyr overlevede nogen af de højere strålingsdoser (tabel 1). Administrering af deoxyribonucleosider ef-20 ter bestråling gav ingen væsentlig forbedret overlevelse i forhold til mus i kontrolgruppen.
I modsætning hertil overlevede dyr behandlet med di-O-acetyl-deoxyribonudeo-sider efter bestråling strålingsdoser som var letal for dyr der fik enten deoxyribonucleosider eller saltvand (770 R til 750 R). Mus behandlet med S'-O-palmi-25 toyldeoxyribonucleosider overlevede også strålingsdoser, som var letale for ubehandlede mus (750 R). Det er tydeligt, at palmitoylderivaterne (8 mikromol administreret en gang dagligt) er mindst ligeså effektiv til forbedring af overlevelsen af bestrålede mus som en tre gange højere dosis af di-O-acetylnucleo-sider (8 mikromol administreret tre gange dagligt).
DK 174400 B1 41
Midler som forbedrer overlevelsen ved administrering efter besråling gør dette ved forbedring af proliferation og differentiation af overlevende hæmatopoietiske stamceller. Det står derfor klart, at nucleosidderivaterne ifølge opfindelsen vil være nyttige i andre tilfælde af knoglemarvspåvirkning, som f.eks. optræder ef-5 ter behandling med visse antineoplastiske midler.
TABEL 3
Procentdel af overlevende mus 30 dage efter potentiel letal gamma-bestråling 10 Strålingsdosis (R) 675 700 725 750
Behandling % overlevelse efter 30 dage 15 Saltvand (kontrol) 20 0 0 0 deoxyribonucleosider 40 0 0 0 di-O-acetyldeoxyribonucleosider 100 100 100 100 S'-O-palmitoyldeoxyribonucleosider - - - 100 20 Mus behandledes med de angivne midler efter gamma-bestråling som beskrevet i teksten Sårheling
Til fremme af helingen af hudsår (hvad enten de skyldes kirurgiske indgreb eller 25 tilskadekomst), er det bedst at applikere acyldeoxyribonucleosidderivater topisk, enten i en salve i bionedbrydelige mikrokapsler eller inkorporeret i plastre. Et topisk antibiotikum kan coadministreres. Den molære ækvivalent til 2-20 mg af en blanding af alle fire betydeligste deoxyribonucleosider bør påføres pr. cm2 sårareal eller 1-10 mg pr. cm lineær incision. Især igangsætningen af de tidlig-30 ste faser af sårheling accelereres.
42 DK 174400 B1
Leverregenerering
Acylderivater af deoxyribonucleosider er nyttige til fremme af regenerering af en beskadiget eller syg lever, især til fremskyndelse af leverens vækst efter kirurgisk fjernelse af en del af denne. I dette tilfælde foretrækkes oral administrering 5 af derivaterne i doser svarende til molære ækvivalenter på 0,2-2 gram af hvert nucleosid. Det er vigtigt at derivater af alle de fire vigtigste deoxyribonucleosider coadministreres.
Claims (11)
1. Acylderivater af 2'-deoxyadenosin med formlen (I) nhr3 XC-N I II II HC-is. /C. XH N N R]0\ CH2„ i HC CH V 4 <j:h-ch2 or2 (i) 5 hvori Ri, R2 og R3 er ens eller forskellige og hver er H eller en acylgruppe afledt af (a) en uforgrenet fedtsyre med 3-22 carbonatomer, (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, 10 glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, forudsat at R2 ikke er afledt fra leucin, og R3 ikke er afledt fra glycin eller threonin, |c) nicotinsyre, eller fd) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, forudsat at R1( R2 og R3 ikke alle er H, og hvis R3 ikke er H, kan Ri og/eller R2 15 også være acetyl, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
2. Acylderivater af 2'-deoxyguanosin med formlen (II) 44 DK 174400 B1 O HN^ >-N R jjj I II II R<N-c<v. /Cv XH N N R.Ox. CH2- HC CH V 4 <j:h"CH2 or2 (il) hvori Ri, R2 og R3 er ens eller forskellige og hver er H eller en acylgruppe afledt af 5 (a) en uforgrenet fedtsyre med 3-22 carbonatomer, idet Ri og R2 ikke begge er afledt af N-betulinsyre når R3 er H, (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, 10 (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, forudsat at Ri, R2 og R3 ikke alle er H, og hvis R3 ikke er H, kan Ri og/eller R2 også være acetyl, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
3. Acylderivater af 2’-deoxycytidin med formlen (III) DK 174400 B1 45 nhr3 r r /CH O N RiO\ CH2n i I HC CH V 4 CH-CH? or2 (111) hvori Ri, R2 og R3 er ens eller forskellige og hver er H eller en acylgruppe afledt af 5 (a) en uforgrenet fedtsyre med 3-22 carbonatomer, (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller 10 (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, forudsat at Ri, R2 og R3 ikke alle er H, og hvis R3 ikke er H, kan Ri og/eller R2 også være acetyl, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
4, Acylderivater af 2'-deoxythymidin med formlen (IV) 46 DK 174400 B1 O R3ijJ /CH O N RiO^ CFl· HC CH2 V 4 C^H"CH OR2 (IV) hvori R2 og R3 er H, og Ri er en acylgruppe afledt af (a) en uforgrenet fedtsyre med 18-22 carbonatomer, 5 (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, 10 og farmaceutisk acceptable salte deraf.
5. Acylderivater af 2'-deoxythymidin mød formlen (IV) DK 174400 B1 47 O R,N C —CH, '! II /CH n Λ CT N RiO^ CH 2^ t HC CFb V 4 (^H-CH OR2 (IV) hvori Ri og R3 er H, og R2 er en acylgruppe afledt af (a) en uforgrenet fedtsyre med 3-13 eller 15-22 carbonatomer, 5 (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, 10 og farmaceutisk acceptable salte deraf. 48 DK 174400 B1
6. Acylderivater af 2'-deoxythymidin med formlen (IV) O II R3N y —ch3 /CH O N RiO^. CH2 n i I HC CHi V 4 <j:H*CH or2 (iv) hvori R3 er H, og Ri og R2 er ens eller forskellige og hver for sig er en acylgrup-pe afledt af 5 (a) en uforgrenet fedtsyre med 5-22 carbonatomer, (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, camitin og omithin, (c) nicotinsyre, eller 10 (d) en dicarboxylsyre med 3*22 carbonatomer, og farmaceutisk acceptable salte deraf.
7. Acylderivater af 2'-deoxythymidin med formlen (IV) 49 DK 174400 B1 O II RjN |[~CHj /CH R|0^° V HC CH-) V 4 “ CH*CH or2 (IV) hvori Ri og R2 er ens eller forskellige og hver er en acylgruppe afledt af (a) en uforgrenet fedtsyre med 2-22 carbonatomer, 5 (b) en aminosyre valgt blandt glycin og L-formerne af alanin, valin, leucin, isoleucin, tyrosin, prolin, hydroxyprolin, serin, threonin, cystein, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, lysin, histidin, carnitin og ornithin, (c) nicotinsyre, eller (d) en dicarboxylsyre med 3-22 carbonatomer, 10 forudsat at Ri og R2 ikke begge er valgt fra (a), og R3 er en acylgruppe afledt af nicotinsyre, benzoesyre eller p-aminobenzoesyre, og farmaceutisk acceptable salte deraf. 50 DK 174400 B1
8. Farmaceutiske præparater indeholdende en eller flere forbindelser ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 og en farmaceutisk acceptabel bærer.
9. Farmaceutiske præparater ifølge krav 8, som yderligere indeholder mindst én 5 radioprotektiv forbindelse valgt blandt WR-2721, NAC, DDC, cysteamin, 2-mer- captoethanol, mercaptoethylamindithiothreitol, glutatihion, 2-mercaptoethansul-fonsyre, WR-1065, nicotinamid, 5-hydroxytryptamin, 2-p-aminoethyl-isothiouro-nium-Br-HBr, glucaner, GLP/B04, GLP/B05, OK-432, Biostim, PSK, Lentinan, Schizophyllan, Rhodexman, Levan, Mannozym, MVE-2, MNR, MMz, IL-1, TNF, 10 thymic faktor TF-5, glutathionperoxidase, superoxiddismutase, katalase, gluta-thionreduktase, glutathiontransferase, selen, CdCI2, MnCb, Zn-acetat, Vitamin A, β-caroten, prostaglandiner, tocopherol, methylenblåt og PABA.
10. Farmaceutiske præparater ifølge krav 8 eller 9 indeholdende 0-50 mol-% af 15 et acylderivat af 2'-deoxycytidin, 0-50 mol-% af et acylderivat af 2'-deoxygua- nosin, 0-50 mol-% af et acylderivat af 2'-deoxythymidin og 0-50 mol-% af et acylderivat af 2'-deoxyadenosin, idet det totale indhold af acyldeoxyribonucleo-sider er 100 mol-%. 20
11. Farmaceutiske præparater ifølge krav 10 indeholdende 25 mol-% af hvert af de nævnte acyldeoxyribonucleosider.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11592387A | 1987-10-28 | 1987-10-28 | |
US11592387 | 1987-10-28 | ||
US8803824 | 1988-10-27 | ||
PCT/US1988/003824 WO1989003838A1 (en) | 1987-10-28 | 1988-10-27 | Acyl deoxyribonucleoside derivatives and uses thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK318089D0 DK318089D0 (da) | 1989-06-27 |
DK318089A DK318089A (da) | 1989-08-28 |
DK174400B1 true DK174400B1 (da) | 2003-02-10 |
Family
ID=22364166
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198903180A DK174400B1 (da) | 1987-10-28 | 1989-06-27 | Acylderivater af deoxyribonucleosider og farmaceutiske præparater indeholdende disse |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6020320A (da) |
EP (2) | EP0355131B1 (da) |
JP (2) | JP2637534B2 (da) |
KR (1) | KR890701609A (da) |
AT (2) | ATE142221T1 (da) |
CA (1) | CA1329932C (da) |
DE (2) | DE3856557T2 (da) |
DK (1) | DK174400B1 (da) |
FI (2) | FI91764C (da) |
HK (1) | HK1004854A1 (da) |
IL (1) | IL88204A (da) |
IN (1) | IN167609B (da) |
NO (1) | NO174392C (da) |
WO (1) | WO1989003838A1 (da) |
ZA (1) | ZA888083B (da) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5470838A (en) | 1987-10-28 | 1995-11-28 | Pro-Neuron, Inc. | Method of delivering exogenous uridine or cytidine using acylated uridine or cytidine |
US6743782B1 (en) * | 1987-10-28 | 2004-06-01 | Wellstat Therapeutics Corporation | Acyl deoxyribonucleoside derivatives and uses thereof |
US7776838B1 (en) | 1987-10-28 | 2010-08-17 | Wellstat Therapeutics Corporation | Treatment of chemotherapeutic agent and antiviral agent toxicity with acylated pyrimidine nucleosides |
US6060459A (en) | 1987-10-28 | 2000-05-09 | Pro-Neuron, Inc. | Enhancing blood cell count with oxypurine nucleosides |
US6329350B1 (en) * | 1987-10-28 | 2001-12-11 | Pro-Neuron, Inc. | Pyrimidine nucleotide precursors for treatment of systemic inflammation and inflammatory hepatitis |
US5736531A (en) | 1987-10-28 | 1998-04-07 | Pro-Neuron, Inc. | Compositions of chemotherapeutic agent or antiviral agent with acylated pyrimidine nucleosides |
US5968914A (en) * | 1987-10-28 | 1999-10-19 | Pro-Neuron, Inc. | Treatment of chemotherapeutic agent and antiviral agent toxicity with acylated pyrimidine nucleosides |
US5691320A (en) * | 1987-10-28 | 1997-11-25 | Pro-Neuron, Inc. | Acylated pyrimidine nucleosides for treatment of systemic inflammation and inflammatory hepatitis |
IE980216A1 (en) * | 1989-04-17 | 2000-02-23 | Scotia Holdings Plc | Anti-virals |
AU663309C (en) * | 1991-02-08 | 2002-08-08 | Pro-Neuron, Inc. | Oxypurine nucleosides and their congeners, and acyl derivatives thereof, for improvement of hematopoiesis |
DE69232070T2 (de) * | 1991-07-05 | 2002-06-06 | Pro-Neuron, Inc. | Behandlung der toxischen wirkung von chemotherapeutischen und antiviralen wirkstoffen mit acylierten pyrimidinnukleosiden |
GB2260319B (en) * | 1991-10-07 | 1995-12-06 | Norsk Hydro As | Acyl derivatives of nucleosides and nucleoside analogues having anti-viral activity |
EP1486210A1 (en) * | 1992-12-08 | 2004-12-15 | Wellstat Therapeutics Corporation | Pyrimidine nucleotide precursors for treatment of inflammatory hepatitis |
US5641758A (en) * | 1993-11-10 | 1997-06-24 | Kluge; Michael | Cytarabine derivatives, the preparation and use thereof |
MX9700109A (es) | 1994-07-01 | 1997-04-30 | Pro Neuron Inc | Precursores nucleotidos de pirimidina para el tratamiento de inflamaciones sistemicas y hepatitis inflamatoria. |
EP0882734B1 (en) * | 1997-06-02 | 2009-08-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | 5'-Deoxy-cytidine derivatives |
US20020006913A1 (en) * | 1997-11-04 | 2002-01-17 | Von Borstel Reid W. | Antimutagenic compositions for treatment and prevention of photodamage to skin |
AU2090099A (en) * | 1997-12-16 | 1999-07-05 | William Darwin Garner | Reduction of uv induced skin cancer by topical amines |
US6444652B1 (en) | 1998-08-10 | 2002-09-03 | Novirio Pharmaceuticals Limited | β-L-2'-deoxy-nucleosides for the treatment of hepatitis B |
CA2340156C (en) | 1998-08-10 | 2007-10-23 | Novirio Pharmaceuticals Limited | .beta.-l-2'-deoxy-nucleosides for the treatment of hepatitis b |
KR100879559B1 (ko) | 1999-02-23 | 2009-01-22 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 미토콘드리아 장애의 치료 또는 예방용 제약조성물 |
US6576619B2 (en) * | 1999-05-24 | 2003-06-10 | Cv Therapeutics, Inc. | Orally active A1 adenosine receptor agonists |
US6787526B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-09-07 | Idenix Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides |
US6875751B2 (en) | 2000-06-15 | 2005-04-05 | Idenix Pharmaceuticals, Inc. | 3′-prodrugs of 2′-deoxy-β-L-nucleosides |
DE10117615A1 (de) * | 2001-04-07 | 2002-10-10 | Max Delbrueck Centrum | Verwendung von Nucleosiden, Nucleobasen und deren Derivaten zur verbesserten Gewinnung von adulten Stammzellen |
TWI244393B (en) | 2002-08-06 | 2005-12-01 | Idenix Pharmaceuticals Inc | Crystalline and amorphous forms of beta-L-2'-deoxythymidine |
SI1572095T1 (sl) | 2002-09-13 | 2015-12-31 | Novartis Ag | Beta-l-2'-deoksinukleozidi za uporabo pri zdravljenju odpornih sevov hbv |
EP2187894B1 (en) | 2007-08-16 | 2020-03-18 | The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. | D. radiodurans extract containing nucleosides and manganese |
CA2751563A1 (en) * | 2009-02-04 | 2010-08-12 | Jelena Mann | Methods of inhibiting fibrogenesis and treating fibrotic disease |
ES2647584T3 (es) | 2010-04-29 | 2017-12-22 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Método para producir vacunas que comprende la irradiación de microorganismos en una composición que comprende aminoácidos y ortofosfato de manganeso |
US9446064B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-09-20 | Epizyme, Inc. | Combination therapy for treating cancer |
AU2021202658A1 (en) | 2021-04-28 | 2022-11-17 | Fondazione Telethon | Gene therapy |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3847898A (en) * | 1969-05-27 | 1974-11-12 | Upjohn Co | N4-trihaloethoxy carbonyl arabino-furanosyl cytosine 5'-esters |
US3585188A (en) * | 1969-06-16 | 1971-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Process for producing 2'-deoxyuridine |
DE1941942A1 (de) * | 1969-08-18 | 1971-03-04 | Sylven Bengt Prof Dr | Neues pharmazeutisches Mittel |
FR2096712A1 (en) * | 1970-06-29 | 1972-02-25 | Giraux Georges | Steroid/b group vitamin compsns - for prevention and treatment of skin-photosensitivity disorders |
US3894000A (en) * | 1971-01-27 | 1975-07-08 | Upjohn Co | Ara-cytidine derivatives and process of preparation |
US3975367A (en) * | 1971-06-08 | 1976-08-17 | The Upjohn Company | Arabinofuranosyl N4 -aminoacyl cytosine containing compounds |
DE2147094A1 (de) * | 1971-09-21 | 1973-04-05 | Robugen Gmbh | Virostatisch wirksames arzneimittel |
US3991045A (en) * | 1973-05-30 | 1976-11-09 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | N4 -acylarabinonucleosides |
US4048432A (en) * | 1976-05-17 | 1977-09-13 | Parke, Davis & Company | 9-(3,5-Di-O-acyl-β-D-arabinofuranosyl)adenine compounds and method for their production |
FR2358155A1 (fr) * | 1976-07-15 | 1978-02-10 | Lapinet Eugene | Composition pour le traitement et la prevention de l'irritation et de l'inflammation de la peau, de l'oeil et des muqueuses |
US4675189A (en) * | 1980-11-18 | 1987-06-23 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Microencapsulation of water soluble active polypeptides |
JPS5791994A (en) * | 1980-11-26 | 1982-06-08 | Fuji Kagaku Kogyo Kk | 5'-o-(n-alkylcarbamoylalanyl)-5-fluorouridine and its preparation |
DE3100478A1 (de) | 1981-01-09 | 1982-08-12 | Dr. Thilo & Co GmbH, 8021 Sauerlach | 5'ester von pyrimidinnucleosiden mit antiviraler wirksamkeit, verfahren zur herstellung und daraus hergestellte arzneimittel |
JPS57156418A (en) * | 1981-03-19 | 1982-09-27 | Sumitomo Chem Co Ltd | Carcinostatic |
JPS5849315A (ja) * | 1981-09-18 | 1983-03-23 | Mitsui Pharmaceut Inc | 抗腫瘍剤 |
JPS58167589A (ja) * | 1982-03-26 | 1983-10-03 | Nissan Chem Ind Ltd | ピラゾ−ル誘導体、その製法および該誘導体を含有する除草剤 |
JPS58167598A (ja) * | 1982-03-29 | 1983-10-03 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | アデノシン誘導体及びその製法 |
FR2536278A1 (fr) * | 1982-11-18 | 1984-05-25 | Dupont Michele | Nouvelle composition therapeutique utile notamment pour la cicatrisation des plaies |
DE3319282A1 (de) * | 1983-05-27 | 1984-11-29 | Gödecke AG, 1000 Berlin | Verwendung von adenosin bei der behandlung von herpes |
JPS59219235A (ja) * | 1983-05-30 | 1984-12-10 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 消化性潰瘍用剤 |
WO1985000608A1 (en) * | 1983-07-20 | 1985-02-14 | Teijin Limited | Antineoplastic agent |
JPS6028929A (ja) * | 1983-07-28 | 1985-02-14 | Hokuriku Seiyaku Co Ltd | 2’−デオキシグアノシンを有効成分とする消化性潰瘍治療剤 |
JPS6064907A (ja) * | 1983-09-17 | 1985-04-13 | Risuburan Prod:Kk | 水性ゲル状化粧料 |
JPS60126220A (ja) * | 1983-12-09 | 1985-07-05 | Otsuka Pharmaceut Factory Inc | 核酸成分組成物 |
FR2556727B1 (fr) * | 1983-12-19 | 1990-01-19 | Biostabilex Labo Pharma | Nouvelles compositions therapeutiques a base d'adn a haut poids moleculaire et leur procede de preparation |
JPS60174797A (ja) | 1984-02-21 | 1985-09-09 | Funai Corp | Ν−アロイルチミジン誘導体ならびに抗腫瘍活性物質の毒性低下剤 |
DE3685315D1 (de) * | 1985-07-22 | 1992-06-17 | Teijin Ltd | Antivirus-heilmittel. |
US4762823A (en) * | 1985-10-16 | 1988-08-09 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Nucleosides of 5-monofluoromethyluracil and 5-difluoromethyluracil |
ATE146077T1 (de) * | 1986-09-22 | 1996-12-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Serotonin-antagonisten zur behandlung von wunden |
US4758533A (en) * | 1987-09-22 | 1988-07-19 | Xmr Inc. | Laser planarization of nonrefractory metal during integrated circuit fabrication |
US5246708A (en) * | 1987-10-28 | 1993-09-21 | Pro-Neuron, Inc. | Methods for promoting wound healing with deoxyribonucleosides |
JP2638949B2 (ja) * | 1988-07-06 | 1997-08-06 | トヨタ自動車株式会社 | 誘導電導機の制御方法 |
JPH0628929A (ja) * | 1992-07-09 | 1994-02-04 | Fujikura Ltd | 絶縁電線 |
JPH0634913A (ja) * | 1992-07-15 | 1994-02-10 | Oki Electric Ind Co Ltd | 密着イメージセンサの光学構成方法 |
JP3251060B2 (ja) * | 1992-08-18 | 2002-01-28 | 電気化学工業株式会社 | 窒化珪素粉末 |
JPH06123917A (ja) * | 1992-08-24 | 1994-05-06 | Fuji Photo Film Co Ltd | 写真作製装置 |
JP3454951B2 (ja) * | 1994-12-12 | 2003-10-06 | 株式会社半導体エネルギー研究所 | 半導体装置の作製方法 |
-
1988
- 1988-10-27 DE DE3856557T patent/DE3856557T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-27 DE DE3855513T patent/DE3855513T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-27 EP EP88910239A patent/EP0355131B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-27 AT AT88910239T patent/ATE142221T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-27 CA CA000581430A patent/CA1329932C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-27 JP JP63509388A patent/JP2637534B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-27 AT AT95203050T patent/ATE243039T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-27 KR KR1019890701195A patent/KR890701609A/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-10-27 WO PCT/US1988/003824 patent/WO1989003838A1/en active IP Right Grant
- 1988-10-27 ZA ZA888083A patent/ZA888083B/xx unknown
- 1988-10-27 EP EP95203050A patent/EP0712629B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-28 IN IN754/MAS/88A patent/IN167609B/en unknown
- 1988-10-28 IL IL8820488A patent/IL88204A/en not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-06-26 NO NO892642A patent/NO174392C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-06-26 FI FI893100A patent/FI91764C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-06-27 DK DK198903180A patent/DK174400B1/da not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-11-17 US US08/153,163 patent/US6020320A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-03-16 FI FI941245A patent/FI97891C/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-10-26 JP JP6299158A patent/JP2764014B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-04-29 HK HK98103631A patent/HK1004854A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK174400B1 (da) | Acylderivater af deoxyribonucleosider og farmaceutiske præparater indeholdende disse | |
US6103701A (en) | Method for enhancing hematopoiesis with acyl deoxyribonucleosides | |
EP0339075B1 (en) | Acylated uridine and cytidine and uses thereof | |
KR100309194B1 (ko) | 항바이러스화합물 | |
EP0352477A2 (en) | Use of adenosine 5'-phosphat in the treatment of cancer cachexia | |
JP2006096772A (ja) | 造血改善のためのオキシプリンヌクレオシド、およびそれらの同族体、ならびにそのアシル誘導体 | |
US6348451B1 (en) | Acyl deoxyribonucleoside derivatives and uses thereof | |
NZ231718A (en) | Pharmaceutical composition comprising a 2',3'-dideoxypurine nucleoside and a purine nucleoside phosphorylase inhibitor | |
US6743782B1 (en) | Acyl deoxyribonucleoside derivatives and uses thereof | |
US7169765B1 (en) | Acyl deoxyribonucleoside derivatives and uses thereof | |
AU610315B2 (en) | Acyl deoxyribonucleoside derivatives and uses thereof | |
US20070254853A1 (en) | Compositions and Methods for Promotion of Wound Healing | |
KR920007395B1 (ko) | 아실 데옥시리보뉴클레오시드 유도체 및 그의 사용 | |
US4044122A (en) | Method of treating herpes virus hominis infections | |
MXPA98006743A (en) | Method and composition to inhibit irreversible cellular changes, due to tension |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |