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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
(2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclopropyl)-glycin (DCG-1/4)
und
3H-DCG-1/4 der nachstehenden Formel
worin R
2 Wasserstoff
oder Tritium darstellt.
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DCG-1/4
kann als ein pharmakologisches Werkzeug zum Untersuchen der Funktion
von Gruppe II mGluR (metabotropischer Glutamatrezeptor) verwendet
werden. 3H-DCG-1/4 ist bei der Einrichtung
eines Radioligandenbindungsassays und bei der Untersuchung der Verteilung
von Gruppe II mGluR im Hirn verwendbar. Das mGluR ist ein exzitatorischer
Aminosäure
(EAA)-Rezeptor, der synaptische Exzitation im zentralen Nervensystem
beim Säuger
vermittelt.
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Nach
der unabhängigen
Entdeckung des ersten mGluR durch Sladeczeck et al. (Nature, 317,
Seite 245 (1985) und durch Nicoletti et al. (Jour. Neuro. Chem.,
46, Seite 40, (1986)) wurde die Multiplizität dieser Klasse durch Expressionsklonierungsstudien
offenbart. Bislang wurden acht mGluR (und verschiedene Splice-Varianten)
isoliert und gemäß der Sequenzhomologie,
Signaltransduktion und Pharmakologie in drei Gruppen unterteilt:
Die erste Gruppe schließt
mGluR1 und mGluR5 ein, die an IP3/Ca2+-Signaltransduktion über Aktivierung von Phospholipase
C gekuppelt sind, wohingegen die Mitglieder von Gruppe II, mGluR2
und mGluR3, sowie jene von Gruppe III, mGluR4, mGluR6, mGluR7 und
mGluR8 negativ an Adenylatcyclase gebunden sind. Das in der Konformation
begrenzte Analoge von L-Glutaminsäure (2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclopropyl)-glycin (DCG-1/4)
hat sich als eine besonders interessante Verbindung, die ein starker
Agonist von Gruppe II mGluR ist, auch wirksam als ein Agonist an
der NMDA-Rezeptorstelle erwiesen.
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Die
in der Literatur (Ohfune et al., International Patent Application
WO 93-08158, Ohfune, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3, 15,
und Ohfune et al., J. Med. Chem. 1996, 39, 407) beschriebene Synthese von
DCG-1/4 ist sehr lang (mehr als 30 Schritte) und ineffizient (nur
mg-Mengen der Verbindung können
hergestellt werden). Außerdem
ist die Synthese von der radiomarkierten Verbindung unter Verwendung
des beschriebenen Verfahrens nicht möglich.
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In
der vorliegenden Erfindung wird ein kurzes und effizientes Verfahren
für die
Synthese von DCG-1/4 in 8 Schritten, ausgehend von (–)-Feist'scher Säure, oder
in 3 Schritten, ausgehend von rac-trans-2,3-Dicarbomethoxy-1-formyl-cyclopropan,
beschrieben. Die vorliegenden Beschreibungen erlauben die Synthese
von DCG-1/4 in g-Mengen sowie die Einführung von Tritium in der Position
1' des Moleküls.
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von Verbindungen der Formel I und einer Verbindung der Formel I
an sich, worin R2 Tritium darstellt, wobei
das Verfahren die nachstehenden Schritte umfasst
- a)
Bromieren von Feist'scher
Säure (1S,2S)-3-Methylen-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure der
Formel zur Gewinnung von (1R,2R)-3-Brom-3-brommethyl-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure der
Formel und
- b) Bilden des Lactons (1RS,5R,6R)-1-Brom-4-oxo-bicyclo-[3.1.0]hexan-6-carbonsäure der
Formel IV auf der Grundlage der Verbindung der Formel III und
- c) Öffnen
des Lactonrings und Verestern der erhaltenen Verbindung zur Gewinnung
einer Verbindung der Formel worin R1 Niederalkyl
darstellt,
und
- d) Oxidieren einer Verbindung der Formel V zur Gewinnung von
(1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbo-alkyloxy-3-formyl-cyclopropan der Formel worin R1 wie
vorstehend beschrieben ist, und
- e) Enthalogenieren einer Verbindung der Formel VI zur Gewinnung
von (1R,2R)-1,2-Dicarbo-methoxy-3-formyl-cyclopropan der Formel worin R1 wie
vorstehend beschrieben ist und R2 Wasserstoff
darstellt,
und, falls erwünscht,
Einführen
von Tritium in Position 1' des
Cyclopropylrings zur Gewinnung von 3-[3H]-(1R,2R)-1,2- Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
der Formel VII, worin R2 Tritium darstellt,
und
- f) Umsetzen einer Verbindung der Formel VII oder der Verbindung
(RS)-trans-2,3-Dicarbomethoxy-1-formyl-cyclopropan mit (R)-α-Phenylglycinol
und mit einem Cyanid zur Gewinnung von (2S,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroxy-1-phenyl-ethyl]-2-(2',3'-dicarbomethoxycyclopropyl)-glycinonitril
der Formel worin R1 und
R2 wie vorstehend beschrieben sind,
und
- g) Abspalten der Richtungsgruppe und Hydrolysieren der Ester- und Nitrilgruppen
zur Gewinnung einer Verbindung der Formel I.
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Die
vorstehenden Verfahrensschritte werden nachstehend genauer beschrieben.
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Verfahren Α
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Die
Synthese von enantiomer reinen Verbindungen der Formel VII in fünf Schritten,
ausgehend von (–)-Feist'scher Säure, wird
in diesem Verfahren beschrieben.
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Ausgehend
von (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan (VI)
ist es möglich, (1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
(VII-1) sowie 3H-(1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
(VII-2) herzustellen.
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Halogenierung,
vorzugsweise Bromierung, von (1S,2S)-3-Methylen-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure (II)
[a) F. Feist, Chem. Ber. 1893, 26, 747, auch kommerziell erhältlich.
b) ein modifiziertes Verfahren wird beschrieben in: A. T. Blomquist,
D. T. Longone, J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 2012. c) optische Auftrennung:
W. von E. Doering, H. D. Roth, Tetrahedron 1970, 26, 2825).] unter
Verwendung von Standardverfahren ergab (1R,2R)-3-Brom-3-brommethyl-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure (III),
welche dann in Wasser erhitzt wird, unter Gewinnung von (1RS,5R,6R)-1-Brom-4-oxa-bicyclo[3.1.0]hexan-6-carbonsäure (VI). Öffnen des
Lactons und Veresterung wird mit Säuren in Alkoholen, vorzugsweise
Schwefelsäure
in MeOH, durchgeführt
unter Gewinnung von (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-hydroxymethyl-cyclopropan
(V), welches dann durch Verwendung von Standardverfahren, bevorzugt
PCC (Pyridiniumchlorochromat) oxidiert wird, unter Gewinnung von
(1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan (VI).
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Enthalogenierung
kann unter Verwendung von Standardverfahren, vorzugsweise durch
Behandlung von (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
(VI) mit Zink in Essigsäure
oder alternativ mit Tributylzinnhydrid in Diethylether oder anderen
Ethern, erreicht werden, unter Gewinnung von (1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
(VII-1).
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Diese
Verfahren, vorzugsweise die Reaktion mit Tributylzinntritid [H.
Andres et al., PCT Int. Appl. WO 91 15 858] können für die Herstellung von 3H-(1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
(VII-2) verwendet werden.
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Weitere
Reaktion von (1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan (VII-1)
und 3H-(1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
(VII-2) werden gemäß Verfahren
B durchgeführt
unter Gewinnung von (2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclopropyl)-glycin
(I-1) [DCG-1/4] und 3H-(2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclopropyl)-glycin
(I-2) [3H-DCG-1/4].
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Verfahren B
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Diese
Synthese beginnt von (RS)-trans-2,3-Dicarbomethoxy-1-formyl-cyclopropan
(VII-3), das durch Addition von Dimethylsulfonium-3-carboxallylid
an Fumarsäuredimethylester
und Behandlung des gebildeten Cyclopropyl-Derivats mit Osmiumtetroxid/Natriummetaperjodat
gemäß einem
in der Literatur beschriebenen Protokoll [Nordlander et al., J.
Org. Chem. 39 (1974) 3814] hergestellt wird.
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Der
Schlüsselschritt
der Synthese ist eine diastereoselektive Strecker-Reaktion, die
nukleophile Addition eines Cyanidions an die Schiff'sche Base, die durch
Kondensation des racemischen Aldehyds mit optisch aktiven α-Aminoalkoholen,
vorzugsweise α-Phenylglycinol,
gebildet wird. Reaktion des Aldehyds mit (R)-α-Phenylglycinol in Alkoholen,
vorzugsweise Methanol, bei Raumtemperatur für 2 Stunden, gefolgt von Behandlung
mit der Schiff'schen
Base mit Cyanid, vorzugsweise Trimethylsilylcyanid, für 12 Stunden
bei Raumtemperatur ergab ein Gemisch von vier α-Aminonitrilen, wie zwei Haupt-
und zwei Nebenkomponenten in einem Verhältnis von ca. 8 : 2.
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Ausgedehnte
Säulenchromatographie
des Gemisches, gefolgt von Kristallisation ergab (2S,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroxy-1-phenyl-ethyl]-2-(2',3'-dicarbo-methoxycyclopropyl)glycinonitril
(VIII).
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Spaltung
der Richtungsgruppen kann durch Standardverfahren, vorzugsweise
oxidative Spaltung mit Bleitetraacetat, Säurehydrolyse (6 N HCl) und
Ionaustauschchromatographie an Dowex 50WX4, durchgeführt werden
unter Bereitstellung von (2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclopropyl)-glycin
(I) [DCG-1/4].
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Das
nachstehende Reaktionsschema erläutert
die Verfahrensschritte für
die Herstellung der Verbindung der Formel I genauer.
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Verfahren Α
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Ausgehend
von (1S,2S)-3-Methylen-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure [(–)-Feist'sche Säure] (II)
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a) (1R,2R)-3-Brom-3-brommethyl-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure
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Zu
einer gekühlten
(0°) und
gerührten
Lösung
von (1S,2S)-3-Methylen-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure [(–)-Feist'sche Säure] (4,0 g, 28,2 mMol) in
Diethylether (250 ml) wurde Brom (2 ml) gegeben und das Rühren wurde über einen
Zeitraum von 16 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Filtration, Verdampfung
des Lösungsmittels
und Kristallisation des Rohprodukts aus Dichlormethan/Hexan ergab
(1R,2R)-3-Brom-3-brommethyl-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure (5,45
g, 64%) als einen schwach braunen Feststoff. Fp. 233°C (Zersetzung);
[α]20 D = +80° (c = 0,25
in MeOH); 1H NMR (DMSO-d6):
d 2,58 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 2,63 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 4,07 (d, J
= 11 Hz, 1H), 4,17 (d, J = 11 Hz, 1H). MS (FAB) m/z 299, 301, 303
[M – H+].
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b) (1RS,5R,6R)-1-Brom-4-oxa-bicyclo[3.1.0]hexan-6-carbonsäure
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Eine
Lösung
von (1R,2R)-3-Brom-3-brommethyl-cyclopropan-1,2-dicarbonsäure (5,4
g, 17,9 mMol) in Wasser (100 ml) wurde unter Rückflussbedingungen über einen
Zeitraum von 4 h gekocht. Filtration, Verdampfung des Lösungsmittels
und Säulenchromatographie
des Rohprodukts (Dichlormethan/Methanol 9 : 1) ergab 2,75 g eines
Feststoffs. Weitere Kristallisation aus Dichlormethan/Hexan ergab
(1RS,5R,6R)-1-Brom-4-oxa-bicyclo[3.1.0]hexan-6-carbonsäure (2,41
g/61%) als einen hellgelben Feststoff. Fp. 196–198°C; [α]20 D = –36° (c = 0,25
in MeOH); 1H NMR (DMSO-d6):
d 2,64 (d, J = 3 Hz, 1H), 2,93 (d, J = 3 Hz, 1H), 4,56 (d, J = 10
Hz, 1H), 4,71 (d, J = 10 Hz, 1H). MS (EI) m/z 220, 222 [M+], 202, 204 (48) [M+ – H2O], 123 (100) [M+ – H2O, –Br],
97 (98).
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c) (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-hydroxymethyl-cyclopropan
-
Zu
einer gerührten
Lösung
von (1RS,5R,6R)-1-Brom-4-oxabicyclo[3.1.0]hexan-6-carbonsäure (2,41 g,
10,9 mMol) in Methanol (25 ml) wurde Schwefelsäure (konz., 2,5 ml) gegeben
und das Rühren über einen Zeitraum
von 2 h fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eis/Wasser (100
ml) gegossen und mit zwei 100 ml-Portionen Essigsäureethylester
extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser
(50 ml) und zwei 50 ml-Portionen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen,
getrocknet (MgSO4) und eingedampft unter
Gewinnung von (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-hydroxymethylcyclopropan (2,85
g, 97%) als ein hellgelbes Öl.
[α]20 D = +98,4° (c = 0,25
in MeOH); 1H NMR (CDCl3):
d 2,66 (dd, J = 6,8 Hz, 1H), 2,70 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 2,87 (d,
J = 6,5 Hz, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,80 (s, 3H), 3,99 (dd, J = 8, 12,5
Hz, 1H), 4,16 (dd, J = 6, 12,5 Hz, 1H). MS (EI) m/z 267, 269 [M
+ H+], 249, 251 (3) [M+ –OH], 235,
237 (14) [M+ –OMe], 207, 209 (94), 175,
177 (82), 169 (83), 155 (46), 113 (100), 59 (76).
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d) (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
-
Zu
einer gerührten
Lösung
von (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-hydroxymethyl-cyclopropan (2,8
g, 10,5 mMol) in Dichlormethan (120 ml) wurde Pyridiniumchlorochromat
(3,35 g, 15,7 mMol) gegeben und das Rühren wurde über einen Zeitraum von 16 h
fortgesetzt. Diethylether (120 ml) wurde zu dem Reaktionsgemisch
gegeben, das dann mit Hilfe eines Whatmanglasmikrofaserfilters filtriert
und verdampft wurde. Säulenchromatographie
des Rohprodukts (Diethylether/Hexan 1 : 1) ergab (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
(1,93 g, 69%) als einen weißen
Feststoff. Fp. 52°C;
[α]20 D = +108° (c = 0,25
in MeOH); 1H NMR (CDCl3):
d 3,16 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 3,27 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 3,76 (s, 3H),
3,83 (s, 3H), 9,26 (s, 1H). MS (EI) m/z 265, 267 [M + H+],
233, 235 (24) [M+ –OMe], 204, 206 (24), 176,
178 (44), 153 (100), 125 (95), 59 (69).
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e) (1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
-
Ein
Gemisch von (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan (428 mg, 1,6 mMol), Zinkpulver
(230 mg, 3,5 mMol) und Essigsäure
(2 ml) wurde über
einen Zeitraum von 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Filtration, Verdampfung
und Säulenchromatographie
ergab (1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formylcyclopropan (265 mg, 88%)
als ein farbloses Öl.
[α]20 D = –48° (c = 1 in
MeOH); 1H NMR (CDCl3):
d 2,53 (ddd, J = 5, 6, 8 Hz, 1H), 2,71 (dd, J = 6, 8 Hz, 1H), 3,01
(t, J = 6 Hz, 1H), 3,76 (s, 6H), 9,42 (d, J = 5 Hz, 1H); MS (FAB)
m/e 187 [M + H+].
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f) (2R,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroxy-1-phenyl-ethyl]-2-(2',3'-dicarbomethoxy-cyclopropyl)-glycinonitril
-
Zu
einer Lösung
von (1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan (256 mg, 1,38
mMol) in Methanol (15 ml) wurde (R)-α-Phenylglycinol (189 mg, 1,38
mMol) gegeben und die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur
5 h gerührt.
Nach Kühlen
auf 0°C
wurde TMSCN (0,34 ml, 2, 75 mMol) zugegeben und das erhaltene Gemisch
wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Verdampfung des Lösungsmittels
ergab ein gelbes Öl,
das dann durch Säulenchromatographie
(Essigsäureethylester/Hexan
1 : 1) gereinigt wurde, unter Gewinnung von (2S,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroxy-1-phenyl-ethyl]-2-(2',3'-dicarbomethoxy-cyclopropyl)-glycinonitril (387
mg, 84%) als ein farbloses Öl.
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Verfahren B
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Ausgehend
von (RS)-trans-2,3-Dicarbomethoxy-1-formylcyclopropan (VII-3)
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a) (2S,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroxy-1-phenyl-ethyl]-2-(2',3'-dicarbomethoxycyclopropyl)-glycinonitril
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Zu
einer Lösung
von (RS)-trans-2,3-Dicarbomethoxy-1-formyl-cyclopropan (3,11 g, 16,7 mMol)
in Methanol (110 ml) wurde (R)-α-Phenylglycinol
(2,29 g, 16,7 mMol) gegeben und die erhaltene Lösung wurde 2 h bei Raumtemperatur
gerührt.
Nach Kühlen
auf 0°C
wurde TMSCN (4,2 ml, 33,4 mMol) zugegeben und das erhaltene Gemisch
wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Verdampfung des Lösungsmittels
ergab ein gelbes Öλ, das dann
wie nachstehend gereinigt wurde:
(1) Säulenchromatographie (Essigsäureethylester/Hexan
2 : 1) ergab 1,32 g (24%) eines farblosen Öls, 2,15 g (39%) eines hellgelben Öls (Gemisch)
und 1,51 g (27%) eines farblosen Öls. (2) Säulenchromatographie (Essigsäureethylester/Hexan
2 : 1) des Gemisches (2,15 g) ergab 0,98 g eines farblosen Öls und 1,08
g eines farblosen Öls.
Weitere Abtrennung des Gemisches wurde durch Kristallisation aus
Diethylether/Hexan durchgeführt
unter Gewinnung von (2S,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroχy-1-phenyl-ethyl]-2-(2',3'-dicarbo-methoxycyclopropyl)-glycinonitril
(1,43 g, 26%) als ein hellgelbes Öl. IR (KBr) ν 1070 (OH),
1190 (Ester), 1720 (Ester), 2227 (CN). MS (FAB) m/z 333 (M + H+). [α]20 D = –90,4° (c = 0,25
in MeOH). NMR (CDCl3): d 1,61 (br, 1H),
1,89 (br, 1H), 2,19 (m, 2H), 2,42 (dd, J = 8,5, 9 Hz, 1H), 3,61
(m, 1H), 3,64 (s, 3H), 3,74 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,80 (dd, J =
4,9 Hz, 1H), 4,09 (dd, J = 4,8 Hz, 1H), 7,36 (m, 5H).
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b) (2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclopropyl)-glycin
(DCG-1/4)
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Blei(IV)acetat
(2,10 g, 4,73 mMol) wurde zu einer kalten (0°C), gerührten Lösung von (2S,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroxy-1-phenyl-ethyl]-2-(2',3'-dicarbo-methoxy-cyclopropyl)-glycinonitril
(1,43 g, 4,30 mMol) in wasserfreiem Methanol-Dichlormethan (36 ml, 1 : 1) gegeben.
Nach 15 Minuten wurde Wasser (36 ml) zugegeben und das erhaltene
Gemisch wurde mit Hilfe von Celite filtriert. Nach Verdampfung des
Lösungsmittels
wurde der Rückstand
in 6 N HCl (100 ml) 12 h unter Rückfluss
erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit Dichlormethan (jeweils
30 ml) gewaschen und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand
wurde Ionenaustauschharz-Chromatographie (Dowex 50 WX4) unterzogen
unter Gewinnung von (2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclo-propyl)-glycin
(0,55 g, 54%) als einen weißen hygroskopischen
Schaum (Diammoniumsalz). Fp. 171–173°C (Zersetzung). [α]20 D = –43,6° (c = 0,25
in H2O). NMR (D2O):
d 1,93 (ddd, J = 6, 9,5, 10 Hz, 1H), 2,07 (dd, J = 5,5, 6 Hz), 2,17
(dd, J = 5,5, 9,5 Hz), 4,03 (d, J = 10 Hz). MS (FAB) m/z 204 (M
+ H+).
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Synthese
von 3H-(2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclopropyl)-glycin
(3H-DCG-1/4) (I-2), ausgehend von (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
(VI).
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a) 3H-(1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formyl-cyclopropan
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Ausgehend
von 250 μl
1,39 M n-Butyllithium (0,347 mMol) wurde eine Lösung von 0,78 ml Lithiumtriethylborantritid
gemäß dem Verfahren
von Andres et al. [H. Andres et al., PCT Int. Appl. WO 91 15 858]
hergestellt:
0,94 ml Tri-n-butylzinnchlorid wurden zugegeben
und die Lösung
wurde 15 min gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde lyophilisiert, das Vakuum wurde mit trockenem
Stickstoff entlastet und der Zweihalskolben wurde von der Tritiierungsapparatur
entfernt.
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Der
Rückstand
wurde in 2 ml n-Heptan suspendiert und diese Suspension wurde auf
eine 0,5 g Kieselgelpatrone (Chromabond, Machery Nagel, #730073)
aufgetragen. Die Patrone wurde mit drei aliquoten Mengen von 1 ml
n-Heptan gespült.
Die gesamte 3H-Aktivität des n-Heptan-Eluats war 5,03
Ci. Das Eluat wurde lyophilisiert und der Rückstand von reinem Tri-n-butylzinntritid
wurde in 1 ml Cyclohexan-Tetrahydrofuran 1 : 1 unter Argon gelöst. 48 mg
(0,181 mMol) (1R,2R)-3-Brom-1,2-dicarbomethoxy-3-formylcyclopropan
und 1,2 mg 2,2'-Azobisisobutyronitril
(AIBN) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 18 h bei
50°C gerührt. Dann
wurde 1 ml gesättigte
Kaliumfluoridlösung
zugegeben und das Rühren
wurde 1 h bei RT fortgesetzt. Aufteilen zwischen Diethylether und
Eis/Wasser, Waschen der organischen Schichten mit gesättigter
Natriumchloridlösung
und Trocknen über
wasserfreiem Natriumsulfat ergab ein Rohprodukt mit einer 3H-Aktivität von insgesamt 4,84 Ci. Säulenchromatographie
an 9 g LichroprepSi60 15–25 μm (Merch
#1.09336) mit n-Hexan-Diethylether 1 : 1 lieferte 2,18 Ci2) des Produkts. Die radiochemische Reinheit
war 96% gemäß DC. Der Verlust
an 3H-Aktivität während Chromatographie
war wahrscheinlich auf Grund Wasserstoffaustausch, der durch leicht
saures Kieselgel katalysiert wurde. Es wird deshalb empfohlen, Chromatographie
an dieser Stufe der Synthese wegzulassen.
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b) 3H-(2S,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroxy-1-phenyl-ethyl]-2-(2',3'-dicarbomethoxy-cyclopropyl)-glycinonitril
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1,3
Ci von 3-[3H]-(1R,2R)-1,2-Dicarbomethoxy-3-formylcyclopropan
und 6,8 mg (0,05 mMol) D-Phenylglycinol in 0,45 ml trockenem Methanol
wurden 6 h bei RT gerührt.
12 μl (0,096
mMol) Trimethylsilylcyanid wurden bei 0°C zugegeben und das Rühren wurde
15 h bei RT fortgesetzt. Säulenchromatographie
an 7 g LichroprepSi6O 15,25 μm
mit n-Hexan-Essigsäureethylester
1 : 1 lieferte 456 mCi 3H-Aktivität von Produkt (2S,2'R,3'R)-N-[(R)-2-Hydroxy-1-phenyl-ethyl]-2-(1'-[3H],2'3'-dicarbomethoxycyclopropyl)-glycinonitril.
-
c) 3H-(2S,2'R,3'R)-2-(2,3-Dicarboxylcyclopropyl)-glycin
(DCG-1/4)
-
Zu
einer Lösung
von 4,2 mg (0,0126 mMol) von 1 (insgesamt 3H-Aktivität 220 mCi)
in 0,5 ml Dichlormethan-Methanol 1 : 1 wurden 6,7 mg (0,015 mMol)
Bleitetraacetat bei 0°C
unter Argon gegeben und das Gemisch wurde 15 min bei dieser Temperatur
gerührt.
Die Lösungsmittel
wurden verdampft, 1,5 ml 6 N Salzsäure wurden hinzugegeben und
das Reaktionsgemisch wurde 15 h bei 100°C gerührt. Das Rohprodukt wurde zwischen
Dichlormethan und Wasser verteilt und die wässrige Phase wurde lyophilisiert.
Der Rückstand
wurde in 5 ml Wasser gelöst
und diese Lösung
wurde auf eine kleine Kationaustauschsäule (5 × 50 mm, 0,6 g Dowex 50 W × 4 H+-Form) aufgetragen. Nach Spülen mit
15 ml Wasser wurde das DCG-1/4 mit 20 ml 2 N Ammoniumhydroxidlösung eluiert.
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HPLC-Reinigung
von 35 mCi von dieser Probe lieferte 14,2 mCi Produkt. HPLC-Bedingungen:
Säule: LiChrocart
Superspher RP-18e 5 μm
4 × 250
mm Merck #16858 mobile Phase: 20 mM Orthophosphorsäure, Fließgeschwindigkeit:
0,5 ml/min, UV-Detektion bei 205 nm. Um von der Orthophosphorsäure zu befreien,
wurde die Lösung
von 3H-DCG-1/4 auf eine SP-Sephadex-Kationaustauschsäule (H+-Form, 10 × 100 mm) aufgetragen. Nach
Waschen mit zwei aliquoten Mengen Wasser von 10 ml wurde das 3H-DCG-1/4 mit 2 N Ammoniumhydroxidlösung unter
Verwendung eines Fraktionssammlers eluiert. Die gesamte 3H-Aktivität des Produkts 11,7 mCi. Die
radiochemische Reinheit war 98,3% gemäß DC (Kieselgel 60, n-Butanol-Essigsäure-Wasser
3 : 1 : 1). Die spezifische Aktivität, bestimmt durch HPLC, war
17,5 Ci/mMol.