DE69812630T2

DE69812630T2 - Integrinbindendes peptid und dessen verwendung

Info

Publication number: DE69812630T2
Application number: DE69812630T
Authority: DE
Inventors: Jyrki Heino; Johanna Ivaska; Jarmo Käpylä
Original assignee: Biotie Therapies Corp
Current assignee: Biotie Therapies Corp
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2018-07-10
Also published as: NO20000126D0; ATE235510T1; PL338001A1; DE69812630D1; BR9810586A; NO20000126L; AU8341398A; AU748134B2; CA2295219A1; EP0994898A1; NZ501767A; HUP0002789A2; EP0994898B1; CA2295219C; ES2195361T3; JP2001509515A; HU225326B1; CN1262688A; RU2203902C2; KR100571046B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Proteintherapeutika. Genauer gesagt, ist die Erfindung auf cyclische Peptide und deren Verwendung gerichtet, insbesondere die Verwendung dieser Peptide, die biologische Aktivität von Integrin zu blockieren oder zu hemmen.
Hintergrund der Erfindung
Integrine sind heterodimere Zelloberflächenglycoproteine, die aus nicht-covalent assoziierten α- und β-Untereinheiten bestehen. Sechzehn α-Untereinheiten, acht β-Untereinheiten wurden bisher identifiziert. Über 20 verschiedene Kombinationen dieser Untereinheiten wurden bisher gefunden.
Integrine verankern die Zellen an ihre Umgebung, indem sie Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen vermitteln (für einen Überblick vgl. Hemler, M.E. Annu. Rev. Immunol. 8: 365– 400 (1990) und Hynes, R.O. Cell 69: 11–25 (1992) und Zitate darin). Die Erkennung der Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD)-Sequenz in extrazellulären Matrixproteinen durch Integrine ist ein fundamentales Phänomen bei der Zell-Matrix-Interaktion. Fibronektin ist der Prototyp eines RGD-enthaltenden Proteins. Zusätzlich vermitteln eine Vielzahl anderer Matrixmoleküle in Säugern, Vögeln, Fröschen und Insekten die Zelladhäsion über ihre RGD-Sequenz. Integrinheterodimere, die eine β1-, β3-, β5- oder β6-Untereinheit enthalten, können RGD-abhängige Rezeptoren erzeugen (Ruoslahti, E. J., Clin. Invest. 87: 1–5 (1991), Busk, M. et al., J. Biol. Chem. 267: 7875–7881 (1992) und Elices, M.J. et al., J. Cell Biol. 112: 169–181 (1991)). In der β1-Untereinheit wurde die RGD-Bindungsstelle an der aminoterminalen Hälfte des Moleküls kartiert und es gibt einige Beweise, die die Möglichkeit nahe legen, dass die α-Untereinheit diese Interaktion beeinflussen kann (Shih, D.T. et al., J. Cell Biol.
122: 1361–1371 (1993)). Insgesamt teilen sich zehn Integrinheterodimere die gemeinsame β1-Untereinheit und besitzen deshalb auch die vermeintliche RGD-Bindungsstelle. Die meisten β1-Integrine besitzen jedoch zusätzliche Mechanismen zur Ligandenbindung. Denaturierte fibrilläre Collagene werden von den RGD-abhängigen Integrinen wie α5β1 erkannt, während native Collagene mit Integrinen auf eine RGD-unabhängige Weise interagieren (Gullberg, D. el al., EMBO J. 11: 3865–3873 (1992)).
Zwei Integrine, die αlβ1- und α2β1-Hetreodimere, sind die zellulären Hauptrezeptoren für native Collagene und wie bei allen Integrinen hängt ihre Interaktion mit Liganden von divalenten Kationen ab (Staatz, W.D. et al., J. Biol. Chem. 266: 7363–7387 (1991)). Das Integrin α2β1 wird beispielsweise auf Epithelzellen, Blutplättchen, Granulationsgewebezellen und verschiedenen Krebszellen exprimiert. Biologische Phänomene, bei denen die α2β1-Integrinaktivität (Funktion) essentiell ist, schließen eine Collagen-induzierte Aggregation der Blutplättchen, die Zellmigration auf Collagen und die zellabhängige Neuordnung von Collagenfasern ein. In der Krebsbiologie wurde das α2β1-Integrin mit einem invasiven Zellphänotyp assoziiert, und es kann ein Marker für ein aggressives Melanom sein. Andererseits stellt die Überexpression von α2β1-Integrin in Brustkrebszellen den normalen Phänotyp wieder her. Wie andere Integrine kann α2β1 auch Signale erzeugen, die die zellulären Funktionen und die Genexpression regulieren. Insbesondere scheinen die mRNA-Spiegel von Collagenase-1 durch α2β1-Integrin kontrolliert zu werden.
Die α1- und α2-Untereinheiten unterscheiden sich in ihrer Struktur von allen anderen β1-assoziierten α-Untereinheiten in dem Sinn, dass sie eine spezielle „eingebaute" Domäne, die I-Domäne, enthalten, die der A-Domäne ähnelt, die man z. B. im von-Willenbrand-Faktor findet (Michishita, M. et al., Cell 72: 857–867 (1993)). Es ist offensichtlich, dass αlI- und α2I-Domänen für die primäre Erkennung von Collagen durch die entsprechenden Integrine verantwortlich sind. (Kamata, T. et. al., J. Biol. Chem. 269: 9659–9663 (1994); Kamata, T. et al., J. Biol. Chem. 269: 26006–26101 (1994); Kern, A. et al., J. Biol. Chem. 269: 22811–22816 (1994)). Zwei weitere Liganden für α2β1-Integrin, nämlich Laminin-1 und Echovirus-1, binden beide auch an die α2I-Domäne. Jedoch scheint der Echovirus-1 eine unterschiedliche α zu erkennen als die Matrixproteine (Bergelson, J.M. et al., J. Clin. Invest. 92: 232–239 (1993)).
Die Bindungsstellen der αlβ1- und α2β1-Integrine in Collagenen wurden in den dreifach-helikalen Bereichen der Moleküle lokalisiert (Eble, J.A. et al., EMBO J. 12: 4795–4802 (1993); Gullberg, D. et al., EMBO J. 11: 3865–3873 (1992)). Es wurde über eine von der Collagen-α-Kette abstammende Peptidsequenz berichtet, die die Integrin-Collagen-Interaktion blockiert, aber das war in vielen Studien ineffektiv und es gibt wahrscheinlich nicht die tatsächliche Bindungsstelle im Collagen wider (Cardarelli, P.M. et al., J. Biol. Chem. 267: 23159–23164 (1992); Pfäff, M. et al., Exp. Cell Res. 206: 167–176 (1993) und Tuckwell, D. et al., J. Cell Sci. 108: 1629–1637 (1995)). Es ist wahrscheinlicher, dass Collagenrezeptor-integrine Aminosäurereste von mehr als einer Collagen-α-Kette erkennen. Bei der Typ IV- Collagen-α1β1-Integrininteraktion wurde die Bedeutung eines Arginin- und zweier Asparaginsäurereste gezeigt, die alle von unterschiedlichen α-Ketten des Collagens stammen (Eble, J.A. et al.,., EMBO J. 12: 4795–4802 (1993)).
Die bekannten Matrixmolekülliganden für α2β1-Integrin enthalten keine RKK(H)-Sequenz. Es wurde gezeigt, dass ein argininreiches lineares Peptid, das eine RKK-Sequenz umfasst, die von einem Tat-Protein eines menschlichen Immunschwächevirus stammt, mit einem αVβS-Integrin interagiert (Vogel, B.E. et al., J. Cell Biol. 121: 461–468 (1993)). Man fand jedoch heraus, dass die Integrin-Peptid-Interaktion in Gegenwart von EDTA stabil war, was einen unterschiedlichen Bindungsmechanismus anzeigt. Es gibt auch eine früher beschriebene Heparinsulfat-Bindungssequenz beim Fibronektin, die ein RKK-Sequenzmotiv enthält, das jedoch offensichtlich im Bezug auf die Integrin-rβα2I-Domänen-Bindung nicht funktional ist (Drake et al., J. Biol. Chem. 268: 15859–15867 (1993)).
Das Gift von verschiedenen Schlangenarten enthält Disintegrin-ähnliche Proteine, die die Integrinfunktion der Blutplättchen blockieren und für den Antikoagulationseffekt der Gifte verantwortlich sind. Diese Proteine halfen dabei, die molekularen Mechanismen der Integrinfunktion zu verstehen, und sie haben auch einen potentiellen Wert bei der Entwicklung neuer Medikamente. Viele der Disintegrine besitzen eine RGD-Sequenz und sie hemmen die Funktion der αIIbβ3- und αVβ3-Integrine der Blutplättchen. Im Jararhagin, einer Disintegrin/Metalloproteinase aus Bothrops jararaca, wird RGD durch die Sequenz ECD ersetzt (Paine, M.J.I. et al., J. Biol. Chem. 267: 22869–22876 (1992)). Jararhagin ist ein starker Inhibitor der Collagen-induzierten Aggregation der Blutplättchen und seine Wirkung basiert auf der Hemmung der α2β1-Integrinfunktion (De Luca, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 570–576 (1995)). Der genaue Mechanismus seiner Wirkung ist bisher unbekannt. Integrin α2β1 kann auch mit Jaracetin, einem Schlangengiftprotein, interagieren, das die Disintegrindomäne von Jararhagin enthält, aber die Interaktion scheint schwächer zu sein als mit Jararhagin (De Luca, M. et al.,., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 570–576 (1995)).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt cyclische Peptide bereit, die an die menschliche α2I-Domäne (nativ und rekombinant) binden. Zusätzlich sind sie starke Inhibitoren der Interaktion von menschlichem Integrin mit Collagen I und IV und Laminin-1.
Die erfindungsgemäßen cyclische Peptide stammen ursprünglich von der Metalloproteinasedomäne von Jararhagin ab. Jedes der neuen Integrin-bindenden Proteine umfasst eine colineare Sequenz dreier Aminosäuren, Arginin-Lysin-Lysin (RKK). Das Vorliegen der RKK-Sequenz in der cyclischen Form hemmt die Integrin-bindende Aktivität.
Die Erfindung stellt ferner cyclische Peptide bereit, die eines oder mehrere Kopien der RKK-Sequenz in der Peptidsequenz enthalten, wobei derartige Kopien ausreichen, um das Peptid mit der Fähigkeit auszustatten, die Interaktion von Integrin mit Collagen zu verringern.
Die Endung stellt ferner cyclische Peptide bereit, die die Aminosäuresequenz X_IRKKX₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NR. 1) umfassen, wobei die Aminosäuren X₁-X₆ beliebige Aminosäuren sein können, aber vorzugsweise X₂ Histidin (H) ist.
Die Endung stellt ferner cyclische Peptide bereit, die vorzugsweise die Aminosäuresequenz X₁RKKX₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NR. 2) umfassen, wobei die Aminosäuren X₁-X₅ beliebige Aminosäuren sein können, aber vorzugsweise X₂ Histidin (H) ist.
Die Endung stellt ferner cyclische Peptide bereit, die stärker bevorzugt die Aminosäuresequenz X₁RKKX₂X₃X₄ (SEQ ID NR. 3) umfassen, wobei die Aminosäuren X₁-X₄ beliebige Aminosäure sein können, aber vorzugsweise X₂ Histidin (H) ist.
Die Erfindung stellt ferner zwei cyclische Peptide bereit, CTRKKHDNC (SEQ ID NR. 4) und CTRKKHDNAQC (SEQ ID NR. 5), die die Aminosäuren 241–247 (CTRKKHD, SEQ ID NR.6) bzw. 241–249 (CTRKKHDNA, SEQ ID NR. 7) der Metalloproteinasedomäne von Jararhagin und cyclische Fragmente dieser Peptide enthalten, denen eine oder mehrere Aminosäuren fehlen, insbesondere eine oder mehrere Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus C, T, H, D, N, A und/oder Q.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Verwendung dieser Peptide bereit, um die Integrinfunktion zu blockieren und um Patienten mit einem physiologischen Zustand oder einer Erkrankung zu behandeln, die einer derartigen blockierenden Aktivität bedarf.
Die cyclischen Integrin-bindenden Peptide der vorliegenden Erfindung sind auch bei der Isolierung α2-enthaltender Integrine aus einem Probengemisch nützlich.
Kurze Beschreibung der Figuren
1(A-D). Bindung von Europium-markiertem rα2I an verschiedene Substrate in einem Festphasen-Test. Die Mikrotiterplatten wurden mit Typ-I-Collagen, Typ-IV-Collagen, Laminin-1 und Fibronektin vorbeschichtet. Man ließ rα2I 3 Stunden binden (A). Man ließ rα2I an Typ-I-Collagen in Gegenwart von EDTA (B) oder MgCl₂ und verschiedene Konzentrationen des Bothrops jararaca-Giftes binden (C). Alternativ wurden Vertiefungen mit Bothrops jararaca-Gift vorbeschichtet und man ließ rα2I 3 Stunden in Gegenwart von MgCl₂ binden (D).
2(A-B). Bindung von Europium-markiertem rα2I an Adäsionsproteine und Jararhagin-abstammende Peptide in einem Festphasen-Test. Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit verschiedenen Peptiden Typ-I-Collagen, Typ-IV-Collagen und Fibronektin vorbeschichtet. Die Daten sind der Mittelwert aus drei parallelen Experimenten, die die rα2I-Bindung an verschiedene Substrate zeigen (A). Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit BSA und Typ-I-Collagen vorbeschichtet, und man ließ rα2I 3 Stunden in Gegenwart des Peptids binden (B).
3 Bindung von rα2I an Peptide und Bothrops jararaca-Gift in Gegenwart des 229ox-Peptids. Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit Peptiden oder Bothrops jararaca-Gift vorbeschichtet. Man ließ die rα2I-Domäne in Gegenwart oder Abwesenheit des 229ox-Peptids binden. Die Daten sind der Mittelwert aus drei parallelen Experimenten.
4(A-C). Eigenschaften des 229ox-Peptids. Dosis-Antwort-Kurven für die Hemmung der rα2I-Bindung an Typ-I-Collagen in Gegenwart von cyclischem oder linearem 229ox-Peptid (A). Alternativ wurden die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 229ox-Peptid vorbeschichtet (B). 229ox-Peptid wurde dem rα2I-Bindungstest auf verschiedenen vorbeschichteten Substraten zugegeben (C).
5 Die Wirkung von 229ox auf die Bindung von rα2I an Typ-I-Collagen und Echovirus-1. Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit Typ-I-Collagen und Echovirus-1 vorbeschichtet. Man ließ rα2I in Gegenwart oder Abwesenheit des Peptids binden. Die Daten sind der Mittelwert aus drei parallelen Experimenten.
6(A-B). Hemmung der Bindung von rα2I an Typ-I-Collagen durch Alaninsubstituierte 229ox-Peptide. Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit den Peptiden vorbeschichtet und man ließ rα2I binden (A). Alternativ wurden die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit Typ-I-Collagen vorbeschichtet, und rα2I wurde in Gegenwart des Peptids zugegeben (B).
7(A-C). Die α2I-Domänenpeptide (A) und rα2I (A, B) wurden an den festen Träger gebunden und biotinyliertes 229ox wurde zugegeben. Die Bindung des 229ox-Peptids an die α2I-Domänen-abstammenden Peptide ist in (A) dargestellt. Die Bedeutung von Mg⁺⁺ für die 229ox-Bindung an einen festen Träger gebundenes rα2I ist in (B) dargestellt. Die Bedeutung von Mg++ für die Bindung von rα2I an einen festen Träger gebundenes Typ-I-Collagen und an 229ox-Peptid wird in (C) dargestellt.
8 Hemmung der Bindung von rekombinantem α2I an Collagen. Die ausgefüllten Kreise zeigen die Wirkung der angegebenen Konzentrationen von 229ox (CTRKKHDNAQC; SEQ ID NR. 5). Die nicht ausgefüllten Kreise zeigen die Wirkung von 248ox (CTRKKHDNC; SEQ ID NR. 4).
9(A-B). Migration von HOS-MNNG-Zellen auf Typ-I-Collagen. Man ließ die Zellen an die Substrate binden. Nach 4 Tagen wurden die Zellen gefärbt, der von den Zellen bedeckte Oberflächenflächenbereich wurde von einem Bildanalysator bestimmt (A) und die Vertiefungen wurden photographiert (B).
10 Zelladhäsion von HaCaT- und UT-SCC-2-Zellen in Gegenwart von 229ox und Gi9-Antikörper gegen α2-Integrin.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
In der nachfolgenden Beschreibung wird eine Anzahl von Begriffen verwendet, die in der Medizin und im Fachgebiet der Proteinchemie häufig verwendet werden. Für ein deutliches und einheitliches Verständnis der Spezifikation und Ansprüche, einschließlich des Rahmens, der derartigen Begriffen gegeben werden soll, gibt es folgende Definitionen.
Mit „Patient" ist ein tierischer oder menschlicher Proband gemeint, der eine tierärztliche oder ärztliche Behandlung benötigt, insbesondere eine Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Verbindung.
Mit „Behandlung" oder „behandeln" ist die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung gemeint, die ein oder mehrere der hier beschriebenen Peptide enthält, an einen Patienten, der dasselbe/dieselbe benötigt, für Zwecke, die die Prophylaxe, Verbesserung, Prävention oder Heilung einer Erkrankung oder potentieller Erkrankung einschließen können, die derartigen Mitteln gegenüber sensitiv sind.
Mit „Verabreichung" ist das Einbringen einer gewünschten Substanz in einen Patienten durch jedes geeignete Verfahren gemeint. Nützliche Verabreichungsverfahren schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf parenterale (z. B. intravenöse), intramuskuläre, subdermale, iontophoretische, orale, rektale und enterale Verabreichung.
Mit „wirksamer Menge" ist eine Menge gemeint, die ausreicht, um den festgelegten gewünschten Endzustand zu erreichen. Eine wirksame Menge des endungsgemäßen Peptids ist eine Menge, die ausreicht, um den Grad der funktionalen Interaktion eines α2I-Domäneenthaltenden Integrins oder eines oder mehrere der Ziele, die mit dem Integrin in Abwesenheit des erfindungsgemäßen Peptids interagiert hätten, zu verringern oder zu hemmen oder zu vermeiden.
Ein „pharmazeutisch verträgliches Salz" soll Salze einschließen, die aus pharmazeutisch verträglichen Säuren oder Basen wie beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf Säuren wie Schwefel-, Salz-, Salpeter-, Phosphorsäure etc. oder Basen wie, jedoch nicht begrenzt auf Alkali-, Erdalkalimetallhydroxide, Ammoniumhydroxide, Alkylammoniumhydroxide etc. erzeugt werden.
Der Begriff „pharmazeutisch verträgliches Vehikel" soll Lösungsmittel, Träger, Verdünnungsmittel und dergleichen einschließen, die als Zusätze zu den erfindungsgemäßen Zubereitungen verwendet werden, damit ein Träger oder Adjuvans für die Verabreichung derartiger Verbindungen bereitgestellt wird.
Während die nachstehende Diskussion und die Beispielgebung oft unter Verwendung menschlicher Integrinproteine dargestellt werden, sind die erfindungsgemäßen Peptide und Verfahren bei jeder Art nützlich, die sensitiv gegenüber Schlangenbissen ist, bei denen Jararhagin ein aktiver Bestandteil des Giftes ist, da eine derartige Aktivität die Fähigkeit der endungsgemäßen Peptide nachweist, das Zielintegrin in derartigen Spezies zu binden.
Deshalb sollen die nachstehende Diskussion und Beispielgebung unter Verwendung der menschlichen Ausführungsform die Erfindung in dieser Hinsicht nicht begrenzen.
Die Erkennung von Collagen durch Integrine ähnelt der Integrin-Fibronektin-Bindung. Die Collagen-bindenden αI-Domänen und RGD-bindenden vermeintlichen βI-Domänen besitzen nicht nur strukturelle Ähnlichkeiten, sondern auch cyclische RGD-Peptide können an ein α2β1-Integrin binden. Die drei Collagenaminosäurereste, von denen man denkt, dass sie für die Integrinbindung an Collagen wichtig sind, enthalten zwei Asparaginsäuren und ein Arginin.
Die Erfinder stellten die Hypothese auf, dass das Motiv im Jararhagin, das die rα2I-Domänenbindung an Collagen blockiert, entweder Asparaginsäure- oder Argininreste enthalten muss und dass das wichtige Motiv für deine derartige Wirkung entweder in einer hydrophilen Schleife wie die bekannten Integrinerkennungstellen in Matrixmolekülen liegt oder die Schlangengift-Disintegrine in hydrophilen Schleifen liegen. Die Erfinder suchte nach zuvor unbekannten Sequenzen in der Jararhaginstruktur, die diese Kriterien erfüllten und stellten synthetische Peptide zum Testen in Festphasen-Tests mit der Integrin rα2I-Domäne bereit.
Man fand heraus, dass eines der Peptide, das von der Metalloproteinasedomäne CTRKKHDNAQC (SEQ ID NR. 5) abstammte, die die Aminosäuren 241-249 (die terminalen Cysteine an einem der beiden Enden wurden der nativen Sequenz hinzugefügt) in der Metalloproteinasedomäne von Jararhagin enthielt, stark an die rα2I-Domäne band. Die hohe Bindungsaffinität wurde durch die Tatsache bewiesen, dass es, wenn die Europium-markierte rα2I-Domäne (rekombinantes α2I) an das Protein gebunden hatte, keine nachweisbare Ablösung während einer 2-ständigen Follow-up-Periode gab, sogar wenn ein 10-facher Überschuss einer unmarkierten rα2I-Domäne dem Test zugegeben worden war.
Von den getesteten Peptiden war dasselbe Peptid auch das einzige, das eine Adhäsion der rα2I-Domäne an Typ-I- und IV-Collagen und an Laminin-1 hemmte. Ferner konkurrierten die Peptide mit B. jararaca-Gift in der rα2I-Domänenbindung. Somit schlossen die Erfinder daraus, dass die Gegenwart einer Aminosäuresequenz, die den vorstehenden Amniosäuren 241-249 entspricht, ein Grund ist, weshalb Jararhagin mit α2β1-Integrin interagiert.
Die Mutationsanalyse der Peptidsequenz zeigte ein neues Integrinbindungsmotiv, RKK oder RKKH (SEQ ID NR. 8). Histidin, die vierte Aminosäure in der RKKH-Sequenz kann ebenfalls für die volle Funktion wichtig sein. Überraschenderweise hatte die Mutation der Asparaginsäure in der Peptidsequenz keine Auswirkung. Die bekannten Matrixmolekülliganden für α2β1-Integrin enthalten nicht die RKK(H)-Sequenz.
Das neue vorstehend gefundene rα2I-Domänenbindungsmotiv oder die Peptide, die dasselbe enthalten, können die Matrixproteinerkennung verhindern. Ohne zu beabsichtigen, an diese Erklärung gebunden zu sein, denkt man, dass dieser Effekt entweder durch direkte Interaktion mit der Ligandenbindungsstelle der I-Domäne oder durch Verursachen einer Konformationsänderung der I-Domäne auftritt und somit die Ligandenerkennungsstelle maskiert. Die Peptid-abhängige Konformationsänderung der rα2I-Domäne wurde in Experimenten offensichtlich, die zeigten, dass begleitend mit dem Verhindern der Collagenbindung das Peptid die Bindung der rα2I-Domäne an Echovirus-1 induzierte. Dies zeigt auch, dass die Besetzung einer Ligandenerkennungsstelle die Affinität einer anderen Stelle regulieren kann.
Demnach umfasst jedes der neuen erfindungsgemäßen Integrin bindenden Proteine eine colineare Sequenz dreier Aminosäuren, Arginin-Lysin-Lysin (RKK), die, wenn das Peptid in der cyclischen Form vorliegt, die Integrin-bindende Aktivität am Peptid behindert. Eine, zwei, drei oder mehr Kopien des RKK-Sequenzmotivs können in der Peptidsequenz vorliegen, wobei derartige Kopien ausreichen, um dem Peptid die Fähigkeit zu verleihen, die Interaktion von Integrin mit Collagen zu verringern.
In einer ersten Ausführungsform sind die endungsgemäßen Peptide cyclische Peptide, die die Aminosäuresequenz X_IRKKX₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NR. 1) enthalten, wobei jedes X eine Aminosäure ist und die Aminosäuren X₁-X₆ beliebige Aminosäuren sind (insbesondere A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y oder V), aber vorzugsweise X₂ Histidin (H) ist.
In einer weiteren Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Peptide cyclische Peptide, die die Aminosäuresequenz X_IRKKX₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NR. 2) enthalten, wobei jedes X eine Aminosäure ist und die Aminosäuren X₁–X₅ beliebige Aminosäuren wie vorstehend sind, aber vorzugsweise X₂ Histidin (H) ist.
In einer weiteren Ausführungsform sind die endungsgemäßen Peptide cyclische Peptide, die die Aminosäuresequenz X₁RKKX₂X₃X₄ (SEQ ID NR. 3) enthalten, wobei die Aminosäuren X₁–X₄ beliebige Aminosäure wie vorstehend sind, aber vorzugsweise X₂ Histidin (H) ist, und bei der das Peptid eine cyclische Struktur wie vorstehend besitzt.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Peptid ein cyclisches Peptid, das die Aminosäuresequenz CTRKKHDNC (SEQ ID NR. 4) besitzt oder ein cyclisches Peptid, das die Aminosäuresequenz CTRKKHDNAQC (SEQ ID NR. 5) besitzt, und vorzugsweise sind die beiden terminalen Cysteinreste an der Erzeugung einer Disulfidbrücke beteiligt, die dem Peptid die cyclische Struktur verleiht.
Den erfindungsgemäßen cyclischen Peptiden kann, wie vorstehend aufgeführt, eine oder mehrere der Aminosäuren X und insbesondere eine oder mehrere von C, T, H, D, N, A und/oder Q fehlen. Ferner können die endungsgemäßen cyclischen Peptide zusätzliche Aminosäuren enthalten, die entweder in die vorstehenden Sequenzen eingebaut sind und/oder die vorstehenden Sequenzen flankieren, solange das RKK-Motiv colinear bleibt, vorausgesetzt, dass derartige Peptide die Fähigkeit α2-Integrin zu binden, beibehalten.
Die terminalen Cysteinreste brauchen nur auf eine Weise lokalisiert werden, die zur Cyclisierung des Peptids führt. Vorzugsweise werden die Cysteine an die terminalen Enden des Peptids gesetzt, so dass die Bildung der Disulfidbindung zu einer Schleife mit der richtigen Größe führt, damit der circulären Form des Peptids die biologische Aktivität verliehen wird. Jedoch können ein oder beide Cyteinreste eher im Inneren des Peptids liegen und nicht so sehr am Ende, und jeder „Schwanz", der über das Cystein hinausreicht, wird wahrscheinlich kein Problem darstellen, solange er nicht zum Verlust der circulären Form des restlichen Peptids beiträgt. So lange die cyclische Form des Peptids nicht behindert wurde, so dass es in einer Konformation vorlag, die zuließ, dass es biologisch aktiv blieb, dann konnte in dieser Hinsicht eine unterschiedliche Einheit, beispielsweise ein Protein wie Albunin als Linker, Spacer verwendet werden oder an das Ende des cyclischen Peptids gebunden werden, damit das erfindungsgemäße cyclische Peptid an einen festen Träger oder eine andere erwünschte Einheit, beispielweise eine nachweisbare Markierung, gebunden ist.
Wenn sich die Cysteine am terminalen Ende des Peptids befinden, enthält das Peptid vorzugsweise neun Aminosäuren zwischen den Cysteinen. Acht Aminosäuren verstärkten die Aktivität nicht und es ist somit auch in dieser Hinsicht nützlich. Ein cyclisches Peptid mit sieben Aminosäuren zwischen den terminalen Cysteinen war etwa 20-mal wirksamer als diejenigen mit sieben oder acht Aminosäuren und wird somit besonders bevorzugt. Im allgemeinen laufen Peptide, die 10 oder mehr Aminosäuren zwischen den terminalen Cysteinen enthalten, Gefahr, sich mehr wie ein (nicht funktionelles) lineares Molekül zu verhalten als ein zirkuläres. Cyclische Peptide, die fünf oder weniger Aminosäuren zwischen den terminalen Cysteinen enthalten, sind sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, herzustellen. Demnach ist ein cyclisches Peptid, das sieben Aminosäuren zwischen den terminalen Cysteinen enthält, die am meisten bevorzugte Ausführungsform.
Die Sequenz des endungsgemäßen Peptids soll die Varianten der vorstehend beschriebenen Peptide umfassen, wobei derartige Varianten Aminosäuresubstitutionen mit irrelevantem Unterschied besitzen, beispielsweise die Substitution einer basischen Aminosäure mit einer anderen (außer beim RKK-Motiv), die Substitution eines hydrophoben Rests mit einem anderen, die Substitution eines neutralen Rests mit einem anderen, die Substitution eines sauren Rests mit einem anderen oder die Substitution eines aromatischen Rests mit einem anderen.
In der bevorzugten Ausführungsform ist die cyclische Form des Peptids auf eine Disulfidbrücke zurückzuführen. Man erwartet jedoch, dass jede covalente Bindung, die zur cyclischen Form des Peptid führt, nützlich ist, da die Funktion der Brücke einfach darin besteht, das Peptid in die richtige Konformation zu zwingen.
Wie aus dem Fachgebiet bekannt, können die Aminosäurereste in ihrer geschützten oder ungeschützten Form vorliegen, wobei geeignete Amino- oder Carboxylschutzgruppen verwendet werden. Nützliche pharmazeutisch verträgliche Kationen schließen Alkali- oder Erd-alkalimetallkationen (beispielsweise Na, K, Li, ½ Ca,½ Ba etc.) oder Aminokationen ein (beispielsweise Tetraalkyammonium, Trialkylammonium, wobei jede Alkylgruppe C₁-C₁₂ sein kann, aber vorzugsweise eine C₁-C₆ verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe ist). Pharmazeutisch verträgliche niedrigere Alkylester, pharmazeutisch verträgliche Amide und pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze können ebenfalls hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können unter Verwendung von aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren synthetisiert und cyclisiert werden, beispielsweise wie in U.S. 5,627,263 beschrieben.
Die cyclischen Integrin-bindenden Peptide nach der vorliegenden Endung sind als Blocker (Inhibitoren) der Integrinfunktion, insbesondere der menschlichen Integrinfunktion, nützlich. Die Integrinbindung an ihre nativen Liganden wird in Gegenwart der erfindungsgemäßen Peptide gehemmt oder verhindert. Insbesondere die cyclischen Integrinbindenden Peptide sind zur Blockierung der Interaktion der Integrin-α2I-Domänen mit Makromolekülen nützlich, die mit dieser Domäne interagieren, beispielsweise Collagene wie Collagen-I und IV und beispielsweise Laminin-1.
Die Sequenz der menschlichen rekombinanten α2I-Domäne wird bei Takada, Y. und M.E. Hemler, J. Cell Biol. 109: 397–407 (1989) bereitgestellt. Die α2I-Domäne kann unter Verwendung herkömmlicher rekombinanter Wirte, beispielsweise E. coli, hergestellt werden. Ihre Eigenschaften können unter Verwendung eines sensitiven Festphasen-Tests charakterisiert werden, der auf der Europium-Markierung der rα2I-Domäne und zeitaufgelöster Fluoreszenzmessungen basiert. Der Test ermöglicht die direkte Messung der Bindung der rα2I-Domäne ohne Gegenwart von Enzymen oder anderen großen Molekülen, die daran gebunden sind.
Die α2-Integrin-bindende Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Peptids kann unter Verwendung jedes Tests bestimmt werden, der eine derartige Bindung nachweist, und insbesondere der die Fähigkeit einer derartigen Bindung nachweist, die Integrininteraktion mit Collagen-I, Collagen-IV oder Laminin-I zu blockieren. Wie nachstehend beispielhaft dargestellt, sind in dieser Hinsicht ein Bindungstest, bei dem eine Europium-markierte rekombinante α2I-Domäne (Beispiel 2) und ein Test nützlich, der die Aktivierung der Virus-1-Erkennungsstelle in der α2I-Domäne nachweist (Beispiel 2).
Die erfindungsgemäßen Peptide sind insbesondere nützlich, um die Zellwanderung auf Collagen, in vivo oder in vitro, zu hemmen oder zu verhindern. Die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Peptids, die Zellmigration zu blockieren, kann unter Verwendung der Zellmigrationstests, wie in Beispiel 7 bereitgestellt, bestimmt werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Hemmung der Zellmigration auf Collagen in vivo und in vitro bei einem Patienten bereit, der eine Behandlung benötigt, um dieselbe zu hemmen, wenn eine derartige Migration in einer Integrin-abhängigen Weise vermittelt wird. Die Endung stellt somit ein therapeutisches Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, einschließlich Periodontitis bereit, bei denen Zellmigration ein Teil des pathogenen Mechanismus ist.
Die Endung stellt ferner ein Verfahren zur Hemmung der Migration maligner Zellen bereit und deshalb zur Behandlung von Krankheiten, die durch dieselben charakterisiert sind, beispielsweise Krebsarten, einschließlich Osteosarkom und Melanom, insbesondere, bei denen die α2β1-Integrin-abhängige Zellmigration zum malignen Mechanismus beitragen kann.
Diese Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Hemmung der Adhäsion von Blutplättchen an Collagen und Collagen-induzierte Aggregation der Blutplättchen bereit. Die Fähigkeit eines endungsgemäßen Peptids zur Hemmung der Zelladhäsion kann bestimmt werden, wie in Beispiel 8 bereitgestellt. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Patienten bereit, die eine präventive oder verbessernde Behandlung für Erkrankungen oder Krankheiten wie cardiovaskuläre Erkrankungen benötigen, die durch einen Bedarf charakterisiert sind, die Adhäsion der Blutplättchen an Collagen und Collageninduzierte Aggregation der Blutplättchen zu verhindern, beispielsweise bei Schlaganfallopfern oder Patienten, die ein Schlaganfallrisiko haben.
Pharmazeutische Zubereitungen, die die erfindungsgemäßen Peptide enthalten, können unter anderem pharmazeutisch verträgliche Träger zur Stabilisierung und wirksamen Formulierung der Peptide enthalten. Geeignete Vehikel und deren Formulierung, einschließlich weiterer menschlicher Proteine, beispielsweise menschliches Serumalbumin, werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Auflage, A.R. Gennaro, Herausg., Mack Publishing, Easton, PA 1990) beschrieben. Um eine pharmazeutisch verträgliche Verbindung zu erzeugen, die für die Verabreichung wirksamer Mengen an endungsgemäßem Peptid an einen Patienten, der eine derartige Verbindung benötigt, geeignet ist, enthält eine derartige Verbindung, wenn gewünscht, eine wirksame Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Peptide zusammen mit einer geeigneten Menge des Trägervehikels.
Die endungsgemäßen Peptide wurden vorzugsweise gereinigt, damit sie im wesentlichen frei von Verunreinigungen sind. Man sagt, dass ein Material „im wesentlichen frei von Verunreinigungen" ist, wenn es im wesentlichen von unerwünschtem Material, mit dem es bei der Synthese entweder in der Zelle oder in einem in vitro-System assoziiert wurde, bis zu einem Grad, der ausreicht, um es nützlich für einen gewünschten Zweck zu machen, gereinigt wurde.
Verbindungen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, können ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide enthalten. Wenn mehr als eines der Peptide in der Verbindung vorliegt, kann es Teil derselben Aminosäurekette sein wie das andere Peptid oder kann als einzelnes Peptid in der Verbindung vorliegen. Verbindungen für die intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung werden vorzugsweise in Dosierungen im Bereich von etwa 1 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht verabreicht, obwohl niedrigere oder höhere Dosen verabreicht werden können. Die erforderliche Dosierung hängt beispielsweise vom Schweregrad der Erkrankung des Patienten und derartigen Kriterien wie Gewicht, Geschlecht, Alter und Krankengeschichte ab. Die Dosis kann auch variieren, abhängig davon, ob sie in einem veterinären Ansatz einem Tier oder einem menschlichen Patienten verabreicht werden soll.
Für die Zwecke der parenteralen Verabreichung werden Verbindungen, die die erfindungsgemäßen Peptide enthalten, vorzugsweise in destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert wird vorzugsweise auf etwa 6 bis 8 eingestellt. Wenn das Peptid in einer lyophilisierten Form bereitgestellt werden soll, kann der Lösung Laktose hinzugefügt werden, um den Lyophilisierungsvorgang zu erleichtern. In derartiger Form wird die Lösung dann sterilisiert, in Phiolen eingebracht und lyophilisiert.
Nützliche Zubereitungen der erfindungsgemäßen Verbindungen für die parenterale Verabreichung schließen auch sterile wässrige und nicht-wässrige Lösungsmittel, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele nützlicher nicht wässriger Lösungsmittel schließen Propylenglycol, Polyethylenglycol, Gemüseöl, Fischöl und injizierbare organische Ester ein. Beispiele von wässrigen Trägern schließen Wasser, Wasser-Alkohol-Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepufferte medizinische parenterale Vehikel einschließlich Natriumchloridlösung, Laktose enthaltende Ringer-Lösung oder fixierte Öle ein. Beispiele intravenöser Vehikel schließen flüssige Zubereitungen und Nährlösungen, Elektrolytlösungen wie diejenigen, die auf Ringer-Dextrose basieren, und dergleichen ein.
Injizierbare Zubereitungen, wie ölhaltige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen können nach aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren formuliert werden, wobei bei Bedarf geeignete Dispersions- oder Befeuchtungsmittel verwendet werden. Wenn die aktiven Bestandteile in einer wasserlöslichen Form beispielsweise in Form von wasserlöslichen Salzen vorliegen, kann bei der sterilen injizierbaren Zubereitung eine nicht toxische parenteral verträgliche Verdünnung oder ein Lösungsmittel wie beispielsweise steriles nicht pyrogenes Wasser oder 1,3-Butandiol verwendet werden. Unter den anderen verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind 5% Dextrose Ringer-Injektion und isotonische Natriumchlorid-Injektion (wie im USP/NF beschrieben). Wenn die aktiven Bestandteile in einer nicht wässrigen löslichen Form vorliegen, werden sterile geeignete ölige Suspensionen verwendet, die geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel wie fetthaltige Öle, beispielsweise Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester enthalten, beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride. Alternativ können wässrige Injektionssuspensionen, die Substanzen enthalten, die die Viskosität erhöhen, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran, und fakultativ auch Stabilisatoren enthalten, verwendet werden.
Für den iontophoretischen Transport eines erfindungsgemäßen Peptids besitzt das Peptid vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 4,0 oder weniger oder einen pH-Wert von etwa 7,0 oder höher. Iontophoreische Verfahren sind bekannt, wie beispielsweise in U.S. 5,637,084 und in U.S. 4,950,229 beschrieben.
Pharmazeutische Zubereitungen für die orale (aber systemische) Verabreichung können durch Kombination der aktiven Bestandteile mit festen Excipienten erhalten werden, fakultativ durch Granulation eines sich ergebenden Gemisches und Bearbeitung des Gemisches oder der Granulate nach Zugabe auf Wunsch oder bei Bedarf geeigneter Hilfsmittel, so dass Tabletten mit Drageekernen erzeugt werden. Pharmazeutische Zubereitungen für die Behandlung von Periodontitis können in einer Verbindung verabreicht werden, die in der Mundhöhle verbleibt, vorzugsweise durch direktes Einsetzen der Zubereitung in die periodontale Höhle und am meisten bevorzugt in einer Dauerfreisetzungsform. Alternativ kann die Zubereitung auf die Zähne und/oder das Zahnfleisch aufgemalt werden, um das Peptid an der gewünschten Stelle lokal freizusetzen. Derartige Verfahren werden in U.S. 5,002,769, U.S. 5,023,082, U.S. 5,160,737, U.S. 5,330,746, U.S. 5,425,953, U.S. 5,438,076 und U.S. 5,639,795 bereitgestellt. Die Zubereitung kann auch auf einer Membran bereitgestellt werden.
Geeignete Excipienten sind insbesondere Füllstoffe wie Zucker beispielsweise Laktose oder Saccharose, Mannit oder Sorbit, Cellulosezubreitungen und/oder Calciumphosphate, beispielsweise Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat sowie Bindemittel wie Stärke, Pasten, wobei beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke oder Kartoffelstärke, Gelatine, Traganth, Methycellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethycellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon und/oder auf Wunsch Disintegrationsmittel wie die vorstehend erwähnten Stärken und auch Carboxymethylstärke, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat erwendet werden. Hilfsmittel sind vor allem fließregulierende Mittel und Schmiermittel beispielsweise Kieselgel, Talkum, Stearinsäure oder Salze davon wie Magnesiumsteart oder Calciumstearat mit geeignetem Überzug, der auf Wunsch magensaftresistent ist und für diesen Zweck unter anderem konzentrierte Zuckerlösungen enthält, die fakultativ Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lakritzlösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Um magensaftresistente Überzüge herzustellen, werden Lösungen mit geeigneten Cellulosezubereitungen wie Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethycellulosephtalat verwendet. Färbemittel oder Pigmente können beispielsweise den Tabletten oder Drageeüberzügen zur Identifizierung zugesetzt werden oder um verschiedene Kombinationen der aktiven Verbindungsdosen zu charakterisieren.
Feste Darreichungsformen für die orale Verabreichung schließen Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pastillen, Pulver und Granula ein. Bei derartigen festen Darreichungsformen kann die aktive Verbindung mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel wie Saccharose, Lactose oder Stärke beigemischt werden. Derartige Darreichungsformen können auch, wie es die normale Praxis ist, pharmazeutische adjuvante Substanzen, z. B. Stearatschmiermittel, umfassen. Feste orale Zubereitungen können auch mit magensaftresistenten oder anderen Überzügen hergestellt werden, die die Freisetzung der aktiven Zutaten modulieren.
Flüssige Darreichungsformen für die orale Verabreichung schließen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups, und Elexiere ein, die inerte nicht toxische Verdünnungsmittel, die herkömmlicherweise im Fachgebiet verwendet werden, wie Wasser und Alkohol enthalten. Derartige Zusammensetzungen können auch Adjuvantien wie Befeuchtungsmittel, Emulgatoren, Suspensionsmittel, Süßstoffe, Geschmackstoffe und Geruchstoffe umfassen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch mittels Pumpen oder in Dauerfreisetzungsform verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zu spezifischen Organen in hoher Konzentrationen mittels geeignet eingebrachter Katheter oder durch Bereitstellung derartiger Moleküle als Teil eines chimeren Moleküls (oder Komplex) transportiert werden, das konstruiert wird, um spezifische Organe anzuvisieren. In dieser Hinsicht können die vorstehenden Peptide eine cyclische „Schleife" am Ende eines längeren Peptids bilden, wobei derartige Peptide eine zweite Domäne besitzen, die eine gewünschte Aktivität besitzt. Derartige Fusionsproteine können so konstruiert sein, eine Domäne bereitzustellen, die bei der Abtötung einer Zelle assistiert, die ein membrangebundenes Integrin enthält, das das erfindungsgemäße cyclische Peptid bindet.
Die Verabreichung einer Dauerfreisetzungsform ist bequemer für den Patienten, wenn wiederholte Injektionen für längere Zeiträume angezeigt sind, um den Komfort des Patienten zu maximieren. Die kontrollierte Freisetzungszubereitung kann durch Verwendung von Polymeren erreicht werden, um die erfindungsgemäßen Peptide zu komplexieren oder adsorbieren. Ein kontrollierter Transport kann erreicht werden, indem die geeigneten Makromoleküle (beispielsweise Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcelluloaseprotaminzink und Protaminsulfat) sowie das Verfahren zum Einbringen ausgewählt werden, um die Freisetzung zu kontrollieren. Ein weiteres mögliches Verfahren, die Dauer der Wirkung durch kontrollierte Freisetzungszubreitungen zu kontrollieren, ist, das gewünschte Peptid in Partikel eines polymeren Materials wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly (Milchsäure)oder Ethylenvinyacetatcopolymere einzubringen. Alternativ können die Peptide, anstatt sie in diese polymeren Partikel einzubringen, in Mikropartikel eingeschlossen werden, die beispielsweise durch Koazervationsverfahren bzw. durch interfaciale Polymerisierung hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose bzw. Gelatinemikrokapseln oder in kolloidalen Transportsystemen für Medikamente, beispielsweise Liposome, Albuminminisphären, Mikroemulsionen, Nonopartikel und Nanokapseln oder in Makroemulsionen.
Die biologische Halbwertszeit des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Erhöhung der Retention oder Stabilität der cyclischen Form in der gewünschten Umgebung verlängert werden. Man kann insbesondere von Mitteln, die die Stabilität der cyclischen Form verstärken, erwarten, dass sie die biologische Halbwertszeit des Peptids erhöhen. In dieser Hinsicht kann die Verwendung von einer oder mehreren D-Aminosäuren (insbesondere wenn sie mit derselben L-Aminosäure an dieser Position ersetzt wurden) oder die Verwendung von einer oder mehrerer Aminosäureanaloga wie Penicillamin (3-Mercaptovalin) in der Peptidstruktur so eingesetzt werden, dass die D-Aminosäure oder das Aminosäureanalogon mit dem metabolischen Abbau in der cyclischen Struktur im Tier oder dem Patienten, dem die Verbindung verabreicht wird, oder in der gewünschten in-vitro-Verbindung interferiert.
Die Verwendung von D-Aminosäuren oder Aminosäureanaloga zur Erhöhung der Bindung des erfindungsgemäßen Peptids, an das Ziel insbesondere an die α2I-Domäne enthaltende Integrine, wird ebenfalls in Erwägung gezogen.
Die Peptide, die in den Verbindungen und in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können in Darreichungsformen wie Tabletten, Kapseln, Pulverpäckchen oder flüssigen Zubereitungen für die orale Verabreichung verwendet werden, wenn die biologische Aktivität des Materials nicht vom Abbauprozess zerstört wird und wenn die Merkmale der Verbindung es zulassen, dass sie über das Darmgewebe absorbiert wird.
Die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung können auf eine Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, beispielsweise durch herkömmliches Mischen, Granulieren, Drageeherstellung, Lösen, Lyophilisieren oder ähnliche Verfahren.
Das erfindungsgemäße Peptid kann auch als Affinitätsreagenz für die Extraktion von Liganden verwendet werden, die an sie binden, insbesondere für die Extraktion von α2Ienthaltenden Integrinen aus einem Gemisch.
Da die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, ist dieselbe unter Bezugnahme von spezifischen Beispielen leichter zu verstehen, die durch Veranschaulichung bereitgestellt werden und die die Erfindung nicht begrenzen sollen, sofern nicht spezifiziert.
Beispiele
Beispiel 1
Erzeugung der menschlichen rekombinanten α2I-Integrin-Domäne
Die DNA-codierende α2I-Domäne wurde durch PCR unter Verwendung menschlicher α2-cDNA als Matrize erzeugt (die Integrin α2-cDNA war ein Geschenk von Dr. M. Hemler, Dana-Faber, Boston). Der Vorwärtsprimer war 5'-CACAGGGATCCCCCTGATTTTCAG-CTC-3' (SEQ ID NR. 9) und der Rückwärtsprimer war 5'-GTGGCTGAATTCAAC-AGTACCTTCAATG-3'(SEQ ID NR. 10). Die Primer wurden konstruiert, um zwei Restriktionsstellen in das Produkt einzuführen: Die BamHI-Schnittstelle am 5'-Ende und die EcoRI- Schnittstelle am 3'-Ende. Das PCR-Produkt und pGEX2T (Pharmacia) wurden mit BamHI und EcoRI gespalten, ligiert und in E. coli-DHαSF'-Zellen transformiert. Das Plasmid, das eine Insertion mit der α2I-Domaine (pJKα2I) besaß, wurde dann sequenziert und in E. coli-BL21 zur Herstellung des rekombinanten Proteins rα2I transformiert. Die Herstellung und Reinigung des Glutathion S-Transferase-rα2I-Fusionsproteins wurden wie folgt durchgeführt: Typischerweise wurden 400 ml LB (Carbenicillin 50 μg/ml) mit 40 ml BL21/pJKα2I- Übernachtkultur angeimpft, und die Kultur wurde 1 h bei 37°C gezüchtet. Dann wurde 4 h ein Inducer, IPTG (Endkonzentration 0,1 mM), zugegeben.
Das menschliche rekombinante Integrin α2I wurde aus E. coli-Zellen wie folgt gereinigt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und die Pellets in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) resuspendiert. Die Suspensionen wurden mit Ultraschall behandelt, zentrifugiert und der Überstand wurde zurückbehalten. Die Pellets wurden in PBS resuspendiert, mit Ultraschall behandelt und zwei weitere Male zentrifugiert und die Überstande wurden vereinigt. Glutathion Sepharose® (Pharmacia) wurde zugegeben und das sich ergebende Lysat wurde 30 min bei Raumtemperatur durch sanftes Schütteln inkubiert. Das Lysat wurde zentrifugiert, die Fraktion mit dem Überstand wurde entfernt und Glutathion Sepharose® mit dem gebundenem Fusionsprotein wurde in die geeignete Säule transferiert. Die Säule wurde dann mit 10 Volumina PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,3) gewaschen und das Fusionsprotein wurde mit Glutathion-Elutionspuffer (Pharmacia; 10 mM reduziertes Glutathion in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) eluiert. Das Fusionsprotein wurde mit Thrombinprotease (Pharmacia; 10 Einheiten) mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur gespalten und gegen PBS dialysiert, um das Glutathion zu entfernen. Das Spaltungsgemisch wurde ein zweites Mal durch die Glutathion Sepharose®-Säule geschickt, um die Glutathion S-Transferase zu entfernen.
Das rα2I wurde aus dem Durchfluss gesammelt. Es war notwendig, das rekombinante Protein mit 5 mM Dithiothreitol (DTT) zu behandeln, um die richtige Faltung zuzulassen (5 mM DTT in PBS), da bei der Analyse mittels nativer PAGE extra Banden ohne Behandlung zu sehen waren. Das rekombinante Protein war nach der SDS-PAGE (Polyacrylgelelektrophorese) zu mindestens 90% rein und nur eine einzige Bande wurde mittels nativer PAGE beobachtet.
Die hergestellte rekombinante α2I-Domäne war 223 Aminosäuren lang mit zwei Nicht-Integrin-Aminosäuren in den aminoterminalen (GS) Integrin-Aminosäuren, die der Integrin-Sequenz 124-339 (PDFQ...IEGTV) (SEQ ID NR. 11 und SEQ ID NR. 12) entspricht, und sechs Nicht-Integrin Aminosäuren im carboxyterminalen Ende (EFIVTDM; SEQ ID NR. 13).
Beispiel 2
Bindungstest für Europium-markiertes rα2I
Gift von Bothrops jararaca verhindert die Bindung der rekombinanten Integrin α2I-Domäne an Typ-I-Collagen
Es wurde ein sensitiver Festphasen-rα2I-Ligandenbindungstest entwickelt, der auf der Verwendung von Europium-markiertem rα2I basiert. Die Markierung von rα2I mit Europium wurde wie folgt durchgeführt: 1/20 Volumen 1 M NaHCO₃ (pH 8,5) wurde dem gereinigten rα2I zugegeben, um den pH-Wert für die Markierung mit Isothiocyanat zu erhöhen. Das Europium-Markierungsreagenz (Wallac) wurde in einem 100-fachen molaren Überschuss zugegeben und über Nacht bei +4°C inkubiert. Die ungebundene Markierung wurde durch Gelfiltration auf einer Sephadex G50/Sepharose 6B-Säule (Pharmacia) entfernt und die das markierte Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt.
Eine Immunplatte mit 96 Vertiefungen (Maxisorp, Nunc) wurde beschichtet, indem die Oberfläche ihrer Vertiefung 0,1 ml PBS, das 5 μg/cm² der Plattenoberfläche enthielt, Typ-1-Collagen (Rinderdermis, Cellon), Typ-IV-Collagen (Sigma), Laminin-1 (gereinigt aus den Basalmembranen des Engelbreth-Holm-Swarm Maustumors, Collaborative Research), Fibronektin (menschliches Plasmafibronektin, Boehringer Mannheim) oder 3,3 μg/ml Echovirus-1 oder Echovirus-7 12 h bei +4°C ausgesetzt wurde. Alternativ wurden die Peptide und das B. jararaca-Gift (Sigma) bei verschiedenen Konzentrationen auf aminbindenden Platten mit 96 Vertiefungen (Costar) nach den Anweisungen des Herstellers beschichtet.
Die restlichen Proteinabsorptionsstellen auf allen Vertiefungen wurden mit 0,1% hitzeinaktiviertem Rinderserumalbumin in PBS 1 h bei +37°C blockiert. Die Echoviren-1 (Farouk-Stamm) und 7 (Wallace) wurden von der ATCC erhalten. Die gereinigten Vieren wurden in PBS, enthaltend 0,5 mM MgCl₂, verdünnt und bei –70°C bis zur Verwendung gelagert. Den beschichteten Vertiefungen wurde mit Europium markiertes rα2I bei einer Konzentration von 500 ng/ml in PBS, 2 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA zugegeben und dann 3 h bei +37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBS, 2 mM MgCl₂ gewaschen. 0,1 ml Delfia-Verstärkerlösung (Wallac) wurde jeder Vertiefung zugegeben und das Europium-Signal wurde mittels Fluorometrie (Modell 1232 Delfia, Wallac) gemessen.
Bei endogener Zugabe der Peptide wurden die lyophilisierten Peptide direkt mit dem Europium-markierten rα2I in 500 ng/ml PBS, 2 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA solubilisiert und dann den Vertiefungen zugegeben. Bei Verwendung von EDTA anstatt von MgCl₂ wurde Europium-markiertes rα2I mit PBS, 2 mM EDTA verdünnt und mit dem Puffer aufeinanderfolgende Waschschritte durchgeführt. Man fand heraus, dass dieser Bindungstest sehr sensitiv war, so dass ermöglicht wurde, dass die Menge der in den Experimenten verwendeten rα2I-Domäne reduziert wurde. Ferner legt die geringe Menge an Europium nahe, dass die Messungen mit größeren Markermolekülen zuverlässiger sind. Drittens befand man den hier beschriebenen Test mit den Miktotiterplattenvertiefungen als nützlich, um eine große Anzahl von vermeintlichen die Integrin-rα2I-Domäne blockierende Moleküle zu durchmustern.
rα2I band Typ-I-Collagen, Typ-IV-Collagen und Laminin-1. Es band jedoch nicht signifikant an Fibronektin oder Albumin (1A), rα2I band Typ-I-Collagen in einer Mg⁺⁺abhängigen Weise und die Zugabe von 2 mM EDTA hemmte die Bindung vollkommen (1B). Das stimmt mit der Tatsache überein, dass α2β1 mit Collagen nur in Gegenwart zweiwertiger Kationen interagiert. Die Bindung der rα2I-Domäne an Echovirus-1 war viel schwächer als an die Matrixmoleküle.
Frühere Studien haben gezeigt, dass das B. jararaca-Gift die Interaktion des α2β1-Integrins der Blutplättchen mit Collagen hemmt (De Luca, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 570–576 (1995)). Jedoch war nicht bekannt, ob diese hemmende Wirkung aufgrund der Blockierung der rα2I-Domänenfunktion erfolgte. Auch die Epitope, die an dieser Interaktion beteiligt waren, waren unbekannt.
Die Wirkungen des B. jararaca-Giftes auf die Bindung der rα2I-Domäne an Typ-1-Collagen wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Festphasen-Ligandenbindungstests untersucht. Man ließ die Europium-markierte ra2I-Domäne an Collagen-l-Substrat in Gegenwart von 2 mM Mg⁺⁺ binden und die Menge des gebundenen rα2I wurde dann bestimmt. Die Wirkung des Giftes wurde mit Konzentrationen im Bereich von 1 μg/ml – 1000 μg/ml getestet. Das Gift hemmte die rα2I-Domänen-Collagen-Interaktion effektiv und in einer konzentrationsabhängigen Weise (1C). Um zu bestimmen, ob die beobachtete Hemmung aufgrund der direkten Interaktion von rα2I mit dem Schlangengift erfolgte, wurden Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit den Giftproteinen beschichtet und auf rα2I-Bindung an dieses Substrat getestet. Man fand heraus, dass das Gift ra2I in einer konzentrationsabhängigen Weise direkt band (1D). Nach der veröffentlichten Literatur ist offensichtlich, dass Jarahagin das Protein im B. jararaca-Gift ist, das die Bindung von α2β1-Integrin an Collagen hemmt (De Luca, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 570–576 (1995)) und deshalb am wahrscheinlichsten die Giftkomponente ist, die an die rα2I-Domäne bindet.
Beispiel 3
Peptide und Bindungstest unter Verwendung von biotinyliertem 229ox
Ein kurzes cyclisches Jararhagin-abstammendes Peptid ahmt die Wirkung des B. jararaca-Giftes auf die Integrin-rα21-Domänen-Collagen-Interaktion nach
Die Charakterisierung der α2I-Domänen-Bindungsstelle im Jararhagin wurde durch die Verwendung einer Reihe von kurzen cyclischen Peptiden fortgesetzt, die den Bereichen entlang des Proteins entsprechen. Die getesteten Bereiche wurden basierend auf dem Folgenden ausgewählt: i) Integrin-bindende Motive in Matrixproteinen und in Schlangengift-Disintegrinen findet man in Schleifenstrukturen. ii) Die bekannten Integrin-bindenden Motive enthalten Asparginsäurereste. iii) Das veröffentlichte Modell der Integrin-Collagen-Interaktion hebt die Rolle des Argininrests zusätzlich zum Asparaginsäurerest hervor.
Die Jararhagin-abstammenden Peptide wurden basierend auf der Vorhersage der Sekundärstruktur der Jararhagin-Aminosäuresequenz konstruiert. Die Vorhersage der Sekundärstruktur erfolgte unter Verwendung des Peptidstrukturprogramms aus dem Genetics-Computer-Group (GCG)-Softwarepaket (Madison, WI). Die Oberflächenwahrscheinlichkeit nach dem Emini-Verfahren (Emini, E.A. et al., J. Virol. 55: 836–839 (1985)) und die Hydrophilizität nach dem Kyte-Doolittle-Verfahren (Kyte, J. et al., J. Mol. biol. 157: 105–132 (1982)) wurden berücksichtigt.
Die Peptide wurden mit einem automatischen Peptidsynthesegerät (Applied Biosystems 431A) unter Verwendung der 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl (Fmoc)-Chemie synthetisiert. Die Peptide für die Alaninsubstitution wurden von Research Genetics (Huntsville, AL) erworben. Nach der Synthese wurden die Peptide oxidiert, um Disulfidbrücken zu erzeugen. Die Peptide wurden bei einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer solubilisiert und 16–24 h bei +4°C inkubiert. Die Oxidation wurde mit der Reversenphasen-HPLC überprüft und die oxidierten Peptide wurden lyophilisiert.
Alle Peptide waren bei 10 mg/ml in PBS vollkommen löslich. Da die höchste verwendete Konzentration 1 mg/ml betrug, wurden unspezifische Effekte aufgrund unlöslicher Peptide vermieden. Die isoelektrischen Punkte (PI) der verschiedenen Peptide wurden ebenfalls von der Primärsequenz unter Verwendung des Isolelektrikprogramms aus dem Genetics-Computer-Group (GCG)-Softwarepaket (Madison, WI) bestimmt. Man fand heraus, dass das Peptid 225ox (Tabelle 1) einen ähnlichen isoelektrischen Punkt wie 229ox besaß (Tabelle 1), und es wurde deshalb in einigen Experimenten als Kontrollpeptid ausgewählt.
Die Biotinylierung von 229ox wurde wie folgt durchgeführt: Lyophilisiertes 229ox-Peptid wurde in PBS und 1/5 Volumen 0,1 M NaHCO₃ solubilisiert, 0,5 M NaCl (pH 8,0) wurde zugegeben, um den pH-Wert für die Biotinylierung zu erhöhen. Sulpho-NHS-Biotin (Calbiochem) wurde 1 : 2 (Gew.%) 229ox:Biotin zugegeben und 2 h bei RT inkubiert. 1/10 Volumen 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) wurde zugegeben, um die Biotinylierungsreaktion zu beenden.
Für die Bindungstests unter Verwendung von biotinyliertem 229ox-Peptid wurden aminbindende Platten mit 96 Vertiefungen (Costar) mit verschiedenen Konzentrationen von rα2I-Domänen- oder rα2I-Domänen-abstammenden Peptiden nach den Anweisungen des Herstellers beschichtet. Die restlichen Proteinabsorptionsstellen auf allen Vertiefungen wurden 1 h mit 0,1% hitzeinaktiviertem Rinderserumalbumin in PBS bei + 37°C inaktiviert. Den beschichteten Vertiefungen wurden 100 μM biotinyliertes 229ox in PBS, 2 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA zugegeben und 3 h bei +37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBS, 2 mM MgCl₂ gewaschen und Europium-markiertes Streptavidin (Wallac) wurde 30 min bei einer Konzentration von 500 ng/ml in PBS, 2 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA bei Raumtemperatur zugegeben. Die Vertiefungen wurden wiederum dreimal gewaschen. 0,1 ml Delfia-Verstärkerlösung (Wallac) wurde jeder Vertiefung zugegeben und das Europium-Signal wurde mittels Fluorometrie (Modell 1232 Delfia, Wallac) gemessen. Bei Verwendung von EDTA anstatt von MgCl₂ wurde das Europium-markierte ra2I in PBS, 2 mM EDTA verdünnt und die folgenden Waschschritte wurden mit diesem Puffer durchgeführt.
Die den ausgewählten Sequenzen entsprechenden Peptide wurden synthetisiert und die sich ergebenden Peptide sind in Tabelle I zusammengefasst.
Um zu untersuchen, ob irgendeines dieser Peptide direkt mit der α2I-Domäne interagieren könnte, wurden die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit Jararhagin-Peptiden zusammen mit dem cyclischen RGD-Peptid, Typ-I-Collagen, Typ IV-Collagen und Fibronektin beschichtet und rα2I-Eu wurde zugegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass eines der Jararhagin-Peptide, bezeichnet als 229ox, effizient an die ra2I-Domäne band, während die anderen getesteten Peptide keine Wirkung zeigten (2A).
Die Peptide wurden dann auf ihre Fähigkeit getestet, die rα2I-Bindung an Typ-I-Collagen bei einer Konzentration von 500 μM zu beeinflussen. Wiederum hatte nur ein Peptid eine signifikante Wirkung: es hemmte fast vollständig die Interaktion zwischen der rα2I-Domäne und Collagen (2B).
Tabelle I
Sequenzen der in dieser Studie verwendeten synthetischen Peptide. Der Name und die Position der synthetisierten Peptide, basierend auf der Primärsequenz von Jararhagin (Paine, M.J.I. et al., J. Biol. Chem. 267: 22869–22876 (1992)) und der α2I-Domäne (Takada, Y. und Hemler, M.E., J. Cell Biol. 109: 397–407 (1989)) werden dargestellt.
Um eine Korrelation zwischen den Bindungseigenschaften des 229ox-Peptids und dem B. jararaca-Gift zu zeigen, wurde die Fähigkeit des 229ox-Peptids getestet, mit der rα2I-Bindungsstelle im Schlangengift zu konkurrieren. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl 229ox als auch das B. jararaca-Gift rα2I binden und dass das 229ox-rα2I zeigt, dass 229ox die tatsächliche Integrinbindungsstelle von Jararhagin ist. Da die Hemmung nicht vollständig war (etwa 50%), gibt es noch die Möglichkeit, dass das B. jararaca-Gift auch eine weitere Bindungsstelle für die α2I-Domäne enthält.
In einer Anzahl von Veröffentlichung wurde gezeigt, dass die cyclische Struktur des Integrinliganden, der die synthetische Struktur nachahmt, oft wesentlich für die Bindung mit hoher Affinität ist. Um dies zu testen, wurde sowohl oxidiertes als auch lineares p229-Peptid im Festphasen-Bindungstest verwendet, a.a.O. Das cyclische 229ox zeigte die Fähigkeit, die rα2I-Adhäsion an Typ-I-Collagen zu hemmen, während die lineare Form des Peptids nur wenig Wirkung hatte (4A). Man fand heraus, dass die Bindung von ra2I an 229ox, das an einen festen Träger gebundenen war, konzentrationsabhängig war und es wurde die signifikante Bindung bei einer Beschichtungskonzentration von 75 μg/ml (4 B) beobachtet. Zusätzlich zur Typ-I-Collagen bindet die ra2I-Domäne auch Typ-IV-Collagen und Laminin-1. Das 229ox-Peptid hemmte die Bindung von ra2I an diese Liganden, während das Kontrollpeptid 225ox mit derselben Länge und Konformation zusammen mit einem ähnlichen pI-Wert keine Wirkung hatte (4C). Das legt nahe, dass die α2I-Domäne all diese Liganden mittels desselben Mechanismus bindet und dass 229ox die Bindung entweder durch direkte Interaktion mit der Ligandenerkennungsstelle bindet oder die dreidimensionale Struktur der I-Domäne in eine inaktive umwandelt.
Beispiel 4
Das Jararhagin-abstammende Peptid aktiviert die Echovirus-l-Erkennungsstelle in der Integrin rα2I-Domäne
Zusätzlich zur Vermittelung der Zelladhäsion an Collagen und Laminin-1 fungiert α2β1-Integrin auch als Virusrezeptor, der die Oberflächenbindung und die Infektion durch einen menschlichen Krankheitserreger, Echovirus-1, vermittelt. Man fand heraus, dass die Matrixproteine und Echovirus-1 mit dem Integrin auf unterschiedliche Weise interagieren, aber die Bindungsstellen für den Echovirus-1 befinden sich ebenfalls in der I-Domäne der a2-Untereinheit. Wie vorstehend beschrieben, zeigte die ra2I-Domäne eine schwache Bindung an das Echovirus-1 auf der Beschichtung, aber überraschenderweise erhöhte die Zugabe von 229ox-Peptid die Bindung um etwa ein 10-faches, während das Kontrollpeptid 225ox keinen Effekt hatte (5). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Bindung des 229ox-Peptids an die α2I-Domäne eine Strukturänderung im Protein induziert, die die Bindungsaffinität von ra2I an Echovirus-1 erhöht.
Dies legt eine mögliche Modulation der Aktivität auf der I-Domäne nahe, wobei die Bindung von RKK die Bindung an Collagen allosterisch hemmen könnte. Die RKKinduzierte Änderung in der Konformation der ra2I-Domäne war in unseren Experimenten offensichtlich, wobei das RKK-Peptid nicht nur die rα2I-Domänenadhäsion an Collagen blockierte, sondern auch die Bindung der ra2I-Domäne an Collagen beträchtlich erhöhte. Zusätzlich zur Bestätigung des vorherigen Vermutung, dass Echovirus-1 und Collagen unterschiedliche Stellen der α2I-Domäne erkennen, zeigen die Daten das Vorhandensein eines wichtigen Regulationsmechanismus der einen Ligandenerkennungsstelle (Echovirus-l-Bindungsstelle) durch das Besetzen der anderen Bindungsstelle (RKK-Bindungsstelle).
Jedoch reichen die vorliegende Informationen über die Struktur-Funktionsbeziehung der α2I-Domäne nicht aus, um daraus den Schluss zu ziehen, ob RKK direkt an die Collagenerkennungsstelle bindet, oder ob es ein allosterischer Inhibitor der α2I-Domänen-Collagen Interaktion ist. In beiden Fällen sind die RKK-enthaltenden Peptide sehr wertvolle Werkzeuge für Studien, die darauf abzielen, die Ligandenerkennungsfunktion der Integrin-I-Domänen zu offenbaren.
Beispiel 5
Die Sequenz von drei Aminosäuren, RKK ist für die Bindung an die Integrin-rα2I-Domäne essentiell
Die zuvor veröffentlichten Informationen über die Integrinerkennungsstellen in verschiedenen Proteinen hebt die Bedeutung der beiden Aminosäurereste, nämlich Asparaginsäure und Arginin hervor. Um die wichtigen Aminosäurereste im 229ox-Peptid zu zeigen, wurde eine Reihe neuer Aminosäuren getestet, bei denen die Aminosären in p229 eine nach der anderen mit Alaninresten ersetzt wurde. Die Peptide wurden an einen festen Träger gebunden und auf ihre Fähigkeit getestet, ra2I zu binden. Interessanterweise fand man heraus, dass drei Aminosäuren Arginin-Lysin-Lysin (RKK) essentiell waren und das benachbarte Histidin etwas Wirkung zeigte. Die Substitution von Asparaginsäure- oder Asparaginresten hatte keine Auswirkung (6A). Vereinbar damit ist, dass die rα2I-Bindung an Typ-I-Collagen mit den Peptiden, die Alaninsubstitutionen der RKK-Sequenz enthielten, nur schwach gehemmt wurde, während die Substitution von Asparaginsäure oder Asparaginresten diese Funktion nicht hemmte (6B).
Um mögliche Bindungsstellen in α2I für das 229ox-Peptid zu identifizieren, wurde eine Reihe von Peptiden, die den hydrophilen Regionen in der α2I-Domäne entsprachen, synthetisiert und auf ihre Fähigkeit getestet, an biotinyliertes 229ox zu binden. Die α2I-Domänenpeptide und ra2I wurden an den festen Träger gebunden und biotinyliertes 229ox wurde zugegeben. Es wurde gezeigt, dass 229ox an ra2I und Peptid-P9 signifikant band, während es in wiederholten Experimenten keine Bindung an andere Peptide gab (7A). Die Interaktion zwischen biotinyliertem 229ox und dem an den festen Träger gebundenen ra2I war von divalenten Kationen abhängig (7A) so wie das bei der Bindung von Europium-markiertem ra2I an einen festen Träger gebundenes Typ-I-Collagen und 229ox Peptid der Fall war (7C).
Beispiel 6
Die kritische Länge des RKK-Peptids
Zur Bestimmung der kritischen Länge des RKK-Peptids wurde eine Reihe von Peptiden hergestellt, die die RKK-Sequenz und zusätzliche Aminosäuren wie folgt umfassen. CTRKKHDNAQC (229ox; SEQ ID NR. 5), CTRKKHDNAC (SEQ ID NR. 3) und CTRKKHDNC (248ox; SEQ ID NR. 4) wurden getestet. Das kürzeste Peptid zeigte eine maximale Hemmung der rα2I-Domänenbindung an Collagen bei einer Konzentration von 10 μM. Dies war mehr als 10-mal effektiver als das längere Peptid 229ox (8).
Beispiel 7
Zellmigrationstests
Ein Migrationstest ahmt die Bewegung der Zellen in der Collagenmatrtx nach. Dieses Beispiel zeigt, dass die vorliegenden Peptide die Bewegung derartiger Zellen blockieren und deshalb bei therapeutischen Verfahren zur Behandlung von Krankheiten nützlich sind, die durch derartige Zellmigration charakterisiert sind.
Um die Wirkungen des 229ox/RKK-Peptids und von 225ox auf die Zell-Collagen-Interaktion zu zeigen, ließ man die chemisch umgewandelten HOS-MNNG-Zellen an Typ-I-Collagen binden und dann auf ihnen wandern. Die Bedeutung von α2β1-Integrin in diesem Verfahren wurde zuvor gezeigt (Vihinen, P. et al.,., Cell Growth Diff. 7: 439–447 (1996)).
Der Zellmigrationstest wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Vihinen, P. et al., Cell Growth Diff. 7: 439–447 (1996)). Im wesentlichen wurden menschliche HOS-MNNG-Osteosarkomzellen (ATCC) in serumfreien Optimem-l-Medium (Life Technologies, Inc.) und 20.000–30.000 Zellen/Vertiefung in ein Zellkultur-Cluster mit 24 Vertiefungen (Costar) in einem Metallzylinder mit einem Durchmesser von 2,80 mm übertragen. Die Zellkulturvertiefungen waren mit 5 μg/cm² Typ-I-Collagen beschichtet worden. Man ließ die Zellen 16 h bei +37°C an Collagen binden. Die Zylinder wurden entfernt, die nicht gebundenen Zellen wurden mit Optimem (Life Technologies, Inc.) abgewaschen, und man ließ die gebundenen Zellen in Optimem in Gegenwart der Peptide 4 Tage wandern. Das frische, Peptide enthaltende Optimem wurde täglich in den Vertiefungen ausgetauscht. Nach 4 Tagen wurde der von den Zellen bedeckte Oberflächenbereich mit einem Mikrocomputer für bildgebende Verfahren Version M4 (Imaging Research Inc.) gemessen.
Die Ergebnisse dieses Experiments werden in 9 gezeigt. Den Zellen wurden entweder 229ox oder das 225ox-Peptid bei einer Konzentration von 500 μM zugegeben und frisches Peptid wurde täglich zugegeben. Die Fähigkeit der HOS-MNNG-Zellen auf Typ-I-Collagen zu wandern, wurde durch das 225ox-Kontrollpeptid nicht beeinflusst, aber das 229ox-Peptid beeinflusste die Migration signifikant (p < 0,001, t-Test nach Student) (9).
Diese Hemmung der Osteosarkomzellmigration auf Collagen legt nahe, dass i) die Bewegung der malignen Zellen und damit die Krebszelleninvasion von p229ox verhindert werden kann und (ii), dass die Migration jedes Zelltyps auch gehemmt werden kann, wenn die Migration wenigstens teilweise eine Folge der α2β1-Integrin-Collagen-Interaktion ist.
Beispiel 8
Hemmung der Zelladhäsion durch ein RKK-Peptid
Die Zelladhäsion der menschlichen Keratinocyten HaCaT-Zellen und der Zelllinie UT-SCC-2, die aus dem Plattenepithelzellkarzinom des Mundes an Typ-I-Collagen etabliert wurde, in Gegenwart des Peptids 220ox oder eines funktionellen Antikörpers gegen α2-Integrin, Gi9 (ein anti-α2-Integrin-Antikörper, der im Handel von Immunotech/Coulter, Westrbrook, Maine, USA) erhältlich ist). Die Zellen wurden mit Cycloheximid 10 μg/ml in serumfreien Medium 1h behandelt. Sie wurden abgelöst und man ließ sie 1 h an mit Typ-I-Collagen vorbeschichteten Mikrotiterplatten in DMEM mit 0,1% Glycin binden. Ungebundene Zellen wurden ausgewaschen, die gebundenen Zellen mit Kristallviolett gefärbt und die Anzahl der gebundenen Zellen wurde geschätzt, indem die optische Absorption gemessen wurde.
Die in 10 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung, beispielsweise Peptid 229ox (p229ox), die Zellmigration hemmen und deshalb bei der Behandlung oder der Vermeidung von mit einer epithelialen Zellmigration einhergehenden Krankheitszuständen, wie beispielsweise Periodontitis, nützlich sind, da die Epithelzellen α2β1-Integrin binden und diese Bindung verwenden, um am Collagen entlang zu wandern.
Beispiel 9
Die Verwendung eines RKK-Peptids bei der Behandlung von Peridontitis und Gingivitis
Peridontitis ist eine Erkrankung, die durch Entzündung und Verlust des unterstützenden Bindegewebes des Zahnes charakterisiert wird. Die Erkrankung wird durch pathogene Bakterien im Mund initiiert, die die Gewebezellen aktivieren, um hydrolytische Enzyme, die Gewebebestandteile abbauen, zu produzieren und freizusetzen. Ein wesentliches Merkmal des Krankheitsprozesses ist die erhöhte Vermehrung und Migration der Epithelzellen, die das Zahnfleisch an die Zahnoberfläche binden (verbindendes Epithel/Taschenepithel).
Die herkömmiche Behandlung von Periodontitis und Gingivitis konzentriert sich auf die Entfernung der pathogenen Bakterien aus dem Periodontium, entweder durch mechanische Zahnsteinentfernung oder durch Antibiotikabehandlung. Ferner wird häufig die operative Korrektur der peridontalen Gewebearchitektur durchgeführt.
Die Hemmung der Zellmigration, die durch die erfindungsgemäßen Peptide, beispielweise p229ox, bereitgestellt wird, kann alleine oder adjunktiv zu anderen Behandlungen verwendet werden, um periodontale Erkrankungen, einschließlich Peridontitis und Gingivitis, zu verhindern oder zu behandeln. Insbesondere können Verbindungen, die wirksame Mengen eines oder mehrerer erfindungsgemäßer circulärer Peptide enthalten, die die RKK-Sequenz enthalten, einem Patienten topisch verabreicht werden, der eine Behandlung der peridontalen Erkrankung, einschließlich Periodontitis und Gingivitis, benötigt. Eine Verbindung, die in dieser Hinsicht nützlich ist, kann für die topische Anwendung unter Verwendung jedes herkömmlichen Verfahrens formuliert werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können in Trägern, einschließlich polymeren Trägern, formuliert werden, wie beispielsweise diejenigen, die auf Ethylcellulose, Silikongummi basieren, und besonders abbaubare Polymere und Copolymere wie Poly(Milchsäure)-, Poly(Glycolsäure)-, Poly(Milchsäure)-Poly(Glycolsäure)-Coploymer, Polyamid und Polyester, Gelatine, Collagen, Albumin, und Fibrinogen, quervernetzt, sind erwünscht, um die gewünschte RKK-Aktivität zu hemmen oder Merkmale freizusetzen. Derartige Transportsysteme für die Mundhöhle werden beispielsweise in U.S. 5,002,769, U.S. 5,023,082, U.S. 5,160,737, U.S.
5,330,746, U.S. 5,425,953, U.S. 5,438,076 und U.S. 5,639,795 beschrieben, die jeweils hier durch Bezugnahme eingebracht werden. Das Peptid wird an die gewünschte Stelle in der Mundhöhle in Implantatform oder als Teil einer flüssigen Verbindung gebracht, die an Ort und Stelle in der Mundhöhle fest wird oder in Form einer Zahnpasta oder Gel, die/das wirksame Spiegel des RKK-enthaltenden Peptids an der gewünschten Stelle bereitstellt. Die Menge des erfindungsgemäßen Peptids wird auf Wunsch variiert, um Spiegel bereit zu stellen, die bei der Bereitstellung des gewünschten hemmenden Effekts in der Umgebung der Mundhöhle und des Transportssystems wirksam sind, aber es kann im allgemeinen bei etwa 0,001%–95% der flüssigen Verbindung vor der Verfestigung oder in der festen Verbindung vorliegen, abhängig von der zu behandelnden Erkrankung.
Es kann auch eine Membran als Träger zur Bereitstellung des erfindungsgemäßen Peptids an die gewünschte Stelle verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen RKK-enthaltenden Peptide sind für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen nützlich, die durch Epithelzellmigration charakterisiert sind, insbesondere für die Behandlung medizinischer Zustände, bei denen topische Anwendungen bevorzugt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Heino, Jyriki Ivaska, Johanna Kāpylā, Jarmo
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Integrin-bindendes Peptid und dessen Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN:
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Sterne, Kessler, Goldstein & Fox P.L.L.C.
(B) STRASSE: 1100 New York Ave., N.W.
(C) STADT: Washington
(D) STAAT: D.C.
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 20005–3934
(v) COMPUTERLESBARE FORM
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE:
(vi) VORHERIGE ANMELDUNGSDATEN
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 08/893,526 USA
(B) ANMELDUNGSDATUM: 29. Jul. 1997 "
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANGABEN für ANWALT/AGENTEN:
(A) NAME: Cimbala, Michele, A.
(B) REGISTRIERNUMMER: 33,851
(C) REFERENZ-/REGISTERNUMMER: 1102.0240000
(ix) TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: 202/371-2600
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Claims

Cyclisches Integrin-bindendes Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz RKK.
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz RKKH (SEQ ID NO. 8).
Peptid nach Anspruch 2, umfassend die Aminosäuresequenz X₁RKKHX₂X_n, wobei X eine beliebige Aminosäure ist und n den Wert 1-4 hat.
Peptid nach Anspruch 2, umfassend die Aminosäuresequenz CTRKKHDNC (SEQ ID NO. 4).
Peptid nach Anspruch 2, umfassend die Aminosäuresequenz CTRKKHDNAQC (SEQ ID NO. 5).
Arzneimittel, umfassend das Integrin-bindende Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Arzneimittel nach Anspruch 6, wobei das Mittel für topische Anwendung geeignet ist.
Verfahren zur Hemmung der Bindung von die α21-Domäne enthaltenden Integrinen an Moleküle, die die α21-Domäne erkennen, indem man das Integrin in vitro dem Integrinbindenden Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 aussetzt.
Integrin-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung für die Hemmung von Integrin-abhängiger Zellmigration.
Peptid nach Anspruch 9, zur Verwendung für die Hemmung von Integrin-abhängiger Zellmigration, wobei die Zellmigration mit Krebs, cardiovaskulärer Krankheit oder einem Periodontitis-Zustand assoziiert ist.
Peptid nach Anspruch 9, zur Verwendung für die Hemmung von Zellmigration auf Kollagen.
Integrin-bindendes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zur Verwendung für die Hemmung der Adhesion von Blutplättchen an Kollagen oder Kollagen-induzierter Blutplättchenaggregation.
Peptid nach Anspruch 12, wobei die Adhesion oder Aggregation mit cardiovaskulärer Krankheit assoziiert sind.