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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung erfolgt auf dem Gebiet
der Proteintherapeutika. Genauer gesagt, ist die Erfindung auf cyclische
Peptide und deren Verwendung gerichtet, insbesondere die Verwendung
dieser Peptide, die biologische Aktivität von Integrin zu blockieren
oder zu hemmen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Integrine sind heterodimere Zelloberflächenglycoproteine,
die aus nicht-covalent assoziierten α- und β-Untereinheiten bestehen. Sechzehn α-Untereinheiten,
acht β-Untereinheiten wurden
bisher identifiziert. Über
20 verschiedene Kombinationen dieser Untereinheiten wurden bisher
gefunden.
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Integrine verankern die Zellen an
ihre Umgebung, indem sie Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen vermitteln
(für einen Überblick
vgl. Hemler, M.E. Annu. Rev. Immunol. 8: 365– 400 (1990) und Hynes, R.O.
Cell 69: 11–25
(1992) und Zitate darin). Die Erkennung der Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD)-Sequenz
in extrazellulären
Matrixproteinen durch Integrine ist ein fundamentales Phänomen bei
der Zell-Matrix-Interaktion. Fibronektin ist der Prototyp eines
RGD-enthaltenden Proteins. Zusätzlich
vermitteln eine Vielzahl anderer Matrixmoleküle in Säugern, Vögeln, Fröschen und Insekten die Zelladhäsion über ihre
RGD-Sequenz. Integrinheterodimere,
die eine β1-, β3-, β5- oder β6-Untereinheit
enthalten, können
RGD-abhängige
Rezeptoren erzeugen (Ruoslahti, E. J., Clin. Invest. 87: 1–5 (1991),
Busk, M. et al., J. Biol. Chem. 267: 7875–7881 (1992) und Elices, M.J.
et al., J. Cell Biol. 112: 169–181
(1991)). In der β1-Untereinheit
wurde die RGD-Bindungsstelle an der aminoterminalen Hälfte des
Moleküls
kartiert und es gibt einige Beweise, die die Möglichkeit nahe legen, dass
die α-Untereinheit
diese Interaktion beeinflussen kann (Shih, D.T. et al., J. Cell
Biol.
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122: 1361–1371 (1993)). Insgesamt teilen
sich zehn Integrinheterodimere die gemeinsame β1-Untereinheit und besitzen deshalb auch
die vermeintliche RGD-Bindungsstelle. Die meisten β1-Integrine
besitzen jedoch zusätzliche
Mechanismen zur Ligandenbindung. Denaturierte fibrilläre Collagene
werden von den RGD-abhängigen
Integrinen wie α5β1 erkannt,
während
native Collagene mit Integrinen auf eine RGD-unabhängige Weise
interagieren (Gullberg, D. el al., EMBO J. 11: 3865–3873 (1992)).
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Zwei Integrine, die αlβ1- und α2β1-Hetreodimere,
sind die zellulären
Hauptrezeptoren für
native Collagene und wie bei allen Integrinen hängt ihre Interaktion mit Liganden
von divalenten Kationen ab (Staatz, W.D. et al., J. Biol. Chem.
266: 7363–7387
(1991)). Das Integrin α2β1 wird beispielsweise
auf Epithelzellen, Blutplättchen,
Granulationsgewebezellen und verschiedenen Krebszellen exprimiert.
Biologische Phänomene, bei
denen die α2β1-Integrinaktivität (Funktion)
essentiell ist, schließen
eine Collagen-induzierte Aggregation der Blutplättchen, die Zellmigration auf
Collagen und die zellabhängige
Neuordnung von Collagenfasern ein. In der Krebsbiologie wurde das α2β1-Integrin mit einem
invasiven Zellphänotyp
assoziiert, und es kann ein Marker für ein aggressives Melanom sein.
Andererseits stellt die Überexpression
von α2β1-Integrin
in Brustkrebszellen den normalen Phänotyp wieder her. Wie andere
Integrine kann α2β1 auch Signale
erzeugen, die die zellulären
Funktionen und die Genexpression regulieren. Insbesondere scheinen
die mRNA-Spiegel von Collagenase-1 durch α2β1-Integrin kontrolliert zu werden.
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Die α1- und α2-Untereinheiten unterscheiden
sich in ihrer Struktur von allen anderen β1-assoziierten α-Untereinheiten
in dem Sinn, dass sie eine spezielle „eingebaute" Domäne, die
I-Domäne,
enthalten, die der A-Domäne ähnelt, die
man z. B. im von-Willenbrand-Faktor findet (Michishita, M. et al.,
Cell 72: 857–867 (1993)).
Es ist offensichtlich, dass αlI-
und α2I-Domänen für die primäre Erkennung
von Collagen durch die entsprechenden Integrine verantwortlich sind.
(Kamata, T. et. al., J. Biol. Chem. 269: 9659–9663 (1994); Kamata, T. et
al., J. Biol. Chem. 269: 26006–26101
(1994); Kern, A. et al., J. Biol. Chem. 269: 22811–22816 (1994)).
Zwei weitere Liganden für α2β1-Integrin,
nämlich
Laminin-1 und Echovirus-1, binden beide auch an die α2I-Domäne. Jedoch
scheint der Echovirus-1 eine unterschiedliche α zu erkennen als die Matrixproteine (Bergelson,
J.M. et al., J. Clin. Invest. 92: 232–239 (1993)).
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Die Bindungsstellen der αlβ1- und α2β1-Integrine
in Collagenen wurden in den dreifach-helikalen Bereichen der Moleküle lokalisiert
(Eble, J.A. et al., EMBO J. 12: 4795–4802 (1993); Gullberg, D.
et al., EMBO J. 11: 3865–3873
(1992)). Es wurde über
eine von der Collagen-α-Kette
abstammende Peptidsequenz berichtet, die die Integrin-Collagen-Interaktion
blockiert, aber das war in vielen Studien ineffektiv und es gibt
wahrscheinlich nicht die tatsächliche
Bindungsstelle im Collagen wider (Cardarelli, P.M. et al., J. Biol.
Chem. 267: 23159–23164
(1992); Pfäff,
M. et al., Exp. Cell Res. 206: 167–176 (1993) und Tuckwell, D.
et al., J. Cell Sci. 108: 1629–1637
(1995)). Es ist wahrscheinlicher, dass Collagenrezeptor-integrine
Aminosäurereste
von mehr als einer Collagen-α-Kette
erkennen. Bei der Typ IV- Collagen-α1β1-Integrininteraktion wurde
die Bedeutung eines Arginin- und zweier Asparaginsäurereste
gezeigt, die alle von unterschiedlichen α-Ketten des Collagens stammen
(Eble, J.A. et al.,., EMBO J. 12: 4795–4802 (1993)).
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Die bekannten Matrixmolekülliganden
für α2β1-Integrin
enthalten keine RKK(H)-Sequenz.
Es wurde gezeigt, dass ein argininreiches lineares Peptid, das eine
RKK-Sequenz umfasst, die von einem Tat-Protein eines menschlichen
Immunschwächevirus
stammt, mit einem αVβS-Integrin
interagiert (Vogel, B.E. et al., J. Cell Biol. 121: 461–468 (1993)).
Man fand jedoch heraus, dass die Integrin-Peptid-Interaktion in
Gegenwart von EDTA stabil war, was einen unterschiedlichen Bindungsmechanismus
anzeigt. Es gibt auch eine früher
beschriebene Heparinsulfat-Bindungssequenz beim Fibronektin, die
ein RKK-Sequenzmotiv enthält,
das jedoch offensichtlich im Bezug auf die Integrin-rβα2I-Domänen-Bindung
nicht funktional ist (Drake et al., J. Biol. Chem. 268: 15859–15867 (1993)).
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Das Gift von verschiedenen Schlangenarten
enthält
Disintegrin-ähnliche
Proteine, die die Integrinfunktion der Blutplättchen blockieren und für den Antikoagulationseffekt
der Gifte verantwortlich sind. Diese Proteine halfen dabei, die
molekularen Mechanismen der Integrinfunktion zu verstehen, und sie
haben auch einen potentiellen Wert bei der Entwicklung neuer Medikamente.
Viele der Disintegrine besitzen eine RGD-Sequenz und sie hemmen
die Funktion der αIIbβ3- und αVβ3-Integrine
der Blutplättchen.
Im Jararhagin, einer Disintegrin/Metalloproteinase aus Bothrops
jararaca, wird RGD durch die Sequenz ECD ersetzt (Paine, M.J.I.
et al., J. Biol. Chem. 267: 22869–22876 (1992)). Jararhagin
ist ein starker Inhibitor der Collagen-induzierten Aggregation der
Blutplättchen
und seine Wirkung basiert auf der Hemmung der α2β1-Integrinfunktion (De Luca,
M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 570–576 (1995)).
Der genaue Mechanismus seiner Wirkung ist bisher unbekannt. Integrin α2β1 kann auch
mit Jaracetin, einem Schlangengiftprotein, interagieren, das die Disintegrindomäne von Jararhagin
enthält,
aber die Interaktion scheint schwächer zu sein als mit Jararhagin (De
Luca, M. et al.,., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 570–576 (1995)).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
cyclische Peptide bereit, die an die menschliche α2I-Domäne (nativ und
rekombinant) binden. Zusätzlich
sind sie starke Inhibitoren der Interaktion von menschlichem Integrin
mit Collagen I und IV und Laminin-1.
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Die erfindungsgemäßen cyclische Peptide stammen
ursprünglich
von der Metalloproteinasedomäne von
Jararhagin ab. Jedes der neuen Integrin-bindenden Proteine umfasst
eine colineare Sequenz dreier Aminosäuren, Arginin-Lysin-Lysin (RKK).
Das Vorliegen der RKK-Sequenz in der cyclischen Form hemmt die Integrin-bindende
Aktivität.
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Die Erfindung stellt ferner cyclische
Peptide bereit, die eines oder mehrere Kopien der RKK-Sequenz in
der Peptidsequenz enthalten, wobei derartige Kopien ausreichen,
um das Peptid mit der Fähigkeit
auszustatten, die Interaktion von Integrin mit Collagen zu verringern.
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Die Endung stellt ferner cyclische
Peptide bereit, die die Aminosäuresequenz
XIRKKX2X3X4X5X6 (SEQ ID NR. 1) umfassen, wobei die Aminosäuren X1-X6 beliebige Aminosäuren sein
können,
aber vorzugsweise X2 Histidin (H) ist.
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Die Endung stellt ferner cyclische
Peptide bereit, die vorzugsweise die Aminosäuresequenz X1RKKX2X3X4X5 (SEQ ID NR. 2) umfassen, wobei die Aminosäuren X1-X5 beliebige Aminosäuren sein
können, aber
vorzugsweise X2 Histidin (H) ist.
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Die Endung stellt ferner cyclische
Peptide bereit, die stärker
bevorzugt die Aminosäuresequenz X1RKKX2X3X4 (SEQ ID NR. 3) umfassen, wobei die Aminosäuren X1-X4 beliebige Aminosäure sein können, aber vorzugsweise X2 Histidin (H) ist.
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Die Erfindung stellt ferner zwei
cyclische Peptide bereit, CTRKKHDNC (SEQ ID NR. 4) und CTRKKHDNAQC
(SEQ ID NR. 5), die die Aminosäuren
241–247
(CTRKKHD, SEQ ID NR.6) bzw. 241–249 (CTRKKHDNA,
SEQ ID NR. 7) der Metalloproteinasedomäne von Jararhagin und cyclische
Fragmente dieser Peptide enthalten, denen eine oder mehrere Aminosäuren fehlen,
insbesondere eine oder mehrere Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus C, T, H, D, N, A und/oder Q.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ferner Verfahren zur Verwendung dieser Peptide bereit, um die Integrinfunktion
zu blockieren und um Patienten mit einem physiologischen Zustand
oder einer Erkrankung zu behandeln, die einer derartigen blockierenden
Aktivität
bedarf.
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Die cyclischen Integrin-bindenden
Peptide der vorliegenden Erfindung sind auch bei der Isolierung α2-enthaltender
Integrine aus einem Probengemisch nützlich.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1(A-D).
Bindung von Europium-markiertem rα2I
an verschiedene Substrate in einem Festphasen-Test. Die Mikrotiterplatten
wurden mit Typ-I-Collagen, Typ-IV-Collagen, Laminin-1 und Fibronektin
vorbeschichtet. Man ließ rα2I 3 Stunden
binden (A). Man ließ rα2I an Typ-I-Collagen
in Gegenwart von EDTA (B) oder MgCl2 und
verschiedene Konzentrationen des Bothrops jararaca-Giftes binden
(C). Alternativ wurden Vertiefungen mit Bothrops jararaca-Gift vorbeschichtet
und man ließ rα2I 3 Stunden
in Gegenwart von MgCl2 binden (D).
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2(A-B).
Bindung von Europium-markiertem rα2I
an Adäsionsproteine
und Jararhagin-abstammende Peptide in einem Festphasen-Test. Die
Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit verschiedenen Peptiden
Typ-I-Collagen, Typ-IV-Collagen und Fibronektin vorbeschichtet.
Die Daten sind der Mittelwert aus drei parallelen Experimenten,
die die rα2I-Bindung
an verschiedene Substrate zeigen (A). Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten
wurden mit BSA und Typ-I-Collagen vorbeschichtet, und man ließ rα2I 3 Stunden
in Gegenwart des Peptids binden (B).
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3 Bindung
von rα2I
an Peptide und Bothrops jararaca-Gift in Gegenwart des 229ox-Peptids.
Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit Peptiden oder
Bothrops jararaca-Gift vorbeschichtet. Man ließ die rα2I-Domäne in Gegenwart oder Abwesenheit
des 229ox-Peptids binden. Die Daten sind der Mittelwert aus drei
parallelen Experimenten.
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4(A-C).
Eigenschaften des 229ox-Peptids. Dosis-Antwort-Kurven für die Hemmung
der rα2I-Bindung
an Typ-I-Collagen in Gegenwart von cyclischem oder linearem 229ox-Peptid
(A). Alternativ wurden die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit
229ox-Peptid vorbeschichtet
(B). 229ox-Peptid wurde dem rα2I-Bindungstest
auf verschiedenen vorbeschichteten Substraten zugegeben (C).
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5 Die
Wirkung von 229ox auf die Bindung von rα2I an Typ-I-Collagen und Echovirus-1.
Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit Typ-I-Collagen
und Echovirus-1 vorbeschichtet. Man ließ rα2I in Gegenwart oder Abwesenheit
des Peptids binden. Die Daten sind der Mittelwert aus drei parallelen
Experimenten.
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6(A-B).
Hemmung der Bindung von rα2I
an Typ-I-Collagen durch Alaninsubstituierte 229ox-Peptide. Die Vertiefungen
von Mikrotiterplatten wurden mit den Peptiden vorbeschichtet und
man ließ rα2I binden (A).
Alternativ wurden die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit Typ-I-Collagen
vorbeschichtet, und rα2I
wurde in Gegenwart des Peptids zugegeben (B).
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7(A-C).
Die α2I-Domänenpeptide
(A) und rα2I
(A, B) wurden an den festen Träger
gebunden und biotinyliertes 229ox wurde zugegeben. Die Bindung des
229ox-Peptids an die α2I-Domänen-abstammenden Peptide
ist in (A) dargestellt. Die Bedeutung von Mg++ für die 229ox-Bindung
an einen festen Träger
gebundenes rα2I
ist in (B) dargestellt. Die Bedeutung von Mg++ für die Bindung von rα2I an einen
festen Träger
gebundenes Typ-I-Collagen
und an 229ox-Peptid wird in (C) dargestellt.
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8 Hemmung
der Bindung von rekombinantem α2I
an Collagen. Die ausgefüllten
Kreise zeigen die Wirkung der angegebenen Konzentrationen von 229ox
(CTRKKHDNAQC; SEQ ID NR. 5). Die nicht ausgefüllten Kreise zeigen die Wirkung
von 248ox (CTRKKHDNC; SEQ ID NR. 4).
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9(A-B).
Migration von HOS-MNNG-Zellen auf Typ-I-Collagen. Man ließ die Zellen
an die Substrate binden. Nach 4 Tagen wurden die Zellen gefärbt, der
von den Zellen bedeckte Oberflächenflächenbereich
wurde von einem Bildanalysator bestimmt (A) und die Vertiefungen
wurden photographiert (B).
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10 Zelladhäsion von
HaCaT- und UT-SCC-2-Zellen in Gegenwart von 229ox und Gi9-Antikörper gegen α2-Integrin.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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In der nachfolgenden Beschreibung
wird eine Anzahl von Begriffen verwendet, die in der Medizin und im
Fachgebiet der Proteinchemie häufig
verwendet werden. Für
ein deutliches und einheitliches Verständnis der Spezifikation und
Ansprüche,
einschließlich
des Rahmens, der derartigen Begriffen gegeben werden soll, gibt
es folgende Definitionen.
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Mit „Patient" ist ein tierischer oder menschlicher
Proband gemeint, der eine tierärztliche
oder ärztliche Behandlung
benötigt,
insbesondere eine Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Verbindung.
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Mit „Behandlung" oder „behandeln" ist die Verabreichung
einer wirksamen Menge einer Verbindung gemeint, die ein oder mehrere
der hier beschriebenen Peptide enthält, an einen Patienten, der
dasselbe/dieselbe benötigt,
für Zwecke,
die die Prophylaxe, Verbesserung, Prävention oder Heilung einer
Erkrankung oder potentieller Erkrankung einschließen können, die
derartigen Mitteln gegenüber
sensitiv sind.
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Mit „Verabreichung" ist das Einbringen
einer gewünschten
Substanz in einen Patienten durch jedes geeignete Verfahren gemeint.
Nützliche
Verabreichungsverfahren schließen
ein, sind aber nicht begrenzt auf parenterale (z. B. intravenöse), intramuskuläre, subdermale,
iontophoretische, orale, rektale und enterale Verabreichung.
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Mit „wirksamer Menge" ist eine Menge gemeint,
die ausreicht, um den festgelegten gewünschten Endzustand zu erreichen.
Eine wirksame Menge des endungsgemäßen Peptids ist eine Menge,
die ausreicht, um den Grad der funktionalen Interaktion eines α2I-Domäneenthaltenden
Integrins oder eines oder mehrere der Ziele, die mit dem Integrin
in Abwesenheit des erfindungsgemäßen Peptids
interagiert hätten,
zu verringern oder zu hemmen oder zu vermeiden.
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Ein „pharmazeutisch verträgliches
Salz" soll Salze
einschließen,
die aus pharmazeutisch verträglichen Säuren oder
Basen wie beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf Säuren wie
Schwefel-, Salz-, Salpeter-, Phosphorsäure etc. oder Basen wie, jedoch
nicht begrenzt auf Alkali-, Erdalkalimetallhydroxide, Ammoniumhydroxide,
Alkylammoniumhydroxide etc. erzeugt werden.
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Der Begriff „pharmazeutisch verträgliches
Vehikel" soll Lösungsmittel,
Träger,
Verdünnungsmittel
und dergleichen einschließen,
die als Zusätze
zu den erfindungsgemäßen Zubereitungen
verwendet werden, damit ein Träger
oder Adjuvans für
die Verabreichung derartiger Verbindungen bereitgestellt wird.
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Während
die nachstehende Diskussion und die Beispielgebung oft unter Verwendung
menschlicher Integrinproteine dargestellt werden, sind die erfindungsgemäßen Peptide
und Verfahren bei jeder Art nützlich, die
sensitiv gegenüber
Schlangenbissen ist, bei denen Jararhagin ein aktiver Bestandteil
des Giftes ist, da eine derartige Aktivität die Fähigkeit der endungsgemäßen Peptide
nachweist, das Zielintegrin in derartigen Spezies zu binden.
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Deshalb sollen die nachstehende Diskussion
und Beispielgebung unter Verwendung der menschlichen Ausführungsform
die Erfindung in dieser Hinsicht nicht begrenzen.
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Die Erkennung von Collagen durch
Integrine ähnelt
der Integrin-Fibronektin-Bindung. Die Collagen-bindenden αI-Domänen und
RGD-bindenden vermeintlichen βI-Domänen besitzen
nicht nur strukturelle Ähnlichkeiten,
sondern auch cyclische RGD-Peptide können an ein α2β1-Integrin
binden. Die drei Collagenaminosäurereste,
von denen man denkt, dass sie für
die Integrinbindung an Collagen wichtig sind, enthalten zwei Asparaginsäuren und
ein Arginin.
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Die Erfinder stellten die Hypothese
auf, dass das Motiv im Jararhagin, das die rα2I-Domänenbindung an
Collagen blockiert, entweder Asparaginsäure- oder Argininreste enthalten
muss und dass das wichtige Motiv für deine derartige Wirkung entweder
in einer hydrophilen Schleife wie die bekannten Integrinerkennungstellen
in Matrixmolekülen
liegt oder die Schlangengift-Disintegrine in hydrophilen Schleifen
liegen. Die Erfinder suchte nach zuvor unbekannten Sequenzen in
der Jararhaginstruktur, die diese Kriterien erfüllten und stellten synthetische
Peptide zum Testen in Festphasen-Tests mit der Integrin rα2I-Domäne bereit.
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Man fand heraus, dass eines der Peptide,
das von der Metalloproteinasedomäne
CTRKKHDNAQC (SEQ ID NR. 5) abstammte, die die Aminosäuren 241-249
(die terminalen Cysteine an einem der beiden Enden wurden der nativen
Sequenz hinzugefügt)
in der Metalloproteinasedomäne
von Jararhagin enthielt, stark an die rα2I-Domäne band. Die hohe Bindungsaffinität wurde
durch die Tatsache bewiesen, dass es, wenn die Europium-markierte
rα2I-Domäne (rekombinantes α2I) an das
Protein gebunden hatte, keine nachweisbare Ablösung während einer 2-ständigen Follow-up-Periode
gab, sogar wenn ein 10-facher Überschuss
einer unmarkierten rα2I-Domäne dem Test
zugegeben worden war.
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Von den getesteten Peptiden war dasselbe
Peptid auch das einzige, das eine Adhäsion der rα2I-Domäne an Typ-I- und IV-Collagen
und an Laminin-1 hemmte. Ferner konkurrierten die Peptide mit B.
jararaca-Gift in der rα2I-Domänenbindung.
Somit schlossen die Erfinder daraus, dass die Gegenwart einer Aminosäuresequenz,
die den vorstehenden Amniosäuren
241-249 entspricht, ein Grund ist, weshalb Jararhagin mit α2β1-Integrin
interagiert.
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Die Mutationsanalyse der Peptidsequenz
zeigte ein neues Integrinbindungsmotiv, RKK oder RKKH (SEQ ID NR.
8). Histidin, die vierte Aminosäure
in der RKKH-Sequenz kann ebenfalls für die volle Funktion wichtig
sein. Überraschenderweise
hatte die Mutation der Asparaginsäure in der Peptidsequenz keine
Auswirkung. Die bekannten Matrixmolekülliganden für α2β1-Integrin enthalten nicht die
RKK(H)-Sequenz.
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Das neue vorstehend gefundene rα2I-Domänenbindungsmotiv
oder die Peptide, die dasselbe enthalten, können die Matrixproteinerkennung
verhindern. Ohne zu beabsichtigen, an diese Erklärung gebunden zu sein, denkt
man, dass dieser Effekt entweder durch direkte Interaktion mit der
Ligandenbindungsstelle der I-Domäne
oder durch Verursachen einer Konformationsänderung der I-Domäne auftritt
und somit die Ligandenerkennungsstelle maskiert. Die Peptid-abhängige Konformationsänderung
der rα2I-Domäne wurde
in Experimenten offensichtlich, die zeigten, dass begleitend mit
dem Verhindern der Collagenbindung das Peptid die Bindung der rα2I-Domäne an Echovirus-1
induzierte. Dies zeigt auch, dass die Besetzung einer Ligandenerkennungsstelle
die Affinität
einer anderen Stelle regulieren kann.
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Demnach umfasst jedes der neuen erfindungsgemäßen Integrin
bindenden Proteine eine colineare Sequenz dreier Aminosäuren, Arginin-Lysin-Lysin
(RKK), die, wenn das Peptid in der cyclischen Form vorliegt, die
Integrin-bindende Aktivität
am Peptid behindert. Eine, zwei, drei oder mehr Kopien des RKK-Sequenzmotivs
können
in der Peptidsequenz vorliegen, wobei derartige Kopien ausreichen,
um dem Peptid die Fähigkeit zu
verleihen, die Interaktion von Integrin mit Collagen zu verringern.
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In einer ersten Ausführungsform
sind die endungsgemäßen Peptide
cyclische Peptide, die die Aminosäuresequenz XIRKKX2X3X4X5X6 (SEQ ID NR. 1)
enthalten, wobei jedes X eine Aminosäure ist und die Aminosäuren X1-X6 beliebige Aminosäuren sind
(insbesondere A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T,
W, Y oder V), aber vorzugsweise X2 Histidin
(H) ist.
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In einer weiteren Ausführungsform
sind die erfindungsgemäßen Peptide
cyclische Peptide, die die Aminosäuresequenz XIRKKX2X3X4X5 (SEQ ID NR. 2) enthalten, wobei jedes X
eine Aminosäure
ist und die Aminosäuren
X1–X5 beliebige Aminosäuren wie vorstehend sind, aber
vorzugsweise X2 Histidin (H) ist.
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In einer weiteren Ausführungsform
sind die endungsgemäßen Peptide
cyclische Peptide, die die Aminosäuresequenz X1RKKX2X3X4 (SEQ
ID NR. 3) enthalten, wobei die Aminosäuren X1–X4 beliebige Aminosäure wie vorstehend sind, aber
vorzugsweise X2 Histidin (H) ist, und bei
der das Peptid eine cyclische Struktur wie vorstehend besitzt.
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In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform
ist das erfindungsgemäße Peptid
ein cyclisches Peptid, das die Aminosäuresequenz CTRKKHDNC (SEQ ID
NR. 4) besitzt oder ein cyclisches Peptid, das die Aminosäuresequenz
CTRKKHDNAQC (SEQ ID NR. 5) besitzt, und vorzugsweise sind die beiden
terminalen Cysteinreste an der Erzeugung einer Disulfidbrücke beteiligt,
die dem Peptid die cyclische Struktur verleiht.
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Den erfindungsgemäßen cyclischen Peptiden kann,
wie vorstehend aufgeführt,
eine oder mehrere der Aminosäuren
X und insbesondere eine oder mehrere von C, T, H, D, N, A und/oder
Q fehlen. Ferner können die
endungsgemäßen cyclischen
Peptide zusätzliche
Aminosäuren
enthalten, die entweder in die vorstehenden Sequenzen eingebaut
sind und/oder die vorstehenden Sequenzen flankieren, solange das
RKK-Motiv colinear bleibt, vorausgesetzt, dass derartige Peptide
die Fähigkeit α2-Integrin
zu binden, beibehalten.
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Die terminalen Cysteinreste brauchen
nur auf eine Weise lokalisiert werden, die zur Cyclisierung des Peptids
führt.
Vorzugsweise werden die Cysteine an die terminalen Enden des Peptids
gesetzt, so dass die Bildung der Disulfidbindung zu einer Schleife
mit der richtigen Größe führt, damit
der circulären
Form des Peptids die biologische Aktivität verliehen wird. Jedoch können ein
oder beide Cyteinreste eher im Inneren des Peptids liegen und nicht
so sehr am Ende, und jeder „Schwanz", der über das
Cystein hinausreicht, wird wahrscheinlich kein Problem darstellen,
solange er nicht zum Verlust der circulären Form des restlichen Peptids
beiträgt.
So lange die cyclische Form des Peptids nicht behindert wurde, so
dass es in einer Konformation vorlag, die zuließ, dass es biologisch aktiv
blieb, dann konnte in dieser Hinsicht eine unterschiedliche Einheit,
beispielsweise ein Protein wie Albunin als Linker, Spacer verwendet
werden oder an das Ende des cyclischen Peptids gebunden werden,
damit das erfindungsgemäße cyclische
Peptid an einen festen Träger
oder eine andere erwünschte
Einheit, beispielweise eine nachweisbare Markierung, gebunden ist.
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Wenn sich die Cysteine am terminalen
Ende des Peptids befinden, enthält
das Peptid vorzugsweise neun Aminosäuren zwischen den Cysteinen.
Acht Aminosäuren
verstärkten
die Aktivität
nicht und es ist somit auch in dieser Hinsicht nützlich. Ein cyclisches Peptid
mit sieben Aminosäuren
zwischen den terminalen Cysteinen war etwa 20-mal wirksamer als
diejenigen mit sieben oder acht Aminosäuren und wird somit besonders bevorzugt.
Im allgemeinen laufen Peptide, die 10 oder mehr Aminosäuren zwischen
den terminalen Cysteinen enthalten, Gefahr, sich mehr wie ein (nicht
funktionelles) lineares Molekül
zu verhalten als ein zirkuläres.
Cyclische Peptide, die fünf
oder weniger Aminosäuren
zwischen den terminalen Cysteinen enthalten, sind sehr schwierig,
wenn nicht unmöglich,
herzustellen. Demnach ist ein cyclisches Peptid, das sieben Aminosäuren zwischen
den terminalen Cysteinen enthält,
die am meisten bevorzugte Ausführungsform.
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Die Sequenz des endungsgemäßen Peptids
soll die Varianten der vorstehend beschriebenen Peptide umfassen,
wobei derartige Varianten Aminosäuresubstitutionen
mit irrelevantem Unterschied besitzen, beispielsweise die Substitution
einer basischen Aminosäure
mit einer anderen (außer
beim RKK-Motiv), die Substitution eines hydrophoben Rests mit einem
anderen, die Substitution eines neutralen Rests mit einem anderen,
die Substitution eines sauren Rests mit einem anderen oder die Substitution
eines aromatischen Rests mit einem anderen.
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In der bevorzugten Ausführungsform
ist die cyclische Form des Peptids auf eine Disulfidbrücke zurückzuführen. Man
erwartet jedoch, dass jede covalente Bindung, die zur cyclischen
Form des Peptid führt, nützlich ist,
da die Funktion der Brücke
einfach darin besteht, das Peptid in die richtige Konformation zu
zwingen.
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Wie aus dem Fachgebiet bekannt, können die
Aminosäurereste
in ihrer geschützten
oder ungeschützten
Form vorliegen, wobei geeignete Amino- oder Carboxylschutzgruppen
verwendet werden. Nützliche
pharmazeutisch verträgliche
Kationen schließen
Alkali- oder Erd-alkalimetallkationen (beispielsweise Na, K, Li, ½ Ca,½ Ba etc.)
oder Aminokationen ein (beispielsweise Tetraalkyammonium, Trialkylammonium,
wobei jede Alkylgruppe C1-C12 sein
kann, aber vorzugsweise eine C1-C6 verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe
ist). Pharmazeutisch verträgliche
niedrigere Alkylester, pharmazeutisch verträgliche Amide und pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze
können
ebenfalls hergestellt werden.
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Die erfindungsgemäßen Peptide können unter
Verwendung von aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren synthetisiert
und cyclisiert werden, beispielsweise wie in U.S. 5,627,263 beschrieben.
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Die cyclischen Integrin-bindenden
Peptide nach der vorliegenden Endung sind als Blocker (Inhibitoren)
der Integrinfunktion, insbesondere der menschlichen Integrinfunktion,
nützlich.
Die Integrinbindung an ihre nativen Liganden wird in Gegenwart der
erfindungsgemäßen Peptide
gehemmt oder verhindert. Insbesondere die cyclischen Integrinbindenden
Peptide sind zur Blockierung der Interaktion der Integrin-α2I-Domänen mit Makromolekülen nützlich,
die mit dieser Domäne
interagieren, beispielsweise Collagene wie Collagen-I und IV und
beispielsweise Laminin-1.
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Die Sequenz der menschlichen rekombinanten α2I-Domäne wird
bei Takada, Y. und M.E. Hemler, J. Cell Biol. 109: 397–407 (1989)
bereitgestellt. Die α2I-Domäne kann
unter Verwendung herkömmlicher
rekombinanter Wirte, beispielsweise E. coli, hergestellt werden.
Ihre Eigenschaften können
unter Verwendung eines sensitiven Festphasen-Tests charakterisiert
werden, der auf der Europium-Markierung der rα2I-Domäne und zeitaufgelöster Fluoreszenzmessungen
basiert. Der Test ermöglicht
die direkte Messung der Bindung der rα2I-Domäne ohne Gegenwart von Enzymen
oder anderen großen
Molekülen,
die daran gebunden sind.
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Die α2-Integrin-bindende Fähigkeit
eines erfindungsgemäßen Peptids
kann unter Verwendung jedes Tests bestimmt werden, der eine derartige
Bindung nachweist, und insbesondere der die Fähigkeit einer derartigen Bindung
nachweist, die Integrininteraktion mit Collagen-I, Collagen-IV oder
Laminin-I zu blockieren. Wie nachstehend beispielhaft dargestellt,
sind in dieser Hinsicht ein Bindungstest, bei dem eine Europium-markierte
rekombinante α2I-Domäne (Beispiel 2)
und ein Test nützlich,
der die Aktivierung der Virus-1-Erkennungsstelle
in der α2I-Domäne nachweist
(Beispiel 2).
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Die erfindungsgemäßen Peptide sind insbesondere
nützlich,
um die Zellwanderung auf Collagen, in vivo oder in vitro, zu hemmen
oder zu verhindern. Die Fähigkeit
eines erfindungsgemäßen Peptids,
die Zellmigration zu blockieren, kann unter Verwendung der Zellmigrationstests,
wie in Beispiel 7 bereitgestellt, bestimmt werden. Somit stellt
die vorliegende Erfindung Verfahren zur Hemmung der Zellmigration
auf Collagen in vivo und in vitro bei einem Patienten bereit, der
eine Behandlung benötigt,
um dieselbe zu hemmen, wenn eine derartige Migration in einer Integrin-abhängigen Weise
vermittelt wird. Die Endung stellt somit ein therapeutisches Verfahren
zur Behandlung von Krankheiten, einschließlich Periodontitis bereit,
bei denen Zellmigration ein Teil des pathogenen Mechanismus ist.
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Die Endung stellt ferner ein Verfahren
zur Hemmung der Migration maligner Zellen bereit und deshalb zur
Behandlung von Krankheiten, die durch dieselben charakterisiert
sind, beispielsweise Krebsarten, einschließlich Osteosarkom und Melanom,
insbesondere, bei denen die α2β1-Integrin-abhängige Zellmigration zum
malignen Mechanismus beitragen kann.
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Diese Erfindung stellt ferner ein
Verfahren zur Hemmung der Adhäsion
von Blutplättchen
an Collagen und Collagen-induzierte Aggregation der Blutplättchen bereit.
Die Fähigkeit
eines endungsgemäßen Peptids zur
Hemmung der Zelladhäsion
kann bestimmt werden, wie in Beispiel 8 bereitgestellt. Somit stellt
die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Patienten bereit,
die eine präventive
oder verbessernde Behandlung für
Erkrankungen oder Krankheiten wie cardiovaskuläre Erkrankungen benötigen, die
durch einen Bedarf charakterisiert sind, die Adhäsion der Blutplättchen an
Collagen und Collageninduzierte Aggregation der Blutplättchen zu
verhindern, beispielsweise bei Schlaganfallopfern oder Patienten,
die ein Schlaganfallrisiko haben.
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Pharmazeutische Zubereitungen, die
die erfindungsgemäßen Peptide
enthalten, können
unter anderem pharmazeutisch verträgliche Träger zur Stabilisierung und
wirksamen Formulierung der Peptide enthalten. Geeignete Vehikel
und deren Formulierung, einschließlich weiterer menschlicher
Proteine, beispielsweise menschliches Serumalbumin, werden beispielsweise
in Remington's Pharmaceutical
Sciences (18. Auflage, A.R. Gennaro, Herausg., Mack Publishing,
Easton, PA 1990) beschrieben. Um eine pharmazeutisch verträgliche Verbindung
zu erzeugen, die für
die Verabreichung wirksamer Mengen an endungsgemäßem Peptid an einen Patienten,
der eine derartige Verbindung benötigt, geeignet ist, enthält eine
derartige Verbindung, wenn gewünscht,
eine wirksame Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Peptide
zusammen mit einer geeigneten Menge des Trägervehikels.
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Die endungsgemäßen Peptide wurden vorzugsweise
gereinigt, damit sie im wesentlichen frei von Verunreinigungen sind.
Man sagt, dass ein Material „im
wesentlichen frei von Verunreinigungen" ist, wenn es im wesentlichen von unerwünschtem
Material, mit dem es bei der Synthese entweder in der Zelle oder
in einem in vitro-System assoziiert wurde, bis zu einem Grad, der
ausreicht, um es nützlich
für einen
gewünschten Zweck
zu machen, gereinigt wurde.
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Verbindungen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren
nützlich
sind, können
ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide enthalten. Wenn
mehr als eines der Peptide in der Verbindung vorliegt, kann es Teil
derselben Aminosäurekette
sein wie das andere Peptid oder kann als einzelnes Peptid in der
Verbindung vorliegen. Verbindungen für die intravenöse, intramuskuläre oder
subkutane Verabreichung werden vorzugsweise in Dosierungen im Bereich
von etwa 1 pg/kg Körpergewicht
bis 1 mg/kg Körpergewicht
verabreicht, obwohl niedrigere oder höhere Dosen verabreicht werden
können.
Die erforderliche Dosierung hängt
beispielsweise vom Schweregrad der Erkrankung des Patienten und
derartigen Kriterien wie Gewicht, Geschlecht, Alter und Krankengeschichte
ab. Die Dosis kann auch variieren, abhängig davon, ob sie in einem
veterinären
Ansatz einem Tier oder einem menschlichen Patienten verabreicht
werden soll.
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Für
die Zwecke der parenteralen Verabreichung werden Verbindungen, die
die erfindungsgemäßen Peptide
enthalten, vorzugsweise in destilliertem Wasser gelöst und der
pH-Wert wird vorzugsweise auf etwa 6 bis 8 eingestellt. Wenn das
Peptid in einer lyophilisierten Form bereitgestellt werden soll,
kann der Lösung
Laktose hinzugefügt
werden, um den Lyophilisierungsvorgang zu erleichtern. In derartiger
Form wird die Lösung dann
sterilisiert, in Phiolen eingebracht und lyophilisiert.
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Nützliche
Zubereitungen der erfindungsgemäßen Verbindungen
für die
parenterale Verabreichung schließen auch sterile wässrige und
nicht-wässrige
Lösungsmittel,
Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele nützlicher nicht wässriger
Lösungsmittel
schließen
Propylenglycol, Polyethylenglycol, Gemüseöl, Fischöl und injizierbare organische
Ester ein. Beispiele von wässrigen
Trägern
schließen
Wasser, Wasser-Alkohol-Lösungen,
Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepufferte medizinische
parenterale Vehikel einschließlich
Natriumchloridlösung,
Laktose enthaltende Ringer-Lösung
oder fixierte Öle
ein. Beispiele intravenöser
Vehikel schließen
flüssige
Zubereitungen und Nährlösungen,
Elektrolytlösungen
wie diejenigen, die auf Ringer-Dextrose basieren, und dergleichen
ein.
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Injizierbare Zubereitungen, wie ölhaltige
Lösungen,
Suspensionen oder Emulsionen können
nach aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren formuliert werden, wobei
bei Bedarf geeignete Dispersions- oder Befeuchtungsmittel verwendet
werden. Wenn die aktiven Bestandteile in einer wasserlöslichen
Form beispielsweise in Form von wasserlöslichen Salzen vorliegen, kann
bei der sterilen injizierbaren Zubereitung eine nicht toxische parenteral
verträgliche
Verdünnung
oder ein Lösungsmittel
wie beispielsweise steriles nicht pyrogenes Wasser oder 1,3-Butandiol
verwendet werden. Unter den anderen verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln,
die verwendet werden können,
sind 5% Dextrose Ringer-Injektion
und isotonische Natriumchlorid-Injektion (wie im USP/NF beschrieben).
Wenn die aktiven Bestandteile in einer nicht wässrigen löslichen Form vorliegen, werden
sterile geeignete ölige
Suspensionen verwendet, die geeignete lipophile Lösungsmittel
oder Vehikel wie fetthaltige Öle,
beispielsweise Sesamöl,
oder synthetische Fettsäureester
enthalten, beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride. Alternativ
können
wässrige
Injektionssuspensionen, die Substanzen enthalten, die die Viskosität erhöhen, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose,
Sorbit und/oder Dextran, und fakultativ auch Stabilisatoren enthalten,
verwendet werden.
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Für
den iontophoretischen Transport eines erfindungsgemäßen Peptids
besitzt das Peptid vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 4,0 oder
weniger oder einen pH-Wert von etwa 7,0 oder höher. Iontophoreische Verfahren
sind bekannt, wie beispielsweise in U.S. 5,637,084 und in U.S. 4,950,229
beschrieben.
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Pharmazeutische Zubereitungen für die orale
(aber systemische) Verabreichung können durch Kombination der
aktiven Bestandteile mit festen Excipienten erhalten werden, fakultativ
durch Granulation eines sich ergebenden Gemisches und Bearbeitung
des Gemisches oder der Granulate nach Zugabe auf Wunsch oder bei
Bedarf geeigneter Hilfsmittel, so dass Tabletten mit Drageekernen
erzeugt werden. Pharmazeutische Zubereitungen für die Behandlung von Periodontitis
können
in einer Verbindung verabreicht werden, die in der Mundhöhle verbleibt,
vorzugsweise durch direktes Einsetzen der Zubereitung in die periodontale
Höhle und am
meisten bevorzugt in einer Dauerfreisetzungsform. Alternativ kann
die Zubereitung auf die Zähne
und/oder das Zahnfleisch aufgemalt werden, um das Peptid an der
gewünschten
Stelle lokal freizusetzen. Derartige Verfahren werden in U.S. 5,002,769,
U.S. 5,023,082, U.S. 5,160,737, U.S. 5,330,746, U.S. 5,425,953,
U.S. 5,438,076 und U.S. 5,639,795 bereitgestellt. Die Zubereitung
kann auch auf einer Membran bereitgestellt werden.
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Geeignete Excipienten sind insbesondere
Füllstoffe
wie Zucker beispielsweise Laktose oder Saccharose, Mannit oder Sorbit,
Cellulosezubreitungen und/oder Calciumphosphate, beispielsweise
Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat sowie Bindemittel
wie Stärke,
Pasten, wobei beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke oder
Kartoffelstärke,
Gelatine, Traganth, Methycellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Natriumcarboxymethycellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon und/oder
auf Wunsch Disintegrationsmittel wie die vorstehend erwähnten Stärken und
auch Carboxymethylstärke,
quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder
ein Salz davon, wie Natriumalginat erwendet werden. Hilfsmittel
sind vor allem fließregulierende
Mittel und Schmiermittel beispielsweise Kieselgel, Talkum, Stearinsäure oder
Salze davon wie Magnesiumsteart oder Calciumstearat mit geeignetem Überzug,
der auf Wunsch magensaftresistent ist und für diesen Zweck unter anderem
konzentrierte Zuckerlösungen
enthält,
die fakultativ Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol
und/oder Titandioxid, Lakritzlösungen
und geeignete organische Lösungsmittel
oder Lösungsmittelgemische
enthalten. Um magensaftresistente Überzüge herzustellen, werden Lösungen mit
geeigneten Cellulosezubereitungen wie Acetylcellulosephthalat oder
Hydroxypropylmethycellulosephtalat verwendet. Färbemittel oder Pigmente können beispielsweise
den Tabletten oder Drageeüberzügen zur
Identifizierung zugesetzt werden oder um verschiedene Kombinationen
der aktiven Verbindungsdosen zu charakterisieren.
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Feste Darreichungsformen für die orale
Verabreichung schließen
Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pastillen, Pulver und Granula
ein. Bei derartigen festen Darreichungsformen kann die aktive Verbindung
mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel wie Saccharose,
Lactose oder Stärke
beigemischt werden. Derartige Darreichungsformen können auch,
wie es die normale Praxis ist, pharmazeutische adjuvante Substanzen,
z. B. Stearatschmiermittel, umfassen. Feste orale Zubereitungen
können
auch mit magensaftresistenten oder anderen Überzügen hergestellt werden, die
die Freisetzung der aktiven Zutaten modulieren.
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Flüssige Darreichungsformen für die orale
Verabreichung schließen
pharmazeutisch verträgliche Emulsionen,
Lösungen,
Suspensionen, Sirups, und Elexiere ein, die inerte nicht toxische
Verdünnungsmittel, die
herkömmlicherweise
im Fachgebiet verwendet werden, wie Wasser und Alkohol enthalten.
Derartige Zusammensetzungen können
auch Adjuvantien wie Befeuchtungsmittel, Emulgatoren, Suspensionsmittel,
Süßstoffe,
Geschmackstoffe und Geruchstoffe umfassen.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch
mittels Pumpen oder in Dauerfreisetzungsform verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch zu spezifischen Organen in hoher Konzentrationen mittels geeignet
eingebrachter Katheter oder durch Bereitstellung derartiger Moleküle als Teil eines
chimeren Moleküls
(oder Komplex) transportiert werden, das konstruiert wird, um spezifische
Organe anzuvisieren. In dieser Hinsicht können die vorstehenden Peptide
eine cyclische „Schleife" am Ende eines längeren Peptids
bilden, wobei derartige Peptide eine zweite Domäne besitzen, die eine gewünschte Aktivität besitzt.
Derartige Fusionsproteine können
so konstruiert sein, eine Domäne
bereitzustellen, die bei der Abtötung einer
Zelle assistiert, die ein membrangebundenes Integrin enthält, das
das erfindungsgemäße cyclische
Peptid bindet.
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Die Verabreichung einer Dauerfreisetzungsform
ist bequemer für
den Patienten, wenn wiederholte Injektionen für längere Zeiträume angezeigt sind, um den
Komfort des Patienten zu maximieren. Die kontrollierte Freisetzungszubereitung
kann durch Verwendung von Polymeren erreicht werden, um die erfindungsgemäßen Peptide
zu komplexieren oder adsorbieren. Ein kontrollierter Transport kann
erreicht werden, indem die geeigneten Makromoleküle (beispielsweise Polyester,
Polyaminosäuren,
Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcelluloaseprotaminzink
und Protaminsulfat) sowie das Verfahren zum Einbringen ausgewählt werden,
um die Freisetzung zu kontrollieren. Ein weiteres mögliches
Verfahren, die Dauer der Wirkung durch kontrollierte Freisetzungszubreitungen
zu kontrollieren, ist, das gewünschte
Peptid in Partikel eines polymeren Materials wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele,
Poly (Milchsäure)oder
Ethylenvinyacetatcopolymere einzubringen. Alternativ können die
Peptide, anstatt sie in diese polymeren Partikel einzubringen, in
Mikropartikel eingeschlossen werden, die beispielsweise durch Koazervationsverfahren
bzw. durch interfaciale Polymerisierung hergestellt werden, beispielsweise
Hydroxymethylcellulose bzw. Gelatinemikrokapseln oder in kolloidalen
Transportsystemen für
Medikamente, beispielsweise Liposome, Albuminminisphären, Mikroemulsionen,
Nonopartikel und Nanokapseln oder in Makroemulsionen.
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Die biologische Halbwertszeit des
erfindungsgemäßen Peptids
kann durch Erhöhung
der Retention oder Stabilität
der cyclischen Form in der gewünschten
Umgebung verlängert
werden. Man kann insbesondere von Mitteln, die die Stabilität der cyclischen
Form verstärken,
erwarten, dass sie die biologische Halbwertszeit des Peptids erhöhen. In
dieser Hinsicht kann die Verwendung von einer oder mehreren D-Aminosäuren (insbesondere
wenn sie mit derselben L-Aminosäure
an dieser Position ersetzt wurden) oder die Verwendung von einer
oder mehrerer Aminosäureanaloga
wie Penicillamin (3-Mercaptovalin) in der Peptidstruktur so eingesetzt werden,
dass die D-Aminosäure
oder das Aminosäureanalogon
mit dem metabolischen Abbau in der cyclischen Struktur im Tier oder
dem Patienten, dem die Verbindung verabreicht wird, oder in der
gewünschten in-vitro-Verbindung
interferiert.
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Die Verwendung von D-Aminosäuren oder
Aminosäureanaloga
zur Erhöhung
der Bindung des erfindungsgemäßen Peptids,
an das Ziel insbesondere an die α2I-Domäne enthaltende
Integrine, wird ebenfalls in Erwägung
gezogen.
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Die Peptide, die in den Verbindungen
und in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, können
in Darreichungsformen wie Tabletten, Kapseln, Pulverpäckchen oder
flüssigen
Zubereitungen für
die orale Verabreichung verwendet werden, wenn die biologische Aktivität des Materials
nicht vom Abbauprozess zerstört
wird und wenn die Merkmale der Verbindung es zulassen, dass sie über das
Darmgewebe absorbiert wird.
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Die Arzneimittel der vorliegenden
Erfindung können
auf eine Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, beispielsweise
durch herkömmliches
Mischen, Granulieren, Drageeherstellung, Lösen, Lyophilisieren oder ähnliche
Verfahren.
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Das erfindungsgemäße Peptid kann auch als Affinitätsreagenz
für die
Extraktion von Liganden verwendet werden, die an sie binden, insbesondere
für die
Extraktion von α2Ienthaltenden
Integrinen aus einem Gemisch.
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Da die Erfindung nun vollständig beschrieben
wurde, ist dieselbe unter Bezugnahme von spezifischen Beispielen
leichter zu verstehen, die durch Veranschaulichung bereitgestellt
werden und die die Erfindung nicht begrenzen sollen, sofern nicht
spezifiziert.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Erzeugung der menschlichen
rekombinanten α2I-Integrin-Domäne
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Die DNA-codierende α2I-Domäne wurde
durch PCR unter Verwendung menschlicher α2-cDNA als Matrize erzeugt (die
Integrin α2-cDNA
war ein Geschenk von Dr. M. Hemler, Dana-Faber, Boston). Der Vorwärtsprimer
war 5'-CACAGGGATCCCCCTGATTTTCAG-CTC-3' (SEQ ID NR. 9) und
der Rückwärtsprimer war
5'-GTGGCTGAATTCAAC-AGTACCTTCAATG-3'(SEQ ID NR. 10).
Die Primer wurden konstruiert, um zwei Restriktionsstellen in das
Produkt einzuführen:
Die BamHI-Schnittstelle am 5'-Ende
und die EcoRI- Schnittstelle am 3'-Ende. Das PCR-Produkt und pGEX2T (Pharmacia)
wurden mit BamHI und EcoRI gespalten, ligiert und in E. coli-DHαSF'-Zellen transformiert.
Das Plasmid, das eine Insertion mit der α2I-Domaine (pJKα2I) besaß, wurde
dann sequenziert und in E. coli-BL21 zur Herstellung des rekombinanten
Proteins rα2I
transformiert. Die Herstellung und Reinigung des Glutathion S-Transferase-rα2I-Fusionsproteins
wurden wie folgt durchgeführt:
Typischerweise wurden 400 ml LB (Carbenicillin 50 μg/ml) mit
40 ml BL21/pJKα2I- Übernachtkultur
angeimpft, und die Kultur wurde 1 h bei 37°C gezüchtet. Dann wurde 4 h ein Inducer,
IPTG (Endkonzentration 0,1 mM), zugegeben.
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Das menschliche rekombinante Integrin α2I wurde
aus E. coli-Zellen wie folgt gereinigt. Die Zellen wurden durch
Zentrifugation geerntet und die Pellets in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS,
pH 7,4) resuspendiert. Die Suspensionen wurden mit Ultraschall behandelt,
zentrifugiert und der Überstand
wurde zurückbehalten.
Die Pellets wurden in PBS resuspendiert, mit Ultraschall behandelt
und zwei weitere Male zentrifugiert und die Überstande wurden vereinigt.
Glutathion Sepharose® (Pharmacia)
wurde zugegeben und das sich ergebende Lysat wurde 30 min bei Raumtemperatur
durch sanftes Schütteln
inkubiert. Das Lysat wurde zentrifugiert, die Fraktion mit dem Überstand
wurde entfernt und Glutathion Sepharose® mit dem gebundenem Fusionsprotein
wurde in die geeignete Säule
transferiert. Die Säule
wurde dann mit 10 Volumina PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) gewaschen
und das Fusionsprotein wurde mit Glutathion-Elutionspuffer (Pharmacia;
10 mM reduziertes Glutathion in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) eluiert.
Das Fusionsprotein wurde mit Thrombinprotease (Pharmacia; 10 Einheiten)
mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur gespalten und gegen PBS
dialysiert, um das Glutathion zu entfernen. Das Spaltungsgemisch
wurde ein zweites Mal durch die Glutathion Sepharose®-Säule geschickt,
um die Glutathion S-Transferase zu entfernen.
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Das rα2I wurde aus dem Durchfluss
gesammelt. Es war notwendig, das rekombinante Protein mit 5 mM Dithiothreitol
(DTT) zu behandeln, um die richtige Faltung zuzulassen (5 mM DTT
in PBS), da bei der Analyse mittels nativer PAGE extra Banden ohne
Behandlung zu sehen waren. Das rekombinante Protein war nach der
SDS-PAGE (Polyacrylgelelektrophorese) zu mindestens 90% rein und
nur eine einzige Bande wurde mittels nativer PAGE beobachtet.
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Die hergestellte rekombinante α2I-Domäne war 223
Aminosäuren
lang mit zwei Nicht-Integrin-Aminosäuren in
den aminoterminalen (GS) Integrin-Aminosäuren, die der Integrin-Sequenz 124-339 (PDFQ...IEGTV)
(SEQ ID NR. 11 und SEQ ID NR. 12) entspricht, und sechs Nicht-Integrin
Aminosäuren
im carboxyterminalen Ende (EFIVTDM; SEQ ID NR. 13).
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Beispiel 2
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Bindungstest für Europium-markiertes
rα2I
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Gift von Bothrops jararaca
verhindert die Bindung der rekombinanten Integrin α2I-Domäne an Typ-I-Collagen
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Es wurde ein sensitiver Festphasen-rα2I-Ligandenbindungstest
entwickelt, der auf der Verwendung von Europium-markiertem rα2I basiert.
Die Markierung von rα2I
mit Europium wurde wie folgt durchgeführt: 1/20 Volumen 1 M NaHCO3 (pH 8,5) wurde dem gereinigten rα2I zugegeben,
um den pH-Wert für
die Markierung mit Isothiocyanat zu erhöhen. Das Europium-Markierungsreagenz
(Wallac) wurde in einem 100-fachen molaren Überschuss zugegeben und über Nacht
bei +4°C
inkubiert. Die ungebundene Markierung wurde durch Gelfiltration
auf einer Sephadex G50/Sepharose 6B-Säule (Pharmacia) entfernt und
die das markierte Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt.
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Eine Immunplatte mit 96 Vertiefungen
(Maxisorp, Nunc) wurde beschichtet, indem die Oberfläche ihrer Vertiefung
0,1 ml PBS, das 5 μg/cm2 der Plattenoberfläche enthielt, Typ-1-Collagen (Rinderdermis,
Cellon), Typ-IV-Collagen (Sigma), Laminin-1 (gereinigt aus den Basalmembranen
des Engelbreth-Holm-Swarm Maustumors, Collaborative Research), Fibronektin
(menschliches Plasmafibronektin, Boehringer Mannheim) oder 3,3 μg/ml Echovirus-1
oder Echovirus-7 12 h bei +4°C
ausgesetzt wurde. Alternativ wurden die Peptide und das B. jararaca-Gift
(Sigma) bei verschiedenen Konzentrationen auf aminbindenden Platten
mit 96 Vertiefungen (Costar) nach den Anweisungen des Herstellers
beschichtet.
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Die restlichen Proteinabsorptionsstellen
auf allen Vertiefungen wurden mit 0,1% hitzeinaktiviertem Rinderserumalbumin
in PBS 1 h bei +37°C
blockiert. Die Echoviren-1 (Farouk-Stamm) und 7 (Wallace) wurden von
der ATCC erhalten. Die gereinigten Vieren wurden in PBS, enthaltend
0,5 mM MgCl2, verdünnt und bei –70°C bis zur
Verwendung gelagert. Den beschichteten Vertiefungen wurde mit Europium
markiertes rα2I
bei einer Konzentration von 500 ng/ml in PBS, 2 mM MgCl2,
1 mg/ml BSA zugegeben und dann 3 h bei +37°C inkubiert. Die Vertiefungen
wurden dann dreimal mit PBS, 2 mM MgCl2 gewaschen.
0,1 ml Delfia-Verstärkerlösung (Wallac)
wurde jeder Vertiefung zugegeben und das Europium-Signal wurde mittels
Fluorometrie (Modell 1232 Delfia, Wallac) gemessen.
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Bei endogener Zugabe der Peptide
wurden die lyophilisierten Peptide direkt mit dem Europium-markierten
rα2I in
500 ng/ml PBS, 2 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA solubilisiert
und dann den Vertiefungen zugegeben. Bei Verwendung von EDTA anstatt
von MgCl2 wurde Europium-markiertes rα2I mit PBS,
2 mM EDTA verdünnt und
mit dem Puffer aufeinanderfolgende Waschschritte durchgeführt. Man
fand heraus, dass dieser Bindungstest sehr sensitiv war, so dass
ermöglicht
wurde, dass die Menge der in den Experimenten verwendeten rα2I-Domäne reduziert
wurde. Ferner legt die geringe Menge an Europium nahe, dass die
Messungen mit größeren Markermolekülen zuverlässiger sind.
Drittens befand man den hier beschriebenen Test mit den Miktotiterplattenvertiefungen
als nützlich,
um eine große
Anzahl von vermeintlichen die Integrin-rα2I-Domäne blockierende Moleküle zu durchmustern.
-
rα2I
band Typ-I-Collagen, Typ-IV-Collagen und Laminin-1. Es band jedoch
nicht signifikant an Fibronektin oder Albumin (1A),
rα2I band
Typ-I-Collagen in einer Mg++abhängigen Weise
und die Zugabe von 2 mM EDTA hemmte die Bindung vollkommen (1B). Das stimmt mit der Tatsache überein,
dass α2β1 mit Collagen
nur in Gegenwart zweiwertiger Kationen interagiert. Die Bindung
der rα2I-Domäne an Echovirus-1 war
viel schwächer
als an die Matrixmoleküle.
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Frühere Studien haben gezeigt,
dass das B. jararaca-Gift die Interaktion des α2β1-Integrins der Blutplättchen mit Collagen hemmt (De
Luca, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206: 570–576 (1995)). Jedoch
war nicht bekannt, ob diese hemmende Wirkung aufgrund der Blockierung
der rα2I-Domänenfunktion erfolgte.
Auch die Epitope, die an dieser Interaktion beteiligt waren, waren
unbekannt.
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Die Wirkungen des B. jararaca-Giftes
auf die Bindung der rα2I-Domäne an Typ-1-Collagen wurden unter
Verwendung des vorstehend beschriebenen Festphasen-Ligandenbindungstests
untersucht. Man ließ die Europium-markierte
ra2I-Domäne
an Collagen-l-Substrat
in Gegenwart von 2 mM Mg++ binden und die
Menge des gebundenen rα2I
wurde dann bestimmt. Die Wirkung des Giftes wurde mit Konzentrationen
im Bereich von 1 μg/ml – 1000 μg/ml getestet.
Das Gift hemmte die rα2I-Domänen-Collagen-Interaktion
effektiv und in einer konzentrationsabhängigen Weise (1C).
Um zu bestimmen, ob die beobachtete Hemmung aufgrund der direkten
Interaktion von rα2I
mit dem Schlangengift erfolgte, wurden Vertiefungen von Mikrotiterplatten
mit den Giftproteinen beschichtet und auf rα2I-Bindung an dieses Substrat getestet.
Man fand heraus, dass das Gift ra2I in einer konzentrationsabhängigen Weise
direkt band (1D). Nach der veröffentlichten
Literatur ist offensichtlich, dass Jarahagin das Protein im B. jararaca-Gift
ist, das die Bindung von α2β1-Integrin
an Collagen hemmt (De Luca, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
206: 570–576
(1995)) und deshalb am wahrscheinlichsten die Giftkomponente ist,
die an die rα2I-Domäne bindet.
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Beispiel 3
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Peptide und Bindungstest
unter Verwendung von biotinyliertem 229ox
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Ein kurzes cyclisches
Jararhagin-abstammendes Peptid ahmt die Wirkung des B. jararaca-Giftes auf die Integrin-rα21-Domänen-Collagen-Interaktion
nach
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Die Charakterisierung der α2I-Domänen-Bindungsstelle
im Jararhagin wurde durch die Verwendung einer Reihe von kurzen
cyclischen Peptiden fortgesetzt, die den Bereichen entlang des Proteins
entsprechen. Die getesteten Bereiche wurden basierend auf dem Folgenden
ausgewählt:
i) Integrin-bindende Motive in Matrixproteinen und in Schlangengift-Disintegrinen findet
man in Schleifenstrukturen. ii) Die bekannten Integrin-bindenden
Motive enthalten Asparginsäurereste.
iii) Das veröffentlichte
Modell der Integrin-Collagen-Interaktion
hebt die Rolle des Argininrests zusätzlich zum Asparaginsäurerest
hervor.
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Die Jararhagin-abstammenden Peptide
wurden basierend auf der Vorhersage der Sekundärstruktur der Jararhagin-Aminosäuresequenz
konstruiert. Die Vorhersage der Sekundärstruktur erfolgte unter Verwendung
des Peptidstrukturprogramms aus dem Genetics-Computer-Group (GCG)-Softwarepaket (Madison,
WI). Die Oberflächenwahrscheinlichkeit
nach dem Emini-Verfahren (Emini, E.A. et al., J. Virol. 55: 836–839 (1985)) und
die Hydrophilizität
nach dem Kyte-Doolittle-Verfahren (Kyte, J. et al., J. Mol. biol.
157: 105–132
(1982)) wurden berücksichtigt.
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Die Peptide wurden mit einem automatischen
Peptidsynthesegerät
(Applied Biosystems 431A) unter Verwendung der 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl
(Fmoc)-Chemie synthetisiert. Die Peptide für die Alaninsubstitution wurden
von Research Genetics (Huntsville, AL) erworben. Nach der Synthese
wurden die Peptide oxidiert, um Disulfidbrücken zu erzeugen. Die Peptide
wurden bei einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer
solubilisiert und 16–24
h bei +4°C
inkubiert. Die Oxidation wurde mit der Reversenphasen-HPLC überprüft und die
oxidierten Peptide wurden lyophilisiert.
-
Alle Peptide waren bei 10 mg/ml in
PBS vollkommen löslich.
Da die höchste
verwendete Konzentration 1 mg/ml betrug, wurden unspezifische Effekte
aufgrund unlöslicher
Peptide vermieden. Die isoelektrischen Punkte (PI) der verschiedenen
Peptide wurden ebenfalls von der Primärsequenz unter Verwendung des
Isolelektrikprogramms aus dem Genetics-Computer-Group (GCG)-Softwarepaket
(Madison, WI) bestimmt. Man fand heraus, dass das Peptid 225ox (Tabelle
1) einen ähnlichen
isoelektrischen Punkt wie 229ox besaß (Tabelle 1), und es wurde
deshalb in einigen Experimenten als Kontrollpeptid ausgewählt.
-
Die Biotinylierung von 229ox wurde
wie folgt durchgeführt:
Lyophilisiertes 229ox-Peptid
wurde in PBS und 1/5 Volumen 0,1 M NaHCO3 solubilisiert,
0,5 M NaCl (pH 8,0) wurde zugegeben, um den pH-Wert für die Biotinylierung
zu erhöhen.
Sulpho-NHS-Biotin (Calbiochem) wurde 1 : 2 (Gew.%) 229ox:Biotin
zugegeben und 2 h bei RT inkubiert. 1/10 Volumen 0,5 M Tris-HCl
(pH 8,0) wurde zugegeben, um die Biotinylierungsreaktion zu beenden.
-
Für
die Bindungstests unter Verwendung von biotinyliertem 229ox-Peptid
wurden aminbindende Platten mit 96 Vertiefungen (Costar) mit verschiedenen
Konzentrationen von rα2I-Domänen- oder
rα2I-Domänen-abstammenden
Peptiden nach den Anweisungen des Herstellers beschichtet. Die restlichen
Proteinabsorptionsstellen auf allen Vertiefungen wurden 1 h mit
0,1% hitzeinaktiviertem Rinderserumalbumin in PBS bei + 37°C inaktiviert.
Den beschichteten Vertiefungen wurden 100 μM biotinyliertes 229ox in PBS,
2 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA zugegeben und 3
h bei +37°C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBS, 2 mM MgCl2 gewaschen und Europium-markiertes Streptavidin
(Wallac) wurde 30 min bei einer Konzentration von 500 ng/ml in PBS,
2 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA bei Raumtemperatur
zugegeben. Die Vertiefungen wurden wiederum dreimal gewaschen. 0,1
ml Delfia-Verstärkerlösung (Wallac)
wurde jeder Vertiefung zugegeben und das Europium-Signal wurde mittels
Fluorometrie (Modell 1232 Delfia, Wallac) gemessen. Bei Verwendung
von EDTA anstatt von MgCl2 wurde das Europium-markierte
ra2I in PBS, 2 mM EDTA verdünnt
und die folgenden Waschschritte wurden mit diesem Puffer durchgeführt.
-
Die den ausgewählten Sequenzen entsprechenden
Peptide wurden synthetisiert und die sich ergebenden Peptide sind
in Tabelle I zusammengefasst.
-
Um zu untersuchen, ob irgendeines
dieser Peptide direkt mit der α2I-Domäne interagieren
könnte, wurden
die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit Jararhagin-Peptiden zusammen
mit dem cyclischen RGD-Peptid, Typ-I-Collagen, Typ IV-Collagen und
Fibronektin beschichtet und rα2I-Eu
wurde zugegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass eines der Jararhagin-Peptide,
bezeichnet als 229ox, effizient an die ra2I-Domäne band, während die anderen getesteten
Peptide keine Wirkung zeigten (2A).
-
Die Peptide wurden dann auf ihre
Fähigkeit
getestet, die rα2I-Bindung
an Typ-I-Collagen
bei einer Konzentration von 500 μM
zu beeinflussen. Wiederum hatte nur ein Peptid eine signifikante
Wirkung: es hemmte fast vollständig
die Interaktion zwischen der rα2I-Domäne und Collagen
(2B).
-
Tabelle I
-
Sequenzen der in dieser Studie verwendeten
synthetischen Peptide. Der Name und die Position der synthetisierten
Peptide, basierend auf der Primärsequenz
von Jararhagin (Paine, M.J.I. et al., J. Biol. Chem. 267: 22869–22876 (1992))
und der α2I-Domäne (Takada,
Y. und Hemler, M.E., J. Cell Biol. 109: 397–407 (1989)) werden dargestellt.
-
-
-
Um eine Korrelation zwischen den
Bindungseigenschaften des 229ox-Peptids und dem B. jararaca-Gift
zu zeigen, wurde die Fähigkeit
des 229ox-Peptids getestet, mit der rα2I-Bindungsstelle im Schlangengift zu konkurrieren.
Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl 229ox als auch das B. jararaca-Gift
rα2I binden
und dass das 229ox-rα2I
zeigt, dass 229ox die tatsächliche
Integrinbindungsstelle von Jararhagin ist. Da die Hemmung nicht
vollständig
war (etwa 50%), gibt es noch die Möglichkeit, dass das B. jararaca-Gift
auch eine weitere Bindungsstelle für die α2I-Domäne enthält.
-
In einer Anzahl von Veröffentlichung
wurde gezeigt, dass die cyclische Struktur des Integrinliganden, der
die synthetische Struktur nachahmt, oft wesentlich für die Bindung
mit hoher Affinität
ist. Um dies zu testen, wurde sowohl oxidiertes als auch lineares
p229-Peptid im Festphasen-Bindungstest verwendet, a.a.O. Das cyclische
229ox zeigte die Fähigkeit,
die rα2I-Adhäsion an
Typ-I-Collagen zu hemmen, während
die lineare Form des Peptids nur wenig Wirkung hatte (4A). Man fand heraus, dass die Bindung
von ra2I an 229ox, das an einen festen Träger gebundenen war, konzentrationsabhängig war
und es wurde die signifikante Bindung bei einer Beschichtungskonzentration
von 75 μg/ml
(4 B) beobachtet. Zusätzlich zur
Typ-I-Collagen bindet die ra2I-Domäne auch Typ-IV-Collagen und
Laminin-1. Das 229ox-Peptid hemmte die Bindung von ra2I an diese Liganden,
während
das Kontrollpeptid 225ox mit derselben Länge und Konformation zusammen
mit einem ähnlichen
pI-Wert keine Wirkung hatte (4C).
Das legt nahe, dass die α2I-Domäne all diese
Liganden mittels desselben Mechanismus bindet und dass 229ox die
Bindung entweder durch direkte Interaktion mit der Ligandenerkennungsstelle
bindet oder die dreidimensionale Struktur der I-Domäne in eine
inaktive umwandelt.
-
Beispiel 4
-
Das Jararhagin-abstammende
Peptid aktiviert die Echovirus-l-Erkennungsstelle in der Integrin
rα2I-Domäne
-
Zusätzlich zur Vermittelung der
Zelladhäsion
an Collagen und Laminin-1 fungiert α2β1-Integrin auch als Virusrezeptor,
der die Oberflächenbindung
und die Infektion durch einen menschlichen Krankheitserreger, Echovirus-1,
vermittelt. Man fand heraus, dass die Matrixproteine und Echovirus-1
mit dem Integrin auf unterschiedliche Weise interagieren, aber die
Bindungsstellen für
den Echovirus-1 befinden sich ebenfalls in der I-Domäne der a2-Untereinheit. Wie
vorstehend beschrieben, zeigte die ra2I-Domäne eine schwache Bindung an
das Echovirus-1 auf der Beschichtung, aber überraschenderweise erhöhte die
Zugabe von 229ox-Peptid die Bindung um etwa ein 10-faches, während das
Kontrollpeptid 225ox keinen Effekt hatte (5). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Bindung
des 229ox-Peptids an die α2I-Domäne eine
Strukturänderung
im Protein induziert, die die Bindungsaffinität von ra2I an Echovirus-1 erhöht.
-
Dies legt eine mögliche Modulation der Aktivität auf der
I-Domäne
nahe, wobei die Bindung von RKK die Bindung an Collagen allosterisch
hemmen könnte.
Die RKKinduzierte Änderung
in der Konformation der ra2I-Domäne
war in unseren Experimenten offensichtlich, wobei das RKK-Peptid
nicht nur die rα2I-Domänenadhäsion an
Collagen blockierte, sondern auch die Bindung der ra2I-Domäne an Collagen
beträchtlich
erhöhte.
Zusätzlich
zur Bestätigung
des vorherigen Vermutung, dass Echovirus-1 und Collagen unterschiedliche Stellen
der α2I-Domäne erkennen,
zeigen die Daten das Vorhandensein eines wichtigen Regulationsmechanismus
der einen Ligandenerkennungsstelle (Echovirus-l-Bindungsstelle) durch das Besetzen der
anderen Bindungsstelle (RKK-Bindungsstelle).
-
Jedoch reichen die vorliegende Informationen über die
Struktur-Funktionsbeziehung der α2I-Domäne nicht
aus, um daraus den Schluss zu ziehen, ob RKK direkt an die Collagenerkennungsstelle
bindet, oder ob es ein allosterischer Inhibitor der α2I-Domänen-Collagen Interaktion
ist. In beiden Fällen
sind die RKK-enthaltenden Peptide sehr wertvolle Werkzeuge für Studien,
die darauf abzielen, die Ligandenerkennungsfunktion der Integrin-I-Domänen zu offenbaren.
-
Beispiel 5
-
Die Sequenz von drei Aminosäuren, RKK
ist für
die Bindung an die Integrin-rα2I-Domäne essentiell
-
Die zuvor veröffentlichten Informationen über die
Integrinerkennungsstellen in verschiedenen Proteinen hebt die Bedeutung
der beiden Aminosäurereste,
nämlich
Asparaginsäure
und Arginin hervor. Um die wichtigen Aminosäurereste im 229ox-Peptid zu
zeigen, wurde eine Reihe neuer Aminosäuren getestet, bei denen die
Aminosären
in p229 eine nach der anderen mit Alaninresten ersetzt wurde. Die
Peptide wurden an einen festen Träger gebunden und auf ihre Fähigkeit
getestet, ra2I zu binden. Interessanterweise fand man heraus, dass
drei Aminosäuren
Arginin-Lysin-Lysin (RKK) essentiell waren und das benachbarte Histidin
etwas Wirkung zeigte. Die Substitution von Asparaginsäure- oder
Asparaginresten hatte keine Auswirkung (6A).
Vereinbar damit ist, dass die rα2I-Bindung an Typ-I-Collagen
mit den Peptiden, die Alaninsubstitutionen der RKK-Sequenz enthielten,
nur schwach gehemmt wurde, während
die Substitution von Asparaginsäure
oder Asparaginresten diese Funktion nicht hemmte (6B).
-
Um mögliche Bindungsstellen in α2I für das 229ox-Peptid
zu identifizieren, wurde eine Reihe von Peptiden, die den hydrophilen
Regionen in der α2I-Domäne entsprachen,
synthetisiert und auf ihre Fähigkeit
getestet, an biotinyliertes 229ox zu binden. Die α2I-Domänenpeptide
und ra2I wurden an den festen Träger
gebunden und biotinyliertes 229ox wurde zugegeben. Es wurde gezeigt,
dass 229ox an ra2I und Peptid-P9 signifikant band, während es
in wiederholten Experimenten keine Bindung an andere Peptide gab
(7A). Die Interaktion zwischen biotinyliertem
229ox und dem an den festen Träger
gebundenen ra2I war von divalenten Kationen abhängig (7A)
so wie das bei der Bindung von Europium-markiertem ra2I an einen
festen Träger gebundenes
Typ-I-Collagen und 229ox Peptid der Fall war (7C).
-
Beispiel 6
-
Die kritische
Länge des
RKK-Peptids
-
Zur Bestimmung der kritischen Länge des
RKK-Peptids wurde eine Reihe von Peptiden hergestellt, die die RKK-Sequenz
und zusätzliche
Aminosäuren
wie folgt umfassen. CTRKKHDNAQC (229ox; SEQ ID NR. 5), CTRKKHDNAC
(SEQ ID NR. 3) und CTRKKHDNC (248ox; SEQ ID NR. 4) wurden getestet.
Das kürzeste Peptid
zeigte eine maximale Hemmung der rα2I-Domänenbindung an Collagen bei
einer Konzentration von 10 μM.
Dies war mehr als 10-mal effektiver als das längere Peptid 229ox (8).
-
Beispiel 7
-
Zellmigrationstests
-
Ein Migrationstest ahmt die Bewegung
der Zellen in der Collagenmatrtx nach. Dieses Beispiel zeigt, dass
die vorliegenden Peptide die Bewegung derartiger Zellen blockieren
und deshalb bei therapeutischen Verfahren zur Behandlung von Krankheiten
nützlich
sind, die durch derartige Zellmigration charakterisiert sind.
-
Um die Wirkungen des 229ox/RKK-Peptids
und von 225ox auf die Zell-Collagen-Interaktion zu zeigen, ließ man die
chemisch umgewandelten HOS-MNNG-Zellen an Typ-I-Collagen binden und dann auf ihnen wandern.
Die Bedeutung von α2β1-Integrin
in diesem Verfahren wurde zuvor gezeigt (Vihinen, P. et al.,., Cell Growth
Diff. 7: 439–447
(1996)).
-
Der Zellmigrationstest wurde wie
zuvor beschrieben durchgeführt
(Vihinen, P. et al., Cell Growth Diff. 7: 439–447 (1996)). Im wesentlichen
wurden menschliche HOS-MNNG-Osteosarkomzellen
(ATCC) in serumfreien Optimem-l-Medium (Life Technologies, Inc.)
und 20.000–30.000
Zellen/Vertiefung in ein Zellkultur-Cluster mit 24 Vertiefungen
(Costar) in einem Metallzylinder mit einem Durchmesser von 2,80
mm übertragen.
Die Zellkulturvertiefungen waren mit 5 μg/cm2 Typ-I-Collagen
beschichtet worden. Man ließ die
Zellen 16 h bei +37°C
an Collagen binden. Die Zylinder wurden entfernt, die nicht gebundenen
Zellen wurden mit Optimem (Life Technologies, Inc.) abgewaschen,
und man ließ die
gebundenen Zellen in Optimem in Gegenwart der Peptide 4 Tage wandern.
Das frische, Peptide enthaltende Optimem wurde täglich in den Vertiefungen ausgetauscht.
Nach 4 Tagen wurde der von den Zellen bedeckte Oberflächenbereich
mit einem Mikrocomputer für bildgebende
Verfahren Version M4 (Imaging Research Inc.) gemessen.
-
Die Ergebnisse dieses Experiments
werden in 9 gezeigt.
Den Zellen wurden entweder 229ox oder das 225ox-Peptid bei einer
Konzentration von 500 μM
zugegeben und frisches Peptid wurde täglich zugegeben. Die Fähigkeit
der HOS-MNNG-Zellen auf Typ-I-Collagen
zu wandern, wurde durch das 225ox-Kontrollpeptid nicht beeinflusst,
aber das 229ox-Peptid beeinflusste die Migration signifikant (p < 0,001, t-Test nach Student)
(9).
-
Diese Hemmung der Osteosarkomzellmigration
auf Collagen legt nahe, dass i) die Bewegung der malignen Zellen
und damit die Krebszelleninvasion von p229ox verhindert werden kann
und (ii), dass die Migration jedes Zelltyps auch gehemmt werden
kann, wenn die Migration wenigstens teilweise eine Folge der α2β1-Integrin-Collagen-Interaktion
ist.
-
Beispiel 8
-
Hemmung der
Zelladhäsion
durch ein RKK-Peptid
-
Die Zelladhäsion der menschlichen Keratinocyten
HaCaT-Zellen und der Zelllinie UT-SCC-2, die aus dem Plattenepithelzellkarzinom
des Mundes an Typ-I-Collagen etabliert wurde, in Gegenwart des Peptids 220ox
oder eines funktionellen Antikörpers
gegen α2-Integrin, Gi9 (ein
anti-α2-Integrin-Antikörper, der
im Handel von Immunotech/Coulter, Westrbrook, Maine, USA) erhältlich ist).
Die Zellen wurden mit Cycloheximid 10 μg/ml in serumfreien Medium 1h
behandelt. Sie wurden abgelöst
und man ließ sie
1 h an mit Typ-I-Collagen vorbeschichteten
Mikrotiterplatten in DMEM mit 0,1% Glycin binden. Ungebundene Zellen
wurden ausgewaschen, die gebundenen Zellen mit Kristallviolett gefärbt und
die Anzahl der gebundenen Zellen wurde geschätzt, indem die optische Absorption
gemessen wurde.
-
Die in 10 zusammengefassten
Ergebnisse zeigen, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung, beispielsweise
Peptid 229ox (p229ox), die Zellmigration hemmen und deshalb bei
der Behandlung oder der Vermeidung von mit einer epithelialen Zellmigration
einhergehenden Krankheitszuständen,
wie beispielsweise Periodontitis, nützlich sind, da die Epithelzellen α2β1-Integrin
binden und diese Bindung verwenden, um am Collagen entlang zu wandern.
-
Beispiel 9
-
Die Verwendung eines RKK-Peptids
bei der Behandlung von Peridontitis und Gingivitis
-
Peridontitis ist eine Erkrankung,
die durch Entzündung
und Verlust des unterstützenden
Bindegewebes des Zahnes charakterisiert wird. Die Erkrankung wird
durch pathogene Bakterien im Mund initiiert, die die Gewebezellen
aktivieren, um hydrolytische Enzyme, die Gewebebestandteile abbauen,
zu produzieren und freizusetzen. Ein wesentliches Merkmal des Krankheitsprozesses
ist die erhöhte
Vermehrung und Migration der Epithelzellen, die das Zahnfleisch
an die Zahnoberfläche
binden (verbindendes Epithel/Taschenepithel).
-
Die herkömmiche Behandlung von Periodontitis
und Gingivitis konzentriert sich auf die Entfernung der pathogenen
Bakterien aus dem Periodontium, entweder durch mechanische Zahnsteinentfernung
oder durch Antibiotikabehandlung. Ferner wird häufig die operative Korrektur
der peridontalen Gewebearchitektur durchgeführt.
-
Die Hemmung der Zellmigration, die
durch die erfindungsgemäßen Peptide,
beispielweise p229ox, bereitgestellt wird, kann alleine oder adjunktiv
zu anderen Behandlungen verwendet werden, um periodontale Erkrankungen,
einschließlich
Peridontitis und Gingivitis, zu verhindern oder zu behandeln. Insbesondere
können Verbindungen,
die wirksame Mengen eines oder mehrerer erfindungsgemäßer circulärer Peptide
enthalten, die die RKK-Sequenz enthalten, einem Patienten topisch
verabreicht werden, der eine Behandlung der peridontalen Erkrankung,
einschließlich
Periodontitis und Gingivitis, benötigt. Eine Verbindung, die
in dieser Hinsicht nützlich
ist, kann für
die topische Anwendung unter Verwendung jedes herkömmlichen
Verfahrens formuliert werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können in
Trägern,
einschließlich
polymeren Trägern,
formuliert werden, wie beispielsweise diejenigen, die auf Ethylcellulose,
Silikongummi basieren, und besonders abbaubare Polymere und Copolymere
wie Poly(Milchsäure)-,
Poly(Glycolsäure)-,
Poly(Milchsäure)-Poly(Glycolsäure)-Coploymer,
Polyamid und Polyester, Gelatine, Collagen, Albumin, und Fibrinogen,
quervernetzt, sind erwünscht,
um die gewünschte
RKK-Aktivität zu hemmen
oder Merkmale freizusetzen. Derartige Transportsysteme für die Mundhöhle werden
beispielsweise in U.S. 5,002,769, U.S. 5,023,082, U.S. 5,160,737,
U.S.
-
5,330,746, U.S. 5,425,953, U.S. 5,438,076
und U.S. 5,639,795 beschrieben, die jeweils hier durch Bezugnahme
eingebracht werden. Das Peptid wird an die gewünschte Stelle in der Mundhöhle in Implantatform oder
als Teil einer flüssigen
Verbindung gebracht, die an Ort und Stelle in der Mundhöhle fest
wird oder in Form einer Zahnpasta oder Gel, die/das wirksame Spiegel
des RKK-enthaltenden Peptids an der gewünschten Stelle bereitstellt.
Die Menge des erfindungsgemäßen Peptids
wird auf Wunsch variiert, um Spiegel bereit zu stellen, die bei
der Bereitstellung des gewünschten
hemmenden Effekts in der Umgebung der Mundhöhle und des Transportssystems
wirksam sind, aber es kann im allgemeinen bei etwa 0,001%–95% der
flüssigen
Verbindung vor der Verfestigung oder in der festen Verbindung vorliegen,
abhängig
von der zu behandelnden Erkrankung.
-
Es kann auch eine Membran als Träger zur
Bereitstellung des erfindungsgemäßen Peptids
an die gewünschte
Stelle verwendet werden.
-
Die erfindungsgemäßen RKK-enthaltenden Peptide
sind für
die Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen nützlich,
die durch Epithelzellmigration charakterisiert sind, insbesondere
für die
Behandlung medizinischer Zustände,
bei denen topische Anwendungen bevorzugt werden.
-
SEQUENZPROTOKOLL
-
- (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
- (i) ANMELDER: Heino, Jyriki
Ivaska, Johanna
Kāpylā, Jarmo
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Integrin-bindendes Peptid und dessen
Verwendung
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN:
- (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
- (A) ADRESSAT: Sterne, Kessler, Goldstein & Fox P.L.L.C.
- (B) STRASSE: 1100 New York Ave., N.W.
- (C) STADT: Washington
- (D) STAAT: D.C.
- (E) LAND: USA
- (F) POSTLEITZAHL: 20005–3934
- (v) COMPUTERLESBARE FORM
- (A) ART DES MEDIUMS: Diskette
- (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE:
- (vi) VORHERIGE ANMELDUNGSDATEN
- (A) ANMELDUNGSNUMMER: 08/893,526 USA
- (B) ANMELDUNGSDATUM: 29. Jul. 1997 "
- (C) KLASSIFIZIERUNG:
- (viii) ANGABEN für
ANWALT/AGENTEN:
- (A) NAME: Cimbala, Michele, A.
- (B) REGISTRIERNUMMER: 33,851
- (C) REFERENZ-/REGISTERNUMMER: 1102.0240000
- (ix) TELEKOMMUNIKATION:
- (A) TELEFON: 202/371-2600
- (B) TELEFAX: 202/371-2540
- (C) TELEX:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 1:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
9 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 1:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 2:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
8 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 2:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 3:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
7 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 3:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 4:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
9 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 5:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
7 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
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- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 6:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
7 Aminosäuren
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- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 7:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
9 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
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- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 8:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
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- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 9:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
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- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANG: Einzelstrang
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- (ii) MOLEKÜLART:
DNA
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 9:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 10:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
28 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANG: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
DNA
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 10:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 11:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
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- (B) TYP: Aminosäure
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- (iii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 11:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 12:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
5 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
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- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 13:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
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- (C) TOPOLOGIE: linear
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Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 13:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 14:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
10 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 14:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 15:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
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- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 15:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 16:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
11 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 16:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 17:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
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- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
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- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
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- (i) SEQUENZMERKMALE:
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- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
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- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 20:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
10 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (x) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 20:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 21:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
17 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 21:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 22:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
17 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 22:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 23:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
16 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 23:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 24:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
16 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 24:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 25:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (D) LÄNGE:
20 Aminosäuren
- (E) TYP: Aminosäure
- (F) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 25:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 26:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
14 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 26:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 27:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
15 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 27:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 28:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
16 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xii) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 28:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 29:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (D) LÄNGE:
17 Aminosäuren
- (E) TYP: Aminosäure
- (F) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 29:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 30:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
20 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xii) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 30:
-
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 31:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
16 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 31:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 32:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
10 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 32:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 33:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
10 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
-
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 33:
- (2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 34:
- (i) SEQUENZMERKMALE:
- (A) LÄNGE:
10 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (C) TOPOLOGIE: circulär
- (ii) MOLEKÜLART:
Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NR: 34: