DE69705903T2

DE69705903T2 - Chemischer Zeitsetzer für einen direktablesbaren Reagenzteststreifen

Info

Publication number: DE69705903T2
Application number: DE69705903T
Authority: DE
Inventors: Ernest J. Kiser; Edward G. Rice; Michael F. Tomasco; Yeung S. Yu
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 1996-09-03
Filing date: 1997-09-02
Publication date: 2002-03-28
Anticipated expiration: 2017-09-03
Also published as: JPH10142225A; CN1186956A; AU3675497A; DE69705903D1; MX9706716A; ES2159379T3; CA2214292A1; DK0826777T3; NO974022D0; TW571097B; EP0826777B1; CN1125341C; KR19980024291A; US5719034A; GR3036990T3; ATE203774T1; PT826777E; EP0826777A1; AU714671B2; NO974022L

Description

Hinterrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung, die chemisch ein Zeitintervall ermittelt; genauer, ein Intervall, währenddessen ein Teststreifen die Konzentration eines Analyten in einer biologischen Lösung mißt.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Für die Messung der Konzentration bestimmter Analyte in biologischen Lösungen sind viele visuelle Testvorrichtungen entwickelt worden. Diese Vorrichtungen haben zum Beispiel Glucose, Cholesterin, Proteine, Ketone, Phenylalanin oder Enzyme in Blut, Urin oder Speichel gemessen.
Trockenphasenreagenzstreifen, die enzymbasierende Zusammensetzungen enthalten, werden umfangreich in klinischen Laboratorien, Arztpraxen, Krankenhäusern und Privathaushalten genutzt, um Proben biologischer Flüssigkeiten auf die Glucosekonzentration hin zu überprüfen. Tatsächlich sind Teststreifen eine tägliche Notwendigkeit für viele der mehrere Millionen Diabetiker in der Bevölkerung geworden. Da die Diabetes gefährliche Anomalien in der Blutchemie hervorrufen kann, kann sie zum Sehverlust, Nierenfehlern und anderen ernstzunehmenden medizinischen Folgen führen. Um das Risiko dieser Folgen zu minimieren, müssen sich die meisten Diabetiker periodisch selbst testen und stellen ihre Glucosekonzentration dementsprechend, durch zum Beispiel Ernährungskontrolle und/oder Insulininjektionen ein. Einige Patienten müssen ihre Blutglucosekonzentration 4 mal am Tag oder öfter bestimmen.
Es ist besonders für Diabetiker wichtig, die ihre Diät zum Regulieren der Zuckeraufnahme und/oder Verabreichen von Insulininjektionen kontrollieren müssen und die im Hinblick darauf regelmäßige Kontrollen ihrer Blutglucosekonzentration brauchen, einen schnellen, preiswerten und genauen Teststreifen zur Glucosebestimmung zu haben.
Es sind Teststreifen bekannt, die einen Indikator enthalten, der eine andere Farbschattierung, abhängig von der Glucosekonzentration in der biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen gegeben wurde, annehmen kann. Obwohl einige dieser Streifen Reduktionschemie nutzen, beinhalten sie häufig einen oxidierbaren Farbstoff oder ein Farbstoffpaar. Einige der Streifen enthalten ein Enzym wie z. B. Glucoseoxidase, die in der Lage ist, Glucose in Gluconsäure und Wasserstoffperoxid zu oxidieren. Sie enthalten ebenfalls einen oxidierbaren Farbstoff und eine Substanz, die peroxidative Aktivität besitzt und zu einer selektiven katalytischen Oxidation des oxidierbaren Farbstoffes in Gegenwart von Wasserstoffperoxid fähig ist. (Siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5,306,623.)
U.S.-Patent Nr. 3,964,871, erteilt am 22. Juni 1976 an Hochstrasser, offenbart einen Einweg-indikatorstreifen für die direkte Messung von Substanzen wie Glucose in biologischen Flüssigkeiten. Der Indikator erfaßt die Konzentration der Substanz sowohl durch ein Indikatorreagenz, welches oxidiert ist und seine Farbe wechselt, wenn es mit der Substanz reagiert als auch durch einen "Antagonisten", der irgendwie die Anreicherung des oxidierten Indikators verhindert bis dieser vollständig aufgebraucht ist.
Palmer et al. offenbaren ein "digitales" quantitatives Untersuchungssystem für Glucose und andere Analyte in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 317 070, veröffentlicht am 24. Mai 1989 (siehe auch U.S.-Patent Nr. 5,036,000, erteilt am 30. Juli 1991). Das System mißt die Konzentration einer organischen Verbindung in einer biologischen Flüssigkeit, indem zuerst die Verbindung mit einer substratspezifischen Oxidase oxidiert wird, um Wasserstoffperoxid zu produzieren. Das System umfaßt ein Chromogen, das ein Reduktionsmittel für Wasserstoffperoxid ist und ein luftstabiles Wasserstoffperoxid reduzierendes Agens, das ein größeres Reduktionspotential hat. Das größere Reduktionspotential verzögert jede feststellbare Farbveränderung durch das Chromogen, bis das erste luftstabile Wasserstoffperoxid-Reduktionsmittel aufgebraucht ist. Somit tritt kein Farbwechsel ein, wenn das zu messende Wasserstoffperoxid weniger ist, als ein vorherbestimmtes Level entsprechend der Konzentration des luftstabilen Peroxidreduktionsmittels. Als Ergebnis mißt das System die Konzentration quantitativ und unabhängig von der Intensität der Farbänderung.
Ismail et al., U.S.-Patent Nr. 4,649,122, erteilt am 10. März 1987, offenbart eine Vorrichtung für einen Überlebenstest, der die Unversehrtheit einer Testzusammensetzung zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten bestätigt. Die Unversehrtheit wird durch Anfeuchten der Vorrichtung gemessen. Nach Anfeuchten mit Wasser kommt es zu einer Farbänderung oder zu einer anderen Änderung, um dem Benutzer des Streifens dessen Überleben zu bestätigen.
White-Stevens und Stover, Glin. Chem. 28, 4,589-595 (1982) diskutieren die Störung, die durch Ascorbinsäure bei diagnostischen Tests verursacht werden kann. Die Ascorbinsäure verursacht eine Zeitverzögerung in der Farbentwicklung bei Tests, die auf der Verwendung von Peroxidase oder Redoxindikatoren basieren.
EP735369, veröffentlicht am 02. Oktober 1996 nach dem Prioritätsdatum dieser Anmeldung, offenbart einen chemischen Zeitsetzer für einen direkt ablesbaren Reagenzteststreifen zur Messung der Konzentration jeglichen Analyts in einer biologischen Flüssigkeit, der auf den Streifen aufgebracht wird. Der Zeitsetzer umfaßt eine Trockenbeschichtung einer Indikatorzusammensetzung, ein Reagenz, das bei Hydratisieren die Fähigkeit besitzt, mit Glycose unter Veränderung der Farbe des Indikators zu reagieren, einen Inhibitor zum Inhibieren des Farbwechsels des Indikators und Glucose. Die Inhibitor- und Glucosekonzentrationen auf der Trockenbeschichtung sind so gewählt, daß die Glucose mit dem Reagenz reagiert und eine Änderung der Farbe des Indikators über eine vorbestimmte Zeit nach Aufbringen der biologischen Flüssigkeit auf den Streifen verursacht.
EP759555, veröffentlicht am 26. Februar 1997, nach dem Prioritätsdatum dieser Anmeldung, offenbart einen mehrlagigen Reagenzteststreifen zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht wird. Die Probe wird zu einer Anzahl von Versuchsfeldern geleitet, die sich entlang des Streifens anordnen, wo der Analyt mit einem Reagenz reagieren kann, um eine Farbveränderung hervorzurufen. Jedes Versuchsfeld beinhaltet auch einen Inhibitor für die Farbänderungsreaktion. Die Inhibitorkonzentration steigt sukzessiv in den Versuchsfeldern an und dabei ist die Anzahl der Felder mit Farbänderung eine Maßeinheit für die Konzentration des Analyten.
Egal ob der Test zu Hause, in der Arztpraxis, der Klinik oder im Krankenhaus durchgeführt wird, ist die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Glucosebestimmung extrem wichtig. Im Falle von farbanzeigenden Reagenzstreifen, ist es wünschenswert, daß der Farbwechsel deutlich hervortritt und abgesehen von Glucose unempfindlich gegenüber Variationen in der Zusammensetzung der biologischen Flüssigkeit ist. Im Falle von visuell zu lesenden Reagenzstreifen, ist es besonders wichtig, daß Diabetiker, die unter Sehstörungen leiden können, ein Testsystem haben, das signifikante Farbwechsel abhängig von der Glucosekonzentration zeigt, obwohl auch der Farbwechsel, angezeigt durch eine Absorptionsänderung bei einer festen Wellenlänge, wichtig für die Genauigkeit der durch Messgeräte zu lesenden Streifen ist.
Da der Farbwechsel eine Reihe von chemischen Reaktionen beinhaltet, geschieht dieser nicht augenblicklich. Deshalb muß der Benutzer eine gewisse Zeit warten - typischerweise eine Minute oder weniger - bevor die Reaktion stattgefunden hat. Wird ein Messgerät zum Lesen des Streifens eingesetzt, kann eine Zeitschaltuhr ein Signal geben, das die Beendigung der Reaktion anzeigt. Wenn ein Streifen visuell ohne Messgerät ausgewertet wird, kann es sein, daß der Benutzer die benötigte Zeit unterschätzt, den Streifen zu früh abliest und ein unkorrektes Ergebnis bekommt. Alternativ kann der Benutzer die Notwendigkeit verspüren, unmäßig lange zu warten, bevor der Streifen abgelesen wird, um sicher zu sein, daß die Reaktion beendet ist, was zu einer unnötigen Verzögerung und Unzufriedenheit des Benutzers führt. Daher besteht die Notwendigkeit für einen "chemischen" Zeitsetzer; d. h. einen Bestandteil auf dem Streifen, der unabhängig von der Konzentration der Glucose in der Probe (oder eines anderen Analyten von Interesse) eine Farbänderung hervorruft, aber nur nach einer Zeit die ausreichend ist, um die farbgebende Reaktion mit der Probe zu beenden.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht ein chemischer Zeitsetzer für einen visuellen Teststreifen zur Messung der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit dem Benutzer des Teststreifens sicher zu sein, daß er oder sie für eine richtige Messung lange genug gewartet hat, ohne daß der Benutzer übermäßig lange warten mußte.
Der Zeitmesser umfaßt eine Trockenbeschichtung aus
a) einer farbigen Verbindung;
b) einem enzymenthaltenden Reagenz, das bei Hydratisierung in der Lage ist, mit Glucose unter Farbwechsel des Indikators zu reagieren,
c) einem Inhibitor, um den Farbwechsel des Indikators zu inhibieren;
d) Glucose und
e) einer Aldose, die nicht wesentlich mit dem Enzym im Reagenz reagiert, in welcher die Inhibitor- und die Glucosekonzentrationen in der Trockenbeschichtung so gewählt werden, daß die Glucose nach einer vorbestimmten Zeit, nachdem die biologische Flüssigkeitsprobe auf den Teststreifen aufgebracht wurde, mit dem Reagenz unter Farbänderung des Indikators reagiert. In Bezug auf den Indikator als "farbig", möchten wir nicht implizieren, daß er nicht weiß ist; vielmehr ist in einer bevorzugten Darstellungsform die Farbe des Indikators vor der Hydratisierung weiß.
In einer anderen Darstellungsform dieser Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Vorbereitung eines chemischen Zeitsetzers für einen visuellen Teststreifen zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit die auf diesen Streifen aufgebracht wurde folgende Schritte
a) Beschichten einer porösen Membran mit einer Lösung eines enzymhaltigen Reagenzes, welches bei Hydratisierung in der Lage ist, mit Glucose zu reagieren und ein Reaktionsprodukt zu bilden;
b) Trocknen der Beschichtung zur Bildung einer ersten Lage und
c) Aufbringen einer zweiten Lage auf die erste Lage, die
i) einen Indikator, der mit dem Reaktionsprodukt reagieren kann, um einen Farbwechsel zu verursachen,
ii) einen Inhibitor zur Inhibierung des Farbwechsels, des Indikators,
iii) Glucose und
iv) eine Aldose, die nicht wesentlich mit dem Enzym des Reagenzes reagiert, enthält.
Wird der Ausdruck "nicht wesentlich mit dem Enzym des Reagenzes reagiert" in dieser Beschreibung und den Ansprüchen benutzt, bedeutet das eine relativ geringere Reaktion mit dem Enzym als mit der Glucose; das heißt, weniger als ungefähr 10% der Glucosereaktionsfähigkeit.
Der Streifen ist derart, daß er eine sichtbare Angabe der Konzentration des Analyten bildet, der in der biologischen Flüssigkeit enthalten ist, wenn diese auf einer "Probenseite" des Streifens aufgebracht wird. Die sichtbare Angabe erscheint auf der Gegenseite (oder "Testseite") des Streifens. Im allgemeinen gibt es eine Verzögerung zwischen der Zeit, wenn die Flüssigkeitsprobe auf der Probenseite aufgebracht worden ist und der entsprechenden sichtbaren Angabe - typischerweise ein Farbwechsel - auf der Testseite. Deshalb kann das Ablesen einen falschen Wert ergeben, es sei denn, der Benutzer wartet mindestens eine gewisse Zeit, bevor er das Ergebnis abliest. Weiterhin kann die entsprechende minimale Zeitverzögerung durch die Umgebung oder die Streifenchemie beeinflußt sein, zum Beispiel die Umgebungstemperatur oder Alterseinflüsse. Der chemische Zeitsetzer der vorliegenden Erfindung bietet dem Benutzer eine sichtbare Angabe, wenn genug Zeit verstrichen ist, nachdem die Flüssigkeitsprobe auf den Streifen aufgebracht wurde.
Die chemische Zusammensetzung des Teststreifens hängt natürlich von dem/der Analyten/biologischen Flüssigkeit, der/die zu messen ist, ab. Der Teststreifen kann so gestaltet sein, daß Analyte wie Glucose oder andere Zucker, Alkohol, Cholesterin, Proteine, Ketone, Harnsäure, Phenylalanin oder Enzyme in biologischen Flüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel aber auch in Wasser detektiert werden können. Ein chemischer Zeitsetzer für einen Reagenzteststreifen würde im allgemeinen, aber nicht notwendigerweise, so angepaßt sein, daß er auf dieselbe Analyt-/biologische Flüssigkeitszusammensetzung wie der Reagenzstreifen selbst anspricht. Wird zum Beispiel ein Teststreifen für die Messung von Alkohol im Gesamtblut gestaltet, wäre es nicht sinnvoll, einen chemischen Zeitsetzer mit Alkohol und einen Inhibitor für die Farbreaktion zwischen dem Alkohol und dem Reagenz des Streifens aufzubringen. In diesem Fall könnte der Zeitsetzer Glucose umfassen, ein Reagenz für das Reagieren mit Glucose zur Bildung einer unterscheidbaren Farbe und einen Inhibitor für diese Reaktion. Wird Blut auf diesen Streifen gegeben, wird der Zeitsetzer hydratisiert und ändert seine Farbe nach einer Zeitverzögerung, wobei die Dauer von der Inhibitorkonzentration abhängt. Natürlich ist es für einen "Glucosezeitsetzer" der zur Nutzung auf einem "Alkoholstreifen" passen soll unverzichtbar, daß die Zeit der Glucosereaktion an die entsprechende Zeit für den Alkoholstreifen angepaßt werden kann. Aus Gründen der Annehmlichkeit und Kürze detektieren der Zeitsetzer und die Reagenzteststreifen, die im Detail in dieser Beschreibung offenbart werden, Glucose im Blut. Ein durchschnittlicher Fachmann könnte leicht die Information in dieser Offenbarung zur Detektion anderer Analyt-/biologischer Flüssigkeitszusammensetzungen anpassen.
Der Anzeigestreifen der vorliegenden Erfindung bietet eine relativ einfache und schnelle Bestimmung der Glucosekonzentration im Blut. Der Streifen umfaßt eine poröse Matrix, die eine Probenseite und eine Testseite hat. Die Matrix ist im allgemeinen eine Membran und die zwei Begriffe werden abwechselnd in der vorliegenden Beschreibung und den nachfolgenden Ansprüchen benutzt. Ein Probereagenz wird auf die Matrix aufgebracht und dringt mehr oder weniger in die Poren der Matrix ein. Der Einfachheit halber beschreiben wir das Reagenz auf der Matrix als eine "Beschichtung" in dieser Beschreibung und den nachfolgenden Ansprüchen, anerkennend, daß das Beschichtungsreagenz die Matrix bis zu einem gewissen Grade durchdringt. Die Matrix ist dahingehend angepaßt, daß sie eine unbemessene Probe vom Gesamtblut, die rote Zellen und Glucose enthält, aufgebracht auf der Probenseite aufnimmt. Die Porosität der Matrix erlaubt der Flüssigkeit durch die Probenseite bis zur Testseite zu dringen, zum Beispiel durch Kapillarwirkung. Somit kann das Testreagenz mit der Glucose aus dem Blut reagieren, um eine Farbveränderung auf oder in der Nähe der Testseite hervorrufen. Da die stark gefärbten roten Zellen es erschweren können, den Farbwechsel zu detektieren, kann die Matrix Poren mit abgestuften Größen von großen Poren auf der Probenseite zu kleinen Poren auf der Testseite besitzen, um die roten Zellen von der Testseite abzufangen. Eine Auswahl von Materialien kann für die verschiedenen Komponenten des Indikatorstreifens und des Zeitsetzers dieser Erfindung genutzt werden. Einige dieser Materialien sind im US-Patent Nr. 5,306,623 offenbart, erteilt am 26. April 1994 an Kiser et at. und durch Bezugnahme hierin einbezogen.
Das Testreagenz umfaßt eine Komponente zur Umwandlung von Glucose in Wasserstoffperoxid, wie die Glucoseoxidase und eine oder mehrere Komponenten zum Nachweis des Wasserstoffperoxids, das mit Hilfe der Glucose aus der Probe erzeugt wurde. Die Komponenten zum Nachweis des Wasserstoffperoxids können eine Peroxidase, bevorzugt Meerettichper-oxidase sein, zusammen mit einem "Indikator", der die Farbe aufgrund der Reaktion ändert. Der Indikator kann ein oxidierbarer Farbstoff oder ein Farbstoffgemisch sein. Die Peroxidase katalysiert die Oxidation des Indikators in Gegenwart des Wasserstoffperoxids. Der letzte Bestandteil der Beschichtung des Reagenzteststreifens ist ein Inhibitor, der die Farbveränderung aufgrund der Oxidation des Indikators verzögert.
In der bevorzugten Ausführungsform ist der Indikatorstreifen der Länge nach segmentiert, so daß benachbarte Segmente verschiedene Indikator/Inhibitorverhältnisse besitzen. Wir bezeichnen diese Segmente als "Ergebnissegmente". Nur ein bestimmtes Ergebnissegment ändert die Farbe ob und wenn genug Glucose vorhanden ist, um zunächst den gesamten Inhibitor aufzubrauchen und dann den Indikator zu oxidieren und hierbei die charakteristische Farbänderung hervorzurufen. Daher zeigt ein Farbwechsel in einem speziellen Ergebnissegment den Schwellwert der Glucosekonzentration in der ursprünglichen Blutprobe an. Entlang des Streifens in einer bestimmten Richtung hat jedes aufeinanderfolgende Ergebnissegment ein Inhibitor/Indikatorverhältnis, das einem schrittweisen Anstieg im Schwellwert der Glucosekonzentration entspricht. Das kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, daß die Indikatorkonzentration in allen Segmenten gleich ist und jedes folgende Segment eine schrittweise größere Inhibitorkonzentration hat, als das Vorhergehende. Selbstverständlich sind auch andere Inhibitor/Indikatorverhältnisse möglich.
Hat das Ergebnissegement eine Indikator/Inhibitorkonzentration in einem angemessenen Bereich für eine spezielle Testprobe, so reagieren die angrenzenden Segmente mit dem Analyten in der Weise, daß ein Ergebnissegement gefärbt und das benachbarte nicht gefärbt ist. Das Ergebnis zeigt, daß die Glucosekonzentration in der Probe mindestens gleich der Schwellwertkonzentration ist, die benötigt wird, um in dem einen Segment die Farbe zu ändern, aber nicht so groß ist, wie sie benötigt werden würde, um die Farbe in dem benachbarten Segement zu ändern. Die Zeitsetzerelementbeschichtung umfaßt die Bestandteile des Indikatorstreifens - eine poröse Matrix, die mit einem Testreagenz beschichtet ist - und zusätzlich Glucose. Vorzugsweise liegt die Glucose im Zeitsetzer in einem solchen Überschuß vor, wie er notwendig ist, um den Inhibitor zu überwinden. In diesem Fall ist die für die Farbänderung notwendige Zeit (nachdem die Probe die Zeitsetzerbeschichtung hydratisiert hat) länger oder kürzer in Abhängigkeit davon, ob mehr oder weniger Inhibitor vorhanden ist. Die Farbänderungen im Streifen und Zeitsetzer können entweder direkt durch das Auge oder mit Hilfe eines optischen Instrumentes, das die Änderungen in der Reflektion mißt, beobachtet werden.
Idealerweise ist die Reagenzchemie in der trockenen Phase vollständig stabil und wird nicht durch die Glucose in der Beschichtung des Zeitsetzerelementes aktiviert. Wie oben beschrieben ist jedoch der Zeitsetzer nicht vollständig stabil, selbst wenn er in einem trockenen Zustand erhalten wird. Statt dessen entstehen stabile Verbindungen zwischen der Glucose im Zeitsetzer und niedermolekularen Proteinen und vermutlich ebenso zwischen Glucose und Enzymen der Beschichtung. Um den Verbrauch der Glucose durch obengenannte Glycosylierungsreaktionen vorzubeugen, kann ein Stabilisator hinzugefügt werden. Der Stabilisator glycosyliert effizienter als Glucose, aber reagiert nicht mit der Glucoseoxidase.
Die notwendige Zeit zum Erscheinen der Zeitsetzeranzeige ist durch Streifenparameter beeinflußt, die in ähnlicher Weise die Zeit beeinflussen, die zum sichtbaren Erscheinen der Anzeige der Glucosekonzentration notwendig ist. Wenn somit eine niedrige Umgebungstemperatur oder ein Altern der Streifenkomponenten die notwendige Zeit für eine gültige Messung der Glucosekonzentration verlängern, so wird auch die Zeit für die Anzeige des chemischen Zeitsetzers verlängert. Wenn schließlich die Falschbehandlung des Streifens - zum Beispiel durch das Aussetzen gegenüber Feuchtigkeit - die Farbänderung verursacht, die die Beendigung der chemischen Zeitsetzerreaktion markiert, bevor der Streifen genutzt wurde, ist der Benutzer durch die Tatsache gewarnt, daß der Streifen unbrauchbar gemacht wurde und wird wissen, daß er ihn nicht verwenden kann.

Kurze Zusammenfassung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht auf die Matrix eines direkt abzulesenden Reagenzteststreifens der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 ist eine Draufsicht auf die Testseite eines direkt abzulesenden Reagenzteststreifens der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 ist eine Draufsicht auf die Probenseite des Streifens von Fig. 2.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein Zeitsetzer der vorliegenden Erfindung mißt ein vorbestimmtes Zeitintervall auf chemischem Wege. Er ist besonders auf die Einbeziehung in einen visuellen Teststreifen zur Messung der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit angepaßt. Solch ein Teststreifen umfaßt eine poröse Matrix, die das Testreagenz beinhaltet, das einem Farbwechsel in Antwort auf den Analyten in einer biologischen Flüssigkeitsprobe unterliegt, die auf den Teststreifen aufgebracht wird.
Die Matrix kann aus einer gleichmäßigen Zusammensetzung oder einem beschichteten Substrat bestehen und sie kann entweder isotrop oder anisotrop sein. Sie hat eine Probenseite, auf die die Probe aufgebracht wird und eine Testseite, wo die Farbänderung beobachtet wird. Bevorzugt ist die Matrix eine anisotrope Membran; besonders bevorzugt eine anisotrope Membran, die einen großen Bereich an Porengrößen besitzt. Zum Beispiel einen Gradient von Porengrößen von ungefähr 0,1 Mikrometer bis ungefähr 150 Mikrometern, der sich durch die Matrix erstrecken kann. Am großporigen Ende ist die Porengröße meist bevorzugt in einem Bereich von ungefähr 30 Mikrometern bis ungefähr 40 Mikrometern. Am Ende der Matrix, wo die Poren am kleinsten sind, ist das Nullvolumen relativ klein und das Material der Membran ist im allgemeinen relativ dicht, wobei eine Schicht bis zu 10%-20% der Membrandicke ausmachen kann. Innerhalb dieser Schicht ist die Porengröße bevorzugt in einem Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 0,8 Mikrometern, und einer nominalen Porengröße von bevorzugt ungefähr 0,3 Mikrometern. Wenn die biologische Flüssigkeit auf die Probenseite aufgebracht wird, stößt die Probe auf zunehmend kleiner werdende Poren als an dem Punkt, an dem sie in die Membran eingetreten ist. Feste Bestandteile wie rote Blutzellen erreichen schließlich eine Stelle in der Membran, wo sie nicht weiter eindringen können. Der Rest der Probe, der noch die gelöste Glucose enthält, dringt bis zur Testseite vor. Die anisotrope Natur der Membran und/oder die Verwendung einer trennenden Komponente (wie unten beschrieben) in der Matrix, ermöglicht relativ hohe Flußraten durch die Membran, selbst während feste Bestandteile filtriert werden.
Während die Probe die Matrix durchläuft, verursacht die Reaktion mit dem Reagenz entweder die Bildung eines lichtabsorbierenden Farbstoffes oder den Zerfall im Nullvolumen in der Nähe der Testseite, wobei im wesentlichen ein Einfluß auf die Reflektion der Matrix stattfindet.
Polysulfone und Polyamide (Nylon) sind Beispiele für ein geeignetes Matrixmaterial. Andere Polymere mit ähnlichen Eigenschaften können auch benutzt werden. Die Polymere können modifiziert werden, um andere funktionale Gruppen einzuführen, welche geladene Strukturen liefern, so daß die Oberfläche der Matrix neutral, positiv oder negativ sein kann.
Eine bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des porösen Materials, das die Matrix bildet, ist es, das Polymer ohne unterstützenden Kern zu gießen. Solch eine Matrix ist zum Beispiel die anisotrope Polysulfonmembran, wie sie von Memtec, Inc., Timonium, MD zur Verfügung steht. Im allgemeinen wird eine Matrix mit weniger als 200 Mikrometern Dicke benutzt, wobei ungefähr 115 bis 155 Mikrometer bevorzugt werden. Besonders bevorzugt ist eine Dicke von ungefähr 130 bis 140 Mikrometern, insbesondere wenn die Matrix Nylon oder ein anisotropes Polysulfon ist. Die Matrix kann wahlweise an eine Stütze angebracht werden, um ihr physikalische Form und Festigkeit zu geben, obwohl dies nicht wesentlich ist. Bevorzugt wird die Unterstützung dadurch erreicht, daß die Matrix zwischen thermoplastischen Blättern liegt. Das Blatt auf der Probenseite besitzt eine Öffnung, durch welche die Probe aufgetragen werden kann. Das Blatt auf der Testseite erlaubt ein Sehen der Farbe auf der Testseite der Matrix.
Die Membran kann mit der Testlösung behandelt werden, indem sie in eine Beimischung der Komponenten getunkt wird und wobei eine Sättigung der Membranmatrix erreicht wird. Überschüssiges Reagenz kann durch mechanische Mittel, wie z. B. eine Arztklinge oder einen Glasstab, entfernt werden. Die Membran wird anschließend getrocknet.
Das Testreagenz umfaßt (i) eine Komponente zur Umwandlung von Glucose in Wasserstoffperoxid, (ii) eine Komponente zum Nachweis von Wasserstoffperoxid und (iii) eine Komponente zur Inhibierung der Komponente, die das Wasserstoffperoxid nachweist. Das Reagenz kann wahlweise weiterhin eine separierende Komponente umfassen, welche bei festen Bestandteilen, sowie zum Beispiel roten Blutzellen, dafür sorgt, daß diese an der Matrix gebunden oder in ihr gefangen werden, was zu einer effektiven Entfernung der festen Bestanteile aus der biologischen Flüssigkeit führt. Zusätzliche Komponenten können, wie weiter unten und in den Beispielen beschrieben, auch mit einbezogen werden.
Die bevorzugten Komponenten für die Umwandlung von Glucose in Wasserstoffperoxid umfassen Glucoseoxidase, ein Enzym, das im allgemeinen von Aspergillus niger oder Penicillium gewonnen wird. Glucoseodixdase reagiert mit Glucose und Sauerstoff unter Produktion von Gluconolacton und Wasserstoffperoxid. Die optimale Glucoseoxidasekonzentration ist abhängig von der Zusammensetzung des Indikatorsystems. Ist zum Beispiel das Indikatorsystem MBTHSB-ANS (welches weiter unten beschrieben wird), so ist Glucoseoxidase in einem Bereich von ungefähr 500-10.000 U/ml geeignet, mehr bevorzugt von ungefähr 700-2.000 U/ml und am meisten bevorzugt von ungefähr 1.000 U/ml. Im allgemeinen führen höhere Konzentrationen der Glucoseoxidase zu einem schnelleren Ablauf der Reaktion und umgekehrt.
Das so produzierte Wasserstoffperoxid reagiert mit der Komponente zum Nachweis des Wasserstoffperoxids, welche eine Peroxidase umfaßt, die selektiv eine Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und einem Indikator katalysiert. Die Peroxidase nutzt Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel, welches in der Lage ist, Wasserstoffatome von verschiedenen Substraten abzuziehen. Eine geeignete Peroxidase kann Ferriprotoporphyrin, ein rotes Hämin aus Pflanzen gewonnen, enthalten. Peroxidasen aus Tieren gewonnen, zum Beispiel aus der Schilddrüse von Tieren, sind auch geeignet. Meerrettichperoxidase (HRPO) ist besonders bevorzugt als Bestandteil der Komponente zum Nachweis des Wasserstoffperoxids.
Das Wasserstoffperoxid, bevorzugt katalysiert durch eine Peroxidase, reagiert entweder als direkte oder indirekte Form oder spaltet einen Indikatorfarbstoff, der Licht bei einem vorbestimmten Wellenlängenbereich absorbiert. Bevorzugt absorbiert der Indikatorfarbstoff bei einer Wellenlänge stark, die sich von der unterscheidet, bei der das Testreagenz stark absorbiert. Die oxidierte Form des Indikators kann das farbige, leicht gefärbte oder farblose Endprodukt sein, das einen Wechsel in der Farbe der Testseite der Matrix nachweist. Das heißt, das Testreagenz kann das Vorhandensein eines Analyten in einer Probe anzeigen, indem eine farbige Zone gebleicht wird oder alternativ eine farblose Zone Farbe entwickelt.
Zu den Indikatoren die für die vorliegende Erfindung nützlich sind gehören (a) 3- Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-Hydrochlorid (MBTH) kombiniert mit 3,3- Dimethylaminobenzoesäure (DMAB); (b) MBTH kombiniert mit 3,5-Dichlor-2- hydroxybenzol-sulfonsäure (DCHBS); (c) 4-Aminoantipyren (4-AAP) und 5-Oxo-1-(p- sulfophenyl)-2-pyrazolin-3-carbonsäure (OPSP); (d) 4-AAP und N-(m-Tolyl)- diethanolamin (NDA); (e) 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)sulfonsäure (ABTS); (f) 4- AAP und 4-Methoxynaphthol; (g) Pyrogallolrot (PGR); (h) Bromopyrogallolrot (BPR); (i) Acid Green 25 (AG); oder (j) [3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon]-N- sulfonylalkylbenzolsulfonat-Mononatrium (MBTHSB), kombiniert mit 8-Anilino-1- naphthalinsulfonat (ANS). MBTHSB-ANS ist bevorzugt. Zusätzliche Informationen bezüglich MBTHSB-ANS erscheinen in der gleichzeitig anhängigen PCT-Anmeldung mit der Seriennummer US95/12091, eingereicht am 07. September 1995 und durch Bezugnahme hierin einbezogen.
Die inhibierende Komponente verzögert die Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und dem Farbstoff oder dem Farbstoffvorläufer, wie zum Beispiel durch Reduzieren des Wasserstoffperoxids oder durch Reduzieren des oxidierten Farbstoffes. Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Arten für die Arbeitsweise des Inhibitors. Zuerst kann der Inhibitor mit dem Indikator konkurrieren und dabei die Geschwindigkeit reduzieren, mit der die Farbänderung des Indikators stattfindet. Alternativ kann der Inhibitor nicht kompetitiv sein, so daß im wesentlichen der gesamte Inhibitor aufgebraucht wird, bevor jegliche wesentliche Farbänderung des Indikators stattfindet. Bevorzugt arbeitet der Inhibitor der vorliegenden Erfindung nach letzterem Mechansimus.
Zum Umfang der geeigneten Inhibitoren zählen 2,3,4-Trihydroxybenzoesäure; Propylgallat; 3,4-Dihydroxyzimtsäure; 3,4-Dihydroxybenzaldehyd; Gallussäure; 5,6- Diaminouracil; Ascorbinsäure; und Isoascorbinsäure. Ascorbinsäure ist bevorzugt; aber Ascorbinsäure oxidiert in wäßriger Lösung. Um die Oxidation zu reduzieren, können andere Lösungsmittel genutzt werden. Bevorzugte Lösemittel sind in erster Linie Alkohole, wie Ethyl-, Methyl- oder Isopropylalkohol. Ethylalkohol ist bevorzugt, besonders in konzentrierteren Lösungen; d. h. Lösungen über 50% oder mehr Ethanol.
Obwohl die anisotrope Membran, die die bevorzugte Matrix ist, rote Blutzellen herausfiltert und sie von der Testseite entfernt hält, kann wahlweise das Testreagenz auch eine separierende Komponente enthalten. Die separierende Komponente sollte in der Lage sein, eine relativ klare, farblose Flüssigkeit aus der Flüssigkeit, die rote Blutzellen enthält, zum Beispiel Gesamtblut, durch das Zurückhalten von roten Blutzellen in der Matrix herzustellen. Die separierenden Komponenten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Polyethylenglykol, Poly(Methylvinylether/malein)anhydrid, Polypropylenglycol, Polystyrensulfonsäure, Polyacrylsäure, Polyvinylalcohol, und Polyvinylsulfonsäure bei einem pH von ungefähr 4,0- 8,0. Solche separierenden Komponenten sind in der Matrix in einer Menge vorhanden, die in Abhängigkeit ihrer Ladung und dem Molekulargewicht, den anderen in die Matrix eingebetteten Komponenten, dem pH und der Porengröße der Matrix und der verbleibenden Feuchtigkeit nach dem Trocknen der Matrix variieren. Solche Parameter sind leicht von einem Fachmann bestimmbar. Wird zum Beispiel Polypropylenglycol als separierende Komponente eingesetzt (zum Beispiel PPG-410 von BASF, Wyandotte, MI), ist es bevorzugt als ungefähr 2-30% Gewicht pro Volumen (w/v) vorhanden, und mehr bevorzugt 8- 10% w/v. Andere separierende Komponenten können auch in einer Konzentration von ungefähr 2-30% w/v eingesetzt werden. Die polymeren, separierenden Komponenten können in die Matrix imprägniert oder eingebettet werden. Einige wasserlösliche Salze können auch eine trennende Wirkung besitzen. Zu den Salzen, die für die Trennung von Blutkomponenten geeignet sind, zählen Citrate, Formiate und Sulfate, ebenso wie bestimmte Säuren, wie Aminosäuren, Zitonensäure, Phytinsäure, und Maleinsäure. (Siehe z. B. U.S.-Patent 3,552,928, erteilt am 05. Januar 1971 an M. C. Fetter.) Ein Vorteil, wenn die Trennungskomponente mit einbezogen wird, ist, daß durch die wesentliche Entfernung von festen Bestandteilen wie roten Blutzellen aus der biologischen Flüssigkeit weniger Hintergrundfarbe auf der Testseite entsteht, die den Farbwechsel des Testreagenzes verschleiert.
Andere Komponenten können in die Matrix eingebettet werden, um die Färbung zu verstärken und die Lesbarkeit des Reagenzstreifens zu verbessern und die Gleichmäßigkeit und Unversehrtheit der Matrix zu erhalten. So kann zum Beispiel das Testreagenz Salze und/oder Puffer enthalten, die die Trennung des Farbstoffes in der Matrix unterstützen. Solche Puffer können zum Beispiel Zitronensäure, in einer Lösung von ungefähr 0,01 M bis ungefähr 1,0 M und bevorzugt ungefähr 0,1 M enthalten. Andere Säurepuffer könnten auch eingesetzt werden.
Komponenten, die die Matrix hydrophiler machen oder Komponenten, die als Stabilisatoren wie hydrolysierte Proteine, reagieren können, können auch eingesetzt werden. Solche Komponenten beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, zum Beispiel Rinderserumalbumin, Polypetide und Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht, verfügbar als CROTEIN SPA (CRODA, Inc. New York, N.Y.). Solche Komponenten werden in Konzentrationen von zum Beispiel ungefähr 1 mg/ml bis ungefähr 100 mg/ml eingesetzt. Im Falle von CROTEIN ist eine Konzentration von 20 mg ml bevorzugt.
Andere Stabilisatoren und Konservierungsmittel können bei der Beschichtung der Matrix auch zugesetzt werden. Zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und verwandte Verbindungen können eingesetzt werden, zum Beispiel in einer Konzentration von ungefähr 0,01 mg/ml bis ungefähr 10 mg/ml. Ein Zweck der Konservierungsmittel ist unter anderem, zur Stabilisierung des Inhibitors beizutragen.
Einige der Indikatoren (zum Beispiel BPR) haben die unerwünschte Tendenz in der Matrix zu wandern. Wird ein solcher Indikator eingesetzt, wird ein ionenpaarendes Mittel zugegeben, um solche Wanderung zu verhindern. So sind z. B. Polyethylenglycolderivate handelsüblich erhältlich als POLYQUART (H) (Henkel, Inc., Ambler, PA) besonders nützlich für ihre Fähigkeit, die Bildung von Tonenpaaren zwischen dem Indikator und anderen Matrixvertretern zu unterstützen.
Wird das Vorhandensein eines Analyten durch die Farbbildung angezeigt (zum Beispiel MBTHSB-ANS), kann zur Farbaufhellung und zur Verstärkung des Kontrastes mit dem Hintergrund ein Tensid zugesetzt werden.
In der Praxis dieser Erfindung können auch organische Lösungsmittel eingesetzt und der Zusammensetzung des Testreagenzes für die Matrix zugesetzt werden, vorausgesetzt natürlich, daß sie mit der Matrix und den Zusammensetzungen des Testreagenzes verträglich sind. Mögliche geeignete organische Lösungsmittel umfassen Chloroform, Aceton, Alkohole, Methylenchlorid, Diethyl- und Petroleumether, Acetonitrile und Gemische aus diesen. In der Praxis der vorliegenden Erfindung wird 70%iges Ethanol in Wasser praktischerweise bevorzugt.
Das auf die Matrix beschichtete oder in die Matrix imprägnierte Testreagenz ist nicht gleichmäßig über die Oberfläche des Teststreifens verteilt. Statt dessen ist das Reagenz bevorzugt in Reihen von parallelen Streifen, oder "Ergebnissegmenten", auf die Matrix aufgebracht, wobei die Zusammensetzung der benachbarten Ergebnissegmente schrittweise in der Inhibitorkonzentration ansteigt. Somit benötigt jedes aufeinanderfolgende Segment eine schrittweise größere Glucosekonzentration in der Probe, um in dem Segment eine Farbänderung hervorzurufen.
Der Zeitsetzerabschnitt der Matrix ist mit einer Zusammensetzung beschichtet oder imprägniert, die das Testreagenz und zusätzlich Glucose und eine Aldose enthalten, die nicht mit dem Enzym des Reagenzes reagiert. Die Glucose ist so zugesetzt, daß der Zeitsetzerabschnitt im Zeitablauf die Farbe ändert, wenn er durch die Zugabe einer wäßrigen Lösung auf den Streifen hydratisiert ist. Die Aldose ist zugesetzt, um den Zeitsetzerabschnitt zu stabilisieren. Während wir nicht an eine bestimmte Theorie gebunden sein wollen, glauben wir, daß das Erfordernis für die Aldose daher rührt, daß viele Monosaccharide stabile kovalente Komplexe mit den Aminogruppen von Proteinen bilden. Somit kann ein Teil der Glucose im Zeitsetzer mit den niedermolekulargewichtigen Proteinen reagieren und vielleicht mit Enzymen im Testreagenz Komplexe bilden. Dieser Prozeß ("Glycosylierung") geschieht nicht-enzymatisch in zwei Schritten. Der erste Schritt, welcher leicht reversible ist, ist die Bildung einer Schiffschen Base; im Falle von Aldosezuckern ein Aldimin. Im Zeitablauf bildet sich in einer irreversiblen Reaktion ein Ketoamin, welches sehr stabil ist.
Um den Verbrauch der Glucose in der Glycosylierungsreaktion zu verhindern, die, wie wir glauben, in dem Zeitsetzer stattfindet, nutzen wir als Stabilisator einen Zucker, welcher ein effizienterer Glycosylator ist und welcher erfolgreich mit der Glucose um die Aminogruppen der Proteine konkurrieren kann. Aus offensichtlichen Gründen ist es auch notwendig, einen Zucker zu nehmen, der nicht mit der Glucoseoxidase reagiert.
Bunn und Higgins, Science 213, 222 (10. Juli 1981) haben entdeckt, daß die Glycosylierungseffizienz von Monosacchariden im Verhältnis zu dem Anteil von Zuckern in Lösung steht, welcher in der offenkettigen Aldehydkonfiguration vorliegt. Die von diesem Paper angepaßte Tabelle 1, enthält eine Liste von Reaktionsraten mit Hämoglobin, k, und eine Anzahl von Aldosen, von denen keine mit Glucoseoxidase reagiert. Im Prinzip sollte der k-Wert so hoch wie möglich sein und in jedem Fall höher, als der der Glucose. In der Praxis muß der Stabilisator schneller als die Glucose mit den Teilen reagieren, die ansonsten mit der Glucose reagieren und diese verringern würden. Deshalb sollte genug Stabilisator vorhanden sein, um mit all diesen Teilen reagieren zu können (d. h. der Stabilisator sollte mindestens equimolar mit diesen Teilen sein). Bevorzugt wird ein Überschuß an Stabilisator zugefügt, besonders, wenn sein k nur leicht höher als der von Glucose ist. In diesem Fall findet sich keine nennenswerte Verringerung der Glucose. Unter diesen Kriterien wurden Mannose und Galactose als brauchbare Stabilisatoren ermittelt. Da sie preiswert sind und rasch zur Verfügung stehen, werden sie bevorzugt.

Tabelle 1:

Aldose Reaktionsraten (k)

D-Glucose 0,60
D-Mannose 3,2
6-Deox-L-mannose (Fucose) 0,7
D-Allose 1,4
D-Galactose 2,8
D-Xylose 2,9
D-Talose 5,2
D-Altrose 5,0
D-Ribose 10,0
D-Idose 55
5,6-Di-O-methyl-D-glucose 104
Der Zweck des Testreagenzes ist die Farbänderung als Reaktion auf Glucose. Deshalb verlangt die Kombination der Glucose und des Reagenzes des Zeitsetzers, ohne eine Farbänderung hervorzurufen, einige Vorsicht. Zur Kompensation dieses Effektes muß eine Inhibitormenge vorhanden sein, die unter der liegt, die für die Funktion des Zeitsetzers notwendig ist. Die Geschwindigkeit, mit der der Zeitsetzerabschnitt trocknet, nachdem die glucosehaltige Lösung aufgebracht wurde, wird kontrolliert. In der Praxis wird die Membran zuerst mit einer Lösung die Puffer und Enzyme enthält beschichtet und diese Beschichtung getrocknet, um die erste Lage zu bilden. Dann wird in einem zweiten Beschichtungsarbeitsgang eine Lösung aufgebracht, die den Indikator, den Inhibitor, die Glucose und eine Aldose enthält, um die zweite Lage zu bilden. Parameter wie in Webegeschwindigkeit, Ofentemperatur und Luftfluß und Quantität der abgeschiedenen Beschichtungslösungen werden im Vorfeld festgelegt und eine entsprechende Anpassung für die Inhibitor- und/oder Glucosekonzentrationen vorgenommen. Anstelle der zweiten Lage, die als Beschichtung aufgebracht wurde, kann alternativ, weniger bevorzugt, die zweite Beschichtung auf einem separaten Gewebe durchgeführt werden und dann über die erste Schicht laminiert werden.
Wird eine Probe auf den Streifen aufgebracht, erlaubt die Hydratisierung der Zusammensetzung des Zeitsetzerabschnitts die Fortführung der Farbentwicklung. Die Zeit, die für die Farbänderung des Zeitsetzerabschnitts notwendig ist, wird durch die Temperatur und durch Besonderheiten des Testreagenzes, insbesondere der Inhibitorkonzentration, der Menge an Glucose und Hydratisierungs- und Sauerstoffdiffusionsraten bestimmt.
Die Zeit für eine Farbänderung des Zeitsetzers kann abhängig von der Glucosekonzentration in der Probe gestaltet werden oder alternativ unabhängig von dieser Konzentration sein. Ist ein großer Überschuß an Glucose in den Zeitsetzer eingearbeitet, ist die Zeit im wesentlichen unabhängig von der Glucosekonzentration der Probe. Wird weniger Glucose in den Zeitsetzer eingearbeitet, kann die Zeit von der Glucose in der Probe abhängig gemacht werden; d. h. der Zeitsetzer wird die Farbe schneller ändern, wenn die Glucosekonzentration in der Probe größer ist. Bevorzugt ist die Glucosekonzentration in der Beschichtungslösung des Zeitsetzers größer als ungefähr 1.500 mg/dl, was den Zeitsetzer im wesentlichen unabhängig von der Glucosekonzentration der Probe in dem gewünschten Bereich von ungefähr 40 bis 400 mg/dl, ebenso wie außerhalb des Bereiches, macht. Die Zusammensetzung des Zeitsetzers sollte dann mindestens oder mehr Inhibitor enthalten als das Ergebnissegment, das die höchste Inhibitorkonzentration hat (welches der höchsten Glucosekonzentration entspricht, die abgelesen werden kann).
Der Zeitsetzer erfüllt auch eine wichtige Qualitätskontrollfunktion, in dem er sichtbar macht, wenn der Teststreifen durch das Aussetzen gegenüber Feuchtigkeit unbrauchbar geworden ist. Der Teststreifen muß bis zu dem Zeitpunkt, wo er gebraucht wird, trocken bleiben, weil ansonsten Komponenten, die die Glucose in Wasserstoffperoxid umwandeln (im allgemeinen Enzyme), die Tendenz haben, bei Feuchtigkeit zu degradieren. So wird der Streifen, wenn er vorweg Feuchtigkeit ausgesetzt worden ist, unverlässlich. Die Unverlässlichkeit des Teststreifens ist für den Benutzer nicht offensichtlich, der deshalb, wenn ein solcher Streifen benutzt wird, ein fehlerhaftes Ergebnis bekommt.
Wenn jedoch der Teststreifen einen Zeitsetzerabschnitt enthält, verursacht das Aussetzen gegenüber Feuchtigkeit eine Farbänderung des Zeitsetzers, was den Benutzer warnt, daß der Streifen beeinträchtigt ist.
Die Erfindung wird nun unter Verwendung der Abbildungen weiter beschrieben.
Fig. 1 zeigt eine Matrix 10 der vorliegenden Erfindung zur Messung der Menge eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit. Obwohl in einer gebogenen Position gezeigt, ist die Matrix 10 flexibel und im allgemeinen bei Benutzung flach. Die Matrix umfaßt eine Probenseite 12, auf die die biologische Flüssigkeitsprobe aufgebracht wird und eine Testseite 14, an oder in der Nähe die Farbänderung das Vorhandensein eines Analyten angibt. Die Farbänderung ist ein Ergebnis der Interaktion des Analyten mit dem in die Poren 16 imprägnierten Reagenzes. Zur Messung der Konzentration von Glucose im Blut, sind die Porengrößen bevorzugt relativ groß in der Nähe der Probenseite 12 und nehmen an Größe ab, je näher sie der Testseite 14 kommen. Der Porengrößengradient dient dazu, die roten Blutzellen in der Nähe der Probenseite 12 abzufangen, so daß ihre Farbe nicht mit der Möglichkeit interferriert, die Farbänderung zu sehen, die das Vorhandensein eines Analyten angibt.
Vier Ergebnissegmente a, b, c und d sind schematisch gezeigt. Jedes nachfolgende Segment hat schrittweise mehr Inhibitor als das Vorhergehende. Wenn zum Beispiel eine Probe in den Segmenten a, b und c eine Farbänderung hervorruft, in d aber nicht (wie in Fig. 1 gezeigt), bedeutet das, daß die Glucosekonzentration in der Probe mindestens so groß ist, wie sie notwendig ist, um das Inhibitorlevel in Segment c aufzubrauchen, aber nicht groß genug ist, um den Inhibitor in Segment d zu überwinden. Sind die Ergebnissegmente einmal kalibriert, führen die Ergebnisse zu einer quantitativen Messung der Glucosekonzentration. Segment t, der Zeitsetzer, beinhaltet eine höhere Konzentration an Glucose, zusätzlich zu dem Testreagenz, das in die Ergebnissegmente imprägniert wurde. Der Inhibitor in Segment t ist mindestens mengenmäßig so groß wie in den Ergebnissegmenten und die notwendige Zeit, um den Inhibitor in Segement t aufzubrauchen, ist mindestens so groß, wie notwendig, um den Inhibitor in den anderen Segmenten aufzubrauchen. Wenn also in Segment t eine Farbänderung stattfindet (wie in Fig. 1 gezeigt), ist genug Zeit vergangen, um eine Farbänderung in allen Ergebnissegmenten zu verursachen, deren Inhibitorkonzentration niedrig genug ist, um von der Glucosekonzentration der Probe verbraucht zu werden und eine exakte Messung kann ohne weitere Verzögerung erhalten werden.
In einem gegenwärtigen Teststreifen ist die Membranmatrix von Fig. 1 zwischen 2 Deckblättern eingelegt, welche aus jeglichem geeigneten thermoplastischen Film bestehen können, wie im Stand der Technik bekannt. Fig. 2 und 3 sind jeweils Draufsichten der Probenseite 22 und der Testseite 24 des Teststreifens 20. Bei Gebrauch wird eine Blutprobe auf die Öffnung 26 der Probenseite 22 gebracht. Die Probe breitet sich durch Kapillarkräfte in Längsrichtung in Richtung des oberen und des unteren Endes des Streifens aus und durchdringt die Matrix in Richtung der Testseite 24. Optionale Luftlöcher 28 erleichtern das Ausbreiten der Probe entlang des Streifens. Das Erscheinen der Probe durch das optionale klare Fenster 30 bestätigt, daß ausreichend Probe für eine Messung zur Verfügung gestellt wurde. Indikatorkreise auf der Testseite 24 lassen den notwendigen Sauerstoff für die Farbbildungsreaktion rein und sind markiert, um die Glucosekonzentration anzuzeigen. Während der Test fortschreitet, wechseln die Indikatorkreise auf der Testseite 24 nacheinander die Farbe, wenn die Blutglucosekonzentration in der Probe gleich oder über der Menge liegt, die dem Kreis entspricht. Deshalb gibt das dargestellte Ergebnis in Fig. 3 an, daß die eine Glucosekonzentration der Probe von mindestens 120 mg/dl, aber weniger als 150 mg/dl ist. Das Ablesen kann jederzeit, nachdem der Zeitsetzerkreis 32 die Farbe gewechselt hat, vorgenommen werden. In den Figuren ist zu beachten, daß die Farbänderung, verursacht durch die Reaktion mit der Glucose, von weiß nach farbig geschieht. Jedoch könnte das System auch alternativ mit einem Indikatorfarbstoff arbeiten, der durch die glucosevermittelte Oxidation zerstört wird und mit einem Farbwechsel von farbig nach weiß reagiert.
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung illustrieren folgende Beispiele verschiede Ausführungsformen der Erfindung. Die Beispiele sollen in keinster Weise limitierend sein. Beispiel 1- BPR Indikator
Die Memtec BTSH 55-Membran wurde in dieser Lösung tauchbeschichtet und der Überstand mit einem Glasstab entfernt. Die beschichtete Membran wurde in einem Flußtrockner bei 180 F unter gemäßigtem Luftstrom getrocknet, so daß das Gewebe im wesentlichen innerhalb von 20 Sekunden trocken war. Das Gewebe wurde in Vorbereitung auf die zweite Beschichtung, wie unten beschrieben, aufgespult.
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:
*Die Glucoselösung ist eine 16.000 mg/dl-Lösung von Glucose in Wasser unter Rühren für 24 Stunden gelöst, gekühlt gelagert.
Die folgenden Lösungen der Stocklösung wurden hergestellt:
0,0405 : 1, 0,108 : 1, 0,236 : 1, 0,369 : 1, 0,569 : 1, 1,260 : 1. Diese schrittweise Erhöhung der Inhibitorkonzentration entspricht der schrittweise größer werdenden Glucosekonzentration, die zu den obenbeschriebenen Kreisen führt. Diese Lösungen werden zusammen mit der Zeitsetzerlösung Seite an Seite auf die großporige Seite der enzymbeladenen Membran geschichtet, so daß ungefähr 1 · 10~ ml pro Quadratmillimeter der Membran abgelagert werden. Die Membran war ungefähr fünfzehn Sekunden naß, bevor sie nach denselben Trocknungsbedingungen, wie oben für den Enzymbeschichtungsschritt beschrieben, getrocknet wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß der Zeitgeber in ungefähr 70 Sekunden reagiert, wobei 95% der Ergebnisse zwischen 64 bis 79 Sekunden erscheinen.

BEISPIEL 2 - MBTHSB-ANS INDIKATOR

Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:
HPLC-Wasser 1500 ml
Zitronensäure 16,92 g
Natriumcitrat 20,88 g
Mannitol 15 g
Na&sub2; EDTA 1,26 g
GANTREZ S95 6,75 g
Crotein SPA 36 g
Glucoseoxidase 1,69 MU
HRPO 1,5 MU
CARBOPOL 910* 75 ml
Na&sub2;Citrat** 225 ml
* 11%ige Lösung in Acetonitril
**0,1 M, pH 5,0
Die Memtec BTS30-Membran wurde in einer Wanne so beschichtet, daß die großporige Oberfläche mit der Beschichtungslösung in Kontakt kam; überschüssige Lösung wurde mit einem Glasstab wie vorher entfernt. Die Membran wurde getrocknet und wie in Beispiel 1 aufgespult. Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:
Für jede Inhibitorlösung wurde das Volumen der Lösung A auf 263 ml festgesetzt. Für die verschiedenen Ergebniskreise wurde das Verhältnis von 70% Ethanol : Lösung C von 58,9 bis 0,200 variiert, so daß das Volumen von 70% Ethanol + Lösung C, die zur Lösung A zugegeben wurden, 87,5 ml für alle Inhibitorlösungen betrug. Das veränderte tatsächlich nur die Konzentration des Inhibitors in jeder Lösung. Die Lösungen, die die schrittweise ansteigende Inhibitorkonzentration und die Zeitsetzerlösung (Lösung D) enthalten, wurden Seite an Seite auf die großporige Seite der Membran geschichtet. Die Ablagerungsrate wurde auf ~ 8 · 10&supmin;&sup5; ml des Inhibitors pro Quadratmillimeter der Membran eingestellt. Die Membran wurde wie oben getrocknet, nur daß die Verzögerung zwischen Beschichtung und Trocknung ungefähr 1,6 Minuten betrug. Das Ergebnis zeigte, daß der Zeitsetzer in ungefähr 60 Sekunden mit einem geringen Einfluß durch das Bluthämatokrit von 30 bis 55% oder 78 bis 420 mg/dl Glucose reagiert.

BEISPIEL 3 - VERSTÄRKTE ZEITSETZERSTABILITÄT

Eine anisoptrope Polysulfonmembran, Memtec BTS-30, wurde mit Reagenz A beschichtet. Die so erhaltene Membran wurde in einem Umluftofen bei 56ºC für 10 Minuten getrocknet. Die Membran wurde anschließend mit Reagenz B überschichtet und unter denselben Bedingungen wie oben getrocknet. Anschließend wurde die Membran in Streifen zum Testen geschnitten.

Reagenz A

Wasser Gewicht (g)

Zitronensäure 3963
Na&sub3;Citrat 45,12
Mannitol 55,68
EDTA 40
GANTREZ S95 3,36
CROTEIN SPA 18
Glucoseoxidase (126 U/mg) 57,72
Meerrettichperoxidase (410 U/m) 37,6
CARBOPOL 910 in MeCN (0,55 mg/5 ml) 12,25
0,1 M Na&sub2;Citrat 177,18
598,3

Reagenz B

Färbelösung:
Ethanol 22,5 ml
Wasser 2,5 ml
MBTHSB 36,3 mg
(NH&sub4;)ANS 472,5 mg
Glucoselösungen:
(1) 16.000 mg/dl D-Glucoselösung in Wasser
(2) 16.000 mg/dl D-Glucose + 16.000 mg/dl Galactoselösung in Wasser
(3) 16.000 mg/dl D-Glucose + 16.000 mg/dl Riboselösung in Wasser
(4) 16.000 mg/dl D-Glucose + 16.000 mg/dl Mannoselösung in Wasser
Die Streifen für alle vier Zusammensetzungen wurden in zwei Gruppen zur Lagerung unterteilt:
- Gruppe 1 wurde für sieben Tage bei 56ºC gelagert - beschleunigte Alterung
- die andere Gruppe wurde für sieben Tage bei 5ºC gelagert - Kontrolle
Am Ende der sieben Tage wurden die Streifen mit Gesamtblutproben getestet, die 100 mg/dl Glucose und 42,5% Hämatokrit enthielten.
Die "gealterten" Streifen, die nur Glucose enthielten, zeigten eine viel längere Zeit zur Entwicklung der vollständigen Farbe ("Reaktionsendzeit") als die "frischen" (d. h. bei 5ºC gelagerten) Streifen. Die Streifen, die Aldose enthielten, zeigten eine wesentlich geringer Verlängerung der Reaktionsendzeit.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 2

Zucker Unterschied in der Reaktionsendzeit (56º vs. 5ºC)
Glucose (Kontrolle) 28 Sekunden
Galactose/Glucose 16 Sekunden
Ribose/Glucose 14 Sekunden
Mannose/Glucose 12 Sekunden
In der obigen Beschreibung und den Beispielen erscheinen folgende Marken:
CARBOPOL 910 Polyacrylsäure-Polymer (B. F. Goodrich)
CROTEIN SPA hydrolysiertes Kollagen - 4000 MW (Croda Inc.)
GANTREZ 595 Poly(methylvinylether/maleinsäure) (International Specialty Products)
MAPHOS 60A komplexe organische Phosphatester (PPG Industries)
POLYQUART H Polyethylenglykol - 15 Talgpolyamin (Henkel Canada Ltd.)
SURFACTOL Q1 ethoxyliertes Rizinusöl (CasChem, Inc.)
Für Fachleute ist es selbstverständlich, daß die vorangegangene Beschreibung und die Beispiele erläuternd für Anwendungen der Erfindung, aber in keinster Weise limitierend sind. Veränderung der hier dargestellten Details können vorgenommen werden, ohne von der Reichweite und der Grundidee der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Ein chemischer Zeitsetzer für einen visuell zu lesenden Teststreifen zur Messung der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht ist, wobei der Zeitsetzer eine Trockenbeschichtung umfaßt aus:

(a) einer gefärbten Indikatorzusammensetzung;

(b) einem Enzymreagenz, das, wenn es hydratisiert ist, in der Lage ist, mit Glucose unter Farbwechsel des Indikators zu reagieren;

(c) einem Inhibitor zur Inhibierung des Farbwechsels des Indikators;

(d) Glucose; und

(e) einer Aldose, die im wesentlichen nicht mit dem Enzym im Reagenz reagiert.

2. Der chemische Zeitsetzer nach Anspruch 1, wobei die Aldose Mannose oder Galactose ist.

3. Der chemische Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Enzymreagenz (b) bevorzugt ein Oxidase-Enzym enthält, wie z. B. Glucoseoxidase.

4. Der chemische Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Analyt Glucose ist.

5. Der chemische Zeitsetzer nach Anspruch 4, wobei der Inhibitor und die Glucosekonzentrationen in der Trockenbeschichtung so gewählt sind, daß die Glucose, über eine vorbestimmte Zeit nachdem die biologische Flüssigkeit auf den Streifen gebracht ist, mit dem Reagenz unter Farbwechsel des Indikators reagiert.

6. Der chemische Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Inhibitor Ascorbinsäure umfaßt.

7. Der chemische Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Indikator aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-Hydrochlorid (MBTH) kombiniert mit 3,3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB);

(b) MBTH kombiniert mit 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure (DCHBS);

(c) 4-Aminoantipyren (4-AAP) und 5-Oxo-1-(psulfophenyl)-2- pyrazolin-3-carbonsäure (OPSP);

(d) 4-AAP und N-(m-Tolyl)-diethanolamin (NDA);

(e) 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)sulfonsäure (ABTS);

(f) 4-AAP und 4-Methoxynaphthol;

(g) Pyrogallolrot (PGR);

(h) Bromopyrogallolrot (BPR);

(i) Acid Green 25 (AG); oder

(j) [3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon]-N- sulfonylalkylbenzolsulfonat-Mononatrium (MBTHSB) kombiniert mit 8-Anilino-1-naphthalinsulfonat (ANS), und ist bevorzugt MBTHSB-ANS.

8. Ein visuell zu lesender Teststreifen, zur Messung der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht ist, der den chemischen Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.

9. Ein Verfahren zur Herstellung des chemischen Zeitsetzers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welches folgende Schritte umfaßt:

(1) Beschichten einer porösen Membran mit einer Lösung des besagten Reagenzes (b) nach Anspruch 1;

(2) Trocknen der Beschichtung, um eine erste Schicht zu bilden; und

(3) Aufbringen einer zweiten Schicht, die die verbleibenden Komponenten des chemischen Zeitsetzers wie in Anspruch 1 aufgelistet enthält, auf die erste Schicht.