DE69505338T2

DE69505338T2 - Nukleotidsequenzen die spezifisch mit einer genomischen Sequent von Campylobacter coli hybridisieren

Info

Publication number: DE69505338T2
Application number: DE69505338T
Authority: DE
Inventors: Jean-Luc F-92310 Sevres Guesdon; Veronique F-92600 Asnieres Stonnet
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1994-11-14
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 1999-04-01
Anticipated expiration: 2015-11-14
Also published as: WO1996015261A2; CA2203933A1; DE69505338D1; ZA959604B; EP0711841B1; DK0711841T3; FR2726826A1; FR2726826B1; CA2203933C; ATE172250T1; JP4040675B2; WO1996015261A3; ES2125577T3; EP0711841A2; EP0711841A3; US5998138A; JPH10508499A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine für Campylobacter coli spezifische Nucleinsäuresequenz genauso wie Anwendungen dieser Sequenz als spezifische Nucleotid- Sonde zum Nachweis von Sequenzen von Campylobacter coli oder von Fragmenten dieser Sequenz als Nucleotid-Primer für die Amplifikation von DNA oder RNA von Campylobacter coli in einer biologischen Probe.
Die Infektionen durch Campylobacter sind in der gesamten Welt sehr verbreitet und betreffen den Menschen genauso wie wilde Tiere oder Haustiere. Obwohl sie zu Beginn des 20sten Jahrhunderts entdeckt wurden, waren die heute Campylobacter genannten Bakterien während langer Zeit schlecht bekannt, weil ihre Besonderheiten ihre Identifizierung und ihre Kultur schwierig machten. Zunächst bei Schafen und Rindern isoliert und Vibrio fetus und später Campylobacter fetus genannt, wurden die ersten Fälle vom Human- Campylobacteriosen nicht vor 1946 beschrieben, und erst ab 1972 wurde die Bedeutung von Infektionen durch Campylobacter nachgewiesen und anerkannt, als selektive Medien für Campylobacter begannen Anwendung zu finden.
Seit der Bestimmung der Art vom Typ Campylobacter fetus wurde ein Dutzend weitere Arten und Unterarten entdeckt, wobei die exakte Anzahl entsprechend den Autoren und den taxonomischen Methoden variieren, die häufig neue Klassifikationskriterien vorschlagen. Unter diesen Arten sind die am häufigsten in der Human- und/oder Tier- Pathologie angetroffenen Campylobacter jejuni, Campylobacter coli und Campylobacter fetus.
Heute sind Campylobacter jejuni und Campylobacter coli häufig verantwortlich für infektiöse Diarrhö beim Menschen.
Das "réseau de surveillance nationale des infections à Campylobacter", das in Frankreich 1986 etabliert wurde, publiziert jedes Jahr eine Bilanz, die die hauptsächlichen epidemologischen und klinischen Daten dieser gemeldeten Fälle zusammenstellt.
In der Art Mensch ist das Hauptsymptom der intestinalen Infektion mit C. jejuni oder C. coli die Diarrhö, die in den schwersten Fällen starke Wasserverluste nach sich ziehen kann, was besonders gefährlich für Kinder und Säuglinge sein kann, die empfindlich für Dehydratation sind. Dennoch bleibt die Campylobacter-Enteritis häufig ohne Komplikationen, und die Diarrhöen können sogar spontan nach einer Woche aufhören. Dennoch können die Coprokulturen bis zu einigen Wochen oder sogar Monaten positiv bleiben, und in 5 bis 10 der Fälle können Rückfälle auftreten. Eine Behandlung und eine rigorose Überwachung sind daher zwingend, vor allem für Personen mit Immundefizit oder schweren Krankheiten (Aids, Leberzirrhose, Krebs, Leukämie usw.), bei denen Campylobacter sich wie opportunistische Bakterien verhalten können.
Weitere Konsequenzen der Infektionen mit C. jejuni oder C. coli wurden ebenfalls beschrieben, obwohl seltener oder außergewöhnlich: mesenterische Adenitis, Cholecystitis, Harnweginfektionen, Meningitis, Sepsis, krotiges Erythem oder Guillain-Barré-Syndrom usw.
Bei Tieren leben Campylobacter gewöhnlich als Parasiten im Verdauungstrakt zahlreicher Arten: Rinder, Schafe, Schweine, Geflügel, Wildvögel, Hunde und Katzen. Diese Tiere, krank oder als gesunde Träger, stellen ein großes Reservoir an Keimen und daher ein bedeutendes Ansteckungsrisiko dar. Im Fall von offensichtlichen Infektionen bei Rindern und Schafen ist von C. jejuni seit der ersten Beschreibung 1931 bekannt, daß er der Grund der Vieh-Dysenterie ist, die als Konsequenz außer der Wirkung auf das Tier die Übertragung auf den Menschen durch Verteilung der Keime in der Umgebung der Tiere (Boden, Wasser) sein kann. Sogar bei asymptomatischen Tieren, "gesunden Trägern", kann die Übertragung auf den Menschen stattfinden: entweder durch direkten Kontakt mit diesen Tieren oder ihren Ausscheidungen, oder durch Verzehr von verschmutzten Lebensmitteln oder Wasser (während der Herstellung kontaminiertes und schlecht gekochtes Fleisch, nicht pasteurisierte Milch, verschmutztes Wasser usw.).
Im Hinblick auf eine Prävention ist es daher sowohl beim Menschen als auch beim Tier wichtig, das Pathogen C. jejuni oder C. coli so früh wie möglich zu identifizieren, um durch adäquate Maßnahmen jede Kontamination zu vermeiden. Dies ist insbesondere in der Agro-Lebensmittel-Industrie der Fall, wo sterile Bedingungen eingehalten werden müssen. Dies ist genauso wichtig in der Human-Pathologie, um eine korrekte Überwachung der im Verlauf einer Infektion mit Campylobacter behandelten Kranken zur Vermeidung jeden neuen Rückfalls zu bewirken.
Schließlich ist es im Fall von festgestellten Infektionen besonders wichtig, den verantwortlichen Keim zu identifizieren, und dies bald nach Ausbruch der Krankheit, um eine richtige und wirksame Behandlung anwenden zu können, die die Entwicklung der Infektion und die Verbreitung von Epidemien verhindern können. Die Identifizierung von Campylobacter und die Bestimmung der betreffenden Art ist jedoch nicht einfach. Tatsächlich erfordert ihre Isolierung spezielle Medien, und ihr klassischer Nachweis findet tatsächlich nur durch eine Anreicherung durch Kultur von mindestens 48 Stunden statt. Dies ist eine sehr lange Zeit, wenn eine schnelle Diagnostik erforderlich ist. Andererseits können, da die mikrobiologische Diagnostik momentan durch bakteriologische und/oder biochemische Techniken stattfindet, die phänotypische Unterschiede ausnutzen, welche zwischen den verschiedenen Arten existieren, diagnostische Irrtümer eintreten, vor allem wenn Mutanten bei einem gegebenen Charakter auftreten. Im genauen Fall von C. jejuni und C. coli ist das einzige Unterscheidungskriterium die Hydrolyse von Hippurat (C. jejuni kann es hydrolysieren, während C. coli es nicht kann), und es kommt manchmal vor, daß diese Unterscheidung nicht stattfinden kann, weil Hippurat-negative C. jejuni-Stämme existieren (Hébert et al., J. Clin. Microbiol., 1984, 20, 138 bis 140, Totten et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1747 bis 1752).
Es wurden einige Wege unter Verwendung der molekularen Hybridisierung zur Identifikation von Arten vorgeschlagen, die zur Gattung Campylobacter gehören. Diese Verfahren ermöglichen die Identifizierung jedoch erst nach Kultur, sie sind nicht ausreichend empfindlich zum Nachweis dieses Bakteriums in der biologischen Umgebung. So wurden Methoden zur Identifikation und Klassifikation von Campylobacter vorgeschlagen, die entweder radioaktive Sonden (Ng et al., Mol. Cell. Probes, 1987, 1, 233 bis 243) oder nicht radioaktive Sonden verwenden (Chevrier et al., J. Clin. Microbiol., 1989, 27, 321 bis 326), diese Verfahren verwenden jedoch vollständige genomische Sonden und erfordern eine Anreicherung des nachzuweisenden Pathogens durch Kultur, weil die Nachweisquelle ziemlich hoch ist, etwa 10&sup5; Bakterien (Chevrier et al., siehe oben).
Untersuchungen von für C. jejuni spezifischen Nucleinsäure-Sonden mit dem Ziel der Diagnostik der Art wurden von Picken et al. (Mol. Cell. Probes, 1987, 1, 245 bis 259), Korolik et al. (J. Gen. Microbiol., 1988, 134, 521 bis 529) und Zhou und Wang durchgeführt (Zbl. Bakt., 1989, 272, 186 bis 190), es bestehen jedoch Probleme der Spezifität fort, und die Sequenzen dieser potentiellen Sonden wurden nicht bestimmt.
Kürzlich haben die Erfinder, Autoren der vorliegenden Erfindung, eine für die Art C. jejuni spezifische DNA-Sequenz entdeckt (FR-2 701 028). Diese Sequenz wurde verwendet, um einen PCR-Test zu entwickeln, der diese Art in einer biologischen Probe nachweisen und identifizieren kann (Stonnet und Guesdon, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1993, 7, 337 bis 344). Unter Berücksichtigung der hohen Spezifität der Sequenz ermöglicht dieser PCR- Test den Nachweis der Art C. coli nicht, die klinisch genauso bedeutsam ist wie C. jejuni. Kürzlich wurde eine Methode zur spezifischen Identifikation und Unterscheidung zwischen Campylobacter thermophiles, darunter auch C. coli, von Eyers et al. beschrieben (J. Clin. Microbiol., 1993, 31, 3340 bis 3343). Die artspezifischen Primer wurden jedoch in hypervariablen Regionen von Genen ausgewählt, die für ribosomische RNA 23S kodieren, was die Möglichkeit zur Erzielung von "falsch-negativen" Ergebnissen nicht ausschließt, wenn eine DNA eines zu testenden Stammes Variationen gerade in der Sequenz der Primer aufweist.
Diese Gründe habe die Erfinder zur Auswahl der Aufgabe geführt, spezifische DNA- Sequenzen vom Campylobacter coli zu isolieren und ausgehend von diesen Sequenzen eine Identifikationsmethode zu entwickeln, die auf der PCR-Technik und der Technik der molekularen Hybridisierung beruht. Die Verbindung dieser beiden Techniken ermöglicht das Erreichen einer sehr niedrigen Nachweisgrenze und ermöglicht den Nachweis und die Identifikation eines einzigen Bakteriums C. coli in einer biologischen Probe.
Die Erfinder haben gegenwärtig eine Nucleinsäure-Sequenz isoliert, die für den spezifischen Nachweis der Art Campylobacter coli geeignet ist.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nucleotid-Sequenz, die spezifisch mit der genomischen Nucleinsäure von Stämmen hybridisiert, die zur Art C. coli gehören, und die unter den üblichen Bedingungen nicht mit Nucleinsäuren von Campylobacterien hybridisiert, die nicht zu dieser Art gehören ebensowenig wie mit den genomischen Nucleinsäuren von Bakterien, die der Gattung Campylobacter ähneln.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Nucleinsäure-Sequenz mit der Sequenz SEQ ID No. 1, die damit komplementäre Sequenz oder eine Sequenz, die sich davon durch Mutation, Insertion, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Basen unterscheidet.
Unter "Sequenz, die sich dadurch durch Mutation, Insertion, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Basen unterscheidet" wird ehe Sequenz verstanden, die mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder ihrer komplementären Sequenz unter den üblichen Stringenzbedingungen hybridisiert, die von SAMBROOK J., FRITSCH E. F. und MANIATIS T. (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed. Cold. Spring Harbor Laboratory 9.47-9.62) definiert wurden.
Diese Bedingungen werden ausgehend von der mittleren Stringenztemperatur Tm bestimmt.
Bevorzugt sind die vorteilhaftesten Sequenzen diejenigen, die im Temperaturbereich (Tm -15ºC) bis (Tm -20ºC) hybridisieren.
Die in Frage stehenden Sequenzen umfassen vorteilhafterweise mindestens 12 Nucleotide.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Klonierungsvektor, der eine Nucleotid-Sequenz wie die oben definierte enthält, genauer gesagt das Plasmid pCS1, das die Sequenz SEQ ID No. 1 enthält und bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes am 14. November 1994 unter der Nummer I-1491 hinterlegt wurde.
Die vorstehend definierten Nucleotid-Sequenzen können DNA-Sequenzen oder RNA- Sequenzen sein.
Die genaue Größe des Fragments der Sequenz SEQ ID No. 1 ist 604 bp.
Zunächst wurde das Fragment CS1 in einem Hybridisierungstest nach der Southern- Blot-Technik bei genomischen DNAs aus verschiedenen Stämmen der Art C. coli verwendet (C. coli CIP 70.54, C. coli CIP 70.77, C. coli CIP 70.78, C. coli CIP 70.79, C. coli CIP 70.80. C. coli CIP 70.81, C. coli CIP 71,5, C. coli CIP 103753, C. coli A630-klinisches Isolat), die jeweils vom Enzym HindIII, BglII und EcoRV verdaut wurden. Alle Stämme besitzen DNA-Fragmente, die mit der Sonde CS1 hybridisieren. Je nach verwendetem Enzym, HindIII, BglII und EcoRV haben diese Fragmente eine Größe von jeweils 2,3 kb, 3,5 kb oder 2,7 und 6 kb.
In einem weiteren Test vom selben Typ wurde das Fragment CS1 als Sonde für DNA-Ziele verwendet, die aus anderen Arten Campylobacter (Campylobacter jejuni, C. lari, C. fetus subsp. fetus, C. fetus subsp. venerealis, C. hyointestinalis, C. sputorum subsp. sputorum, C. sputorum subsp. bubulus, C. concisus, C. curvus und C. fecalis) oder aus anderen Bakterienarten (Escherichia coli, Arcobacter cryaerophylus, Helicobacter pylori, Salmonella typhimurium) stammen. Diese DNA-Ziele wurden vom Enzym HindIII verdaut. Eine bedeutsame Hybridisierung mit DNA von C. coli (positive Probe) wurde nach 3 Stunden Autoradiographie beobachtet. Nach 24 Stunden Exposition ist ein leichtes Signal sichtbar, das von der DNA von C. jejuni stammt. Diese leichte Kreuzhybridisierung ist nicht unerklärlich, weil 30 bis 50% Homologie im Genom zwischen C. jejuni und c. coli bestehen. Das Fragment CS1 hybridisiert mit keiner der anderen getesteten DNAs. Kein anderes Signal war auf der Autoradiographie sichtbar, sogar nach sehr langen Expositionszeiten (72 Stunden).
Die Sequenz SEQ ID No. 1 von Teilen oder damit äquivalente funktionelle Varianten davon können in molekularen Hybridisierungstechniken zum Nachweis und zur Identifikation von Campylobacter coli verwendet werden.
Die funktionell äquivalenten Varianten umfassen Sequenzen, in denen Basenpaare mutiert, Deletionen eingeführt, Basenpaare insertiert oder substituiert wurden, ohne daß die für die Spezifität dieser Fragmente wesentlichen Eigenschaften beeinträchtigt wurden.
Die Nucleotid-Sequenzen gemäß der Erfindung haben diagnostische und epidemologische Anwendungen in der Human- oder Veterinärmedizin, insbesondere als spezifische Nucleinsäure-Sonden für Campylobacter coli oder als Oligonucleotid-Primer zur Amplifikation einer spezifischen Sequenz von Campylobacter coli.
Die erfindungsgemäßen Sonden umfassen vorteilhafterweise mindestens 20 aufeinanderfolgende Nucleotide von den oben genannten Sequenzen oder Sequenz- Fragmenten.
Die Sonden sind DNA-Sonden oder RNA-Sonden.
Die in dieser Erfindung beschriebenen Nucleotid-Sequerzen können auch als Sonden zum spezifischen Nachweis auf direkte Weise von Stämmen von Campylobacter coli in einer biologischen Probe verwendet werden. Die nicht markierten Sequenzen können direkt als Sonden verwendet werden, während die Sequenzen im allgemeinen mit einem radioaktiven Element (³²P, ³&sup5;S, ³H, ¹²&sup5;I) oder durch ein nicht radioaktives Molekül markiert werden (Biotin, Acetylaminofluoren, Digoxigenin, 5-Bromo-Desoxyuridin), um für zahlreiche Anwendungen einsetzbare Sonden zu erhalten.
Im letzteren Fall kann man eine der Markierungsmethoden verwenden, die in FR 2 422 956 und FR 2 518 755 beschrieben sind. Die Hybridisierungstechnik kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden (Matthews, J. A. und Kricka, L. J., Anal. Biochem. 1988, 169, 1 bis 25). Die allgemeinste Methode besteht in der Immobilisierung der aus Zellen von Campylobacter extrahierten Nucleinsäuren auf einem Träger (Nitrocellulose, Nylon, Polystyrol, ...) und in der Inkubation der immobilisierten Nucleinsäure unter gut definierten Bedingungen mit der Sonde. Nach der Hybridisierung wird der Überschuß der Sonde entfernt, und die gebildeten Hybrid-Moleküle werden durch eine geeignete Methode nachgewiesen (Messung der Radioaktivität, der Fluoreszenz oder der mit der Sonde zusammenhängenden enzymatischen Aktivität).
In einer weiteren Anwendung können die hier beschriebenen Nucleinsäuresonden als Fängersonden verwendet werden. In diesem Verfahren wird die Sonde auf einem Träger immobilisiert und dient zum Abfangen durch spezifische Hybridisierung des aus C. coli extrahierten Nucleinsäureziels. Falls notwendig, wird der feste Träger von der Probe abgetrennt, und der zwischen der Fänger-Sonder und dem Nucleinsäure-Strang gebildete Duplex wird anschließend mit Hilfe einer zweiten Nachweissonde nachgewiesen, die mit einem leicht nachweisbaren Element markiert ist.
Wenn eine ausreichende Menge der Nucleinsäure von Campylobacter coli aus der zu analysierenden Probe extrahiert werden kann, können die im Patent beschriebenen Sequenzen zum direkten Nachweis und zur Identifikation der zu Campylobacter coli gehörenden Stämme in diesen Proben verwendet werden. Im gegenteiligen Fall kann eine Schnellkultur in flüssigem Medium vor Extraktion der Nucleinsäure von Campylobacter coli durchgeführt werden, oder die kleine aus der Probe extrahierte Menge der Nucleinsäure aus Campylobacter coli kann einer Amplifikationstechnik wie beispielsweise der PCR-Technik unterworfen werden.
Die Sequenz SEQ ID No. 1 und davon abgeleitete Sequenzen können genauso zur Selektion von Oligonucleotid-Primern, insbesondere für die PCR-Technik verwendet werden.
Diese Technik erfordert die Auswahl von Oligonucleotid-Paaren, die das zu amplifizierende Fragment einrahmen (Patent US Nr. 4 683 202). Diese Oligodesoxyribonucleinsäure oder Oligoribonucleinsäure-Primer weisen vorteilhafterweise eine Länge zwischen 18 und 30 und bevorzugt 18 bis 22 Nucleotiden auf. Einer dieser Primer ist komplementär zum Strang (+) der Matrix, und der andere Primer ist komplementär zum Strang (-). Es ist wichtig, daß diese Primer keine Sekundärstruktur oder zueinander komplementäre Sequenz aufweisen. Andererseits muß die Länge der Sequenz jedes Primers so ausgewählt werden, daß diese Primer nicht mit anderen Nucleinsäure hybridisieren, die aus procaryotischen oder eucaryotischen Zellen stammen, insbesondere mit Nucleinsäuren von Campylobacter, die nicht zur Art coli gehören und mit Human-DNA oder -RNA, die die Probe eventuell kontaminieren kann.
Als spezifische Primer für die Amplifikation von Nucleinsäure-Sequenzen von zu Campylobacter coli gehörenden Stämmen selektionierte Amplimere werden beispielsweise durch Befolgen der von Griffais und Coll. (Nucleic Acids Res. 1991, 19, 3887 bis 3891) beschriebenen Methode ausgewählt.
Ausgehend von der Sequenz SEQ ID No. 1 haben die Erfinder Oligonucleotide zur Durchführung eines PCR-Tests ausgewählt. Aufgrund dieser Oligonucleotide haben sie eine spezifische Amplifikation von Campylobacter coli erreicht, wobei keine Amplifikation mit DNA der oben genannten 10 weiteren Campylobacter sichtbar war, insbesondere C. jejuni, und nicht mit DNA aus Escherichia coli, Helicobacter pylori, Salmonella typhimurium, Arcobacter cryaerophilus.
Ein Paar besonders bevorzugte Primer ist durch aus der Sequenz SEQ ID No. 1 stammende Oligonucleotide CSF und CSR dargestellt, mit den Sequenzen:
Primer CSF: &sup5;' ATA TTT CCA AGC GCT ACT CCC C³
Primer CSR: &sup5;' CAG GCA GTG TGA TAG TCA TGG G³
Die durch Genamplifikation mit Hilfe der oben beschriebenen Primer erhaltenen Nucleinsäure-Fragmente stellen ebenfalls einen Gegenstand der Erfindung dar.
Die amplifizierten Fragmente können mit einer Gelelektrophorese auf Agarose oder Polyacrylamid oder nach einer Kapillarelektrophorese oder auch mit einer chromatographischen Technik (Gelfiltration, hydrophobe Chromatographie oder auf Ionenaustauscher) identifiziert werden. Die Spezifität der Amplifikation kann durch molekulare Hybridisierung unter Verwendung der Nucleotid-Sequenz SEQ ID No. 1, Fragmenten davon, diese Sequenzen oder Fragmente davon enthaltenden Plasmide, komplementäre Oligonucleotide dieser Sequenzen oder Fragment-Sequenzen oder Amplifikationsprodukten kontrolliert werden. Diese Sonden können mit radioaktiven Elementen oder mit nicht radioaktiven Molekülen markiert sein oder nicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Nachweisverfahren für die Gegenwart von Stämmen für von Campylobacter coli in einer biologischen Probe, charakterisiert durch die folgenden Schritte:
i) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe mit einem Paar Primer genannten Oligonucleotid-Fragmenten wie vorstehend definiert, wobei die in der Probe enthaltene Nucleinsäure gegebenenfalls zuvor der Hybridisierung zugänglich ich gemacht wurde und unter Bedingungen, die eine Hybridisierung der Primer mit der Nucleinsäure aus den zu Campylobacter coli gehörenden Stämmen ermöglichen;
ii) Amplifikation der Nucleinsäure aus den Stämmen von Campylobacter coli;
iii) Nachweis der Amplifikation der Nucleinsäure-Fragmente, die dem durch die Primer eingefaßten Fragment entsprechen;
iv) gegebenenfalls Feststellung der Sequenz des amplifizierten Fragments, beispielsweise durch Hybridisierung mit spezifischer Sonde, durch Sequenzierung oder durch Analyse der Restriktionsstelle.
Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung e in Kit oder ein Kästchen zum Nachweis der Anwesenheit von Stämmen, die zu Campylobacter coli gehören, in einer biologischen Probe, dadurch charakterisiert, daß es die folgenden Elemente umfaßt:
- ein Paar Oligonucleotid-Fragmente wie zuvor definiert;
- die zur Bewirkung einer Amplifikation der Nucleinsäure der zu Campylobacter coli gehörenden Stämme notwendigen Reagentien;
- gegebenenfalls einen Bestandteil für die Feststellung der Sequenz des amplifizierten Produkts, insbesondere eine Nucleinsäure-Sonde wie zuvor definiert.
Dieses Kit enthält vorteilhafterweise das oder die markierten oder nicht markierten Sonden. Diese können in Lösung oder auf einem Träger immobilisiert vorliegen. Das Kit kann auch die notwendigen Reagentien für die Lyse der Bakterien und die Extraktion der Nucleinsäure-Stränge genau wie die Hybridisierungslösungen und die Waschlösungen entsprechend der gewählten Methode enthalten.
Die Erfindung wird im größeren Detail in den folgenden Beispielen und den beigefügten Figuren dargestellt, von denen:
- Fig. 1 die Hybridisierungsprofile von DNAs aus verschiedenen Stämmen von C. coli mit dem als Sonde verwendeten Fragment CS1 darstellen;
- Fig. 2 die nach Amplifikation durch PCR mit dem Primerpaar CSF und CSR erhaltenen Ergebnisse der Elektrophorese darstellt.

Beispiel 1

Konstruktion der Genbank von C. coli, Screenen der Bank und Bestimmung der Sequenz des spezifischen Fragments:
Die genomische DNA aus C. coli CIP 70.80 wird partiell von der Restriktionsendonuclease HindIII verdaut, indem 0,5U Enzym pro ug DNA im vom Hersteller empfohlenen Puffer während einer Stunde bei 37ºC einwirkt. Diese Bedingungen ermöglichen die bevorzugte Herstellung von Fragmenten mit einer Länge zwischen 30 und 40 kb. Nach Verdauen wird die die DNA-Fragmente enthaltende Mischung durch Extraktion mit Phenol/Chloroform gereinigt, und die DNA wird mit Ethanol ausgefällt.
Der Vektor ist das Cosmid pHC79. Er wird durch das Enzyl HindIII verdaut und zur Vermeidung jeder Autoligation dephosphoryliert.
Die Ligation wird durch Mischen von 700 ng des Vektors und 3 ug der DNA- Fragmente von 30/40 kb bewirkt, die Mischung wird bei 12ºC während 18 Stunden stehengelassen, nachdem man 5 Einheiten T4 DNA-Ligase in einem geeigneten Puffer zugegeben hat.
Die rekombinanten Cosmide werden in vitro eingekapselt und zur Transformation der Bakterien (E. coli HB 101) verwendet. Die transformierten Bakterien werden während einer Stunde bei 37ºC in LB-Medium transformiert, und anschließend auf einem selektiven Agarmedium, enthaltend 25 ug/ml Ampillicin, ausgestrichen. Die gegen Ampillicin resistenten Kolonien werden alle hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit gegen Tetracylin getestet, in der Tat wird das DNA-Fragment von 30/40 kb in den Vektor so insertiert, daß es das Resistenzgen für Tetracylin (Tet) inaktiviert und das Resistenzgen für Ampillicin (Amp) erhält.
Aus den ersten Transformanten-Kolonien, die gegen Ampillicin resistent (Ampr) und gegen Tetracyclin empfindlich sind (TetS), wird nach der Techmik der alkalischen Lyse eine Mini-Präparation von DNA durchgeführt. Die DNA aus diesen Präparationen wird anschließend durch die Restriktionsendonucleas HindIII verdaut, durch Agarosegelelektrophorese 0,8% analysiert und anschließend auf Nylonfilter übertragen. Die DNA wird auf irreversible Weise durch 3 Minuten Bestrahlung mit UV bei 254 nm fixiert.
Diese verschiedenen Filter werden während 16 bis 18 Stunden bei 65ºC in einem Puffer 6X SSC (1X SSC entspricht 0,15M NaCl und 0,015M Natriumcitrat), enthaltend 10 % Dextransulfat, eine Denhardt-Lösung 5-fach konzentriert (eine Denhardt-Lösung 1X entspricht 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und 0,02% Rinderserumalbumin), 10 mM EDTA, 0,5% SDS, 100 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA und mit ³²P durch Multipriming radiomarkierte genomische DNA einer der beiden folgenden Arten: C. jejuni CIP 70.2, C. coli CIP 70.80 inkubiert.
Nach Hybridisierung werden die Filter zweimal 10 Minuten in 2X SSC bei 65ºC, einmal während 30 Stunden in 2X SSC + 0,1% SDS bei 65ºC und schließlich einmal während 10 Minuten mit 0,1X SCC bei 65ºC gewaschen. Die noch feuchten Filter werden einer Autoradiographie bei -80ºC mit einem Intensivierungsschirm während 15 Minuten bis 3 Tagen unterworfen.
Die Ergebnisse dieser Hybridisierungen ermöglichten die Isolierung eines kosmidischen Klons, der ein CS1 genanntes Fragment von ungefähr 2,3 kb enthielt.
Die Spezifität des Fragments wurde verifiziert wie in Beispiel 2 beschrieben.
Das Fragment CS1 wurde nach der Methode von Sanger unter Verwendung des Sequenzierungskits "T7 Sequencing kit" (Pharmacia) direkt auf dem Cosmid sequenziert, nach alkalischer Denaturierung der beiden DNA-Stränge. Alle Sequenzierungsreaktionen wurden mit durch ³&sup5;S markiertem dATP durchgeführt.
Der sequenzierte Teil (600 Basenpaare) des Fragments ist in der der Beschreibung beigefügten Liste dargestellt. Der Vergleich zwischen den Datenbanken "Genebank" und "EMBL" und den 600 Nucleotiden des so bestimmten Fragments CS1 läßt keinerlei signifikante Homologie mit den bisher bekannten Sequenzen erkennen.

Beispiel 2:

DNA-Analyse durch Southern-Technik unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Sequenzen als Sonden:
Die Liste und die Referenzen der verwendeten Bakterien in dieser Untersuchung sind die folgenden:

Campylobacter:

C. jejuri subsp. jejuni CIP 70.2, CIP 70.86 CIP 81.1
C. jejuni subsp. doylei CIP 103751
C. coli CIP 70.80, CIP 71.5, CIP 70.81, CIP 70.79, CIP 70.78, CIPI 70.77, CIP 70.54
C. lari CIP 102722
C. upsaliensis CIF 103681
C. fetus subsp. fetus CIP 5395
C. fetus subsp. venerealis CIP 6829
C. hyointestinalis (isolat clinique)
C. sputorum subsp. sputorum CCUG 9728
C. sputorum subsp. bubulus CIP 53103
C. concisus (isolat clinique)
C. fecalis CIP 12014
C. Curvus (isolat clinique)

Nicht-Campylobacter:

Arcobacter cryaerophila CCUG 17801
Helicobacter pylori CIP 101260
Escherichia coli HB101
Salmonella subsp. typhimurium C 53
Salmonella subsp. salamae
Salmonella subsp. diarizonae
Enterococcus fecalis JH2-SM
Enterococcus faecium D372 (klinisches Isolat)
Bacteroides fragilis E134 (klinisches Isolat)
Bacteroides fragilis F238 (klinisches Isolat)
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, wobei die Nummer der Bahnen in der Reihenfolge den oben aufgezählten Stämmen entspricht.

DNA von Bakterien, die zur Art Campylobacter gehören, außer C. coli:

Nach Kultur in geeignetem Medium (Gelose aus Schaffblut 5%, Biomérieux) werden Campylobacter auf die folgende Art behandelt: die Bakterien aus jeder Petrischale werden mit 2 ml Puffer TE-Glukose (Tris-HCl pH 8 25 mM, EDTA 10 mM, Glukose 50 mM) geerntet, während 5 Minuten bei 5000 g zentrifugiert, der Niederschlag wird redispergiert und in TE-Glukose gewaschen und anschließend erneut zentrifugiert, die Bakterien werden in 100 ul Puffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) resuspendiert, und die DNA wird nach der Technik von Pitcher et al. extrahiert (Lett. Appl. Microbiol., 1989, 8, 151 bis 156). Zwei, ug der so extrahierten DNA werden einer vollständigen Verdauung durch das Enzym HindIII unterworfen. Die erhaltenen Fragmente werden anschließend durch Agarosegel 0,8% in TAE getrennt, vor Transferieren auf eine Nylon-Membran nach der Southern-Technik.
Die transferierten Fragmente werden durch molekulare Hybridisierung analysiert. Die Sonde CS1, markiert mit ³²P, weist spezifisch die DNA aus C. coli nach und hybridisiert nicht mit der genomischen DNA von anderen Campylobacter, mit Ausnahme einer sehr leichten Hybridisierung mit einem auf dem Genom von C. jejuni angeordneten DNA- Fragment. Diese Kreuzhybridisierung ist erst nach 18 Stunden Belichtung nachweisbar, während die DNA aus C. coli nach 3 Stunden Belichtung nachweisbar ist.

DNA von Bakterien, die nicht zur Art Campylobacter gehören:

Die DNA dieser Bakterien und die als positive Kontrolle verwendete aus C. coli wurde durch das Restriktionsenzym HindIII hydrolysiert, anschließend wurden die Fragmente durch Agaroseelektrophorese getrennt und auf eine Nylon-Membran Hybond-N transferiert. Diese verschiedenen DNA-Fragmente werden durch molekulare Hybridisierung analysiert, indem als Sonde das mit ³²P markierte Fragment CS1 verwendet wurde, nach der Technik des Kits "Random primed DNA labelling" (Boehringer). Die Autoradiographie zeigt, daß die einzige nachgewiesene Art C. coli ist. Keine Hybridisierung ist mit der DNA von Nicht- Campylobacter-Arten nachweisbar, sogar nach 72 Stunden Belichtung.

Beispiel 3:

Enzymatische in vitro Amplifikation von DNA aus C. coli mit definierten Primern ausgehend von der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Sequenz.

Auswahl der Primer:

Es wurde gezeigt, daß es im wesentlichen das 3'-Ende der Oligonucleotid-Primer ist, das die Spezifität der PCR bestimmt. Es ist daher wichtig, daß diese 3'-Region perfekt spezifisch für das zu amplifizierende Ziel ist.
Bei der gegebenen Tatsache, daß das Genom von Campylobacter einen sehr geringen prozentualen Anteil von Guanin und Cytosin enthält (zwischen 28 und 38% G + C) haben die Erfinder gedacht, daß Primer, deren 3'-Ende reich an G + C ist, einen bedeutenden Grad an Spezifität zeigen könnten.
Mit Hilfe eines Informatik-Programms, haben die Erfinder im Inneren der Sequenz CS1 an G + C reiche Zonen gesucht, die ein einziges Mal in CS1 vorhanden sind. Ausgehend von diesen Regionen wurde die Sequenz der Primer orientiert und so vervollständigt, daß sie eine Länge von ca. 20 Nucleotiden erhielt.

Synthese von Oligonucleotid-Primern:

Die von der Sequenz CS1 abgeleiteten Primer, CSF und CSR genannt und mit einer Länge von 22 Nucleotiden, wurden mit Hilfe einer Phosphoramidit-Methode in einem Automaten durch den Service de Chimie organique des Institut Pasteur synthetisiert. Die Konzentration jedes Primers wird im Spektrophotometer bestimmt.

Amplifikation:

Die Technik der enzymatischen Amplifikation in vitro (PCR) wird nach dem von Saiki et al (Science, 1988, 239, 487 bis 491) beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 1 uM der Oligonucleotide CSF und CSR und 30 bis 100 ng DNA von verschiedenen Stämmen von Campylobacter mit 0,5 Einheiten Taq-Polymerase in einem Puffer durchgeführt, der 25 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,5 1,5 mM MgCl&sub2;, 200 uM Desoxyribonucleotid-Triphosphate und 100 ug/ml Rinderserumalbumin enthält, wobei das Endvolumen der Reaktion 50 ul beträgt. Die Parameter der Schritte der PCR werden auf die folgende Weise ausgewählt: 5 Minuten bei 94ºC, 1 Minute bei 60ºC, 1 Minute bei 72ºC, anschließend (1 Minute bei 94ºC, 1 Minute bei 60ºC, 1 Minute bei 72ºC) 38 mal und in einem letzten Zyklus 1 Minute bei 94ºC, 1 Minute bei 60ºC, 5 Minuten bei 72ºC. 40 Zyklen wurden so unter Verwendung eines automatischen Apparates durchgeführt. Nach dem letzten Zyklus werden die Proben bis zur Analyse bei 4ºC gehalten.

Elektrophoretische Analyse der amplifizierten Proben auf einem Agarosegel:

Zehn ul der amplifizierten Proben werden auf einem Agarosegel in 2% in einem TBE-Puffer (0,04 M Tris-Borat, 0,002M EDTA) aufgetragen, der 1 ug/ml Ethidiumbromid enthält. Die amplifizierten Fragmente werden unter UV sichtbar gemacht, und die Gele werden unter Verwendung eines Films Polaroid 667 photographiert.
Die mit den DNAs aus verschiedenen Art von Campylobacter und den Primern CSF und CSR erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Länge des erhaltenen amplifizierten Fragments der theoretischen Länge entspricht, die mit diesem Primerpaar erwartet wird und die 258 Basenpaare beträgt.
Zusätzlich zu diesen Ergebnissen war kein amplifiziertes Fragment sichtbar, wenn die analysierte DNA aus den folgenden Arten oder Familien extrahiert wird: C. jejuni. subsp. jejuni, C. jejuni subsp. doylei, C. lari, C. upsaliensis, C. fetus. subsp. fetus, C. fetus subsp. venerealis, C. hyointestinalis, C. cryaerophila, C. sputorum subsp. sputorum, C. sputorum subsp. bubulus, C. fecalis, C. concisus, C. curvus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Arcobacter cryaerophilus, Salmonella subsp. salamae, Salmonella subsp. diarizonae, Enterococcus fecalis, Enterococcus faecium, Bacteroides fragilis oder Human-Zellen. Alle getesteten Stämme von C. coli ergaben positive Ergebnisse, egal ob es sich um Stämme aus einer Sammlung oder Isolate aus Kranken handelt.
Als Zusammenfassung hat die Gesamtheit dieser Ergebnisse gezeigt, daß mit Hilfe der PCR-Technik und den in dieser Erfindung beschriebenen Primern möglich ist, spezifisch die Art C. coli nachzuweisen, was vermuten läßt, daß Isolate aus Kranken und biologische Proben, die mit C. coli infiziert sind, identifiziert werden können, was die Methode auf dem Gebiet der klinischen Bakteriologie, der Veterniärmedizin und in der Agro-Nahrungsmittel- Industrie verwendbar macht.

Sequenzprotokoll

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder:
(A) Name: Institut Pasteur
(B) Straße: 28 Rue de Docteur Roux
(C) Stadt: Paris
(E) Land: Frankreich
(F) Postleitzahl: 75724
(G) Telefon: 45688093
(H) Telefax: 40613017
(ii) Titel der Erfindung: Mit einer genomischen Nucleinsäure-Sequenz aus Campylobacter coli spezifische hybridisierende Nucleotid-Sequenz
(iii) Anzahl der Sequenzen: 3
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Trägertyp: Diskette
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatenIn Release £1.0, Version £1.25 (EPA)
(v) Daten der vorliegenden Anmeldung: Anmeldenummer: WO PCT/FR95/01491
(2) Information für SEQ ID No. 1:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 604 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Anzahl der Stränge: doppelt
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(iv) Ursprung:
(A) Organismus: CS1
(C) Isoliertes Individuum: Campylobacter coli
(G) Zelltyp: Bakterium
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID No. 1:
(2) Information für SEQ ID No. 2:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 22 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID No. 2: ATATTTCCAA GCGCTACTCC CC 22
(2) Information für SEQ ID No. 3:
(i) Eigenschaften der Sequenz:
(A) Länge: 22 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID No. 3: CAGGCAGTGT GATAGTCATG GG 22

Claims

1. Nucleinsäuresequenz, die spezifisch mit einer genomischen Nucleinsäure der Stämme, die der Spezies Campylobacter coli angehören, hybridisiert, und die unter üblichen Bedingungen weder mit einer Nucleinsäure von Campylobakterien, die dieser Spezies nicht angehören, noch mit einer genomischen Nucleinsäure von Bakterien, die der Gattung Campylobacter nahestehen, hybridisiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, die dazu komplementäre Sequenz oder eine Sequenz aufweist, die sich davon durch Mutation, Insertion, Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Basen unterscheidet.

2. Klonierungsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 aufweist.

3. Plasmid, hinterlegt bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes am 14. November 1994 unter der Nr. I-1491.

4. Nucleinsonde, spezifisch für Nucleinsäuren von Campylobacter coli, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 20 aufeinanderfolgende Nucleotide aufweist, ausgewählt aus den Nucleotidsequenzen nach Anspruch 1.

5. Nucleinsonde gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie an einem Träger immobilisiert ist und als Abfangsonde verwendet wird.

6. Oligonucleotidische Primerpaare, spezifisch für die Amplifikation einer Nucleinsequenz von Campylobacter coli, dadurch gekennzeichnet, daß sie Oligonucleotidpaare mit 18 bis 30 Nucleotiden, vorzugsweise 18 bis 22 Nucleotiden, ausgewählt aus den Sequenzen nach Anspruch 1, umfassen.

7. Oligonucleotidisches Primerpaar, spezifisch für die Amplifikation einer Nucleinsequenz von Campylobacter coli gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es gebildet wird aus Oligonucleotidpaaren der Sequenzen:

5'ATA TTT CCA AGC GCT ACT CCC C3'

5'CAG GCA GTG TGA TAG TCA TGG G3'

8. Nucleinsäurefragment, erhalten durch Amplifikation einer Nucleinsäure von C. coli mittels einer Gen-Amplifikationtechnik, insbesondere mit der PCR-Technik mittels eines oligonucleotidischen Primerpaares nach Anspruch 6 oder 7.

9. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Carrpylobacter coli in einer biologischen Probe, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einem Primerpaar gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die Nucleinsäure von Campylobacter coli, die in der biologischen Probe enthalten ist, gegebenenfalls vorher für eine Hybridisierung zugänglich gemacht wurde, und unter Bedingungen, die eine Hybridisierung der Primer zu der Nucleinsäure, die Campylobacter coli angehört, ermöglichen;

b) Amplifikation der zu Campylobacter coli gehörenden Nucleinsäure;

c) Darstellung der Amplifikation der Nucleinsäurefragmente von Campylobacter coli, die dem durch die Primer umfaßten Fragment entsprechen;

d) gegebenenfalls Feststellung der Sequenz des amplifizierten Fragments, beispielsweise durch Hybridisierung mit spezifischer Sonde, durch Sequenzierung oder durch Analyse der Restriktionsstelle.

10. Kit zur Feststellung der Anwesenheit von Campylobacter coli in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Elemente umfaßt:

- ein Primerpaar nach Anspruch 6 oder 7;

- die zur Erwirkung einer Amplifikation einer Nucleinsäure von Campylobacter coli notwendigen Reagenzien;

- gegebenenfalls einen Bestandteil der die Feststellung der Sequenz des amplifizierten Fragments ermöglicht, insbesondere eine Nucleinsonde nach Anspruch 4 oder 5.