DE69424076T2 - Verfahren zum Nachweisen von Luciferase - Google Patents

Verfahren zum Nachweisen von Luciferase

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich allgemein auf die Stabilisierung der Luziferase-katalysierten Lumineszenz. Ebenso bezieht sie sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Verlängerung der Lebensdauer der Lumineszenzreaktion. Die Erfindung umfasst auch Assay-kits zum Nachweis eines exprimierten Luziferasegens, das bei Reportergentechniken verwendet wird.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Luziferasen werden bei einer weiten Vielfalt von Organismen gefunden, einschließlich Leuchtkäfern, Photobakterien, Quallen und vielen anderen. Luziferasen sind Enzyme, die die Erzeugung von Licht durch Oxidieren von Luziferin zu Oxyluziferin in einem Prozess katalysieren, der allgemein als Biolumineszenz bekannt ist.
  • Die Erzeugung von Photonen durch Luziferase geschieht in einer zweistufigen Reaktion, welche Luziferin, Adenosintriphosphat (ATP) und O&sub2; verbraucht. In der ersten Stufe katalysiert Luziferase die Bildung von Luziferyladenylat aus Luziferin und ATP. In dieser ersten Stufe wird Pyrophosphat freigesetzt und ein Mg²&spplus;-Cofaktor oder ein anderes divalentes Kation ist für die eigentliche Luziferasefunktion erforderlich. Nach Bildung verbleibt Luziferyladenylat innerhalb der aktiven Stellen der Luziferase. In der nächsten Stufe oxidiert Luziferase Luziferyladenylat zu einem Elektronenangeregten Oxyluziferin unter Verbrauch von Sauerstoff. Die Lichterzeugung tritt ein, wenn das Elektronen-angeregte Oxyluziferin zum Oxyluziferin im Grundzustand abfällt. Der Abfall vom angeregten Zustand in den Grundzustand geschieht begleitet von der Emission eines Photons. Die Farbe des erzeugten Lichts ist verschieden, je nach der Quelle der Luziferase und scheint durch Unterschiede in der Struktur der verschiedenen Luziferasen bestimmt zu sein. Ein Beispiel für ein Verfahren, das das Luziferasesystem verwendet, ist in der EP-A-0015 437 offenbart.
  • Luziferasen sind neuerdings bei der Reportergentechnik nützlich geworden. Bei dieser Technik wird ein Reportergen, wie ein Luziferase kodierendes Polynucleotid, als Indikator für die Transkription und Translation eines Gens in einem zellulären Expressionssystem verwendet. Das Reportergen ist mit einem Promotor operativ gekoppelt, der vom zellulären Expressionssystem erkannt wird. Andere gewöhnlich verwendete Reportergene schließen β-Galaktosidase und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) ein. Bei einem typischen Peportergen-Assay wird ein DNA-Vektor, der das Reportergen enthält, in eine zur Expression des Reportergens befähigte Zelle mittels Transfektion eingeschleust, die zu einer Exprimierung des Reportergens befähigt ist. Nachdem eine für die Expression des Reportergens ausreichende Zeit verstrichen ist, wird die Zellmembran zur Freisetzung des exprimierten Genprodukts aufgebrochen. Die für die katalytische Reaktion des Reportergens benötigten Reagentien werden daraufhin der Reaktionslösung zugesetzt und es wird die enzymatische Aktivität des Reportergens bestimmt. Alternativ kann die Zelle in Gegenwart aller zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Reportergens notwendigen Reagentien aufgebrochen werden. Wenn ein β-Galaktosidase kodierendes Polynucleotid als Reportergen verwendet wird, wird die Hydrolyse eines Galaktosides bestimmt. Wenn ein Chloramphenicol-Acetyltransferase kodierendes Polynucleotid als Reportergen verwendet wird, wird die Erzeugung eines acetylierten Chloramphenicols bestimmt. Wenn Luziferase als Reportergen verwendet wird, werden die bei der Luziferase-Luziferin-Reaktion erzeugten Photonen gemessen.
  • Ein Hauptproblem bei der Bestimmung der Expression eines Luziferasegens als ein Reportergen ist die kurze Dauer der Photonenerzeugung. Typischerweise nimmt die Luziferase-katalysierte Photonenerzeugung innerhalb weniger Sekunden ab. Möglichkeiten zur Verlängerung des Zeitraumes der Photonenerzeugung sind intensiv gesucht worden. Neuerdings kann mit einem im Handei erhältlichen Kit der Promega Corporation (Madison, Wi) die Halbwertszeit der Luziferase-katalysierten Photonenerzeugung grob auf fünf Minuten ausgedehnt werden. Trotzdem stellt für die Messung einer großen Zahl von Proben die Luziferase-katalysierte Photonenerzeugung mit einer Halbwertszeit von nur fünf Minuten keine realisierbare Alternative dar. Wie sie hier benutzt wird, bedeutet die Halbwertszeit diejenige Zeit, die es braucht, damit die Photonenerzeugung auf die Hälfte abnimmt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Steigerung der Dauer einer nachweisbaren Photonenemission einer Luziferase-Luziferin- Reaktion zur Verfügung.
    • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • In einer Hinsicht liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verlängerung der Dauer der Photonenemission einer Luziferase-Luziferin-Reaktion. Bei einer Ausführungsform wird ein Reaktionsgemisch, das Luziferase, Luziferin, ATP, und die für die katalytische Aktivität der Luziferase erforderlichen Cofaktoren enthält, mit einer Zusammensetzung vermischt, die Adenosinmonophosphat, einen Radikalfänger und einen Chelatbildner zur Bildung einer Beimischung enthält. Die durch die Luziferase-Luziferin-Reaktion erzeugten Photonen werden dann durch Messung der Lumineszenz der Beimischung nachgewiesen. Die Luziferase-katalysierte Photonenerzeugung kann in einem Zeitraum von mehr als fünf Minuten nachgewiesen werden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthalten 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat (ATP), Cofaktoren für die katalytische Luziferaseaktivität, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat (AMP), etwa 385 mg Dithiothreitol (DTT) und etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
  • Bei einer anderen Ausführungsform kann die Menge einer Komponente der Beimischung verändert sein, wohingegen die Mengen aller anderen Bestandteile unverändert bleiben. Beispielsweise kann die Menge des Luziferins in 100 ml Beimischung zwischen etwa 0,2 bis etwa 30 mg verändert sein, während die Mengen des ATP bei etwa 110 mg, des AMP bei etwa 2,2 mg, des DTT bei etwa 385 mg und EDTA bei etwa 20 mg gehalten werden. In ähnlicher Weise können die Bestandteile folgendermaßen individuell verändert sein: In 100 ml Beimischung kann die Menge des Luziferins von etwa 0,2 bis etwa 30 mg verändert sein; die Menge des ATP von etwa 10 bis 300 mg verändert sein; die Menge des AMP von etwa 0,2 bis 30 mg verändert sein; die Menge des DTT kann verändert sein von etwa 200 bis etwa 2000 mg und die Menge des EDTA kann verändert sein zwischen etwa 10 und etwa 50 mg.
  • Bei einer anderen Ausführungsform beabsichtigt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von Luziferase in einer biologischen Probe. Die biologische Probe mit einem angenommenen Gehalt an Luziferase wird mit einer Reaktionsmischung vermischt, die Luziferin, Adenosintriphosphat, die für die katalytische Luziferaseaktivität erforderlichen Cofaktoren, Adenosinmonophosphat, Dithiothreitol, Ethylendiamintetraessigsäure, Phenylessigsäure, Oxalsäure und ein Detergens zur Bildung einer Beimischung enthält. Die durch die Luziferase-Luziferin-Reaktion erzeugten Photonen werden durch Messung der Lumineszenz der Beimischung nachgewiesen.
  • Mit einer bevorzugten Ausführungsform beabsichtigt die vorliegende Erfindung eine Beimischung für den Nachweis von Luziferase in einer biologischen Probe. Einhundert ml einer Beimischung enthalten etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure und etwa 0,85 mg Oxalsäure.
  • Bei einer anderen Ausführungsform kann die Menge einer der Komponenten der Beimischung verändert sein, während die Mengen aller anderen Bestandteile unverändert bleiben. Zum Beispiel kann die Menge des Luziferins in 100 ml Beimischung zwischen etwa 0,2 und etwa 30 mg verändert sein, während die Menge des ATP bei etwa 110 mg, des AMP bei etwa 2,2 mg, des DTT bei etwa 385 mg, der EDTA bei etwa 20 mg, der Phenylessigsäure bei etwa 4,5 mg und der Oxalsäure bei etwa 0,85 mg gehalten wird. In ähnlicher Weise können die Bestandteile individuell folgendermaßen verändert sein: In 100 ml der Beimischung kann die Menge des Luziferins von etwa 0,2 bis etwa 30 mg verändert sein; die Menge des ATP von etwa 10 bis etwa 300 mg verändert sein; die Menge des AMP kann verändert sein von etwa 0,2 bis etwa 30 mg; die Menge des DTT kann verändert sein von etwa 200 bis etwa 2000 mg und die Menge EDTA kann verändert sein von etwa 10 bis etwa 50 mg; die Menge Phenylessigsäure kann verändert sein von etwa 1 bis etwa 10 mg und die Menge der Oxalsäure kann verändert sein von etwa 0,2 bis etwa 5 mg.
  • In einer anderen Hinsicht beabsichtigt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung für den Nachweis des Vorkommens von Luziferase in biologischen Proben durch Nachweis emittierter Photonen aus der Luziferase-Luziferin-Reaktion. Einhundert ml dieser Zusammensetzung enthalten etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure, etwa 0,85 mg Oxalsäure und etwa 4 g Triton.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt die Auswirkungen einer Veränderung der AMP-Konzentration auf die Luziferase-Luziferin-Lichterzeugung.
  • Fig. 2 zeigt die Auswirkungen einer Veränderung der DTT-Konzentration auf die Luziferase-Luziferin-Lichterzeugung.
  • Fig. 3 zeigt die Auswirkungen einer Veränderung der DTT- und der AMP- Konzentrationen auf die Luziferase-Luziferin-Lichterzeugung.
  • Fig. 4 zeigt die Auswirkungen verschiedener Reagentien auf die Luziferase- Luziferin-Reaktion.
  • Fig. 5 zeigt die Lichterzeugung eines Reportergen-Assays unter Verwendung einer klonierten Luziferase.
  • Fig. 6 zeigt, dass die Verbindung A entweder ein unspezifischer Inhibitor des HIV-rev Regulatorproteins oder für die Zellen toxisch ist.
  • Fig. 7 zeigt, dass die Verbindung B ein spezifischer Inhibitor des HIV-rev Regulatorproteins ist.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Luziferase katalysiert die Oxidation des Luziferins begleitet von der Emission der Photonen. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zu Verlängerung der Dauer der nachweisbaren Photonenemission einer Luziferase- Luziferin-Reaktion zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung stellt eine Luziferase- Luziferin-Reaktion zur Verfügung, in der die Lichterzeugung für mehr als fünf Minuten nachgewiesen werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Photonenemission einer Luziferase-Luziferin-Reaktion bis zu und einschließlich acht Stunden nachgewiesen werden. Bei einer anderen Ausführungsform ist die Photonenemission aus der Luziferase-Luziferin-Reaktion bis zu 8 Stunden linear (siehe Fig. 1-5).
  • Bei einer Ausführungsform wird ein Reaktionsgemisch, das Luziferase, Luziferin, ATP, und die für die katalytische Aktivität der Luziferase erforderlichen Cofaktoren enthält, mit einer Zusammensetzung vermischt, die Adenosinmonophosphat, einen Radikalfänger und einen Chelatbildner zur Bildung einer Beimischung enthält. Die durch die Luziferase-Luziferin-Reaktion erzeugten Photonen werden dann durch Messung der Lumineszenz der Beimischung nachgewiesen. Die Luziferase-katalysierte Photonenerzeugung kann gemäß den durch die Erfindung offenbarten Methoden und Zusammensetzungen in einem Zeitraum von mehr als fünf Minuten nachgewiesen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Photonenemission für mehr als dreissig Minuten und bis zu acht Stunden nachgewiesen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform fällt die Photonenemission bis zu acht Stunden linear ab, wie in den Fig. 1-3 gezeigt.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Beimischung für die Luziferase-Luziferin-Reaktion zur Verfügung. Einhundert ml der Beimischung enthalten etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol und etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure.
  • Bei einer anderen Ausführungsform kann die Menge einer Komponente der Beimischung verändert sein, wohingegen die Mengen aller anderen Bestandteile unverändert bleiben. Beispielsweise kann die Menge des Luziferins in 100 ml Beimi schung zwischen etwa 0,2 bis etwa 30 mg verändert sein, während die Menge des ATP bei etwa 110 mg, des AMP bei etwa 2,2 mg, des DTT bei etwa 385 mg und EDTA bei etwa 20 mg gehalten werden. In ähnlicher Weise können die Bestandteile folgendermaßen individuell verändert sein: In 100 ml Beimischung kann die Menge des Luziferins von etwa 0,2 bis etwa 30 mg verändert sein; die Menge des ATP von etwa 10 bis 300 mg verändert sein; die Menge des AMP von etwa 0,2 bis 30 mg verändert sein; die Menge des DTT kann verändert sein von etwa 200 bis etwa 2000 mg und die Menge der EDTA kann verändert sein zwischen etwa 10 und etwa 50 mg. Beispielsweise beabsichtigt die vorliegende Erfindung eine Beimischung der folgenden Zusammensetzung: 100 ml der Beimischung enthalten etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, zwischen etwa 0,2 bis etwa 35 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol und etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure. Andere Beimischungen in denen nur ein Bestandteil in Übereinstimmung mit oben offenbarten Limitierungen verändert ist, sind beabsichtigt.
  • In anderer Hinsicht beabsichtigt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von Luziferase in einer biologischen Probe. Die biologische Probe mit einem angenommenen Gehalt an Luziferase wird mit einer Reaktionsmischung vermischt, die Luziferin, Adenosintriphosphat, die für die katalytische Luziferaseaktivität erforderlichen Cofaktoren, Adenosinmonophosphat, Dithiothreitol, Ethylendiamintetraessigsäure, Phenylessigsäure, Oxalsäure und ein Detergens zur Bildung der Beimischung enthält. Die durch die Luziferase-Luziferin-Reaktion erzeugten Photonen werden dann durch Messung der Lumineszenz der Beimischung nachgewiesen. Eine bevorzugte biologische Probe ist eine Zelle, die Luziferase produziert. Ein beispielhaftes Detergens ist Triton N101. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung, mit denen das Vorkommen von Luziferase in der biologischen Probe durch den Nachweis emittierter Photonen für mehr als fünf Minuten nachgewiesen werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Photonenemission für mehr als dreissig Minuten und bis zu acht Stunden nachgewiesen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform fällt die Photonenemission bis zu acht Stunden linear ab, wie in den Fig. 1 bis 3 gezeigt.
  • Mit einer bevorzugten Ausführungsform beabsichtigt die vorliegende Erfindung eine Beimischung zum Nachweis des Vorkommens von Luziferase in einer biologischen Probe. Einhundert ml der Beimischung enthalten etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol; etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure, etwa 0,85 mg Oxalsäure und ein Detergens.
  • Bei einer anderen Ausführungsform kann die Menge einer der Komponenten der Beimischung verändert sein, wohingegen die Mengen aller anderen Bestandteile unverändert bleiben. Beispielsweise kann die Menge des Luziferins in 100 ml Beimischung zwischen etwa 0,2 bis etwa 30 mg verändert sein, während die Mengen des ATP bei etwa 110 mg, des AMP bei etwa 2,2 mg, des DTT bei etwa 385 mg und EDTA bei etwa 20 mg, Phenylessigsäure bei etwa 4,5 mg und Oxalsäure bei etwa 0,85 mg gehalten werden. In ähnlicher Weise können die Bestandteile folgendermaßen individuell verändert sein: In 100 ml Beimischung kann die Menge des Luziferins von etwa 0,2 bis etwa 30 mg verändert sein; die Menge des ATP von etwa 10 bis etwa 300 mg verändert sein; die Menge des AMP von etwa 0,2 bis etwa 30 mg verändert sein; die Menge des DTT kann verändert sein von etwa 200 bis etwa 2000 mg, die Menge des EDTA kann verändert sein zwischen etwa 10 und etwa 50 mg, die Menge der Phenylessigsäure kann verändert sein zwischen etwa 1 und etwa 10 mg und die Menge der Oxalsäure kann zwischen etwa 0,2 und etwa 5 mg verändert sein.
  • In anderer Hinsicht beabsichtigt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zum Nachweis des Vorkommens von Luziferase in biologischen Proben durch Nachweis emittierter Photonen aus der Luziferase-Luziferin-Reaktion. Einhundert ml dieser Zusammensetzung enthalten etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure und etwa 0,85 mg Oxalsäure.
  • Mit einer stärker bevorzugten Ausführungsform beabsichtigt die Erfindung eine Reaktionsmischung zum Nachweis des Vorkommens von Luziferase in einer biologischen Probe, bei der in 100 ml 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure, etwa 0,85 mg Oxalsäure und ein Detergens enthalten sind. Beispielsweise beabsichtigt die vorliegende Erfindung eine Beimischung folgender Zusammensetzung: 100 ml der Beimischung enthalten etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, zwischen etwa 200 und 2000 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure und etwa 0,85 mg Oxalsäure. Andere Beimischungen, in denen nur eine Komponente verändert ist, wie oben besprochen, sind beabsichtigt.
  • So wie er hier verwendet wird, bedeutet der Ausdruck "Luziferase" ein Enzym, das die Oxidation von Luziferin katalysiert, begleitet von der Emission eines Photons. Luziferasen können aus biologischen Proben, die Luziferase produzieren oder aus Zellen, in die ein Luziferase kodierendes Polynucleotid durch Transformation oder Transfektion eingeschleust worden war, isoliert werden. Eine Isolierung von Luziferase aus einer biologischen Probe liegt im Bereich der Erfahrung eines mit der gebräuchlichen Technik vertrauten Fachmannes. In ähnlicher Weise ist die Vorgehensweise der Transformation oder der Transfektion eines Luziferase kodierenden Polynucleotids in eine Zelle in der einschlägigen Technik wohlbekannt.
  • Ein Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verlängerung der Dauer der nachweisbaren Photonenemission der Luziferase-Luziferin-Reaktion auf mehr als dreissig Minuten durch Zusatz bestimmter Reagentien. Über eine große Zahl von Substanzen, die die Luziferase-Luziferin-Reaktion beeinflussen ist berichtet worden, einschließlich Dithiothreitol, Cytidin-Nucleotide, AMP, Pyrophosphat, Coenzym A, EDTA, Protease-Inhibitoren und Luziferase-Inhibitoren einschließlich von Luziferin-Analogen.
  • Die Zersetzung und Inaktivierung der Luziferase verkürzt die Lebensdauer der Luziferase-Luziferin-Reaktion infolge einer Inaktivierung der Luziferase. Bei der Reportergentechnik, bei der Zelllysate verwendet werden, ist die Inaktivierung der Luziferase durch im Zelllysat vorhandene endogene Proteasen ein besonderes Problem. Der Zusatz von Proteaseinhibitoren wie Phenylessigsäure (PAA), Oxalsäure, Monensin, Acetylphenylalanin, Leupeptin, Ammoniumchlorid, Aprotinin und Anderen verhindern den Abbau der Luziferase durch in der biologischen Probe vorhandene endogene Proteasen. Durch Verlangsamung oder Verhinderung der Inaktivierung der Luziferase wird die Luziferase-katalysierte Lichterzeugung verlängert. Die obige Aufzählung ist nur illustrativ, in der einschlägigen Technik sind viele andere Proteaseinhibitoren gut bekannt. Die Verwendung anderer Proteaseinhibitoren ist mit der vorliegenden Erfindung ebenfalls beabsichtigt.
  • Der Zusatz von Luziferin-Analogen und anderen Inhibitoren für Luziferase steigert die Lebensdauer der Lichterzeugung durch Inhibierung der Luziferase. Es muss dafür Sorge getragen werden, dass der Inhibitor reversibel an Luziferase gebunden ist. Analoge, die irreversibel binden, hemmen Luziferase dauerhaft. Beispiele für reversible Inhibitoren der Luziferase schließen Phenylbenzthiazol, 2-Aminoethanol, Benzthiazol, 2-Hydroxyphenylbenzthiazol und Pyrophosphat ein.
  • Adenosinmonophosphat (AMP) ist ein katalytisches Produkt der Luziferase- Luziferin-Reaktion. Der Zusatz von AMP beschleunigt die Anfangsphase der Luziferase-Luziferin-Reaktion. Wie in Fig. 1 gezeigt, ist die anfängliche Photonenemission bei Abwesenheit von AMP niedrig und die maximale Lichterzeugung tritt annähernd sechs Stunden nach der Initiierung der Luziferase-Luziferin-Reaktion ein. Im Gegen satz dazu tritt die Lichterzeugung unverzüglich ein und nimmt linear mehr als acht Stunden ab, wenn die Konzentration des AMP zwischen etwa 2, 2 und etwa 35,2 mg/100 ml liegt. Fig. 1 zeigt die Auswirkung einer Veränderung der AMP-Konzentration auf die Luziferase-Luziferin-Lichterzeugung. 100 ml der Beimischung enthielten 110 mg Adenosintriphosphat, 385 mg Dithiothreitol, 2,8 mg Luziferin, 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, 4 ml einer 10% Triton N101-Lösung in H&sub2;O, 4,5 mg Phenylessigsäure und 0,85 mg Oxalsäure in 50 mM N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'- [2-ethansulfonsäure] (HEPES), pH 7,8. Die Menge des zu 100 ml Testlösung zugesetzten AMP wurde von etwa 0 bis etwa 35,2 mg verändert. Beim Zusatz von etwa 8,8 mg und etwa 35,2 mg AMP war die nachweisbare Photonenemission zwischen einer und acht Stunden linear. Der Zusatz von 2,2 mg AMP lieferte eine Photonenemission, die bis zu acht Stunden linear war.
  • Thiolverbindungen wie Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol, Glutathion und andere gut bekannte Reduktionsmittel sind Radikalfänger und steigern die Dauer einer nachweisbaren Photonenemission einer Luziferase-Luziferin-Reaktion. Obwohl der Mechanismus der Stabilisierung der Luziferase-Luziferin-Reaktion durch Thiolverbindungen nicht gut verstanden wird, wirken diese Verbindungen wahrscheinlich durch Begrenzung der Verfügbarkeit des in der zweiten Stufe der Luziferase-Luziferin-Reaktion erforderlichen Sauerstoffs. Bei höheren Konzentrationen steigert DTT die Emission von Photonen durch einen unbekannten Mechanismus. Fig. 2 zeigt die Auswirkung einer Veränderung der DTT-Konzentration auf die Luziferase-Luziferin- Lichterzeugung. In Fig. 2 enthielten 100 ml der Testlösung 2,2 mg Adenosinmonophosphat, 110 mg Adenosintriphosphat, 2,8 mg Luziferin, 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, 4 ml einer 10% Triton N101-Lösung in H&sub2;O, 4,5 mg Phenylessigsäure und 0,85 mg Oxalsäure in 50 mM N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), pH 7,8. Die Menge des DTT in der Beimischung schwankte von 193 bis 770 mg. Der Zusatz von 385 und 770 mg DTT führte zu einer nachweisbaren Photonenemission, die bis zu acht Stunden linear war. Wenn 193 mg DTT zugesetzt wurden, verringerte sich die Lichterzeugung und war linear zwischen zwei und acht Stunden.
  • Fig. 3 zeigt die Auswirkungen einer Veränderung beider DTT- und AMP- Konzentrationen auf die Dauer einer nachweisbaren Photonenemission aus der Luziferase-Luzifenin-Reaktion. 100 ml der Beimischung enthielten 110 mg Adenosintriphosphat, 2,8 mg Luzifern, 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, 4 ml einer 10% Triton N101-Lösung in H&sub2;O, 4,5 mg Phenylessigsäure und 0,85 mg Oxalsäure in 50 mM N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), pH 7,8. Die Zugabe von 385 mg DTT und 2,2 mg AMP führte zu einer nachweisbaren Photonen emission, die zwischen 1,75 und 8 Stunden linear war. Der Zusatz von 770 mg DTT und 35 mg AMP führte zu einer nachweisbaren Photonenemission, die bis zu acht Stunden linear war.
  • Chelatbildner, die Metallionen binden, können durch Binden von Mg²&spplus; und anderer divalenter Kationen einschließlich Ca²&spplus;, Fe²&spplus;, Mn²&spplus;, Co²&spplus; und Zn²&spplus; die Dauer der Photonenemission aus einer Luziferase-Luziferin-Reaktion verlängern. Bei Reportergentechniken können die Konzentrationen zweiwertiger Kationen nicht rigoros kontrolliert werden, weil ganze Zelllysate verwendet werden. Die Lyse von Zellen, die ein Luziferase codierendes Gen exprimieren, entlassen die gesamten endogenen zweiwertigen Kationen einschließlich Mg²&spplus; und Ca²&spplus; in die Beimischung der Luziferase-Luziferin-Reaktion. Der Zusatz von Chelatbildnern bewirkt die Entfernung der freigesetzten Mg²&spplus; und Ca²&spplus;-Ionen. Beispielhafte Chelatbildner schließen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N',N'- tetraessigsäure (EGTA) ein. Eine Verwendung anderer Chelatbildner ist bei der vorliegenden Erfindung beabsichtigt.
  • Die Verwendung von Detergentien zur Lyse von Zellen mit angenommener Luziferase-Expression ist in der einschlägigen Technik gut bekannt. Beispiele für anionische Detergentien schließen die Detergentien der Triton-Serie, einschließlich Triton N-101 ein. Deren Ersatz durch andere Detergentien einschließlich sowohl ionischer und anionischer Detergentien liegt im Bereich der Erfahrung eines durchschnittlichen Fachmannes.
  • Die Verwendung von Reagentien zum Aufrechterhalten des pH der Luziferase-Luziferin-Reaktionslösung ist in der einschlägigen Technik gut bekannt. Ein exemplarischer Puffer ist N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES). Es sind viele andere Puffer gut bekannt und im Handel erhältlich.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Kombination von Reagentien zur Verfügung, welche die Dauer der nachweisbaren Photonenemission aus einer Luziferase- Luziferin-Reaktion verlängert. Fig. 4 zeigt die Auswirkung auf die Lebensdauer der Luziferase-Luziferin-Reaktion in einer Beimischung die aus Luziferase, Luziferin, ATP, den für die katalytische Luziferaseaktivität notwendigen Cofaktoren und EDTA (20 mg/100 ml) in 50 mM HEPES und AMP, DTT oder Coenzym A besteht. Bei allen in Fig. 4 gezeigten Kombinationen dauerte die nachweisbare Photonenemission aus der Luziferase-Luziferin-Reaktion mindestens acht Stunden an, mit Ausnahme der Lösung, die EDTA und 250 uM Coenzym A enthielt, bei der die Photonen für 7 Stunden nachgewiesen werden können.
  • Die Linearität der Abnahme der Photonenemission während der Dauer einer Luziferase-Luziferin-Reaktion ist ein wichtiger Aspekt bei der vorliegenden Erfindung. Da die Photonenemission während der Dauer der Luziferase-Luziferin-Reaktion linear ist, kann die anfängliche Lumineszenz aus der zu irgendeinem Zeitpunkt während der Dauer der bei der Luziferase-Luziferin-Reaktion bestimmten Lumineszenz leicht bestimmt werden. Aus der berechneten Anfangslumineszenz kann die Konzentration der Luziferase in der gemessenen Probe bestimmt werden. Zum Beispiel können bei der Reportergentechnik Proben mit angenommener Luziferase-Expression über einen Zeitraum von vielen Stunden gemessen und die Anfangskonzentration der Luziferase in den Proben bestimmt werden.
  • Wie nachfolgend in den Beispielen 1 und 2 erörtert wird, erlaubt die vorliegende Erfindung die Messung einer großen Anzahl von Proben. Kürzlich wurde eine Messgeräteausrüstung für die Messung der Photonenemission aus Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verfügbar ("TopCount Microplate Scintillation and Luminescence Counter" von der Packard Instrument Company, Inc. of Downers Grove, Illinois). Der Lichtausgang jeder Platte mit 96 Vertiefungen benötigt grob 10 Minuten zur Messung. Mit einer linearen Photonenemission von über acht Stunden können so achtundvierzig Platten mit 96 Vertiefungen leicht gemessen werden. Dies führt zur Messung der Photonenemission aus 4608 individuellen Proben.
    • Beispiel 1: Reportergen-Assay unter Verwendung einer cDNA-Luziferase
  • Die eine klonierte Luziferase verwendende Reportergentechnik wurde verwendet um die verlängerte Dauer der Luziferase-Luziferin-Reaktion zu demonstrieren. Die Erzeugung von Licht aus vorübergehend transformierten Human-T-Zellen (Jurkat) wurde über acht Stunden gemessen. Die Jurkat-Zellen wurden in der Phase logarithmischen Wachstums mittels DEAE-Dextrantechnik transformiert und in einem befeuchteten Inkubator 48 Stunden unter Testbedingungen inkubiert. Der Plasmidvektor enthielt ein Luziferasegen unter Kontrolle des EF-Promotors. Nach 48 Stunden wurden 100 ul der Zellsuspension mit 100 ul PBS und 100 ul einer 100 ml- Lösung, die 2,2 mg Adenosinmonophosphat, 110 mg Adenosintriphosphat, 385 mg Dithiothreitol, 2,8 mg Luziferin, 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, 4 ml einer 10% Triton N101-Lösung in H&sub2;O, 4,5 mg Phenylessigsäure, 0,85 mg Oxalsäure und 50 mM N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), pH 7,8, enthielt, vermischt. Die Erzeugung von Licht wurde dann bis zu acht Stunden gemessen. Die Kurve "hoher Aktivität" (durchgezogene Linie) gibt die Lichterzeugung der transformierten Jurkat-Zellen mit dem 2 ug Luziferase enthaltenden Vektor bei einer Konzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml wieder. Die Kurve "niedriger Aktivität" gibt die Lichterzeugung aus dem gleichen Experiment, jedoch mit einer Zellkonzentration von 50.000 Zellen/ml wieder. Die Halbwertszeit der "hochaktiven" Probe wurde grob zu 3,5 Stunden und die Halbwertszeit der "niederaktiven" Probe grob zu 5 Stunden gefunden.
    • Beispiel 2: Luziferase-Reportergen Hochleistungstest für die HIV-Rev-RRE- Wechselwirkung.
  • Ein die DEAE-Dextrantechnik für T-Zelllinien verwendender intermediärer Transfektionstest wurde für das Screening von Inhibitoren des HIV-rev-Regulatorproteins (RRE) aufgebaut. Zwei Expressionsvektoren, einer für das HIV-1 Gen (pEFcRev) und der andere für ein Luziferase-Reportergen (pCMV-Luc/RRE) werden zusammen mittels Transfektion in die Jurkat-Zelllinie (lymphoblastoide Zellen) eingeschleust. RRE wird zusammen mit Luziferase exprimiert, wenn sich ein gewisser Gehalt an funktionellem rev-Protein in der Zelle gesammelt hat. Der Test ahmt die natürliche Wirkungsweise des rev. nach. REV transportiert ungespleißte oder einzeln gespleißte RRE enthaltende mRNA aus dem Zellkern zum Translationsmechanismus im Cytoplasma. Wenn sich im Zellkern ein gewisser Schwellengehalt an rev-Protein akkumuliert hat, bindet sich rev an RRE enthaltende mRNA, vervielfältigt sich und vermittelt den Transport dieser mRNA in einen den zellulären Spleißmechanismus umgehenden zellulären Weg. Dies wird durch Bindung des Rev/RRE-Komplexes an einen Zellfaktor, den Translation imitierenden Faktor eIF-5a der in den Nucleoli gebil deten Prä-Ribosomen erreicht. Inhibitoren jeder dieser Schrille der Wirkungsweise des rev sind mit diesem Reportergen Assay nachweisbar.
  • Um die Stimulierung der Luziferase-Expression um annähernd das 20 bis 100- fache über dem Grundeffekt innerhalb von 20 Stunden Transfektion zu erhalten, sind die Testbedingungen optimiert worden. Die in den Kontroll-Transfektionen mit einem identischen, das rev-Gen im gegenläufigen Sinn zum Promotor (pEF-AScRev) tragenden Expressionsvektor bestimmte Luziferase-Grundexpression ist gewöhnlich unter 5% der rev-induzierten Expression. Die Toxizität der zu prüfenden Verbindungen wird mit einem parallelen Transfektionstest bestimmt. Bei diesem Test wird ein rev-unabhängiges Luziferase-Konstrukt (pCMV-LUC) zusammen mit dem rev-Expressionsvektor (pEF-cRev) mittels Transfektion eingeschleust, um die Konditionen ähnlich zum rev-Test zu halten. Dieser Toxizitätstest identifiziert auch Verbindungen, die Inhibitoren der Luziferaseenzyme oder für die an den CMV-Promotor bindenden Transkriptionsfaktoren sind. Daher ist der Toxizitätstest dazu befähigt, als Spezifitätskontrolle zu wirken.
  • Der Test wurde an die Mikroplattentechnik angepasst und kann automatisiert werden. Während Detektoren für die Messung von Vielfachproben einige Zeit bekannt sind, sind moderne Einzelphotonenmesstechniken mit einer ausserordentlich hohen Empfindlichkeit für den Nachweis von Biolumineszenzsignalen aus Mikroplatten erst kürzlich auf den Markt gekommen. Die Stabilisierung des Biolumineszenzsignales mit einer Halbwertszeit von wenigen Minuten bis zu vier Stunden und mehr erlaubt die Automatisierung des Tests durch Verwendung neuerdings verfügbarer Mikroplatten-Einzelphotonenzähler. Eine Luziferase codierende cDNA ist daher ein ideales Reportergen. Die Verwendung einer Luziferase ist bei vielen anderen Mechanismus-basierenden zellulären Testsystemen für pharmazeutische, toxikologische und Screening-Systeme anwendbar.
  • Suspensionskulturen von Jurkat T-Zellen, Stamm 1722 werden täglich mit einer Verdünnung von mindestens 1 : 2 geteilt. Die End-Zelldichte sollte, um die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase zu halten, 6 · 10&sup5; Zellen/ml nicht übersteigen. Zum Erhalt der Stammkulturen können die Zelten mit einer Dichte von 0,5 · 10&sup5;/ml oder darunter ausgesäht werden. Kultivieren in Rollflaschen (annähernd 10 rpm) ist die bevorzugte Kultivierungsmethode.
  • Die folgenden Puffer und Reagentien wurden verwendet:
  • - Dulbecco's PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung)
  • - DEAE-Dextran (MW ca. 500.000), PHARMACIA # 17-0350-00 gelöst zu 10 mg/ml in PBS und durch 0,2 um Nalgene-Filter filtriert.
  • - Testmedium: RPMI 1640 ohne Phenolrot, ergänzt durch:
  • +10% FCS inaktiviert
  • +1% v/v HEPES Puffer (1 M)
  • +1% Penicillin/Streptomycin, GIBCO 043-05070
  • +0,1% Gentamycin GIBCO 043-05750
  • +1% Chloroquin (10 mM = 5,52 mg/ml in PBS) Sigma # C6628
  • - Waschmedium: RPMI 1640 ohne Phenolrot, ergänzt durch:
  • +1% v/v HEPES Puffer (1 M)
  • +1% Penicillin/Streptomycin, GIBCO 043-05070
  • +0,1% Gentamycin GIBCO 043-05750
  • - DNA-Präparationen, gereinigt durch Zentrifugation mit zwei Durchläufe eines CsCl-Gradienten, aufbewahrt in Teilmengen bei -20ºC gefroren (gelöst zu 1 mg/ml in H&sub2;O).
  • pCMV-Luc/RRE DNA # 18 xx
  • pEF-cREV DNA # 21 xx
  • pEF-AScRev DNA # 22 xx
  • pCMV-Luc DNA # 3 xx
  • - Luziferase-Substratlösung
  • 2,2 mg AMP (Sigma A1877)
  • 110 mg ATP (Sigma A5394)
  • 385 mg Dithiothreitol
  • 280 ul Luziferin (10 mg/ml in H&sub2;O), Sigma L5256 gelöst in 100 ml Puffer bestehend aus:
  • 5 ml HEPES (1 M)
  • 20 mg EDTA (Triplex III)
  • 4 ml Triton N101 (10% in H&sub2;O)
  • 4,5 mg Phenylessigsäure, Sigma Nr. P4514
  • 0,85 mg Oxalsäure Sigma Nr. 07626
  • pH auf 7,8 eingestellt (2 N NaOH, ca 1,1 ml)
  • - Mikroplatten:
  • Packard Cultur Plates 6005180 mit haftender Abdeckung
  • - Zellfilter Falcon # 2340
  • Es gilt folgendes Testprotokoll:
    • Herstellung der Verdünnungen:
  • Reine Substanzen CHC (500 uM in DMSO gesättigtem Wasser) 1 : 50 Endverdünnung:
  • - Medium = RPMI 1640 plus Zusätze (siehe oben)
  • - Vorverdünnung: 8 ul Probe plus 192 ul Testmedium (Mikroplatte)
  • - Zusatz von 50 ul Vorverdünnung, jeweils in parallelen Positionen auf 3 weisse Packard Kulturplatten (B1 bis H12)
  • - Blindprobe: 50 ul Medium (A1 durchgehend bis A12)
  • bis zum Zusatz der Zellen werden die Platten im CO&sub2;-Behälter aufbewahrt
  • Kulturbrühe; Endverdünnung von Aktinomyceten bei 1 : 200, 1 : 100 bei Pilzen und 1 : 100 bei Bakterien:
  • - Vorverdünnung: 8 ul Probe plus 392 ul Testmedium = 1 : 50 (Titertek racks) für Bakterien und Pilze.
  • 8 ul Probe plus 792 ul Testmedium = 1 : 100 (Titertek racks) für Aktinomyceten.
  • - Zusatz von 150 ul Vorverdünnung, jeweils in drei Parallelen der weissen Packard Kulturplatten (B1 bis H12)
  • - Blindprobe: 50 ul Testmedium (A1 bis A12)
  • - bis zur Zugabe der Zellen werden die Platten im CO&sub2;-Behälter aufbewahrt.
  • Bezeichnung der Kontrollvertiefungen beim Primärscreening.
  • Sekundärscreening (Validisierung) der positiven toxischen Treffer (1 : 50 bis 1 : 6400 Endverdünnung für die Substanzen):
  • - Vorverdünnung: 20 ul Probe plus 480 ul Testmedium (Titertek racks)
  • - Zugabe von 100 ul Vorverdünnung in die Duplikate der Vertiefungen der Reihe A (3 bis 12) parallel zu den beiden Packard Kulturplatten.
  • - Zugabe von 50 ul Testmedium zu allen verbleibenden Vertiefungen
  • - Verdünnung der Kolonnen 3 bis 12 durch serielle Übertragung von 50 ul und Verwerfen des Restes nach Reihe H.
    • Herstellung der Zellen und Transfektionsprozedur
  • - Zellen, wie oben beschrieben, werden zentrifugiert (200 g, 10 Min.) und zweimal mit vorgewärmten Waschmedium gewaschen.
  • - die Zellen werden in vorgewärmten PBS suspendiert und in einem Hämacytometer gezählt; die Zelldichte wird dann auf 4 · 10&sup6; Zellen/ml eingestellt.
  • - DNA-Lösungen werden in vorgewärmten PBS hergestellt (2,5 ml/Platte, 25 ul/zu untersuchender Vertiefung):
  • - Zugabe von 25 ul DEAE/Dextran pr ml PBS
  • - Zugabe von DNA:
  • - Für REV/RRE: 0,60 ul/ml pCMV-Luc/RRE # 18 xx und 1 ul/ml pEF-cREV # 21 xx.
  • - Für Negativkontrollen: 0,60 ul/ml pCMV-Luc/RRE # 18 xx und 1 ul/ml AScREV # 22 xx.
  • - Für toxische/unspezifische Inhibierung: 0,60 ul/ml pCMV-Luc # 3 xx und 1 ul/ml pEF-cREV # 21 xx.
  • - Für Toxizität/Gebrauchskontrolle: 0,60 ul/ml pCMV-Luc # 3 xx und 1 ul/ml pEF-AScREV # 22 xx.
  • - Zusatz eines gleichen Volumens Zellsuspension (4 · 10&sup6; Zellen/ml) zu jeder der DNA-Lösungen.
  • - Die DNA/Zellsuspension wird 10 Min bei 37ºC inkubiert, leicht von Hand geschüttelt und weitere 10 Min inkubiert.
  • - Es wird ein gleiches Volumen vorgewärmten Testmediums zugesetzt, die Zellen leicht von Hand geschüttelt und weitere 10 Min inkubiert.
  • - Die pelletierten Zellen werden resuspendiert in vorgewärmten RPMI 1640 plus Zusätze (Testmedium) und auf eine Endkonzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml eingestellt.
  • - Die Zellen werden einmal durch eine Spritze gesaugt und unmittelbar bevor sie auf die Platten verteilt werden, durch ein Zellfilter filtriert.
  • - 50 ul der Zellsuspension werden jeder der Vertiefungen der betreffenden Zellsuspensionen zugesetzt.
  • Jurkat-Rev Sekundärtest:
  • - "High"control und Substanzverdünnungen: pCMV-luc/RRE + pEFcRev in den Vertiefungen A1-H1
  • - Blindproben: 50 ul Medium in den Vertiefungen A2-D2
  • - "low"-control: pCMV-Iuc/RRE + pEF-AScRev in den Vertiefungen E2-H2
  • Jurkat-Toxizitäts-Sekundärtest:
  • - "High"control und Substanzverdünnungen: pCMV-luc + pEF-cRev in den Vertiefungen A1-H1
  • - Blindproben: 50 ul Medium in den Vertiefungen A2-D2
  • - Gebrauchskontrolle: pCMV-Luc + pEF-AScRev in den Vertiefungen E2-H2
  • - Die Platten werden unter Verwendung eines Mikroplattenschüttlers geschüttelt und im Inkubator bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre 16-24 Stunden aufbewahrt.
    • Messung der Luziferaseaktivität
  • - Nach der Inkubierung werden 100 ul Luziferase-Substratlösung, die jeden Tag frisch herzustellen ist, jeder Vertiefung zugesetzt.
  • - Die Platten werden unter Verwendung eines Mikroplattenschüttlers einige Sekunden geschüttelt und mit einer haftenden Abdichtung versiegelt (keine Erhitzungsabdichtungen verwenden).
  • - Die Platten werden in einem Packard nTopCount Microplate Scintillation and Luminescence Counter" oder in einem gleichwertigen Element nach einer Zählverzögerung von 2 Minuten für 0,15 Minuten pro Vertiefung ausgezählt. Die Temperatur der Zählkammer sollte, ebenso wie die Temperatur des Plattengestells 22ºC nicht übersteigen, weil sonst die Halbwertszeit der Lichtemission unter 4 Stunden abfallen kann.
  • - Die bewertete, hintergrundkorrigierte REV-Luc/RRE ("high"-control)- und die Luc (Toxizitätskontrolle)- sollten schließlich 2000 cps sein, die AsREV-Luc/RRE ("low"-control) sollte 100 cps nicht übersteigen.
    • Ergebnisse
  • Die Fig. 6 und 7 zeigen die Ergebnisse eines Screening-Tests in großem Maßstab für Verbindungen, die das HIV-rev Regulatorprotein (RRE) inhibieren. In Jurkat-Zellen werden zwei Plasmide, pEF-cRev und entweder pCMV-Luc/RRE oder pCMV-Luc zusammen mittels Transfektion eingeschleust. Die geschlossenen Quadrate stellen Zellen dar, in die pEF-cREV und pCMV-Luc/RRE eingeschleust wurde. Die offenen Quadrate stellen Zellen dar, in die pEF-cRev und pCMV-Luc eingeschleust wurde. Wenn eine Versuchsverbindung RRE inhibiert, sollten Zellen mit eingeschleustem pEF-cREV und pCMV-Luc/RRE einen Abfall bei der Lichterzeugung aus der Luziferase-Luziferin-Reaktion zeigen, verglichen mit Zellen in die pEF-cREV und pCMV-Luc eingeschleust worden war. Wenn eine Versuchsverbindung RRE nicht inhibiert, sollte die Lichterzeugung aus der Luziferase-Luziferin-Reaktion unverändert bleiben, ganz gleich ob in die Zellen pCMV-Luc/RRE oder pCMV-Luc eingeschleust wurde.
  • Fig. 6 zeigt die Auswirkungen der Verbindung A auf RRE. Die von Zellen, in die mittels Transfektion pEF-cRev und entweder pCMV-Luc/RRE (geschlossene Quadrate) oder pCMV-Luc (offene Quadrate) zusammen eingeschleust worden war, erhaltenen Inhibierungskurven sind nicht dramatisch verschieden. Verbindung A scheint daher kein Inhibitor für RRE zu sein. Oder aber die Toxizität der Verbindung A vermag die transfizierten Zellen vorzeitig abzutöten, ehe bedeutsame Daten erhalten werden können.
  • Fig. 7 zeigt die Auswirkungen der Verbindung B auf RRE. Die von Zellen, in die mittels Transfektion pEF-cRev und entweder pCMV-Luc/RRE (geschlossene Quadrate) oder pCMV-Luc (offene Quadrate) zusammen eingeschleust worden war, erhaltenen Inhibierungskurven sind dramatisch verschieden. Es ergibt sich ein signifikanter Unterschied bei der Inhibierung von RRE zwischen Zellen, in die pCMV- Luc/RRE und Zellen, in die pCMV-Luc eingeschleust worden war. Bei Zellen, in die pCMV-Luc/RRE eingeschleust worden war, ergaben etwa 0,1 uM Verbindung B 50% Inhibierung. Bei Zellen, in die pCMV-Luc eingeschleust worden war, muss die Verbindung B in Konzentrationen größer als 10 uM anwesend sein, um 50% Inhibierung zu erhalten (Daten nicht gezeigt).

Claims (20)

1. Verfahren zum Nachweis des Vorkommens von Luziferase in einer biologischen Probe durch Messung der Lumineszenz, wobei das Verfahren umfasst:
(a) Vermischen der biologischen Probe mit einem angenommenen Gehalt an Luziferase mit einem Reaktionsgemisch, das Luziferin, Adenosintriphosphat, für die katalytische Luziferaseaktivität erforderliche Cofaktoren, Adenosinmonophosphat, einen Radikalfänger für freie Radikale und einen Chelatbildner enthält und
(b) Messen der Lumineszenz, die durch das die Probe enthaltende Reaktionsgemisch erzeugt wird, wobei die Lumineszenz für mindestens 30 Minuten nachgewiesen werden kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Radikalfänger für freie Radikale Dithiothreitol ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Chelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem 100 ml der Beimischung zwischen 0,2 und 30 mg Luziferin, zwischen 10 und 300 mg ATP, zwischen 0,2 und 30 mg AMP, zwischen 200 und 2000 mg Dithiothreitol und zwischen 10 und 50 mg EDTA enthalten.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol und etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure enthalten.
6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem 100 ml der Beimischung zwischen 0,2 und 30 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol und etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure enthalten.
7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, zwischen 10 und 300 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol und etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure enthalten.
8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, zwischen 0,2 und 35 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol und etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure enthalten.
9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, zwischen 200 und 2000 mg Dithiothreitol und etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure enthalten.
10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol und zwischen 10 und 50 mg Ethylendiamintetraessigsäure enthalten.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das Reaktionsgemisch zusätzlich einen Proteaseinhibitor und ein Detergens enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Proteaseinhibitor Phenylessigsäure und/oder Oxalsäure ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem 100 ml der Beimischung zwischen 1 bis 10 mg Phenylessigsäure und/oder zwischen 0,2 und 5 mg Oxalsäure enthalten.
14. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Detergens Triton® N-101 ist.
15. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure und etwa 0,85 mg Oxalsäure enthalten.
16. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, zwischen 1 und 10 mg Phenylessigsäure und etwa 0,85 mg Oxalsäure enthalten.
17. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem 100 ml der Beimischung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat, etwa 385 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure und zwischen 0,2 und 5 mg Oxalsäure enthalten.
18. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die biologische Probe eine Zelle umfasst, die Luziferase produziert.
19. Eine zum Nachweis des Vorkommens von Luziferase in einer biologischen Probe verwendete Zusammensetzung, worin 100 ml der Zusammensetzung zwischen 0,2 und 30 mg Luziferin, zwischen 10 und 30 mg ATP, zwischen 0,2 und 30 mg AMP, zwischen 200 und 2000 mg Dithiothreitol und zwischen 10 und 50 mg EDTA enthalten.
20. Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, worin 100 ml der Zusammensetzung etwa 2,8 mg Luziferin, etwa 110 mg Adenosintriphosphat, etwa 2,2 mg Adenosinmonophosphat etwa 385 mg Dithiothreitol, etwa 20 mg Ethylendiamintetraessigsäure, etwa 4,5 mg Phenylessigsäure, etwa 0,85 mg Oxalsäure und etwa 4 g Triton® enthalten.
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