DE69232005T2

DE69232005T2 - Biozide proteine

Info

Publication number: DE69232005T2
Application number: DE69232005T
Authority: DE
Inventors: Frans Broekaert; Philippe Cammue; Miguel De Bolle; Bronwen Rees; Jozef Vanderleyden
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1991-03-11
Filing date: 1992-03-10
Publication date: 2002-06-06
Anticipated expiration: 2012-03-11
Also published as: BR9205760A; DK0576483T3; ES2162796T3; ATE204328T1; DE69232005D1; CA2106092A1; AU652430B2; AU1366492A; NZ241910A; JPH06505160A; US5689048A; US5482928A; US5942663A; WO1992015691A1; EP0576483B1; JP3410734B2; EP0576483A1

Description

Diese Erfindung betrifft biozide Proteine, ihr Herstellungsverfahren und ihre Verwendung sowie die sie codierenden DNA-Sequenzen. Sie betrifft insbesondere aus Mirabilis isolierte antimikrobielle Proteine.
Mirabilis umfasst etwa 60 tropische amerikanische Spezies, von denen viele zur Zierde als Gartenpflanze gezüchtet werden. Mirabilis jalapa ist allgemein als "Wunderblume" bekannt und hat weiße, gelbe oder rote Blüten. Aus den knollenartigen Wurzeln von M. jalapa wird ein Abführmittel gewonnen, das als Ersatz für Jalap verwendet wird.
Obwohl Pflanzen normalerweise auf Substraten wachsen, die äußerst reich an Pilzen sind, bleibt eine Infektion ein seltenes Ereignis. Um mögliche Eindringlinge fernzuhalten, produzieren Pflanzen, entweder konstitutiv oder induzierbar, eine ganze Reihe von Anti-Pilz- Verbindungen. Am besten untersucht sind Phytoalexine, Sekundärmetaboliten mit einem breiten antimikrobiellen Wirkungsspektrum, die spezifisch bei der Wahrnehmung von entsprechenden, mit der Abwehr zusammenhängenden Signalmolekülen synthetisiert werden. Die Produktion von Phytoalexinen hängt von der Transkriptionsaktivierung einer Reihe von Genen ab, die Enzyme des Phytoalexin-Biosynthesewegs codieren. Während des letzten Jahrzehnts wurde jedoch zunehmend deutlicher, dass einige Pflanzenproteine eine direktere Rolle bei der Kontrolle phythopathogener Pilze spielen können. Bisher sind mehrere Proteinklassen mit Anti-Pilz-Eigenschaften identifiziert worden, einschließlich Chitinasen, beta-1,3- Glucanasen, Ribosomen-inaktivierender Proteine, Ihionine, Chitin-bindender Lektine und Zeamatine.
Wissenschaftler bei Japan Tobacco Inc. haben kürzlich ein anti-virales Protein aus Mirabilis jalapa-Suspensionszellen (Kallus, der anfangs aus Blättern induziert wurde) und auch aus Wurzel- und Blattgewebe extrahiert (Tsutomu Ikeda et al., 1987; Plant Cell Reports, 6, 216-218). Dieses "anti-virale Pflanzenprotein aus Mirabilis" (MAP) hat ein Molekulargewicht von 24 kDa. Die Aminosäuresequenz von MAP wurde bestimmt, und sie besteht aus 250 Aminosäuren. Ein synthetisches MAP-Gen mit 759 Basenpaaren wurde in einen Vektor cloniert und in Escherichia coli exprimiert (Noriyuki Habuka et al.; 1989; Journal of Biological Chemistry 264 (12), 6629-6637). Die folgenden Patente wurden erteilt: J88061317 und US4701522 umfassen den Mirabilis-MAP-Proteinextrakt; J87027797 umfasst die Herstellung von MAP durch Züchtung von Kallusmaterial. Die folgenden Patentanmeldungen wurden ebenfalls eingereicht: J63123386 über durch Clonierung von Kalluszellen erhaltenes MAP; J02186988 über die Herstellung des anti-viralen Proteins durch Züchtung von E.coli- Transformanten; J01294694 über ein anti-virales Peptid (NOG-22) aus Mirabilis, J01294693 über ein ähnliches synthetisches Peptid (NOG-53) und EP414134 über das anti-virale Protein codierende Gen. Zusätzlich hat Japan Tobacco Patentanmeldungen eingereicht, die zwei anti- virale Proteine umfassen, die aus Bougainvillea (eine nah verwandte Gattung in derselben Familie wie Mirabilis) extrahiert wurden: BAP-1 hat ein Molekulargewicht von 33 kDa (J01272598), und BAP-2 hat ein Molekulargewicht von etwa 30 kDa (J01272599).
Wir haben jetzt eine neue Klasse wirksamer antimikrobieller Proteine gereinigt.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Protein mit Anti-Pilz-Wirkung, das aus Mirabilis-Samen isolierbar ist, bereitgestellt.
Weiterhin wird nach der vorliegenden Erfindung ein Protein mit Anti-Pilz-Wirkung bereitgestellt, das von DNA codiert wird, die durch Absuchen einer Pflanzengenombank mit einer Sonde isolierbar ist, die mindestens einen Teil der Nucleotidsequenz umfasst, die in Fig. 6 oder 7 nachfolgend dargestellt ist.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Protein bereit, das aus Mirabilis-Samen isolierbar ist und das zur Klasse der Proteine gehört, die das Protein mit der Aminosäuresequenz von Fig. 6 oder Fig. 7 umfasst.
Weiterhin umfasst diese Erfindung einen Vektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein erfindungsgemäßes Protein codiert. Die DNA kann in ein biologisches System, das die Expression des codierten Proteins zulässt, cloniert oder transformiert werden. Diese biologischen Systeme machen zusammen mit dem davon erhaltenen Protein besondere Ausführungsformen der Erfindung aus.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Erfindung mit rekombinanter DNA transformierte Pflanzen, welche die erfindungsgemäßen Proteine codieren, wie das Protein mit der Aminosäuresequenz von Fig. 6 oder Fig. 7.
Weiterhin wird nach der vorliegenden Erfindung eine Anti-Pilz-Verbindung bereitgestellt, die ein oder mehrere der vorstehend beschriebenen Proteine enthält.
Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen, das deren Exponierung gegenüber den vorstehend beschriebenen Proteinen oder den Anti-Pilz- Zusammensetzungen umfasst.
Weiterhin umfasst die Erfindung, wie vorstehend beschrieben, ein Extraktionsverfahren zur Herstellung von Proteinen aus diese enthaltendem organischem Material, umfassend die Mazerierung und Lösungsmittelextraktion des organischen Materials. Geeigneterweise wird das Protein anschließend durch Zentrifugation, Chromatographie und Dialyse gereinigt. Das in dem Extraktionsverfahren verwendete organische Material kann Mirabilis-Samen oder einen Mikroorganismus umfassen, der mit DNA transformiert wurde, die erfindungsgemäßen Proteine codiert.
Aus Mirabilis jalapa-Samen wurde eine neue Klasse wirksamer antimikrobieller Proteine isoliert. Die Klasse umfasst zwei Proteinfaktoren, die nachstehend als Mj-AMP1 (Mirabilis jalapa-antimikrobielles Protein 1) bzw. Mj-AMP2 (Mirabilis jalapa-antimikrobielles Protein 2) bezeichnet werden. Beide sind dimere Proteine. Mj-AMP1 besteht aus zwei 4 kDa- Untereinheiten, und Mj-AMP2 besteht aus zwei 3,5 kDa-Untereinheiten. Trotz ihres Ursprungs unterscheidet sich ihre Primärstruktur von allen anderen bekannten Pflanzenproteinen und zeigt statt dessen eine Homologie mit Insekten-Neurotoxinen, die man im Gift von Invertebraten findet. Die Aminosäuresequenz von Mj-AMP1 und Mj-AMP2 wurde bestimmt. Diese Sequenzen ermöglichen die Herstellung des Proteins unter Verwendung eines Standard-Peptid-Synthesegeräts.
cDNA, codierend Mj-AMP1 und Mj-AMP2, wurde isoliert und sequenziert. Diese DNA kann unter Verwendung eines Standard-Nucleinsäure-Synthesegeräts hergestellt werden, oder es können geeignete Sonden (abgeleitet von der bekannten Sequenz) verwendet werden, um das/die eigentliche(n) Mj-AMP-Gen(e) und Kontrollsequenzen aus dem Pflanzengenom zu isolieren. Dieses genetische Material kann dann in ein biologisches System cloniert werden, dass die Expression der Proteine unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors zulässt. Daher können die Proteine zum weiteren Gebrauch in einem geeigneten Mikroorganismus oder einer Kulturzelle produziert, extrahiert und isoliert werden. Geeignete Mikroorganismen umfassen Escherichia coli und Pseudomonas. Geeignete Zellen umfassen Insektenkulturzellen. Die DNA kann auch durch bekannte Verfahren in jede Pflanzenspezies transformiert werden, so dass die antimikrobiellen Proteine innerhalb der Pflanze exprimiert werden.
Erfindungsgemäße Pflanzenzellen können mit erfindungsgemäßen Konstrukten nach einer Vielzahl von bekannten Verfahren (Agrobacterium-Ti-Plasmide, Elektroporation, Mikroinjektion, Mikroprojektilbeschuss usw.) transformiert werden. Die transformierten Zellen können dann in geeigneten Fällen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, in die das neue Kernmaterial stabil in das Genom eingebaut wird. Sowohl transformierte monokotyle als auch dikotyle Pflanzen können auf diese Weise erhalten werden, obwohl die Letzteren gewöhnlich leichter zu regenerieren sind.
Beispiele von genetisch modifizierten erfindungsgemäßen Pflanzen umfassen: Früchte wie Tomaten, Mangos, Pfirsiche, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen und Melonen; Ackerpflanzen wie Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, kleinkörniges Getreide wie Weizen Gerste und Reis, Mais und Baumwolle und Gemüse wie Karotte, Kopfsalat, Kohl und Zwiebel.
Die Mj-AMP-Proteine zeigen weitreichende Anti-Pilz-Aktivitäten und wirken auch gegen Gram-positive Bakterien. Die Proteine könnten als Fungizide oder Antibiotika eingesetzt, werden, indem sie auf Pflanzenteile aufgebracht werden. Ihre Anti-Pilz-Aktivität ist salzabhängig und kann mit der Art und Konzentration der in der Zusammensetzung vorliegenden Ionen variieren. Insbesondere scheint die Anti-Pilz-Aktivität durch das Vorhandensein von Ionen abzunehmen. Die Proteine könnten durch Expression innerhalb von Pflanzenteilen auch zur Bekämpfung von Pilz- oder bakteriellen Krankheiten eingesetzt werden.
Die Mj-AMP-Proteine können aus Mirabilis jalapa-Samen isoliert und gereinigt werden, künstlich aus ihrer bekannten Aminosäuresequenz synthetisiert werden oder in einem geeigneten Mikroorganismus durch Expression rekombinanter DNA hergestellt werden. Die Proteine können auch in einer transgenen Pflanze exprimiert werden.
Die Erfindung kann besser verstanden werden durch Betrachtung der Zeichnungen, bei denen:
Fig. 1A das Gelfiltrations-Chromatogramm für die antimikrobiellen Proteine und das dazugehörige Diagramm der Hemmung des Pilzwachstums darstellt.
Fig. 1B das Kationenaustausch-Chromatogramm für die antimikrobiellen Proteine und das dazugehörige Diagramm der Hemmung des Pilzwachstums darstellt.
Fig. 2A das HPLC-Profil des gereinigten Mj-AMP1 darstellt.
Fig. 2B das HPLC-Profil des gereinigten Mj-AMP2 darstellt.
Fig. 3 die SDS-PAGE-Analyse für die gereinigten antimikrobiellen Proteine darstellt.
Fig. 4A die vollständigen Aminosäuresequenzen von Mj-AMP1 und Mj-AMP2 darstellt. Unterschiede werden durch Pfeile angezeigt.
Fig. 4B die Aminosäuresequenzen von Mj-AMP1 und Mj-AMP2 darstellt, die mit denjenigen der Neurotoxine ausgerichtet wurden.
Fig. 5 die zeitabhängigen Kurven der Pilzwachstumshemmung darstellt, die bei variierenden Konzentrationen der antimikrobiellen Proteine gemessen wurden.
Fig. 6 die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Clons MJ1 (Mj- AMP1) darstellt.
Fig. 7 die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des Clons MJ2 (Mj- AMP2) darstellt.
Fig. 8 die Konstruktion des Expressionsvektors pMDB 1 darstellt.
Fig. 9 die Konstruktion von pBinRi darstellt.
Fig. 10 die Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pMDB2 darstellt.
Fig. 11 die Konstruktion von pVT0 darstellt. -
Fig. 12 die Konstruktion von pVT1 darstellt.
Fig. 13 die Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pVT2 darstellt. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

Extraktion basischer hitzestabiler Proteine aus Mirabilis jalapa-Samen

Ein kg M. jalapa-Samen (gekauft von Chiltern Seeds, Ulverston, Cumbria, UK) wurde in einer Kaffeemühle gemahlen, und das sich ergebende Mehl wurde 2 Stunden lang bei 4ºC mit 2 Liter eines eiskalten Extraktionspuffers extrahiert, enthaltend 10 mlvi NaH&sub2;PO&sub4;, 15 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 2 mM Thioharnstoff, 1 mM PMSF und 1 mg/l Leupeptin. Das Homogenat wurde durch ein Baumwollpresstuch gedrückt und durch Zentrifugation geklärt (5 min bei 5.000 · g). Festes Ammoniumsulfat wurde dem Überstand zugegeben, um 35% relative Sättigung zu erhalten, und das Präzipitat, das sich nach 1-stündigem Stehen bei Raumtemperatur bildete, wurde durch Zentrifugation (10 min bei 5.000 · g) entfernt. Der Überstand wurde auf 65% relative Ammoniumsulfat-Sättigung eingestellt, und das über Nacht bei Raumtemperatur gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation (30 min bei 5.000 · g) gesammelt. Nach Wiederauflösen des Pellets in 300 ml 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 6) wurde die Lösung 10 Minuten lang bei 75ºC erhitzt. Das koagulierte unlösliche Material wurde nach Zentrifugation (20 min bei 5.000 · g) verworfen und der Überstand ausgiebig gegen destilliertes Wasser unter Verwendung eines Schlauchs aus benzoylierter Cellulose (Sigma) und mit einer Molekülausschlussgrenze von 2.000 Da dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung durch Zugabe des 10-fach konzentrierten Puffers auf 50 mM. Tris-HCl (pH 9) eingestellt und anschließend über eine mit 50 mM Tris-HCl (pH 9) äquilibierte Q- Sepharose-Fast-Flow- (Pharmacia) Säule (12 · 5 cm) gegeben. Die Proteine in der ungebundenen Fraktion wurden durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu 75% relativer Sättigung präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (20 min bei 5.000 · g) gesammelt und das Pellet wiederum in 15 ml mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) aufgelöst. Dieses Material ist die basische hitzestabile Protein-Fraktion der M. jalapa-Samen, und war das für die Isolierung und Reinigung verwendete Ausgangsmaterial der antimikrobiellen M. jalapa- Proteine.

Beispiel 2

Anti-Pilz-Aktivitäts-Assay

Anti-Pilz-Aktivität wurde, wie zuvor beschrieben, mittels Mikrospektrophotometrie gemessen (Broekaert, WF et al. 1990; FEMS Microbiol. Lett. 69, 55-60).
Die Tests wurden routinemäßig mit 20 ul einer (sterilfiltrierten) Testlösung und 80 ul einer Pilzsporen-Suspension (2 · 10&sup4; Sporen/ml) in Kartoffel-Dextrose-Bouillon (Difco) halber Stärke durchgeführt. Die Kontroll-Mikrokulturen enthielten 20 ul (steriles) destilliertes Wasser und 80- ul Pilzsporen-Suspension. Wenn nicht anders angegeben, war der Testorganismus Fusarium culmorum und die Inkubation erfolgte 48 Stunden lang bei 25ºC. Die prozentuale Wachstumshemmung wird definiert als das 100-fache des Verhältnisses der korrigierten Absorption der Kontroll-Mikrokultur minus der korrigierten Absorption der Testmikrokultur durch die korrigierte Absorption bei 595 nm der Kontroll-Mikrokultur. Die korrigierten Absorptionswerte entsprechen der nach 48 Stunden gemessenen Absorption bei 595 nm der Kultur minus der nach 30 min gemessenen Absorption bei 595 nm. Die Werte der Wachstumshemmung, die weniger als 10% betragen, werden nicht auf den Chromatogrammen dargestellt.

Beispiel 3

Reinigung der antimikrobiellen Proteine aus M. jalapa-Samen

Das Ausgangsmaterial für die Isolierung der antimikrobiellen M. jalapa-Proteine war die basische, hitzestabile, aus den reifen Samen extrahierte Protein-Fraktion. Fig. 1A veranschaulicht, wie die antimikrobiellen Proteine durch Gelfiltrations-Chromatographie gereinigt wurden. Fraktionen mit einem ml wurden auf eine Superose-12-Säule (50 · 1,6 cm) aufgebracht, die zuvor mit PBS äquilibiert wurde. Der Laufpuffer war PBS und die Fließrate betrug 1 ml/min. Das Eluat wurde durch Absorption bei 280 nm überwacht und in 2,5 ml Fraktionen gesammelt, wovon 2 td in dem in Beispiel 2 beschriebenen mikrospektrophotometrischen Anti-Pilz-Test eingesetzt wurden (Ergebnisse werden im oberen Feld von Fig. 1A dargestellt). Bei der Fraktionierung ergab sich bei dem Gemisch eine Auflösung in drei Peaks, bei denen die Anti-Pilz-Aktivität zusammen mit dem am meisten verzögerten Peak eluierte. Die Anti-Pilz-Aktivität enthaltenden Fraktionen (Material aus diesem Peak) wurden vereinigt, gegen 50 mM Na-MES (pH 5) dialysiert und einer Kationenaustausch-Chromato-graphie unterzogen. Aktive, aus drei parallelen Gelfiltrations-Chromatographie-Läufen vereinigte Fraktionen wurden auf eine mit 50 mM Na-MES (pH 5) äquilibierte S-Sepharose- Hochleistungssäule (10 · 1,6 cm) aufgebracht. Die Säule wurde bei 3 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0 bis 150 mM NaCl in 50 mM Na-MES (pH 5) in insgesamt 450 ml eluiert. Durch Messung der Absorption bei 280 nm wurde überprüft, ob das Eluat Protein enthielt (Ergebnisse werden im unteren Feld von Fig. 1B dargestellt). Das Eluat wurde in 15 ml-Fraktionen gesammelt, wovon 2 ul in dem mikrospektrophotometrischen Anti-Pilz-Test eingesetzt wurden (Ergebnisse werden im oberen Feld von Fig. 1B dargestellt). Es wurde keine Anti-Pilz-Aktivität in der ungebundenen Fraktion gefunden. Die Anwendung eines linearen NaCl-Gradienten ließ die Trennung zweier Faktoren mit Anti-Pilz-Aktivität zu. Der erste Faktor, als Mj-AMP1 (Mirabilis jalapa - Antimikrobielles Protein 1) bezeichnet, eluierte als Hauptpeak bei etwa 50 mM NaCl, während der zweite Faktor, analog als Mj-AMP2 bezeichnet, bei 100 mM NaCl eluierte.
Die Reinheit der isolierten antimikrobiellen Faktoren wurde durch eine Umkehr- Phasen-Chromatographie verifiziert. Man erhielt die HPLC-Profile der gereinigten Mj-AMPs durch das Beladen einer mit 0,1% TFA äquilibierten Pep-S- (poröses Kieselgel C&sub2;/C&sub1;&sub8;) Säule (25 · 0,4 cm) (Pharmacia) mit zwei 100 ug-Mj-AMP1- und Mj-AMP2-Mengen. Die Säule wurde bei 1 ml/min mit den folgenden Gradienten eluiert (Lösungsmittel B ist Methanol mit einem Gehalt von 0,1% TFA): 0-1 min. 0% B; 1-3 min. 0-30% B; 3-23 min. 30-80% B; 23-25 min. 80-100% B. Durch Messung der Absorption bei 280 nm wurde überprüft, ob das Eluat Protein enthielt. Fraktionen mit einem ml des Eluats wurden gesammelt, gefriergetrocknet und schließlich in 100 ul destilliertem Wasser aufgelöst, wovon 20 ul in einem mikrospektrophotometrischen Anti-Pilz-Test eingesetzt wurden. Die Chromatographie wurde an einer Waters 600-HPLC-Station durchgeführt.
Fig. 2A und Fig. 2B stellen die HPLC-Profile des gereinigten Mj-AMP1 bzw. Mj- AMP2 dar. Die unteren Felder stellen die Überprüfung des Eluats nach Proteinen durch Messung der Absorption bei 280 nm dar. Die Ergebnisse des mikrospektrophotometrischen Anti- Pilz-Tests werden in den oberen Feldern dargestellt. Sowohl Mj-AMP1 als auch Mj-AMP2 ergaben einzelne, gut aufgelöste Hauptpeaks, die exakt zusammen mit der Anti-Pilz-Aktivität eluierten.

Beispiel 4

Molekulare Struktur der gereinigten antimikrobiellen Proteine

Die molekulare Struktur der gereinigten Mj-AMPS wurde weiter analysiert. Die Elektrophorese erfolgte auf vorgegossenen, käuflichen Gelen (PhastGel High Density von Pharmacia) unter Verwendung einer PhastSystem- (Pharmacia) Elektophorese-Gelkammer. Der Probenpuffer enthielt 200 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1% (Gew./Vol.) SDS, 1 mM EDTA, 0,005% Bromphenolblau und, wenn nicht anders angegeben, 1% (Gew./Vol.) Dithiothreit (DTT). Die Silberfärbung der Proteine im Gel erfolgte nach dem Development Technique File Nr. 210 von PhastSystem (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden). Das Diffusions-Blotten mit der anschließenden Silberfärbung der Blots wurde durchgeführt, wie im Development Technique File Nr. 222 des PhastSystems beschrieben.
Die Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) der nicht reduzierten Mj-AMPs zeigte keine vorhandenen Proteine. Als jedoch Nitrocellulose-Blots von den Gelen hergestellt wurden, erschienen Mj-AMP1 und Mj-AMP2 auf den Blots als Einzelbanden mit Molekulargewichten 8 kDa bzw. 7 kDa. Nicht reduzierte Proteinproben (200 ng) wurden in Probenpuffer ohne DTT aufgelöst, auf einem PhastGel-High-Density- (Pharmacia) Gel aufgetrennt, auf Nitrocellulose geblottet und auf dem Blot silbergefärbt. Myoglobin-Fragmente wurden als Molekulargewichtsmarker verwendet. Die reduzierten Mj- AMPs könnten direkt im Gel nach der SDS-PAGE gefärbt werden, wobei sich ziemlich diffuse Banden in der offensichtlichen Molekulargewichtszone von 3 bis 4 kDA zeigten. Die Proteinproben (200 ng) wurden in Probenpuffer mit DTT reduziert, auf einem PhastGel-High- Density-Gel aufgetrennt und im Gel silbergefärbt. Fig. 3 stellt die SDS-PAGE-Analyse der gereinigten antimikrobiellen Proteine dar. Feld A der Fig. 3 stellt die nicht reduzierten Proteinproben dar: Spur 1, Mj-AMP2; Spur 2, Mj-AMP1; Spur R, Myoglobin-Fragmente mit Molekulargewichten, die rechts von Feld B in kDa angegeben sind. Feld B der Fig. 3 stellt die reduzierten Proteinproben dar: Spur 1, Mj-AMP2; Spur 2, Mj-AMP1; Spur R, Myoglobin- Fragmente als Molekulargewichtsmarker.
Deshalb sind die antimikrobiellen Faktoren anscheinend dimere Proteine, die durch Disulfidbrücken stabilisiert werden und jedes aus zwei identischen Untereinheiten besteht (etwa 4 kDa und 3,5 kDa für Mj-AMP1 bzw. Mj-AMP2). Versuche, das Molekulargewicht der nativen Mj-AMPs mittels Gelfiltration entweder auf Superose-12 oder Superdex zu bestimmen, ergaben deutlich zu niedrig angesetzte Werte (zwischen 1 und 2 kDa), höchstwahrscheinlich aufgrund von Interaktionen mit der Gelmatrix.
Die Perjodsäure-Schiff-(PAS) Färbung reduzierter mittels SDS-PAGE aufgetrennter Mj-AMPs war negativ, was nahelegt, dass ihre Polypeptide nicht glykosyliert sind. Die PAS- Färbung für Glycoproteine erfolgte durch das Verfahren von Zacharius, RM et al (1969; Anal. Biochem. 30 148-152) unter Verwendung von Ovalbumin (3,2% Kohlenwasserstoff) als positive Kontrollprobe. Die pl-Werte von Mj-AMP1 und Mj-AMP2 wurden durch isoelektrische Fokussierung bestimmt und lagen bei etwa 10,5 für beide Proteine. Die isoelektrische Fokussierung erfolgte auf vorgegossenen Immobilin-Trockenstreifen (Pharmacia) unter Verwendung von Markerproteinen im pI-Bereich von 4,7 bis 10,6 (Pharmacia).
Alle Cysteinreste von Mj-AMP2 sind anscheinend an Disulfidbrücken beteiligt, da nicht reduziertes Mj-AMP2 keine freien Thiolgruppen enthielt. Ebenso reagierte Mj-AMP1 nur mit Thiolreagenzien in seinem reduzierten, aber nicht in seinem nicht reduzierten Zustand. Die Bestimmung der Thiolgruppen erfolgte mittels des Dithionitrobenzoesäure-Verfahrens von Ellman, GL (1959; Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-74) unter Verwendung von 10 nmol Protein. Reduzierte Proteinproben wurden durch eine 1-stündige Reaktion bei 45ºC mit 10 mM DTT hergestellt, gefolgt von einer ausgiebigen Dialyse gegen destilliertes Wasser unter Verwendung von Schläuchen aus benzoylierter Cellulose (Sigma) und mit einer Molekülausschlussgrenze von 2 kDa.

Beispiel 5

Aminosäuresequenzierung der Mj-AMPs

Cysteinreste der antimikrobiellen Proteine wurden durch S-Carboxyamidomethylierung wie folgt modifiziert: 100 ug gereinigte Proteinmengen wurden in 150 gl 0,3 M Tris-HCl (pH 8,6), enthaltend 30 mM DTT, aufgelöst und 1 Stunde bei 45ºC umgesetzt. Jodacetamid wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben, und das Gemisch wurde im Dunkeln 1 Stunde lang bei 37ºC aufbewahrt. Die Reaktion wurde schließlich gequenched, indem DTT bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben wurde, und man ließ dann die Reaktion eine weitere Stunde bei 37ºC ablaufen. Die Entsalzung erfolgte mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) auf einer Pep-S- (poröses Kieselgel C&sub2;/C&sub1;&sub8;) (Pharmacia) Säule (25 · 0,4 cm). Die carboxyamidomethylierten Proteine wurden durch Eluieren der Säule mit einem linearen Gradienten von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) bis zu 2-Propanol, das 0,1% TFA enthielt, wiedergewonnen. Die so erhaltenen Protein- Fraktionen wurden einer Aminosäuresequenzanalyse in einem 477A Protein-Sequenziergerät (Applied Biosystems) mit einem online-Nachweis der Phenylthiohydantoin- Aminosäurederivate in einem 120A-Analysator (Applied Biosystems) unterzogen.
Man erhielt nach Behandlung mit Pyroglutamat-Amino-Peptidase (um einen blockierten N-terminalen Rest zu entfernen) und mit Trypsin (um interne Peptide zu erzeugen) die Sequenzdaten für 37 Reste von Mj-AMP1. Die molekulare Masse von Mj-AMP1 wurde durch massenspektrometrische Bestimmung mit schnellem Atombeschuss verifiziert und betrug 3976, Dalton, was exakt der vorhergesagten molekularen Masse entsprach. Die Sequenz war mit Mj-AMP2 homolog, wobei sich Unterschiede bei Aminosäure 28 (ein Asparagin ersetzt durch ein Glycin), Aminosäure 33 (ein Valin ersetzt durch ein Tyrosin) und Aminosäure 35 (ein Arginin ersetzt durch ein Lysin) zeigten. Weiterhin identifizierte man bei Mj-AMP1 ein Glutamin bei Aminosäure 1. Beide Peptide enthalten 6 Cysteinreste. Fig. 4A stellt die vollständigen Aminosäuresequenzen von Mj-AMP1 und Mj-AMP2 dar. Unterschiede werden durch Pfeile gekennzeichnet.
Man fand heraus, dass die Mj-AMP-Sequenzen homolog zu Neurotoxinen waren, die im Gift von Invertebraten gefunden wurden, einschließlich der u-Agatoxine von der Spinne Agelenopsis aperta (Skinner, WS. et al.; 1989; J. Biol. Chem. 264, 2150-2155), Conotoxine von der Meeresschnecke Conus sp. (Olivera, BM. et al.; 1985, Science 230, 1338-1343), Toxine vom Buthotus-Skorpion (Fazal A. et al.; 1989; FEBS Letters 257, 260-2) und Curtatoxine (Stapleton et al.; 1990; J. Biol. Chem. 265(4), 2054-2059). Fig. 4B stellt die Aminosäuresequenzen von Mj-AMP1 und Mj-AMP2 dar, die mit denjenigen der Neurotoxine ausgerichtet wurden. Homologe Aminosäuren sind umrandet. Striche geben die eingeführten Lücken für die optimale Ausrichtung der Sequenzen an.

Beispiel 6

Stabilität der Anti-Pilz-Aktivität der Mj-AMPs

Tabelle 1 fasst die Ergebnisse weiterer Stabilitätsprüfungen der Anti-Pilz-Aktivität der Mj-AMPs zusammen. Die Anti-Pilz-Aktivitätstests wurden nach dem in Beispiel 2 angegebenen Test-Verfahren mit 20 ul Proben durchgeführt, die mit Wachstumsmedium, das Fusarium culmorum-Sporen (2 · 10&sup4; Sporen/ml) enthielt, fünffach verdünnt wurden. Kontrollproben enthielten entweder Mj-AMP1 bei 500 ug/rnl oder Mj-AMP2 bei 100 ug/ml in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7). Die Reduktion erfolgte durch Zugabe von DTT bei 2,5 mM, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation bei 37ºC. Die pH-Wert-Stabilität wurde in den folgenden Puffern getestet: 20 mM Glycin-HCl (pH 2 und 3); 20 mM Diethanolamin-HCl (pH 10); und 20 mM Glycin-NaOH (pH 11). Nach einstündiger Inkubation in den entsprechenden Puffern wurden die Proben 16 Stunden lang gegen 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7) dialysiert. Zur Spaltung wurden Proteasen bei 100 ug/mi zugegeben und 16 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Tabelle 1 Stabilität der Anti-Pilz-Aktivität der Mj-AMPs.
Nach Reduktion ihrer Disulfidbrücken verloren die Mj-AMPs vollständig ihre Anti- Pilz-Aktivität gegenüber F. culmorum. Die Aktivität der nativen Proteine wurde jedoch durch 10-minütige Hitzebehandlungen bis zu 100ºC nicht beeinträchtigt und war stabil über den pH-Bereich von 2 bis 11. Mj-AMP1 war gegenüber der Protease Chymotrypsin sensitiv, war jedoch fast vollständig resistent gegenüber der Spaltung durch Pronase E, Trypsin und Proteinase K, während Mj-AMP2 am sensitivsten gegenüber der Behandlung mit Pronase E war.

Beispiel 7

Anti-Pilz-Wirksamkeit der Mj-AMPs

Die Anti-Pilz-Wirksamkeit der Mj-AMPs wurde an 13 verschiedenen pflanzenpathogenen Pilzen untersucht und mit derjenigen von zwei bekannten Anti-Pilz-Proteinen, Urtica dioica-Agglutinin bzw. UDA (Broekaert, WF. et al.; 1989; Science 245, 1100-1102) und β- Purothionin (Hernandez-Lucas, C. et al.; 1974; Appl. Microbiol. 28, 165-168), verglichen. Die Pilze wurden auf sechs Getreide-Agars unter weißem Fluoreszenzlicht gezogen, und die Sporen wurden geerntet und aufbewahrt wie zuvor beschrieben (Broekaert, WF: et al.; 1990; FEMS Microbiol. Lett. 69, 55-60). Es wurden folgende Pilzstämme verwendet: Alternaria brassicola MUCL 20297, Ascochyta pisi MUCL 30164, Botyris cinerea MUCL 30158, Colletotrichum lindemuthianum MUCL 9577, Fusarium culmorum IMI 180420, Fusarium oxysporum f. sp. pisi IMI 236441, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici MUCL 909, Nectaria haematococca Sammlung Van Etten 160-2-2, Phoma betae MUCL 9916, Pyrenophora tritici- repentis MUCL 30217, Pyricularia oryzae MUCL 30166, Venturia inaequalis MUCL 15927, Verticillium dahliae MUCL 19210. UDA wurde aus den Rhizomen der Brennessel (Urtica dioica), wie zuvor beschrieben (Peumans, WJ. et al.; 1983; FEBS Lett. 177, 99-103), isoliert. Das β-Purothionin würde aus Weizenendosperm mittels des Verfahrens von Redman, DG. und Fisher, N. (1969; J. Sci. Fd. Agric. 20, 427-432) gereinigt.
Tabelle 2 fasst die Ergebnisse zusammen. Die Pilze wurden mit Reihenverdünnungen von Mj-AMP1, Mj-AMP2, UDA und β-Purothionin versetzt, und die prozentuale Wachstumshemmung wurde mittels Mikrospektrophotometrie (wie in Beispiel 2 beschrieben) gemessen. Die erforderliche Konzentration für die 50%ige Hemmung des Wachstums nach 48- stündiger Inkubation wurde als IC&sub5;&sub0;-Wert angesetzt, der aus den Dosis-Antwortkurven errechnet wurde. Der IC&sub5;&sub0; des langsam wachsenden Pilzes Venturia inaequalis wurde nach 10- tägiger Inkubation gemessen.
Die erforderlichen Konzentrationen für die 50%ige Hemmung des Pilzwachstums nach 48-stündiger Inkubation (IC&sub5;&sub0;) variierten von 6 bis 300 ug/ml für Mj-AMP1, von 0,5 bis 20 ug/ml für Mj-AMP2, von 0,5 bis 15 ug/ml für β-Purothionin und von 20 bis über 1.000 ug/ml für UDA, abhängig vom Testorganismus. Unter Zugrundelegung von Durchschnittswerten stellt sich die erhaltene Anti-Pilz-Aktivitätsreihe wie folgt dar: Mj-AMP2 = β-Purothionin > Mj-AMP1 > UDA. Einige Pilze wie B. cinerea, C. lindemuthianum und V. inaequalis sind deutlich sensitiver gegenüber Mj-AMP2 als gegenüber β-Purothionin. Dagegen ist das letztere Protein am wirksamsten bei der Unterdrückung des Wachstums anderer Pilze wie F. oxysporum f. sp. pisi und P. tritici-repentis.
Bei allen getesteten Anti-Pilz-Pröteinen tendierte das Ausmaß der Wachstumshemmung dazu, abzunehmen, wenn die Inkubationszeit erhöht wurde. Beispielsweise stieg der IC&sub5;&sub0;- Wert von Mj-AMP1 auf C. lindemuthianum nach 48-stündiger Inkubationszeit von 6 gg/ml auf 12 ug/ml nach 72-stündiger Inkubationszeit an. Die zeitabhängige Abnahme bei der Anti- Pilz-Aktivität war jedoch für Mj-AMP2 und β-Purothionin weniger deutlich als für Mj-AMP1 oder UDA.
Mj-AMP2 und β-Purothionin produzierten charakteristischerweise auch steilere Dosis- Antwortkurven als Mj-AMP1 oder UDA. Fig. 5 stellt die zeitabhängigen Wachstumshemmkurven der Pilze Colletotrichum lindemuthianum (Felder A, C, E, G) und Alternaria brassicola (Felder B, D, F, H) dar, die bei variierenden Konzentrationen der folgenden Proteine gemessen wurden: Mj-AMP1 (Felder A und B), Mj-AMP2 (Felder C und D), UDA (Felder E und F) und β-Purothionin (Felder G und H). Die prozentuale Wachstumshemmung wurde nach 48 h ( --- ); nach 60 h (0----0) oder nach 72 h ( ---- ) dokumentiert. Tabelle 2 Anti-Pilz-Aktivität der Mj-AMPs und anderer Anti-Pilz-Proteine bei verschiedenen phytopathogenen Pilzen
*NB = nicht bestimmt

Beispiel 8

Anti-Pilz-Aktivität der Mj-AMPs gegen Blattkrankheiten: in vivo-Test

Die basische hitzestabile Protein-Fraktion aus Mirabilis jalapa und eine reine Probe von Mj-AMP1 wurden unter Verwendung folgender Technik bei Pilzerkrankungen des Blattes getestet.
Die Pflanzen wurden in John-Innes-Blumenerde (Nr. 1 oder 2) in Mini-Töpfen mit 4 cm Durchmesser gezogen. Die Protein-Zubereitung wurde unmittelbar vor Gebrauch durch Auflösen in sterilem deionisierten Wasser und Verdünnen bis zur geeigneten Konzentration formuliert. Man nimmt an, dass der Proteinextrakt etwa 1% aktiven Bestandteil enthält. Eine reine Probe von Mj-AMP1 wurde ähnlich hergestellt. Die Formulierungen wurden bei den Pflanzen als Blattspray angewendet. Das Spray wurde bis zur maximalen Zurückhaltung einzelner Tröpfchen angewendet. Wenn das Spray bei Getreide angewendet wurde, wurde Tween 20 bis zu einer Endkonzentration von 0,05% zugegeben. Die Protein-Zubereitung wurde, ein oder zwei Tage bevor die Pflanze mit den Krankheitserregern beimpft wurde, auf das Blattwerk (durch Sprühen) aufgebracht (Schutzanwendung). Die Blatt-Krankheits-erreger wurden durch ein Spray als Sporensuspension auf die Blätter der Testpflanzen aufgebracht. Nach der Beimpfung wurden die Pflanzen in eine geeignete Umgebung gebracht, um das Fortschreiten der Infektion zuzulassen und dann inkubiert, bis die Krankheit sich soweit entwickelt hatte, dass eine Auswertung erfolgen konnte. Der Zeitraum zwischen Beimpfen und Auswertung variierte von vier bis vierzehn Tage, je nach Erkrankung und Umgebung.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 für drei pathogene Pilz dargestellt: Septoria nodorum (Fungi Imperfecti) getestet bei Weizen; Plasmopara viticola (Phycomycet) getestet beim Weinstock und Cercospora beticola getestet bei der Zuckerrübe. Die Kontrolle des Krankheitsverlaufs wurde durch folgende Bewertung dokumentiert: 4 = keine Erkrankung; 3 = Spur - 5% Erkrankung bei unbehandelten Pflanzen; 2 = 6-25% Erkrankung bei unbehandelten Pflanzen; 1 = 26-60% Erkrankung bei unbehandelten Pflanzen; 0 = 61-100% Erkrankung bei unbehandelten Pflanzen. Tabelle 3 Kontrolle des Verlaufs der Pilzerkrankungen in vivo durch Mirabilis-Proteine
Diese Ergebnisse bestätigen, dass der Mirabilis-Proteinextrakt oder das gereinigte Mj- AMP1-Peptid als Fungizid in vivo wirken kann, wenn er oder es als Blattspray angewendet wird.

Beispiel 9

Anti-Pilz-Aktivität der Mj-AMPs gegen Blattkrankheiten: in vitro-Test

Die Protein-Zubereitung wurde, wie in Beispiel 8 definiert, auch auf Aktivität gegen ein Spektrum von pathogenen Pilzen in vitro getestet. Ein abgemessenes Aliquot des formulierten. Materials wurde in einem Agarmedium dispergiert (Petris-Minimalmedium, bestehend aus einer Salzlösung von 2 g Ca(NO&sub3;)&sub2;, 0,725 g MgSO&sub4;, 0,725 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,6 g KCl, 17,2 g NaH&sub2;PO&sub4;, 17,725 g Na&sub2;HPO&sub4; in 1000 ml Wasser plus einer Agarlösung, bestehend aus 10 g Technischem Agar Nr. 3 (Oxoid) und 50 g Saccharose in 800 ml Wasser). Der Agar wurde anschließend mit einer Reihe von pathogenen Pilzen unter Verwendung von entweder Sporensuspension oder mycelhaltigen Pfropfen beimpft. Die Agarplatten wurden dann für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen vor der Auswertung inkubiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Kontrolle des Krankheitsverlaufs wurde mittels folgender Bewertung dokumentiert: 4 = kein Wachstum des pathogenen Pilzes (vollständige Hemmung); 3 = Spuren von Wachstum des pathogenen Pilzes; 2 = begrenztes/gemäßigtes Wachstum des pathogenen Pilzes; 0 = keine Hemmung des pathogenen Pilzes; M = fehlendes Ergebnis. Tabelle 4 Kontrolle des Verlaufs der Pilzerkrankungen in vitro durch Mirabilis-Proteinextrakt
Der Proteinextrakt zeigt ein breites Spektrum an Anti-Pilz-Aktivität bei beiden untersuchten Konzentrationen.

Beispiel 10

Inhibitorische Aktivität der Mj-AMPs gegenüber Hefe

Die inhibitorische Aktivität der Mj-AMPs gegenüber der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde untersucht. Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Mj-AMPs tatsächlich das Hefewachstum bei Konzentrationen von 500 ug/ml oder darüber hemmen. Tabelle 5 Inhibitorische Aktivität der gereinigten Mj-AMPs
+++: vollständige Hemmung
+: leichte Hemmung
-: keine Hemmung

Beispiel 11

Antibakterielle Aktivität der Mj-AMPs: in vitro-Test

Die antibakterielle Aktivität der Mj-AMPs wurde gegen eine Reihe Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien getestet: Bacillus megaterium, Sarcina lutea, Escherichia coli und Erwinia carotovora. β-Purothionin und UDA wurden zum Vergleich getestet (siehe Beispiel 7). Die Tests erfolgten in Weichagarmedium, das 1% Trypton mit oder ohne 1mM CaCl&sub2; und 50mM KCl enthielt. Die Absorption, 595nm, der Kultur wurde nach 48 Stunden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Antibakterielle Aktivität der Mj-AMPs, β-Purothionin und UDA
Die Ergebnisse zeigen, dass die Mj-AMPs tatsächlich das Wachstum der Gram- positiven Bakterien hemmen, während sie keine Aktivität gegen Gram-negative Bakterien zu haben scheinen.

Beispiel 12

Clonierung und Sequenz der Mj-AMP cDNAs

Voll ausgereifte Mirabilis jalapa-Samen wurden von im Freien gezogenen Pflanzen gesammelt, unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt. Die Gesamt-RNA wurde aus 15 g pulverisierten Samen mittels des Verfahrens von De Vries et al. (1988, Plant Molecular Biology Manual, B6, 1-13) extrahiert. Poly(A)&spplus;-RNA wurde durch Oligo(dT)-Cellulose-Affinitäts-Chromatographie gereinigt, wie von Silflow et al. (1979, Biochemistry 18, 2725-2731) beschieben, und ergab etwa 10 g Poly(A)&spplus;-RNA. Doppelsträngige cDNAs wurden aus 2 g Poly(A)&spplus;-RNA nach Gubler und Hoffman (1983, Gene 25, 263-269) unter Verwendung von cDNA Synthesis System Plus von Amersham hergestellt. Die cDNAs wurden in den λgt10-Phagenvektor (Amersham) nach der Ligierung mit EcoRI-Linkern (Amersham) nach den Anweisungen des Herstellers cloniert. Phagen-DNA wurde in vitro mit dem Gigapack II Gold-Verpackungssysten (Stratagene) verpackt.
Eine DNA-Sonde zum Absuchen der cDNA-Bank wurde durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR) wie folgt hergestellt. Es wurden zwei degenerierte Oligonucleotide synthetisiert: OWB3 (5'TGYATHGGNAAYGGNGGNMGNTG) und OWB4 (5'ACNCCRTANCCYTGRTTNGGYTG). OWB3 entspricht den Aminosäuren 1 bis 8 von Mj-AMP2 und hat eine Sense-Orientierung. OWB4 entspricht den Aminosäuren 25 bis 32 von Mj-AMP2 und hat eine Antisense-Orientierung. Die PCR wurde mit Taq-Polymerase unter Standardbedingungen (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Lab Press) unter Verwendung von OWB3 und OWB4 als Amplimere und 25 ng cDNA als Ziel-DNA durchgeführt. Das Temperaturprogramm beinhaltete einen 5-minütigen Anfangsschritt bei 94ºC, 30 Zyklen (1 min bei 94ºC; 2 min bei 45ºC; 3 min bei 72ºC) und einen letzten 10-minütigen Schritt bei 72ºC. Das amplifizierte 100 bp-PCR-Produkt wurde auf einem 3%igen Agarose-Gel (NuSieve, FMC) gereinigt und erneut durch PCR unter denselben Bedingungen amplifiziert, außer dass das Reaktionsgemisch 130 uM dTTp und 70 uM Digoxygenin-11-dUTP anstatt 200uM dTTP enthielt. Das Digoxygenin-markierte PCR-Produkt wurde auf einem 3%igen NuSieve-Agarosegel gereinigt.
Etwa 100.000 Plaque-bildende Einheiten der λgt10-cDNA-Genbank wurden mit dem Digoxygenin-markierten PCR-Produkt durch in situ-Plaque-Hybridisierung unter Verwendung von Nylonmembranen (Hybond -N, Amersham) abgesucht. Die Membranen wurden luftgetrocknet, und die DNA würde auf den Membranen unter UV-Licht (0,15 J/cm²) quervernetzt. Die Hybridisierung erfolgte 16 Stunden lang bei 68ºC in 5 · SSC, 1% Blockierreagenz (Boehringer Mannheim), 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% Natrium-Dodecyl- Sulfat, enthaltend 10 ng/ml der hitzedenaturierten Digoxygenin-markierten Sonde. Unspezifisch gebundenes Sondenmaterial wurde durch zweimaliges 5-minütiges Waschen in 2 · SSC/0,1% SDS bei 25ºC und zweimaliges 15-minütiges Waschen in 0,1 · SSC/0,1% SDS bei 68ºC entfernt. Der Nachweis der Sonde erfolgte nach Anweisung des Herstellers unter Verwendung von an alkalische Phosphatase (Boehringer Mannheim) gebundene anti- Digoxygenin-Antikörper und deren Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (Boehringer Mannheim). Positive Plaques wurden durch zwei zusätzliche Absuchungsrunden mit derselben Sonde unter denselben Bedingungen gereinigt. Insertionen von gereinigten Plaques wurden in die EcoRI-Schnittstelle von pEMBL18 (Dente et al., 1983; Nucl. Acid Res., 11, 1145- 1155) subcloniert. Die Sequenzierung der Nucleotide erfolgte unter Verwendung von Fluorescein-markierten M13-Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Pharmacia) mit einem automatischen ALF-Sequenziergerät (Pharmacia). Die Sequenzanalyse erfolgte mittels der PC-gene Software (Intelligenetics).
Insertionen von zwei positiven Clonen, MJ1 und MJ2, wurden einer Nucleotid- Sequenzanalyse unterzogen.
MJ1 ist 360 Nucleotide lang und scheint an seinem 5'-Ende abgeschnitten zu sein. Die codierende Region enthält 61 Aminosäuren einschließlich der 37 Aminosäuren von Mj- AMP1 am carboxyterminalen Teil. Auch weist der aminoterminale Teil (24 Aminosäuren) all die Merkmale eines Signalpeptids auf, ist aber abgeschnitten, weil ihm ein Methionin am Anfang fehlt. Die nicht-translatierte 3'-Region ist 172 Nucleotide lang und schließt ein mögliches Polyadenylierungs-Signal (AATAAG) an Position 326 und einen 12 Nucleotide langen Poly(A)-Schwanz ein.
MJ2 ist 433 Nucleotide lang und enthält einen offenen Leserahmen von 63 Aminosäuren. Die 36 carboxyterminalen Aminosäuren entsprechen genau der Aminosäuresequenz von Mj-AMP2, während die 27 aminoterminalen Aminosäuren eine vorausgesagte Signalpeptidstruktur-Sequenz aufweisen, die der (-1,-3)-Regel gehorcht (von Heijne, 1985, Mol. Biol., 184, 99-105). MJ2 hat 34 Nucleotide und 210 Nucleotide lange nicht-translatierte Regionen am 5'- bzw. 3'-Ende. Ein mögliches Polyadenylierungs-Signal (AATAAG) befindet sich an Position 399, und 11 Nucleotide stromabwärts folgt ein 18 Nucleotide langer Poly(A)- Schwanz.
Die Fig. 6 und 7 stellen die Nucleotidsequenzen und abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Clone MJ1 bzw. MJ2 dar. Die offenen Kästchen entsprechen der Aminosäuresequenz der reifen Mj-AMPs. Stop-Codons sind mit Sternchen gekennzeichnet, und die möglichen Polyadenylierungsstellen sind unterstrichen.

Beispiel 13

Konstruktion des Expressionsvektors pMDB1

Die Insertionen MJ2 (enthaltend die Mj-AMP2-Sequenz) wurde durch eine BamHI- Spaltung aus dem pEMBL18&spplus;-Vektor entfernt und in eine BamHI-Schnittstelle des Expressionsvektors pFAJ3002 subcloniert. pFAJ3002 ist eine Modifikation des Expressionsvektors pFFl9 (Zimmermans et al., 1990, J. Biotechnology, 14, 333-344), der eine HindIII- Substitution einer EcoRI-Schnittstelle und eine doppelte CaMV35-Enhancersequenz enthält. Ein Clon, der MJ2 in Sense-Orientierung umfasst, wurde als pMDB1 bezeichnet: seine Konstruktion ist in Fig. 8 dargestellt.

Beispiel 14

Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pMDB2 für die extrazelluäre Expression von Mj-AMP2

Die MJ2-CaMV355-Promotor-Insertion wurde mit HindIII aus pMDB 1 herausgespalten und in die einzige HindIII-Schnittstelle von pBinRi subcloniert. pBinRi ist eine modifizierte Version des Pflanzentransformationsvektors pBin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Research, 12: 22, 8711-8721), wobei die einzigen EcoRI- und HindIII-Schnittstellen ausgetauscht sind und ein Wildtyp-npt II-Gen eingefügt ist, wie in Fig. 9 dargestellt. Der neue Pflanzentransformationsvektor wird als pMDB2 bezeichnet und ist in Fig. 10 dargestellt.

Beispiel 15

Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pVT2 für die Expression von Mj-AMP2 in den Vakuolen

Es wurde ein Kontrukt hergestellt, um die richtige Prozessierung und den richtigen Transport von Mj-AMP2 in die Vakuolen transgener Pflanzen sicherzustellen. Es wurde eine Nucleotidsequenz synthetisiert, die ein 15 Aminosäuren langes Propeptid (Bednarek S. Y. et al., 1991, Plant Cell 3, 1195-1206) mit einer zusätzlichen Aminosäure codiert, um die Abspaltung des Propeptids vom reifen Protein zu erleichtern. Unter Verwendung von PCR- Techniken wurde die neue synthetische Sequenz für das Propeptid mit der Pflanzen-cDNA verbunden, die das Mj-AMP2-Peptid und das Signalpeptid (MJ2) codiert, um die als VT bezeichnete Insertion zu ergeben, die eine KpnI-Schnittstelle am 5'-Ende und eine PstI- Schnittstelle am 3'-Ende enthält. Das KpnI-PstI-Fragment (durch PCR erzeugt) wurde in die KpnI-PstI-Schnittstelle von pEMBLI8+ cloniert, um den in Fig. 11 dargestellten Vektor pVT0 zu ergeben. Das KpnI-PstI-Fragment von pVT0 wurde in die KpnI-PstI-Schnittstellen der Pflanzenexpressionskassette pFF19 cloniert, um den in Fig. 12 dargestellten Vektor pVT1 zu ergeben. Das HindIII-EcoRI-Fragment von pVT1 wurde dann in die HindIII-EcoRI- Schnittstelle von pBinRi cloniert, um den als pVT2 bezeichneten und in Fig. 13 dargestellten Pflanzentransformationsvektor zu ergeben.

Beispiel 16

Transformation von Pflanzen

Der Agrobacterium-Stamm LBA4404 ACH5 [pAL4404] wurde unter Verwendung der Methode von de Framond A et al. (Biotechnology 1, 262-9) transformiert, um einen der beiden Vektoren pMDB2 oder pVT2 zu erhalten.
Die Transformation von Tabak erfolgte unter Verwendung von Blattscheiben von Nicotiana tabacum Samsun, basierend auf den Verfahren von Hozsch RB et al. (1985, Science 227, 1229-31), und gemeinsamer Kultur mit pMDB2- oder pVT2- enthaltenden Agrobacterium-Stämmen. Die gemeinsame Kultur erfolgte unter Selektionsdruck von 100 ug/ml Kanamycin.
Transgene Pflanzen (transformiert mit pMDB2 oder pVT2) wurden regeneriert. Diese transgenen Pflanzen werden gerade unter Verwendung von Standard-Western-Blot-Techniken daraufhin analysiert, ob die Expression der neu eingeführten Gene erfolgt ist. Pflanzen, die zu einer konstitutiven Expression der eingeführten Gene fähig sind, werden selektiert und mit sich selbst zur Samengewinnung bestäubt. F1-Sämlinge der transgenen Pflanzen werden weiter analysiert.

Claims

1. Protein mit Anti-Pilz-Wirkung, das aus Mirabilis-Samen isolierbar ist.

2. Protein mit Anti-Pilz-Wirkung, das von DNA codiert wird, die isolierbar ist durch Absuchen eines Pflanzengenombank mit einer Sonde, die mindestens einen Teil der Nucleotidsequenz von Fig. 6 oder Fig. 7 umfaßt.

3. Protein, das aus Mirabilis-Samen isolierbar ist und das zur Klasse der Proteine gehört, die das Protein mit der Aminosäuresequenz von Fig. 6 oder Fig. 7 umfaßt.

4. Protein nach Anspruch 3, das ein Protein mit der Aminosäuresequenz von Fig. 6 umfaßt.

5. Protein nach Anspruch 3, das ein Protein mit der Aminosäuresequenz von Fig. 7 umfaßt.

6. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das synthetisch ist.

7. Rekombinante DNA-Sequenz, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert.

8. Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 7.

9. Vektor, nach Anspruch 7, der eine DNA-Sequenz enthält, die aus einem Pflänzengenom isoliert wurde.

10. Biologisches System von Nicht-Säugern umfassend DNA nach Anspruch 7, das die Expression des codierten Proteins erlaubt.

11. Biologisches System nach Anspruch 10, das ein Mikroorganismus ist.

12. Biologisches System nach Anspruch 10, das eine Pflanze ist.

13. Pflanzen, transformiert mit der rekombinanten DNA nach Anspruch 7.

14. Pflanzen, transformiert mit einer rekombinanten DNA-Sequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz von Fig. 6 codiert.

15. Pflanzen, transformiert mit einer rekombinanten DNA-Sequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz von Fig. 7 codiert.

16. Protein, das von der Expression der DNA nach Anspruch 7 stammt.

17. Anti-Pilz-Zusammensetzung, enthaltend eines oder mehrere der Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder Anspruch 16.

18. Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen, umfassend deren Behandlung mit Proteinen oder Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 3 bis 5 oder Anspruch 16 oder 17.

19. Extraktionsverfahren zur Herstellung von Proteinen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Anspruch 16 aus diese enthaltendem organischen Material, umfassend die Mazerierung und Lösungsmittelextraktion des organischen Materials.

20. Extraktionsverfahren nach Anspruch 19, wobei das Protein anschließend durch Zentrifugation, Chromatographie und Dialyse gereinigt wird.

21. Extraktionsverfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei das organische Material Mirabilis-Samen umfaßt.

22. Extraktionsverfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei das organische Material einen Mikroorganismus nach Anspruch 11 umfaßt.