DE69226525T2

DE69226525T2 - Verwendung von aus blutplättchen gewonnenem wachstumsfaktor zur herstellung eines medikaments zur behandlung von gastrointestinaler geschwüre

Info

Publication number: DE69226525T2
Application number: DE69226525T
Authority: DE
Inventors: Marc F. Needham Ma 02192 Charette; Sandor Brookline Ma 02167 Szabo
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; Creative Biomolecules Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; Creative Biomolecules Inc
Priority date: 1991-04-12
Filing date: 1992-04-10
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2012-04-11
Also published as: JPH06506939A; ES2123004T3; EP0584286A4; AU1795992A; CA2108120A1; ATE169226T1; EP0584286A1; WO1992018153A1; DE69226525D1; EP0584286B1; CA2108120C; AU657960B2

Description

Die Erfindung betrifft im allgemeinen die Verwendung von aus Blutplättchen gewonnenem Wachstumsfaktor zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von gastrointestinaler (GI) Erkrankungen.

Hintergrund der Erfindung

Peptische Geschwüre umfassen Magengeschwüre, die als Läsionen in der Magenwand auftreten, und Duodenalgeschwüre, die tiefe, in der Wand des Duodenums auftretende Läsionen sind, d. h. des obere Bereiches des Dünndarms. Die Hauptabwehr des Körpers gegen die korrosiven Wirkungen potenter gastrischer Verdauungssäfte ist die muköse Bicarbonatschicht, die das Innere des Duodenums und des Magens auskleidet. Duodenalgeschwüre sind Folge eines Ungleichgewichtes der Faktoren, die die natürliche Bicarbonatschicht erhalten und somit zur Zerstörung des Epithels und darunterliegender Bindegewebe führen. Obwohl herkömmliche, gegen Geschwüre gerichtete Therapeutik, einschließlich antisekretorischer Produkte, wie zum Beispiel Cimetidin und Ranitidin, wirksam in der Heilung von Duodenalgeschwüren zu sein scheinen, wird im allgemeinen angenommen, daß sie wirksam sind, da sie die normale Magensäuresekretion verringern. Während die Ver ringerung des Säuregehaltes bei der Verschließung des Geschwürs hilft, stört sie ebenfalls die normale Verdauung. Untersuchungen haben gezeigt, daß 40-60% der mit herkömmlichen Therapien geheilten Geschwüre innerhalb eines Jahres nach Therapie wiederkehren. Es wird angenommen, daß diese hohe Rate wiederkehrender Geschwüre zumindest teilweise der verringerten Anzahl schleimproduzierender Zellen im vernarbten Gewebe, das an der Stelle des geheilten Geschwürs zurückbleibt, zuzuschreiben ist. Es wird vermutet, daß dieser Bereich anfälliger für einen Riß ist, wenn der gastrointestinale Säuregehalt zum Normalwert zurückkehrt.
Geschwürige Colitis ist eine entzündliche Darmerkrankung der Colon und Rektum auskleidenden Schleimhaut, für die es kaum wirksame Behandlungen gibt. Sie ist eine chronische entkräftende Erkrankung mit hoher Morbidität und kann zu colorektalem Krebs führen. Die Erkrankung beschränkt sich hauptsächlich auf die mukösen und submukösen Schichten der Colonwand, wo schwere Entzündungen der colorektalen Schleimhaut, cryptische Abszesse und multiple Geschwüre auftreten. Sie ist durch blutigen Stuhl, Diarrhö, Fieber und Abnormalitäten der Leberfunktion gekennzeichnet. Mehr als 50% aller Patienten mit chronischer geschwüriger Colitis werden zum Beseitigen der beeinträchtigten Gewebe einem operativen Eingriff innerhalb der ersten zwei Jahre ihrer Krankheit unterzogen.
Geschwurige Mukositis ist eine ernste und Dosis- limitiernde toxische Nebenwirkung vieler Arten der Chemotherapie gegen Krebs. Die als Folge dieser Konditionen auftretenden Läsionen verursachen starke Schmerzen und einen Funktionsverlust in betroffenen Patienten. Die Störung der oralen Schleimhaut hat eine systemische Öffnung zum Eintritt der zahlreichen im Mund vorhandenen Mikroorganismen zur Folge. Folglich ist die Mundhöhle der am häufigsten festzustellende Ursprung für Sepsis eines Krebspatienten mit Granulocytopenie. Eine für Mukositis allgemein anerkannte Therapie beschränkt sich auf entweder lokale oder systemische Linderung oder topische antibakterielle Therapie.
PCT Anmeldungsnr. PCT/US89/03467 offenbart die Verwendung eines säureresistenen Fibroblasten Wachstumsfaktors zur Behandlung von GI Geschwüren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF) ein potenter Wachstumsstimulator des Granulationsgewebes ist, das unterhalb der Epithelschicht liegt und den gesamten gastrointestinalen Trakt auskleidet. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung eines innerhalb des gastrointestinalen Traktes eines Säugers auftretenden Geschwürs zur Verfügung, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an PDGF oder einer pharmazeutisch geeigneten Form davon in den gastrointestinalen Trakt des Säugers einschließt. Wie hierin verwendet, erstreckt sich der gastrointestinale Trakt vom Mund bis zum Rektum, einschließlich; d. h. besagter Trakt ist der alimentäre Kanal.
Der Säuger ist z. B. ein Mensch, und dank der Erfindung behandelbare Geschwüre umfassen solche, die im Ileum vorzufinden sind, die regionale Ileitis verursachen, solche, die im Colon vorzufinden sind, die geschwürige Colitis, Crohn Krankheit, Proktitis und andere Formen der entzündlichen Darmerkrankung (IBD) verursachen, solche, die im Mund vorzufinden sind, insbesondere durch Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie verursachte orale Mukositis, und peptische Geschwüre, wie zum Beispiel gastrische Geschwüre, die im Magen vorzufinden sind, oder solche Geschwüre, die im Duodenum oder Ösophagus vorzufinden sind. Vorzugsweise wird PDGF oral oder rektal verabreicht.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "PDGF" auf natürlich vorkommendes PDGF, durch rekombinante DNS- Techniken unter Verwendung entweder eukaryontischer oder bakterieller Wirtszeilen erzieltes PDGF, als auch biologisch aktive PDGF-Mutanten, biologisch aktive PDGF- Fragmente und biologisch aktive Mutanten der biologisch aktiven PDGF-Fragmente. Eine biologisch aktive PDGF- Mutante oder PDGF-Fragment wird den biologisch aktiven Bereich des PDGF behalten, kann sich aber von der Aminosäure-Sequenz des nativen Polypeptides unterscheiden; d. h. einem PDGF-Fragment können Aminosäure-Sequenzen fehlen, die für die biologische Aktivität des Proteins notwendig sind, und einer PDGF-Mutante können Aminosäuren fehlen, die für die biologische Aktivität nicht essentiell sind oder sie kann zusätzliche enthalten oder kann Aminosäuren substituieren, deren Anwesenheit die biologische Aktivität des Proteins nicht beeinflussen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Geschwür" auf eine offene Läsion oder Integritätslücke der Epithelauskleidung des gastrointestinalen Traktes, die eine Erosion des darunterliegenden Granulationsgewebes zur Folge hat.
Andere Kennzeichen und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung der bevorzugten Anwendungen und in den Ansprüchen ersichtlich.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

PGDF ist ein aus Blutplättchen hergestelltes Peptidhormon, das die Regulierung einer Vielzahl biologischer Systeme einschließlich Wundheilung, Arteriosclerosis, Neoplasie, Embryogenese und Knochenmarkfibrose beeinflußt. Bei Wundheilung ruft PDGF sowohl chemotaktische als auch mitogene Antworten in Fibroblasten, glatten Muskel und Gliazellen hervor. Es wird angenommen, daß eine Verletzung der Endothelauskleidungen eine Adhäsion der Blutplättchen am exponierten Bindegewebe an der Wunde verursacht, und diese dabei PDGF ausschütten. Es wird vermutet, daß das abgegebene PDGF chemotaktisch Fibroblasten, Monocyten, Glia- und glatte Muskelzellen rekruitiert, zur Wunde zu migrieren. Es wird angenommen, daß PDGF ebenfalls DNS-Synthese in diesen Zellen stimuliert, wobei deren Proliferationsrate erhöht wird.
Natives PDGF ist ein dimeres Molekül, das aus zwei Polypeptidketten zusammengesetzt ist, von denen eine oder mehrere glycosyliert sein können. Die zwei Ketten (bezeichnet als A oder alpha und B oder beta) sind homolog, aber nicht identisch. Sie haben Molekulargewichte von etwa 17.000-18.000 Daltons und beziehungsweise etwa 13.000-14.000 Daltons. In vivo werden die A- und B- Ketten aus größeren Vorläufern synthetisiert, die anschließend am Amino- und Carboxyterminus prozessiert werden. Die ausgereifte menschliche A- Kette ist aus 110 oder 125 Aminosäuren und verschiedenen N-gekoppelten Zuckerseitenketten zusammengesetzt, wobei Länge und Aminosäure-Sequenz vom Gewebeursprung abhängen. Die vollständig prozessierte menschliche B- Kette wird vom C- sis Gen codiert, und sie enthält 112 Aminosäuren. Biologisch aktives PDGF kann auch als AA- oder BB- Dimer vorkommen mit einem Molekulargewicht von etwa 35.000 Daltons oder beziehungsweise etwa 32.000 Daltons.
Die Erfindung beruht auf der Verwendung von aus Blutplättchen gewonnenem Wachstumsfaktor zur Herstellung eines Pharmazeutikums oder Medikamentes zur Verwendung in der nicht-parenteralen Behandlung von Geschwüren des gastrointestinalen Traktes. Der GI Trakt, vom Mund zum Rektum, enthält eine Epithelschicht, die das Granulationsgewebe bedeckt. Somit enthält der gesamte GI Trakt, der Mund, Ösophagus, Magen, oberes und unteres Intestinum und Colon diese ähnlichen Zelltypen. Deshalb wird die Behandlung eines Geschwüres, z. B. des Ileums, durch PDGF- Verabreichung gemäß der Erfindung ebenfalls auf eine Behandlung von Geschwüren anderer Regionen des GI Traktes, z. B. des Mundes anwendbar sein. Unten sind Experimente, in denen ein Geschwür des Duodenums mit PDGF gemäß der Erfindung behandelt wurde und schneller als ein unbehandeltes Geschwür heilte und Experimente, in denen PDGF bezüglich der Behandlung von oraler Mukositis und geschwüriger Colitis untersucht wurde, beschrieben. Dank der Erfindung ist eine PDGF-Behandlung eines Geschwüres in jeglichem Bereich des GI Traktes anwendbar. Das Behandlungsverfahren schließt in seiner einfachsten Form eine Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an PDGF oder eines pharmazeutisch geeigneten Derivats oder eines Salzes davon an den GI Trakt eines Säugers via parenteraler, aber vorzugsweise oraler oder rektaler Mittel ein.
PDGF kann aus menschlichen Blutplättchen präpariert, durch rekombinante DNS-Techniken hergestellt werden oder kann aus kommerziellen Quellen erhalten werden. Die PDGF-Präparation aus menschlichen Blutplättchen ist in der Literatur beschrieben. Siehe zum Beispiel Heidin et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 3722-3726; Antoniades et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 1809-1813), Antoniades et al., U.S. Patent Nr. 4,479,896, und Lipton et al., U.S. Patent Nr. 4,350,687. Zusätzlich kann PDGF unter Verwendung entweder transformierter eukaryontischer Zellen wie zum Beispiel Hefe, EP Veröffentlichungsnr. 0177957, oder unter Verwendung transformierter prokaryontischer Zellen wie zum Beispiel E. coli (Charette et al. U.S. Patentanmeldungsnr. 07/155,066, eingereicht am 11. Februar 1988, an den selben Rechtsnachfolger übertragen) rekombinant hergestellt werden. PDGF ist ebenfalls von Amgen Corporation (Thousand Oaks, CA), PDGF, Inc. (Boston, MA), Collaborative Research, Inc. (Waltham, MA) und Creative BioMolecules, Inc. (Hopkinton, MA) kommerziell erhältlich.
Eine PDGF-Präparation zur Verabreichung wird durch herkömmliche Techniken bereitgestellt. Zum Beispiel können Flüssigkeitspräparation, Tabletten oder Kapseln durch Anwendung von Additiven hergestellt werden, wie zum Beispiel pharmazeutisch geeignete Träger (z. B. Lactose, Maisstärke, leichtes Kieselsäureanhydrid, microkristalline Cellulose, Saccharose), Bindemittel (z. B. Stärke in alpha-Form, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon), disintegrierende Agenzien (z. B. Carboxymethylcellulose-Calcium, Stärke, gering substituierte Hydroxymethylcellulose), oberflächenaktive Substanzen (z. B. Tween 80 Kao-Atlas), Pluronic F68 (Asahi Denka, Japan); Polyoxyethylen- Polyoxypropylen Kopolymer)), Antioxidanzien (z. B. L- Cystein, Natriumsulfit, Natriumascorbat), Lubricantia (z. B. Magnesiumstearat, Talk) und Ähnliche.
Rektale Präparationen werden ebenfalls durch herkömmliche Techniken hergestellt, zum Beispiel durch Anwendung einer ölartigen Base wie zum Beispiel ein höheres Fettsäureglycerid (z. B. Kakaobutter, Witepsols (eine semisynthetische Base) Dynamite Nobel, Bundesrepublik Deutschland), ein mittleres Fettsäureglycerid (z. B. Miglyols (Dynamite Nobel)) oder ein pflanzliches Öl (z. B. Sesamöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Baumwollsamenöl, Olivenöl).
Bei bestimmten Erkrankungen des unteren GI Traktes, wie zum Beispiel peptische Geschwüre und geschwurige Colitis und andere Formen entzündlicher Darmerkrankungen wird bevorzugt, daß die PDGF-Zusammensetzung mit einem enteralen Kopolymer wie zum Beispiel Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Celluloseacetatphthalat oder Methacrylsäure Kopolymer beschichtet ist, um das PDGF vor Säure und Verdauungsenzymen, wie zum Beispiel Pepsin weiter zu schützen. Diese beschichtete Zusammensetzung dringt in den Bereich des GI Traktes ein, indem deren therapeutischer Wert optimiert ist.
Die Erfindung sorgt ebenfalls für die Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die PDGF oder das Salz davon, und ein oder mehrere stabilisierende, potenzierende oder anderweitig die therapeutische Wirksamkeit des PDGF beeinflussende Agenzien umfassen. Solche Agenzien umfassen: (i) stabilisierende Agenzien wie zum Beispiel Glycosaminglycan, die Heparin, Glucansulfat, wie zum Beispiel Dextransulfat, sulfatierte Cyclodextrine, wie zum Beispiel beta-Cyclodextrintetradecasulfat und B- 1,3-Glucansulfat umfassen; (ii) antisekretorische Agenzien wie zum Beispiel H&sub2;-Rezeptor-Antagonisten (z.B Cimetidin, Ranitidin, Famotidin, Roxatidinacetat), Muscarin-Rezeptor-Antagonisten (z. B. Pirenzepin), Protonenpumpe-(ATPase)-Inhibitoren (z. B. Omerrazon); (iii) cytoprotective Agenzien wie zum Beispiel kolloidale Wismutsalze (z. B. De-Nol), Sucralfat und Prostaglandin Derivate; und (iv) Antacide wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid-Gel, Magnesiumhydroxid und Natriumbicarbonat. Solche Agenzien können entweder getrennt oder als Bestandteil der Zusammensetzung verabreicht werden.
Die relative Menge der stabilisierenden/potenzierenden Agenzien und PDGF kann in Abhängigkeit einiger Faktoren, einschließlich des verwendeten Agens, des Zustandes des Patienten und der Art der Verabreichung variieren. Im allgemeinen ist das Gewichtsverhältnis des Stabilisators zu PDGF etwa 0,1 bis 100, am besten 0,2 bis 20, vorzugsweise etwa 0,5 bis 4.
Stabilisierende Agenzien, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Glycosaminglycane, wie zum Beispiel Heparin, Heparin- Fragmente, Glucansulfate, wie zum Beispiel Dextransulfat, Cyclodextrinsulfat und β-1,3-Glucansulfat. Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Glucansulfat kann auch in Form eines Salzes sein. Wie das Salz kann jegliches pharmazeutisch geeignete Kation eingesetzt werden, wie z. B. Natrium, Kalium, Ammonium, Trimethylammonium und Ähnliche.
Die bevorzugten antisekretorischen Agenzien sind Ranitidin und Cimetidin. Die Menge der verwendeten antisekretorischen Agenzien wird gemäß der oben beschriebenen Faktoren variiert. Zum Beispiel enthält bei der Behandlung peptischer Geschwüre eine bevorzugte Zusammensetzung etwa 10 bis 300 ug PDGF, vorzugsweise 100 ug PDGF und etwa 20 bis 600 mg antisekretorisches Agens, vorzugsweise 200 mg antisekretorisches Agens.
Die bevorzugten Antacide umfassen Aluminiumhydroxid-Gel, Natriumbicarbonat und Magnesiumhydroxid. Das Antacidum kann in Verbindung mit PDGF genommen werden oder kann als eine Komponente in der PDGF-Zusammensetzung selbst inkorporiert sein. Die Menge des Antacidums sollte im allgemeinen 0,5 bis 5,0 g pro Behandlung sein.
Die Menge des verwendeten cytoprotektiven Agens wird von einer Reihe von Faktoren abhängen, einschließlich dem verwendetem Agens. Im allgemeinen werden zwischen 2,5 bis 5 ug Prostaglandin-Derivate pro erwachsenem Menschen und 0,5 ug Sucralfat pro erwachsenem Menschen verwendet.
Ein repräsentatives Beispiel einer PDGF-Präparation ist PDGF in Kombination mit dem Stabilisator Glucansulfat. Wenn dis PDGF-Proteinkomponente der vorliegenden Erfindung mit Glucansulfat in einem wässrigen Medium in Kontakt gebracht wird, wird dies bevorzugt in Anwesenheit zwei- oder dreibasischer Carbonsäuren durchgeführt, um ein noch stabileres PDGF zu erzeugen. Beispiele zweibasischer Carbonsäuren umfassen Weinsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure und Fumarsäure. Beispiele dreibasischer Carbonsäuren umfassen Citronensäure und Iso-Citronensäure. Die oben erwähnten Carbonsäuren können auch in Form eines Salzes vorliegen. Es ist ebenfalls möglich, daß native Carbonsäure in ein wässriges Medium hinzugefügt wird, in das eine adequate Menge einer Lauge oder einer Säure hinzugefügt wird, um den gewünschten pH einzustellen.
Das In-Kontakt-Bringen der PDGF-Proteinkomponente mit Glucansulfat und außerdem mit Carbonsäure in einem wässrigen Medium wird durch Mischen dieser Materialien in einem wässrigen Medium vollbracht. Das wässrige Medium besteht vorzugsweise aus destilliertem Wasser, physiologischer Saline, Glucoselösung, Puffern wie zum Beispiel Phosphatpuffer und tris-Hydroxymethylaminmethan-HCl Puffer. Eine wässrige Lösung der PDGF-Proteinkomponente, eine wässrige Glucansulfatlösung und eine wässrige Carbonsäurelösung können vermischt werden, oder eine Mischung dieser Materialien in Festform kann in Wasser gelöst werden. Die Mischung dieser Materialien wird bei Temperaturen im Bereich von 3 bis 10ºC durchgeführt, vorzugsweise bei etwa 5 bis 9ºC. Die benötigte Zeit zum Mischen ist gewöhnlich im Bereich von etwa 1 bis 30 Minuten. Die resultierende Zusammensetzung kann lyophilisiert werden, während dem Vorgang kann sich ein Komplex bilden und wiedergewonnen werden. Zum Abtrennen und Wiedergewinnen der resultierten stabilisierten PDGF- Zusammensetzung kann ein Gelfiltrations-Verfahren unter Verwendung eines Sephadex-Gels oder eine Ionenaustausch- Chromatographie unter Verwendung von DEAE- oder cm- Toyopearl verwendet werden. Alternativ kann die stabilisierte PDGF-Zusammensetzung so wie sie ist verwendet werden, ohne Trennung oder Wiedergewinnung.

Dosierung und Art der Verabreichung

Die bevorzugte Art der Verabreichung an GI Geschwüre nach der vorliegenden Erfindung ist oral, z. B. durch Tablette, Kapsel, Pastille oder Kaugummi, oder rektal durch Zäpfchen oder Klistier.
Die zum Behandeln von GI Geschwüren in menschlichen erwachsenen Patienten erforderliche Dosierung von PDGF ist im allgemeinen etwa 0,1 ug bis 30 mg pro Tag, vorzugsweise etwa 0,1 ug bis 10 mg, und bevorzugter etwa 1,0 ug bis 3 mg pro Tag und am besten etwa 10 ug bis 300 ug pro Tag. Zur oralen Verabreichung können 10 ug bis 150 ug PDGF oder dessen Salz als eine Tablette oder eine Kapsel zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger, Verdünnungsmittel oder einem anderen geeigneten Vehikel formuliert werden. Eine solche Formulierung wird ein oder viermal täglich verabreicht, um die Dosierung innerhalb des bevorzugten Bereichs zu bringen.
Bezugnehmend auf die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter verständlicher.

PDGF Behandlung eines induzierten Duodenalgeschwürs

In den folgenden Beispielen wurden Geschwüre in Ratten induziert und dann anschließend mit PDGF behandelt.
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (150-200 Gramm) erhielten das Duodenalgeschwür-Ulcerogen Cysteamin-HCl 3 mal am selben Tag oral durch intragastrische Sondenernährung in einer Dosis zu 25 Milligramm (mg) pro 100 Gramm (g) Körpergewicht. Zusätzlich wurde Cortisol subkutan an jede Ratte in einer einzelnen Dosis zu 5 mg Cortisol pro 100 g Körpergewicht verabreicht, um die von der Cysteamin-HCl Verabreichung resultierende Mortalität zu vermindern.
Drei Tage nach Cysteamin-HCl Verabreichung wurden Ratten mit penetrierenden und perforierenden Duodenalgeschwüren durch Laparotomie bestimmt und wurden zufällig in Kontroll- und PDGF-behandelte Gruppen aufgeteilt.
Gruppe 1 beinhaltete neun Ratten mit Geschwüren. Alle neun Ratten in Gruppe 1 erhielten kein PDGF und wurden nur mit Saline behandelt. Die Ratten wurden mit dem Saline-Vehikel durch Sondenernährung zweimal täglich behandelt, bis zur Autopsie am Tag 21, an dem die Geschwüre gemessen und histologische Sektionen genommen wurden.
Gruppe 2 beinhaltete fünf Ratten, von denen jede 100 ng PDGF pro 100 g Körpergewicht durch Sondenernährung zweimal täglich erhielt, bis zur Autopsie am Tag 21, an dem die Geschwüre gemessen und histologische Sektionen genommen wurden.
Gruppe 3 beinhaltete fünf Ratten, von denen jede 500 ng PDGF pro 100 g Körpergewicht durch Sondenernährung zweimal täglich erhielt, bis zur Autopsie am Tag 21, an dem die Geschwüre gemessen und histologische Sektionen genommen wurden.
Geschwürmessungen mit und ohne PDGF Behandlung und in der Kontrollgruppe sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Gruppe 1
Geschwürbefall = 100%
Geschwürkrater = 16,9 ± 6,8 mm²
Gruppe 2
Geschwürbefall = 60%
Geschwürkrater = 2,5 ± 1,1 mm² (p = 0,051)
Gruppe 3
Geschwürbefall = 29%
Geschwürkrater = 2,05 ± 1,4 mm² (p = 0,048)
Histologie und duodenale Sektionen PDGF-behandelter Tiere offenbarten geheilte Geschwüre mit prominentem und dichtem Granulationsgewebe und teilweise oder vollständiger Re-Epithelisierung.
Somit zeigen die Ergebnisse, daß orale PDGF- Verabreichung signifikant die Heilung von Geschwüren des GI Traktes beschleunigen kann.

Magensäure und Pepsin-Sekretion von PDGF-behandelten Ratten

In den folgenden Experimenten wurden Sekretionsgehalte der Magensäure und Pepsin in PDGF-behandelten und Kontrollratten gemessen.
Gruppe 1 beinhaltete acht bis zehn Ratten, die 24 Stunden gefastet hatten und ein Saline-Vehikel und 30 mg Latex unter Ether-Anästhesie bekamen. Die Mägen der Ratten wurden durch eine einstündige pylorische Ligatur eingeengt.
Gruppe 2 beinhaltete acht bis zehn Ratten, die 24 Stunden gefastet hatten und 500 ng PDGF pro 100 g Körpergewicht oral eingespritzt erhielten. Die Mägen der Ratten wurden dann durch eine einstündige pylorische Ligatur eingeengt.
Von jeder Ratte in Gruppe 1 und 2 wurde dann Magensaft gesammelt, zentrifugiert und Aliquots für eine Säuretitration zur Berechnung des Magensaftausstoßes und Pepsin-Bestimmung bearbeitet. Magensäure wurde durch den Säuregehalt der Magensäfte gemessen und die Pepsin- Gehalte wurden gemäß der dem Fachmann bekannten Standard- Protease-Assays bestimmt. Da Pepsin die am häufigsten vorkommende Protease im Magen ist, ist der gesamt Proteasegehalt ein gutes Maß für den Pepsingehalt. Die Aliquots der Magensäfte wurden spektralphotometrisch unter Verwendung von Albumin als ein Substrat untersucht. (Szabo, S. et al., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 1977, 16, 311-323).
Gruppe 1, die Kontrollratten, die Saline anstelle von PDGF erhielten, hatten normale Gehalte an gastrischen Pepsin. In Gruppe 2, die die PDGF-behandelten Ratten enthielt, wurde keine Verminderung des Säurevolumens des Magensaftes oder des Pepsin-Ausstoßes beobachtet. Somit beeinflußt eine PDGF-Behandlung von Geschwüren des GI Traktes nicht die normalen Gehalte an Magensäure oder Pepsin im GI Trakt.

PDGF Behandlung von oraler Mukositis

Orale Mukositis umfaßt Geschwürbildung des Mundes als eine Folge z. B. einer Bestrahlungstherapie oder Chemotherapie. Der Verlauf der geschwürigen Mukositis kann in eine destruktive Phase und eine Heilungsphase aufgeteilt werden. Da sich die Zellen der Basalschicht des oralen Epithels mit einer hohen Rate teilen, sind sie anfällig für die antimitogenen und toxischen Wirkungen der Chemotherapie. Als eine Folge ereignen sich atrophische Veränderungen, an die sich Geschwürbildung anschließt. Dies bildet die destruktive Phase. Nach der Geschwürbildung lösen sich die Läsionen langsam während der Heilungsphase auf. PDGF ist ein bekannter Stimulator der Epithelzellproliferation. Seine Wirksamkeit im Vermindern der Heilungszeit von Mukositis kann durch einem Fachmann bekannte experimentelle Verfahren abgeschätzt werden, von denen ein Beispiel folgt.
Die PDGF-Wirkung auf männliche goldene syrische Hamster, 6-8 Wochen alt (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) wird untersucht. Die Tier-Untersuchungs- Gruppen werden eine Placebo Kontrollgruppe (1) eine Gruppe mit niedriger PDGF-Dosierung (2) und eine Gruppe mit hoher PDGF-Dosierung (3) einschließen. Jede Gruppe wird 12 Tiere enthalten.
Am Tag 0 werden alle fünf Tiergruppen mit dem Mukositis-Induktionsverfahren beginnen. Fünf Fluoruracil (60 mg/kg) wird intraperitoneal am Tag 0 und 5 injiziert. Am Tag 2 wird die rechte Backentaschenschleimhaut oberflächlich mit einer kalibrierten Nadel der Feinheitsnummer 18 gereizt. Schwere geschwurige Mukositis sollte am Tag 7 in mindestens 80% der Tiere induziert sein.
Am Tag 5 werden die Hamster in Gruppe 2 und 3 zweimal täglich PDFG-Applikationen erhalten (etwa 100-500 ng/100 g). Die Tiere werden weiterhin bis zum Tag 18 PDFG erhalten. Die Tiere in Gruppe 1 werden Placebos vom Tag 0 bis Tag 18 erhalten.
Die Vehikelkontrolle oder PDGF-Material werden nach sanftem Trocknen der Backentaschenschleimhaut verabreicht, gefolgt von gleichmäßiger Applikation des Vehikels oder des PDGF-Materials über die muköse Oberfläche. Eine auf Hydroxypropylcellulose basierende Beschichung wird zum Erhalten des Kontaktes des PDGF mit der Schleimhaut verwendet. Diese Beschichtung wird eine mindestens 4 stündige Kontaktzeit bereitstellen.
Am Tag 9 werden zwei Tiere jeder Gruppe für histologische Untersuchungen geopfert. Die rechte Backentaschenschleimhaut und darunterliegendes Bindegewebe werden seziert und in 10% Formalin fixiert. Die Proben werden in Paraffin aufgenommen und zur histologischen Untersuchung präpariert. Sektionen werden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und werden blind von einem Mundpathologen mit Fachkenntniss in Hamster-Histologie untersucht. Das Ausmaß an Atrophie, zellulärer Infiltration, Bindegewebszerfall, Geschwürbildungsgrad und Epithelisierung werden bewertet.
Die oralen Geschwüre werden dann bezüglich einem Hinweis für beschleunigte Heilung relativ zur Kontrollgruppe beobachtet. Die verbleibenden Hamster werden täglich untersucht und gewogen, und die rechte Backentasche wird umgewendet und photographiert.
Die Photographien der Backentaschen werden nummeriert, gemischt und blind durch 3 Beobachter gegen eine Standard-Mukositis-Bewertungstafel bewertet. Die durchschnittliche Mukositis-Bewertung für jede Gruppe wird für jeden Experimenttag bestimmt. Unterschiede zwischen den Gruppen werden unter Verwendung des Student t'-Tests bestimmt. Zusätzlich werden Daten zwischen den Gruppen durch Vergleich der Anzahl der Tiere mit schwerer Mukositis unter Verwendung der statistischen Chi-Quadrat- Analyse bewertet. Die Signifikanz der Unterschiede des durchschnittlichen täglichen Gewichts wird ebenfalls bestimmt. Es wird erwartet, daß eine solche Behandlung mit PDGF die Verletzung durch Heilung des geschwürigen Gewebes der Mundhöhle verringert.

PDGF-Behandlung von geschwüriger Colitis

Geschwürige Colitis umfaßt Geschwüre des Colons. Die Wirkung der PDGF-Behandlung von Colongeschwüren kann durch dem Fachmann bekannte experimentelle Verfahren bewertet werden, von denen ein Beispiel folgt.
Meerschweinchen, 500-550 g (Charles River Loboratories) werden in einzelnen Käfigen und in Temperatur-kontrollierten Räumen gehalten und mit Meerschweinchenfutter (Purina Co., St. Louis, MO) und Wasser nach Belieben gefüttert. Nach 48 stündigem Ruhen werden die Tiere in 3 Experimentgruppen aufgeteilt.
Alle drei Gruppen werden mit destilliertem Wasser gefüttert, das degradiertes Carrageenin (ein aus Seetang gewonnenes Polysaccharid, Glaxo Laboratories, Paris, Frankreich) enthält. Carrageenin ist ein bekannter Induktor der geschwürigen Colitis in Meerschweinchen. In der Kontrollgruppe (1) werden 20 Meerschweinchen Wasser erhalten, das 0% degradiertes Carrageenin enthält. In der Gruppe 2 und 3 werden 20 Meerschweinchen in jeder Gruppe Wasser erhalten, das 1% und beziehungsweise 5% degradiertes Carrageenin enthält. Dies wird 30 Tage fortgeführt. Während dieser Zeitspanne werden die Tiere täglich beobachtet und gewogen.
Die Entwicklung der Colitis wird unter Verwendung mehrerer Kriterien bestimmt: 1) Anwesenheit oder Verlust und/oder blutiger Kot durch visuale Inspektion, 2) Nachweis von okkultem Blut im Kot unter Verwendung von Coloscreen III mit hemocult Developer (Helena Labs, Bumont, TX) und 3) Gewichtsverlust.
Am Tag 25 wird jedes Tier mit intramuskulär verabreichtem Ketamin (3-5 mg/kg) anästhisiert und eine colorektale Schleimhaut-Biopsie zu 3 mm wird unter Verwendung eines kleinen Nasenspiegels entnommen.
Alle Proben werden in 15% Formaldehyd fixiert und histologisch unter Verwendung von Hämatoxylin und Eosin untersucht. Die pathologische Diagnose der geschwürigen Colitis wird durch die Anwesenheit cryptischer Abszesse, lymphocytischer Infiltration, kapillarer Kongestion der Lamina propria und Geschwürbildung der Colonschleimhaut (Onderdonk, Digestive Disease Science 30: 40(s), 1985) festgelegt. Die Schwere der geschwürigen Colitis wird in eine Skala von 0 bis 3 eingestuft und als pathologischer Index gemäß dem Standard-Bewertungssystem ausgedrückt (Onderdonk et al., Amer. J. Clin. Nutrition 32: 258, 1979, Okayasu et al., Gastroenterology 98: 694, 1990).
Am Tag 30 werden 25% der Meerschweinchen, in denen geschwurige Colitis histologisch nachgewiesen wurde, mit PDGF behandelt und die restlichen 25% werden destilliertes Wasser als Kontrolle erhalten. PDGF wird der einen Hälfte der Meerschweinchen in einer geringen Dosis zu 100 ng/100 g verabreicht und die restliche Hälfte wird eine hohe Dosis (500 ng/100 g) PDGF zweimal pro Tag durch eine 3 mm knollenförmige Nadel für eine Dauer von 10 Tagen (Tag 28-37) oral verabreicht erhalten.
Während der Behandlung werden die Tiere klinisch bewertet, und Erhöhungen des Körpergewichtes, Stuhlkonsistenz und Verringerung oder Abwesenheit von Blut in den Stühlen werden aufgezeichnet. Am Tag 37 werden alle Tiere mit einer Überdosis Pentobarbital (> 200 mg/kg) geopfert, und der gesamte Colon wird zur Untersuchung der Wirksam keit einer PDGF-Behandlung in der Heilung Carrageenininduzierter Colongeschwüre entfernt.
Statistische Analysen werden unter Verwendung von SAS wiederholten Messungsanalysen der Varianz (ANOVA) durchgeführt, wobei die Tiere danach durch paarweisen Vergleich durch den Newman-Keuls Test eingestuft werden. Ein signifikanter Gehalt von p< 0,05 wird als signifikant anerkannt. Datenorganisation und -Analyse werden durch das Clinfo Data Management und Analysis System (Brigham and Women's Hospital, Boston, MA) unterstützt. Es wird erwartet, daß eine Behandlung mit PDGF signifikante Heilung des geschwürigen Gewebes des Colons induziert.
Andere Anwendungen der Erfindung sind innerhalb der folgenden Ansprüche enthalten.

Claims

1. Verwendung von aus Blutplättchen gewonnenem Wachstumsfaktor zur Herstellung eines Pharmazeutikums oder Medikaments zur Verwendung in der nicht-parenteralen Behandlung von gastrointestinaler Geschwüre.

2. Die Verwendung nach Anspruch 1, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament zur Behandlung von im Magen anwesender Geschwüre ist.

3. Die Verwendung nach Anspruch 1, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament zur Behandlung eines peptischen Geschwüres oder eines gastrischen Geschwüres ist.

4. Die Verwendung nach Anspruch 1, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament zur Behandlung von im Ileum anwesender Geschwüre ist.

5. Die Verwendung nach Anspruch 1, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament zur Behandlung von im Duodenum anwesender Geschwüre ist.

6. Die Verwendung nach Anspruch 1, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament zur Behandlung von im Colon anwesender Geschwüre ist.

7. Die Verwendung nach Anspruch 6, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament zur Behandlung von geschwüriger Colitis ist.

8. Die Verwendung nach Anspruch 1, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament zur Behandlung von im Mund anwesender Geschwüre ist.

9. Die Verwendung nach Anspruch 8, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament zur Behandlung von oraler Mukositis ist.

10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament für orale Verabreichung formuliert ist.

11. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin besagtes Pharmazeutikum oder Medikament für rektale Verabreichung formuliert ist.