DE69113261T2 - Hybridizierungssonden von dem abstand zwischen den 16s und 23s rna genen und nachweis von nicht-viralen mikroorganismen. - Google Patents

Hybridizierungssonden von dem abstand zwischen den 16s und 23s rna genen und nachweis von nicht-viralen mikroorganismen.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäuresonden, die aus der Spacerregion zwischen Genen für ribosomale Ribonukleinsäure (rRNA) und insbesondere zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S abgeleitet ist, zur Verwendung für den spezifischen Nachweis von nichtviralen Organismen in einer biologischen Probe durch ein Hybridisierungsverfahren.
  • Obwohl in der letzten Dekade bedeutende Fortschritte erzielt wurden, sind für viele Mikroorganismen die diagnostischen Verfahren, die zur Zeit in Gebrauch sind, noch sehr mühselig, unempfindlich und unspezifisch. Viele dieser Fallstrikke können überwunden werden unter Verwendung von Nukleinsäuresonden. Diese Nukleinsäuresonden können zum Beispiel ganze genomische Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Plasmide, Ribosonden oder synthetische Oligonukleotide sein, und diese Sonden können die Spezies der genomischen DNA oder der Messenger-RNA oder der stabilen RNA, die in biologischen Proben vorhanden sind, als Target haben. Obwohl dies nicht nötig ist, ist die Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden bevorzugt. Oligonukleotide können unter Verwendung von chemischen Verfahren in großen Mengen schnell synthetisiert werden, haben eine lange Halbwertszeit und können leicht gereinigt und markiert werden.
  • Für die zuverlässige Diagnose von Mikroorganismen unter Verwendung von DNA-Sondentechnologie sollten die Sonden hochgradig spezifisch (das heißt, sie sollten keine Kreuzreaktionen mit Nukleinsäuren anderer Organismen eingehen) und hochgradig empfindlich (das heißt, fast alle, wenn nicht alle Stämme der Organismen, die nachgewiesen werden sollen, sollten mit der Sonde reagieren) sein. So sollten die bevorzugten Zielsequenzen die folgenden Eigenschaften besitzen:
  • (i) die Sequenz sollte im Genom eines jeden Stammes des in Rede stehenden Organismus vorhanden sein.
  • (ii) Die evolutionäre Diversität der Sequenz sollte so geartet sein, daß auf der einen Seite ausreichende Sequenzdiversität vorhanden ist, um eine Differenzierung der in Rede stehenden Spezies von anderen eng verwandten Spezies zu erlauben und auf der anderen Seite ausreichende Sequenzeinfrierung aufweisen, um den Nachweis aller Stämme der in Rede stehenden Spezies mit der verwendeten Sonde zu ermöglichen.
  • Speziesspezifische Sonden wurden für eine große Zahl von Organismen beschrieben. Für einen kürzlichen Übersichtsartikel siehe Tenover, Clin. Microbiol. Rev. 1:82-101, 1988
  • Allerdings ist es nicht offensichtlich, aus welchem Gen im Genom die spezifische Sondensequenzen abgeleitet werden können. Bei der Sondenentwicklung müssen oft lange Selektionsprozeduren durchlaufen werden, um Fragmente zu erhalten, die sich schließlich als spezifisch für den untersuchten Organismus herausstellen (Korolik et al., J. Gen. Microbiol 134:521-529, 1988; Grimont et al., J. Clin. Microbiol. 21:431-437, 1985; Welcher et al., Nucl. Acids Res. 14:10027-10044, 1986; Donegan et al., Mol. Cell. Probes 3:13-26, 1989; Beaulieu und Roy, Abstract Nr. D249, Abstracts of the Annual Meeting of the American Society for Microbiology [Zusammenfassung des jährlichen Treffens der Amerikanischen Gesellschaft für Mikrobiologie], 1989). An häufigsten ist die Funktion oder Identität des Gens, aus dem das spezifische Fragment abgeleitet ist, nicht bekannt und die Screeningprozedur muß jedesmal blind wiederholt werden, wenn eine andere spezifische Sonde gewünscht wird. Die genaue Identifikation eines Gens, das die vorstehend aufgeführten Kriterien erfüllt und das ubiquitär vorhanden ist, würde die Notwendigkeit für die zeitaufwendigen und langweiligen Auswahlen überflüssig machen.
  • Die rRNA-Gene vom Typ 16S oder 23S werden ziemlich oft für die Sondenentwicklung verwendet, da die Sequenzen leicht erhalten werden können unter Verwendung dei beschriebenen Verfahren und es bekannt ist, das variable Regionen in diesen hochgradig eingefrorenen Genen existieren, die für den speziesspezifischen Nachweis verwendet werden können. Allerdings kann es für gewisse 0rganismen nicht möglich sein, hochgradig spezifische und hochgradig empfindliche Sonden aus den rRNA-Genen vom Typ 16S oder 23S abzuleiten, zum Beispiel weil ihre evolutionäre Nukleinsaurensequenzeinfrierung zu groß ist. Eine andere Konsequenz des eingefrorenen Charakters dieser Gene ist, das die Differenzierung von zwei Organismen oft auf nur einer oder wenigen Abweichungen in der Zielsequenz beruhen, was der Schärfe (stringency) der Hybridisierung Zwänge auferlegt. Ein leichtes Abweichen von diesen Bedingungen kann zu einer Fehlidentifizierung führen.
  • Deshalb wäre die Charakterisierung eines ubiquitären Gens, das die Entwicklung von speziesspezifischen Sonden für die meisten Organismen erlaubt, einschließlich solchen, für die es nicht möglich war, spezifische Sonden aus den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S zu gewinnen, und bevorzugt einen breiteren Schärfebereich besitzen, extrem vorteilhaft.
  • Jede zelluläre Organismus besitzt ribosomale RNA-Cistrone, da ihre Transkribierung essentiell für die Funktion von Ribosomen und die Synthese von Proteinen ist. In allgemeinen sind Gene in mehrfachen Kopien in Genom vorhanden. In Eubakterien wird das rRNA-Gen vom Typ 16S [auch kleine Untereinheits- RNA genannt (srRNA)] am 5'-Ende des rRNA-Cistrons gefunden, gefolgt vom rRNA-Gen vom Typ 23S [auch große Untereinheits-rRNA genannt (lrRNA)]. Das rRNA-Gen vom Typ 5S befindet sich am 3'-Ende des Cistrons. Die rRNA-Gene vom Typ 16S, 23S und 5S sind durch Spacerregionen getrennt, in denen Transfer-RNA-Gene (tRNA) und Signalsequenzen, die in der Verarbeitung nach der Transkribierung eine Rolle spielen, gefunden werden können. Zuerst wird das rRNA-Cistron als ein einzelnes Vorläufer-RNA-Molekül transkribiert. Dieses primäre Transskript wird weiter durch Endo- und Exoribonukleasen zum reifen Produkt verarbeitet. Als Folge sind die Sequenzen von Spacerregionen nicht ausschließlich im Genom des Organismus vorhanden, sondern auch in Vorläufer- RNA-Molekülen und Verarbeitungsprodukten. Die Struktur und die Verarbeitung von eubakteriellen rRNA-Cistronen wird im Detail in der folgenden Literaturstelle diskutiert. Gegenheimer und Apirion, Microbiol. Rev. 45:502-541, 1981.
  • Die Situation in nuklearen Genomen von Eukarioten unterscheidet sich etwas darin, daß ein RNA-Gen vom Typ 5.8S zwischen der srRNA und der lrRNA angeordnet ist, und rRNA-Gene vom Typ 5S in getrennten langen Tandemfeldern angeordnet sind (Perry, Annu. Rev. Biochem. 45:605-629, 1976; Long und Dawid, Annu. Rev. Biochem. 49:727-764, 1980). Allerdings sind rRNA-Cistrone in den Mitochondrien oder Chloroplasten von eukariotischen Organismen von prokariotischer Natur (Borst und Grivell, Nature 290:443-444, 1981).
  • Die Nukleinsäuresequenz der Spacerregion einer sehr begrenzten Anzahl von eukariotischen oder prokariotischen Organismen ist in der Literatur verfügbar (zum Beispiel Young et al., J. Biol. Chem. 254:3264-3271, 1979; Martens et al., System. Appl. Microbiol. 9:224-230, 1987). Aus diesen Daten kann keine zuverlässige Abschätzung der Einfrierung der Nukleinsäuresequenz gemacht werden, und infolgedessen kann nichts geschlossen betreffend der Eignung der Spacerregion für die Auswahl von spezifischen Sonden.
  • Genauer gesagt wurden, was Prokarioten betrifft, Hybridisierungssonden, die von der Spacerregion zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S abgeleitet sind, für den Nachweis von Mikroorganismen in einer biologischen Probe bisher nicht beschrieben, noch sind sie bekannt für die entsprechende Spacerregion zwischen dem kleinen und dem großen Untereinheits-rRNA-Gen der Eukarioten.
  • Was die Eukarioten betrifft, ist die Verwendung eines klonierten Fragmentes eines ribosomalen Genspacers in einer taxonomischen Studie über Leishmania beschrieben (Ramirez und Guevara, Mol. Bioch. Parasitol. 22:177-183, 1987). Allerdings ist die verwendete Region wie auch der Ansatz der Studie für den Fachmann keine Hilfe bei der Verwendung einer Sonde, die aus der Spacerregion zwischen dem kleinen rRNA- und dem großen rRNA-Gen abgeleitet ist, insbesondere mit den folgenden Gründen:
  • (i) Der ribosomale Genspacer, der von Ramirez und Guevara verwendet wurde, ist nicht die Spacerregion zwischen der srRNA und der lrRNA, sondern bezieht sich auf die Sequenz, die zwischen zwei benachbarten rRNA-Cistronen vorhanden ist; solche Spacer werden nur in Eukarioten gefunden zwischen den Wiederholungseinheiten von rRNA-Cistronen und sind nicht bezogen auf den inneren Spacer zwischen dem srRNA und dem lrRNA-Gen.
  • (ü) Die Differenzierung zwischen Leishmania-Taxonen unter Verwendung des Genspacerfragmentes wird erreicht durch Vergleichen von Restriktionsfragmentmustern; das verwendete Fragment ist nicht spezifisch.
  • Infolgedessen ist eine Differenzierung mit dem Fragment unter Verwendung eines einfachen Hybridisierungsprotokolls ohne Hinzuziehung der Southern-Blot- Analyse nicht möglich.
  • Es wird kein Hinweis darauf gegeben, daß hochgradig spezifische Sonden in diesem ribosomalen Genspacer gefunden werden können.
  • So besteht das Ziel der Erfindung darin, speziesspezifische Sonden bereitzustellen, die aus der Spacerregion zwischen rRNA-Genen für einen bestimmten Organismus, wie zum Beispiel eine bakterielle Spezies, abgeleitet sind.
  • Ein andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, DNA-Sonden bereitzustellen, die aus der Spacerregion zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S abgeleitet wurden, zum Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli.
  • Noch eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, DNA-Sonden bereitzustellen, die aus der Spacerregion zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S abgeleitet wurden, zum Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae und Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in einer biologischen Probe durch Hybridisierungstests, wie zum Beispiel den Test mit punktförmigen Flecken (dot-spot), den Strangversetzungstest (strand-displacement), Wettbewerbstest (competition), Sandwichtest oder den Test mit umgekehrter Hybridisierung.
  • Noch eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Sonden und eine einfaches Verfahren für die in-vitro-Diagnose von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli bereitzustellen.
  • Die Erfindung bezieht sich auf eine Sonde, die aus wenigstens etwa 15 Nukleotiden der Spacerregion zwischen rRNA-Genen eines nichtviralen Organismus, insbesondere eines prokariotischen Organismus und spezifisch eines Bakteriums besteht.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf eine Sonde, die aus etwa 15 Nukleotiden bis etwa der Gesamtzahl an Nukleotiden dei Spacerregion und weiter bevorzugt aus etwa 15 bis etwa 100 Nukleotiden der Spacerregion zwischen rRNA- Genen und insbesondere zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S eines nichtviralen Organismus, insbesondere eines prokariotischen Organismus und spezifisch eines Bakteriums besteht.
  • Im folgenden bezeichnet der Ausdruck "Spacerregion" die Spacerregion zwischen rRNA-Genen und insbesondere zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S.
  • Die Erfindung bezieht sich auf eine Sonde zur Verwendung in einem Hybridisierungsassay, das dazu neigt, durch ein Verfahren erhalten zu werden, das es umfaßt, daß ein Oligonukleotid konstruiert wird, das ausreichend komplementär ist, um an eine Sequenz der Spacerregion zwischen rRNA-Genen zu hybridisieren, das so ausgewählt wurde, das es einzigartig für die nichtviralen Organismen, insbesondere für die prokariotischen Organismen und spezifisch für die Bakterien ist, die nachgewiesen werden sollen, wobei die Sequenz der Spacerregion zwischen den rRNA-Genen ausgewählt wird entweder durch
  • Vergleichen der Nukleotidsequenz der Spacerregion zwischen den rRNA- Genen des gesuchten Organismus mit der Nukleotidsequenz der Spacerregion zwischen den rRNA-Genen des nächsten Nachbarn und
  • Auswahl einer Sequenz von etwa wenigstens 15 Nukleotiden, bevorzugt von etwa 15 bis etwa der Maximalzahl von Nukleotiden der Spacerregion und weiter bevorzugt von etwa 15 Nukleotiden bis etwa 100 Nukleotiden der Spacerregion zwischen rRNA-Genen des gesuchten Organismus, wobei die Sequenz wenigstens einen Abweichung gegenüber der Spacerregion zwischen den rRNA-Genen wenigstens eines der engsten Nachbarn aufweist,
  • oder durch
  • Löschen in der Spacerregion des gesuchten Organismus die tRNA-Gene und möglicherweise die Signalsequenzen, um eine verkürzte Spacerregion zu erhalten und
  • Bestimmen durch Versuch und Irrtum einer spezifischen Nukleotidsequenz von wenigsten etwa 15 Nukleotiden, bevorzugt von etwa 15 bis etwa der Maximalzahl von Nukleotiden der Spacerregion und weiter bevorzugt von etwa 15 bis etwa 100 Nukleotiden aus der verkürzten Spacerregion, wobei die Sequenz in der Lage ist, spezifisch mit den Nukleinsäuren (DNA und/oder RNAs) des gesuchten Organismus zu hybridisieren.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf eine Sonde, worin die Spacerregion zwischen rRNA-Genen die transkribierte Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S darstellt.
  • Die Spacerregionen mehrerer Mikroorganismen wurden kloniert, sequenziert und verglichen, wie hier im folgenden skizziert wird. Der Vergleich ergab, daß die Nukleinsäuresequenz der Spacerregion von halbeingefrorener Natur ist im Vergleich mit den rRNA-Genen, die hochgradig eingefroren sind. Infolgedessen kann die Spacerregion besser geeignet sein für die Sondenentwicklung als die rRNA-Gene selbst. Figg. 1, 2 und 10 veranschaulichen, daß es einen hohen Grad an Sequenzhomologie zwischen den eng verwandten Organismen (wie zum Beispiel eng verwandten Stämmen der selben Genospezies) gibt. Etwas weitergehende Sequenzvariationen wurden gefunden zwischen weiter verwandten Organismen, wie in Figg. 3 und 7 dargestellt. Und ein vollständiges Fehlen von signifikanter Sequenzhomologie (mit Ausnahme der tRNA-Sequenzen) konnte gezeigt werden zwischen entfernt verwandten Spezies, wie in Figg. 4 bis 6 dargestellt.
  • In der folgenden Tabelle werden Homologiewerte (in % Sequenzhomologie) von 16S-rRNA-Sequenzen verschiedener Stämme (16S hom) mit den entsprechenden Homologiewerten der Spacerregionen (Spacer hom) verglichen. Die Homologiewerte (16S hom und Spacer hom) wurden berechnet unter Verwendung der "PC Gene"-Software, die von Intelligetics Inc. und Genofit SA (Version 6.01/20. April 1989) geliefert wurde. Die Gesamtzahl der verglichenen Nukleotide ist in Klammern angegeben. Die Ergebnisse zeigen klar, daß die Spacerregion weniger eingefroren ist als die des 16S-rRNA-Moleküls. verglichene Stämme Spacer hom Stamm N. gonorrhoeae B. pertussis B. catarrhalis H. ducreyi B. bronchiseptica N. meningitidis M. nonliquefaciens E. coli
  • Als Ergebnis konnten hochgradig speziesspezifische und empfindliche Sonden von der Sequenz der Spacerregion der relevanten pathogenen, in Untersuchung befindlichen Spezies abgeleitet werden, das heißt von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli. Wertvolle Sonden konnten auch aus der Spacerregion für die Spezies Neisseria meningitidis und Bordetella pertussis abgeleitet werden, für die hochgradig spezifische Sonden in den 16S- und/oder 23S-rRNA-Molekülen nicht gefunden werden konnten. Es ist sehr wahrscheinlich, das spezifische Sonden für andere Spezies als die hier beschriebenen (zum Beispiel andere Campylobacter-Species, andere Haemophilus-Species, andere Actinobacillus-Species, andere Bacteroid- Species, andere Chlamyclia-Species und dergleichen) ebenfalls von den Sequenzen der Spacerregion abgeleitet werden können.
  • Das Target der Sonden, die von der transkribierten Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S abgeleitet wird, sind die genomische DNA und die Vorläufer-RNA-Moleküle, die in den nachzuweisenden Zellen vorhanden sind. Der Nachweis der Vorläufer-RNA-Moleküle ist vorteilhaft, da diese Moleküle einsträngig sind und in mehrfacher Kopie vorhanden sein können. Auf der anderen Seite sind DNA-Moleküle wesentlich beständiger gegen enzymatischen Abbau als RNA-Moleküle. So ist die Auswahl von DNA als Target bevorzugt, wenn biologische Proben nicht verarbeitet können und/oder angemessen gelagert werden können, um RNA-Abbau vor der Hybridisierung zu verhindern.
  • Ein anderer insbesondere bestehender Vorteil von Sonden, die aus den transkribierten Spacerregionen zwischen rRNA-Gene vom Typ 16S und 23S abgeleitet wurden, liegt im Targetnachweis nach enzymatischer Verstärkung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Spacerregion vieler Mikroorganismen kann zum Beispiel enzymatisch verstärkt werden unter Verwendung der gleichen Primer, die in einer eingefrorenen Region des 3'-Endes und des 5'- Endes der rRNA-Gene vom Typ 23S beziehungsweise 16S bereitgestellt sind. Unter Ausnutzung des hochgradig eingefrorenen Charakters der rRNA-Gene können Spacerregionen von vielen Organismen verstärkt werden, wenn bevorzugt gleichzeitig, unter Verwendung der gleichen Reagenzien und des gleichen Protokolls, und danach kann das verstärkte Fragment nachgewiesen werden unter Verwendung einer Sonde, die spezifisch die Spacerregion des interessierenden Organismus als Target hat. Ein vorteilhaftes Verfahren für den gleichzeitigen und spezifischen Nachweis von gleichzeitig verstärkten Fragmenten ist die umgekehrte Hybridisierung.
  • Da die Spacerregion von eingefrorenen Sequenzen flankiert ist, ist das Klonieren und Sequenzieren dieser Region mit Hilfe der PCR-Technik einfach, und das gleiche Protokoll kann auf eine große Vielfalt von Organismen angewendet werden. So werden die Sequenzen der Spacerregionen durch enzymatische Verstärkung von rRNA-Genen unter Verwendung von eingefrorenen Primer erhalten, die in der 16S- oder 23S-rRNA angeordnet sind. Beispiele von grundlegenden Primerpaaren, die verwendet werden können zur Verstärkung von Fragmenten, die die Spacerregionen überspannen, sind:
  • Primerpaar 1: TGGCTCAGAT TGAACGCTGG CGGC und CCTTTCCCTC ACGGTACTGG T
  • Primerpaar 2: TGGGTGAAGT CGTAACAAGG TA und CACGTCCTTC GTCGCCT.
  • Das verstärkte Fragment kann als solches oder als zwei Subfragmente nach Verdauung durch ein Restriktionsenzym, das einen einzigartigen Restriktionsbereich erkennt, kloniert werden. Eine Strategie zur Klonierung von PCR-Produkten in M13 wurde von Metlin et al. (Gene 71:491-499, 1988) beschrieben.
  • Die gleiche Strategie kann verwendet werden zum Klonieren in einem Plasmidvektor. Bei diesem Ansatz werden die grundlegenden Primer an ihren 5'-Enden mit einem Nukleotidsequenz verlängert, die einen einzigartigen Restriktionsbereich umfaßt, was das gerichtete Klonieren des Fragmentes ermöglicht. Nach dem Klonieren in einem Plasmidvektor kann die Spacerregion sequenziert werden unter Verwendung des Dideoxikettenterminierungsverfahrens.
  • Dieser Ansatz ist erkennbar weniger langweilig und zeitaufwendig als die konventionellen Klonierungsverfahren unter Verwendung von Genombanken oder ausgewählten Restriktionsendonukleasefragmenten.
  • Obwohl die Sequenzinformation schneller erhalten wird, wenn die Sequenzierungsreaktionen direkt an PCR-Fragmenten ohne Klonierung durchgeführt werden, ist die Sequenzinformation, die von klonierten Fragmenten erzeugt wird, genauer und vollständiger. In Gegensatz zu den PCR-Fragmenten können klonierte Genfragmente leicht in großen Mengen gereinigt werden, was klar lesbare Sequenzierungsleitern ergibt. Da ein einziger Fehler in der Sondensequenz nutzlose Sonden ergeben kann, ist Genauigkeit gegenüber Geschwindigkeit stark bevorzugt, wenn Sequenzen erhalten werden.
  • Wenn man die Leichtigkeit berücksichtigt, mit der Spacersequenzen mit dem vorstehend skizzierten Ansatz erhalten werden, ist der Nukleotidsequenzvergleich der Spacerregion des Organismus, für den eine Sonde gewünscht wird, mit der Spacerregion des nächsten Nachbarn der bevorzugte Weg, um spezifische Sondensequenzen abzuleiten.
  • Der nächste Nachbarn bedeutet das Taxon, von dem bekannt ist, daß es am engsten verwandt ist, was die DNA-Homologie betrifft, und das vom interessierenden Organismus unterschieden werden muß.
  • Abhängig von der taxonomischen Position des interessierenden Organismus kann der engste Nachbar sehr eng mit dem interessierenden Organismus verwandt sein, wobei er einen mehr als 75%igen Bindungsgrad aufweisen kann, oder ziemlich entfernt verwandt sein, wobei er keinen signifikanten Prozentsatz von DNA-Homologie zeigt. Beim Verfahren über die anfängliche Renaturierungsgeschwindigkeit sind Werte des Bindungsgrades von unter etwa 30% nicht signifikant, bei den Feststoff-DNA:DNA-Hybridisierungsverfahren sind DNA- Homologien mit Werten unter zwischen 10 und 20% Bindungsgrad nicht signifikant.
  • Wenn allerdings die Nukleotidsequenzen der engsten Nachbarn, von denen der interessierende Organismus unterschieden werden muß, nicht verfügbar sind, kann die Auswahl der spezifischen Sonde durch Versuch und Irrtum durchgeführt werden. In diesem Fall muß für jeden einzelnen Organismus eine spezifische Sondenregion, die irgendwo in der Spacerregion liegen kann, experimentell definiert werden. Nur wenige Gebiete in den Spacerregionen, wie zum Beispiel tRNA-Gene oder Signalsequenzen, können unter bestimmten Umständen von vornherein als Sondenregionen ausgeschlossen werden. Da allerdings Spacerregionen zwischen rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S im allgemeinen klein sind, üblicherweise nicht länger als 900 Bp, können gute Sondensequenzen leicht gefunden werden ohne ausuferndes Screening.
  • Als Beispiel sei angegeben, daß für eine Spacerregion zwischen den rRNA-Genen vom Typ 23S und 16S von 700 Bp Länge die "verkürzte" Spacerregion, die durch Löschen des tRNA-Gens und der Signalsequenz erhalten wurde, etwa 500 Bp Länge haben kann.
  • Der Begriff "eine biologische Probe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Exemplar, wie zum Beispiel eine klinische Probe (Eiter, Auswurf, Blut, Urin und dergleichen) eine Umweltprobe, bakterielle Kolonien, kontaminierte oder reine Kulturen, gereinigte Nukleinsäure und dergleichen, in denen die interessierende Targetsequenz gesucht wird.
  • Der Begriff "abgeleitete rRNA-Genspacerregion", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Tatsache, daß die in Betracht gezogenen Sonden mit Sequenzen hybridisieren, die in der Spacerregion zwischen ribosomalen RNA-Genen angeordnet sind, die normalerweise im Genom oder den Transkript-RNA-Molekülen vorhanden sind, unabhängig davon, ob die Sonde selber aus DNA- oder RNA- Fragmenten gebildet wurde, oder ob sie aus klonierten Fragmenten (im Fall der DNA) oder aus synthetischen Oligonukleotiden besteht.
  • Eine erfindungsgemäße Hybridisierungssonde zum Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae enthält:
  • entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 Nukleotide bis zur Maximalzahl von Nukleotiden in der ausgewählten Nukleinsäure einschließt: Gruppe NGI1: Gruppe NGI2:
  • oder eine variante Sequenz, die sich von jeder beliebigen der vorhergehenden Sequenzen unterscheidet durch
  • - entweder Hinzufügen oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden von irgendeinem ihrer entsprechenden Enden,
  • - oder Ändern innerhalb irgendeiner der Sequenzen eine oder mehrere Nukleotide
  • - oder beides,
  • jedoch vorausgesetzt, daß in einem beliebigen der vorstehenden Umstände die besagte Sonde noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Target hybridisiert, wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
  • Eine erfindungsgemäße Hybridisierungssonde zum Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis enthält:
  • entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 Nukleotide bis zur Maximalzahl von Nukleotiden in der ausgewählten Nukleinsäure einschließt: Gruppe NMI1: Gruppe NMI2: Gruppe NMI3: Gruppe NMI4: Gruppe NMI5: Gruppe NMI6:
  • oder eine variante Sequenz, die sich von jeder beliebigen der vorhergehenden Sequenzen unterscheidet durch
  • - entweder Hinzufügen oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden von irgendeinem ihrer entsprechenden Enden,
  • - oder Ändern innerhalb irgendeiner der Sequenzen eine oder mehrere Nukleotide
  • - oder beides,
  • jedoch vorausgesetzt, daß in einem beliebigen der vorstehenden Umstände die besagte Sonde noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Target hybridisiert, wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
  • Eine erfindungsgemäße Hybridisierungssonde zum Nachweis von Stämmen von Branhamella catarrhalis enthält:
  • entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 Nukleotide bis zur Maximalzahl von Nukleotiden in der ausgewählten Nukleinsäure einschließt: Gruppe BCI1: Gruppe BCI2:
  • oder eine variante Sequenz, die sich von jeder beliebigen der vorhergehenden Sequenzen unterscheidet durch
  • - entweder Hinzufügen oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden von irgendeinem ihrer entsprechenden Enden,
  • - oder Ändern innerhalb irgendeiner der Sequenzen eine oder mehrere Nukleotide
  • - oder beides,
  • jedoch vorausgesetzt, daß in einem beliebigen der vorstehenden Umstände die besagte Sonde noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Target hybridisiert, wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
  • Eine erfindungsgemäße Hybridisierungssonde zum Nachweis von Stämmen von Haemophilus ducreyi enthält:
  • entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 Nukleotide bis zur Maximalzahl von Nukleotiden in der ausgewählten Nukleinsäure einschließt: Gruppe HDI1:
  • oder eine variante Sequenz, die sich von jeder beliebigen der vorhergehenden Sequenzen unterscheidet durch
  • - entweder Hinzufügen oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden von irgendeinem ihrer entsprechenden Enden,
  • - oder Ändern innerhalb irgendeiner der Sequenzen eine oder mehrere Nukleotide
  • - oder beides,
  • jedoch vorausgesetzt, daß in einem beliebigen der vorstehenden Umstände die besagte Sonde noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Target hybridisiert, wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
  • Eine erfindungsgemäße Hybridisierungssonde zum Nachweis von Stämmen von Haemophilus influenzae enthält:
  • entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 Nukleotide bis zur Maximalzahl von Nukleotiden in der ausgewählten Nukleinsäure einschließt: Gruppe HII1: Gruppe HII2:
  • oder eine variante Sequenz, die sich von jeder beliebigen der vorhergehenden Sequenzen unterscheidet durch
  • - entweder Hinzufügen oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden von irgendeinem ihrer entsprechenden Enden,
  • - oder Ändern innerhalb irgendeiner der Sequenzen eine oder mehrere Nukleotide
  • - oder beides,
  • jedoch vorausgesetzt, daß in einem beliebigen der vorstehenden Umstände die besagte Sonde noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Target hybridisiert, wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
  • Eine erfindungsgemäße Hybridisierungssonde zum Nachweis von Stämmen von Bordetella pertussis enthält:
  • entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 Nukleotide bis zur Maximalzahl von Nukleotiden in der ausgewählten Nukleinsäure einschließt: Gruppe BPI1:
  • oder eine variante Sequenz, die sich von jeder beliebigen der vorhergehenden Sequenzen unterscheidet durch
  • - entweder Hinzufügen oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden von irgendeinem ihrer entsprechenden Enden,
  • - oder Ändern innerhalb irgendeiner der Sequenzen eine oder mehrere Nukleotide
  • - oder beides,
  • jedoch vorausgesetzt, daß in einem beliebigen der vorstehenden Umstände die besagte Sonde noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Target hybridisiert, wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
  • Eine erfindungsgemäße Hybridisierungssonde zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus pneumoniae enthält:
  • entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 Nukleotide bis zur Maximalzahl von Nukleotiden in der ausgewählten Nukleinsäure einschließt: Gruppe SPI1: Gruppe SPI2: Gruppe SPI3:
  • oder eine variante Sequenz, die sich von jeder beliebigen der vorhergehenden Sequenzen unterscheidet durch
  • - entweder Hinzufügen oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden von irgendeinem ihrer entsprechenden Enden,
  • - oder Ändern innerhalb irgendeiner der Sequenzen eine oder mehrere Nukleotide
  • - oder beides,
  • jedoch vorausgesetzt, daß in einem beliebigen der vorstehenden Umstände die besagte Sonde noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Target hybridisiert, wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
  • Eine erfindungsgemäße Hybridisierungssonde zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus agalactiae enthält:
  • entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 Nukleotide bis zur Maximalzahl von Nukleotiden in der ausgewählten Nukleinsäure einschließt: SAI1: Gruppe SAI2: Gruppe SAI3: Gruppe SAI4:
  • oder eine variante Sequenz, die sich von jeder beliebigen der vorhergehenden Sequenzen unterscheidet durch
  • - entweder Hinzufügen oder Entfernen von einem oder mehreren Nukleotiden von irgendeinem ihrer entsprechenden Enden,
  • - oder Ändern innerhalb irgendeiner der Sequenzen eine oder mehrere Nukleotide
  • - oder beides,
  • jedoch vorausgesetzt, daß in einem beliebigen der vorstehenden Umstände die besagte Sonde noch mit dem gleichen RNA- oder DNA-Target hybridisiert, wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf Hybridisierungssonden zum Nachweis von Stämmen von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli, die eine Sequenz von 15 bis zur Maximalzahl von Nukleotiden enthält, abgeleitet aus der Spacersequenz zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S, wie sie in Fig. 10 dargestellt ist oder der entsprechenden, worin T durch U ersetzt ist, oder ihrem Komplement oder der entsprechenden, worin T durch U ersetzt ist, vorausgesetzt daß die Sonden unter angemessenen Bedingungen spezifisch mit DNA und/oder RNA von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli hybridisieren.
  • In den Sequenzen, die in den Gruppen NGI1, NGI2, NMI1, NMI2, NMI3, NMI4, NMI5, NMI6, BCI1, BCI2, HDI1, HII1, HII2, BPI1, SPI1, SPI2, SPI3, SAI1, SAI2, SAI3 und SAI4 angegeben werden, stehen die Buchstaben für die folgenden Nukleotide.
  • A: Adenylrest
  • C: Cytidylrest
  • G: Guanidylrest
  • T: Thymidylrest
  • U: Uracylrest.
  • Unter den Begriff "Ziel" ist eine Sequenz zu verstehen, die komplementär zu einer der Sequenzen der Gruppen NGI1, NGI2, NMI1, NMI2, NMI3, NMI4, NMI5, NMI6, BCI1, BCI2, HDI1, HII1, HII2, BPI1, SPI1, SPI2, SPI3, SAI1, SAI2, SAI3 und SAI4 ist, wie sie vorstehend definiert wurden.
  • In Fällen, in denen die erfindungsgemäße Sonde Nukleinsäureverlängerungen auf einer Seite oder beiden Seiten der vorstehend definierten Sequenzen umfassen - zum Beispiel Nukleinsäurefragmente von Klonierungsvektoren oder Linkerfragmente, die sich aus der Spaltung der Sonde aus dem Klonierungsvektor heraus ergeben - ist zu berücksichtigen, daß solche Verlängerungen so ausgewählt werden sollten, daß sie die Möglichkeit vermeiden, daß sie sich selbst hybridisieren mit irgendeiner anderen entsprechenden komplementären Nukleinsäuresequenz außerhalb des vorstehend definierten Targets in einer DNA eines beliebigen Mikroorganismus, der wahrscheinlich im erfindungsgemäßen Verfahren geprüft wird, wie es im folgenden definiert wird. Eine solche Hybridisierung wäre von parasitärer Natur und würde die Spezifität der Sonde verringern. Bevorzugte Sonden bestehen aus Nukleinsäurefragmenten, die aus einer beliebigen Sequenz dei Sequenzen aus den vorstehend definierten Gruppen gebildet wurde, wobei die Fragmente 15 bis zu Maximalzahl der Nukleotide der entsprechenden Nukleinsäuresequenz enthalten.
  • Es ist zu berücksichtigen, daß in den genannten Nukleotidsequenzen (und noch in den anderen, die im folgenden genannte werden) das linke Ende der Formeln jeweils dem 5'-Ende und des rechte Ende dem 3'-Ende der jeweiligen betrachteten Sequenz entspricht.
  • Wenn weiter dabei Bezug genommen wird auf eine "Sonde der Gruppe 'X'", wobei 'X' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NGI1, NGI2, NMI1, NMI2, NMI3, NMI4, NMI5, NMI6, BCI1, BCI2, HDI1, HII1, HII2, BPI1, SPI1, SPI2, SPI3, SAI1, SAI2, SAI3 und SAI4, sollte berücksichtigt werden, daß eine solche Sonde eine Sequenz besitzt, die in einer der Nukleinsäuren eingeschlossen ist, die zu der Gruppe gehört, wie sie vorstehend oder im folgenden definiert wird.
  • Es ist auch zu berücksichtigen, daß das Wort "Nukleotid", wie es hier verwendet wird, sich ohne Unterscheidung auf Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide und modifizierte Nukleotide, wie zum Beispiel Inosin bezieht, so weit nicht anders angegeben. Der Ausdruck "Nukleotide" bezieht sich auch auf solche, die weiter Modifikationsgruppen umfassen, wie zum Beispiel chemische Modifikationsgruppen, die ihre Hybridisierungsfähigkeiten nicht fundamental beeinflussen. Solche Modifikationsgruppen zielen zum Beispiel auf die Erleichterung der Kupplung, entweder direkt oder indirekt, mit geeigneten Markierungsmitteln oder Labeln für den nachfolgenden Nachweis der Sonden.
  • Zum Beispiel sind solche Modifikationsgruppen erkennbar durch Antikörper, die ihrerseits spezifisch durch andere Antikörper erkannt werden können, die geeignete enzymatische oder fluoreszierende oder chemiluminiszente Markierungen tragen. Mögliche Markierungsverfahren werden im folgenden weiter beispielhaft ausgeführt.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf Sonden, die eine der Sequenzen, wie sie vorstehend definiert wurden, besitzen und bei denen einige Nukleotide verschieden sind, vorausgesetzt daß das andere Nukleotid beziehungsweise die anderen Nukleotide nicht die Spezifität der Sonde, wie sie vorstehend definiert wurde, beeinträchtigt beziehungsweise beeinträchtigen. Einige Sonden können aus einer der Nukleinsäuren bestehen, die zur einer beliebigen der Gruppen gehört, die vorstehend aufgeführt wurden, oder ein Teil davon sein wobei die Sonden allerdings Nukleotidverlängerungen auf jeder ihrer Seiten einschließen bis zu dem Maß, daß solche Verlängerungen nicht die Spezifität der Sonden für das genetische Material von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli ändern.
  • Die Erfindung stellt deshalb Sonden bereit, die entweder Replikate darstellen (solche, die durch Zahlen gefolgt von "IC" oder "ICR" bezeichnet sind), ausgedrückt als Nukleotidsequenz aus Sequenzen, die in den RNAs oder DNAs der meisten Stämme von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae oder Streptococcus pneumoniae enthalten sind mit gelegentlich einigen unbedeutenden Unterschieden in den Nukleotidsequenzen, oder gebildet sind aus Sequenzen (solche, die durch reine Zahlen oder durch Zahlen gefolgt von einen "R" bezeichnet sind), die komplementär zu den Sequenzen sind, die in den natürlichen DNAs oder RNAs von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae oder Streptococcus pneumoniae eingeschlossen sind.
  • Insbesondere sollte berücksichtigt werden, daß die Zielsequenzen in den betrachteten DNAs aus einer beliebigen der folgenden aufeinanderfolgenden Sequenzen besteht, die in den meisten, wenn nicht allen Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae oder Streptococcus pneumoniae enthalten sind, wobei die Sequenzen möglicherweise nicht signifikanten näturlichen Unterschieden von einem Stamm zum anderen unterliegen, wodurch solche natürlichen Differenzen wahrscheinlich nicht die Hybridisierungsspezifität der erfindungsgemäßen Sonden mit solchen Targets berühren:
  • Im Fall von Neisseria gonorrhoeae
  • Im Fall von Neisseria meningitidis
  • Im Fall von Branhamella catarrhalis
  • Im Fall von Haemophilus ducreyi
  • Im Fall von Bordetella pertussis
  • Im Fall von Haemophilus influenzae
  • Im Fall von Streptococcus pneumoniae
  • Im Fall von Streptococcus agalactiae
  • Die erfindungsgemäßen Sonden können gebildet werden durch Klonierung von rekombinationsfähigen Plasmiden, die Einschübe enthalten einschließlich der entsprechenden Nukleotidsequenzen, wenn notwendig durch Herausschneiden der letzteren aus den klonierten Plasmiden durch Verwendung angemessener Nukleasen und ihre Isolierung, zum Beispiel durch Fraktionierung nach dem Molekulargewicht. Die erfindungsgemäßen Sonden können auch chemisch synthetisiert werden, zum Beispiel durch das konventionelle Phosphotriesterverfahren.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zum Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in einer biologischen Probe, worin das Verfahren umfaßt, daß die biologische Probe, in der die Nukleinsäuren (DNAs und RNAs) für die Hybridisierung verfügbar gemacht wurden, wenn erforderlich unter geeigneter Denaturierungsbedingungen, mit einer erfindungsgemäßen Sonde unter Bedingungen, die die Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Stämme, die in der Probe vorhanden sein können, ermöglichen und daß die Hybride, die möglicherweise gebildet wurden, nachgewiesen werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, Stämme von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneunioniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli von den meisten anderen Organismen zu unterscheiden, wie zum Beispiel von Hefe, Pilzen, Protozonen oder anderen bakteriellen Stämmen und/oder menschlichen Zellen, die leicht in der Probe vorhanden sein können, in der die interessierenden Organismen gesucht werden. Das Verfahren bezieht sich auf den Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli entweder direkt in der Probe oder nach Kultivierung der Stämme.
  • Der Nachweis eines Hybrides kann dahingehend interpretiert werden, daß er bedeutet, daß eine Infektion aufgrund von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae und Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in der biologischen Probe vorhanden war, wenn eine beliebige der Sonden der Gruppen NGI1, NGI2, NMI1, NMI2, NMI3, NMI4, NMI5, NMI6, BCI1, BCI2, HDI1, HII1, HII2, BPI1, SPI1, SPI2, SPI3, SAI1, SAI2, SAI3 beziehungsweise SAI4 verwendet werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind im Verfahren zum Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli die verwendeten Sonden solche, die sowohl mit DNA allgemein und RNA von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae und Campylobacter jejuni und Campylobacter coli hybridisieren, die in der biologischen Probe vorhanden sein können.
  • Die Hybridisierungsbedingungen können überwacht werden, indem man auf verschiedene Parameter vertraut, zum Beispiel die Hybridisierungstemperatur, die Natur und Komponentenkonzentration der Medien und die Temperatur, unter der die gebildeten Hybride gewaschen werden.
  • Die Hybridisierungs- und Waschtemperatur ist in einem oberen Wert begrenzt gemäß der Sonde (ihrer Nukleinsäurezusammensetzung, Sorte und Länge) und der maximalen Hybridisierungs- oder Waschtemperatur der Sonden, die hier beschrieben sind, auf etwa 30ºC bis 58ºC. Bei höheren Temperaturen konkurriert das Duplexieren mit dem Dissoziieren (oder Denaturieren) der zwischen Sonde und Target gebildeten Hybride.
  • Ein bevorzugtes Hybridisierungsmedium enthält etwa 3 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), etwa 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1 und 20% deionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll , 0,02% Rinderserumalbumin, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml durch Scherkräfte denaturierte Lachsperma-DNA.
  • Ein bevorzugtes Waschmedium enthält etwa 3 x SSC, etwa 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1 und 20% deionisiertes Formamid. Andere Hybridisierungs- oder Waschmedien können auch verwendet werden.
  • Wenn allerdings Modifikationen eingeführt werden, sei es in den Sonden oder in den Medien, sollten die Temperaturen, bei denen die Sonden verwendet werden können, um die erforderliche Spezifität zu erhalten, geändert werden gemäß bekannten Beziehungen, wie zum Beispiel denen, die in der folgenden Literaturstellen beschrieben sind: B. D. Hames und S. J. Higgins, (Herausgeber), Nucleic acid hybridization. A practical approach (Nukleinsäurehybridisierung. ein praktischer Ansatz), IRL Press, Oxford, UX, 1985.
  • In diesem Zusammenhang sollte auch angemerkt werden, daß im allgemeinen DNA:DNA-Hybride weniger stabil sind als RNA:DNA- oder RNA:RNA-Hybride. Abhängig von der Natur des nachzuweisenden Hybrids sollten die Hybridisierungsbedingungen entsprechend angepaßt werden, um einen spezifischen Nachweis zu erreichen.
  • Das Verfahren zum Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli im allgemeinen kann gemäß der Erfindung ausgeführt werden durch angemessene Anpassung der Hybridisierungstemperatur auf einen Wert, bei dem die Hybridisierung spezifisch ist. In einem solchen Fall ist das Waschen unter schärferen Bedingungen nicht notwendig.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens muß die Hybridisierungstemperatur nicht notwendigerweise auf einen Wert angepaßt werden, an dem die Hybridisierungs spezifisch ist, und es kann insbesondere eine niedrigere Temperatur als die Temperatur, bei der die Hybridisierung spezifisch ist, verwendet werden, vorausgesetzt, daß ein Waschen durchgeführt wird bei einer Temperatur, die dem Wert entspricht, bei dem die Hybridisierung spezifisch ist.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NGI1 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 50ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NGI2 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 50ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NMI1 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 45ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NMI2 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 45ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NMI3 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 40ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NMI4 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 48ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsförm des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NMI4 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 48ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NMI5 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 58ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe NMI6 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 50ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Branhamella catarrhalis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe BCI1 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 30ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Branhamella catarrhalis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe BCI2 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 42ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Bordetella pertussis (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe BPI1 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 55ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Haemophilus ducreyi (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe HDI1 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 40ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Haemophilus influenzae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe HII1 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 55ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Haemophilus influenzae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe HII2 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 35ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus agalactiae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe SAI1 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 35ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus agalactiae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe SAI2 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 45ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus agalactiae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe SAI3 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 45ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus agalactiae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe SAI4 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 37ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus pneumoniae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe SPI1 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 52ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus pneumoniae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe SPI2 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 45ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Stämmen von Streptococcus pneumoniae (und zur Unterscheidung derselben von anderen bakteriellen Taxonen) mit einer Sonde der Gruppe SPI3 werden die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur angemessen auf etwa 45ºC angepaßt, wobei die Medien die sind, die vorstehend definiert wurden.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die spezifisch für Neisseria meningitidis ist, das heißt, eine Sonde der Gruppe MNI1, NMI2, MNI3, MNI4, MNI5 oder MNI6,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungsreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Neisseria meningitidis durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die spezifisch für Neisseria gonorrhoeae ist, das heißt, eine Sonde der Gruppe NGI1 und NGI2,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Neisseria gonorrhoeae durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Branhamella catarrhalis, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die ausgewählt ist unter denen, die spezifisch sind für Branhamella catarrhalis, das heißt, eine Sonde der Gruppe BCI1 und BCI2,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Branhamella catarrhalis durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Haemophilus ducreyi, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die ausgewählt ist unter denen, die spezifisch sind für Haemophilus ducreyi, das heißt, eine Sonde der Gruppe HDI1,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Haemophilus ducreyi durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Bordetella pertussis, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die ausgewählt ist unter denen, die spezifisch sind für Bordetella pertussis, das heißt, eine Sonde der Gruppe BPI1,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Bordetella pertussis durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Haemophilus influenzae, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die ausgewählt ist unter denen, die spezifisch sind für Haemophilus influenzae, das heißt, eine Sonde der Gruppe HII1 oder HII2,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Haemophilus influenzae durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Streptococcus agalactiae, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die ausgewählt ist unter denen, die spezifisch sind für Streptococcus agalactiae ist, das heißt, eine Sonde der Gruppe SAI1, SAI2, SAI3 oder SAI4,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erförderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Streptococcus agalactiae durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Streptococcus pneumoniae, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die ausgewählt ist unter denen, die spezifisch sind für Streptococcus pneumoniae ist, das heißt, eine Sonde der Gruppe SPI1, SPI2 oder SPI3,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Streptococcus pneumoniae durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Ausrüstung zum spezifischen Nachweis von Stämmen von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli, die folgendes enthält:
  • Eine Sonde, die ausgewählt ist unter denen, die spezifisch sind für Campylobacter jejuni und Campylobacter coli ist,
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind zur Herstellung des Puffers, der es ermöglicht, eine Hybridisierungreaktion zwischen dieser Sonde und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stammes der Campylobacter jejuni und Campylobacter coli durchzuführen,
  • das Hilfsmittel zum Nachweis der sich ergebenden Hybride aus der vorhergehenden Hybridisierung, wenn es angemessen ist.
  • Die erfindungsgemäßen Sonden können in einem Sandwichhybridisierungssystem verwendet werden, das die Spezifität eines Assays auf Grundlage einer Nukleinsäuresonde verbessert. Das Prinzip und die Verwendung von Sandwichhybridisierungen in einem Assay auf Grundlage von Nukleinsäuresonden wurde bereits beschrieben (zum Beispiel Dunn und Hassel, Cell, 12: 23-36, 1977; Ranki et al., Gene, 21: 77-85, 1983). Obwohl Direkthybridisierungsassays eine günstige Kinetik besitzen, sind Sandwichhybridisierungen vorteilhaft in Bezug auf ein höheres Signalrauschverhältnis. Darüber hinaus können Sandwichhybridisierungen die Spezifität eines Assays auf Grundlage einer Nukleinsäuresonde verbessern.
  • Wenn ein Sandwichhybridisierungsassay gut ausgearbeitet ist, maximiert es tatsächlich die Spezifität eines Tests auf Grundlage einer Nukleinsäuresonde, wenn zwei Sonden verwendet werden, die zwei verschiedene Nukleinsäureabschnitte ein und desselben Organismus erkennen. Die einzigen Anforderungen, die erfüllt werden müssen, sind die, daß beide Sonden (i) an das gleiche Nukleinsäuremolekül des Zielorganismus hybridisieren und (ii) nicht an die gleichen Organismen hybridisieren, die nicht Ziel sind.
  • Für zwei gegebene Sonde I und II kann das Sandwichhybridisierungssystem wie folgt beschrieben werden:
  • Sonde I hybridisiert an die Nukleinsäure der Organismen A und B (nicht an C); Sonde II hybridisiert an die Nukleinsäure der Organismen A und C (nicht an B).
  • Da es absolut erforderlich ist, daß beide Sonden an die Zielnukleinsäure hybridisieren, wird ein nachweisbares Signal nur erzeugt, wenn die Nukleinsäure von Organismus A in der Probe vorhanden ist. Es ist offensichtlich, daß, wenn eine der Sonden spezifisch für den Organismus ist, der nachgewiesen werden soll, die andere Sonde aus einer beliebigen spezifischen oder nichtspezifischen Sequenz zusammengesetzt sein kann, vorausgesetzt, daß sie an das gleiche Zielmolekül wie die erste Sonde hybridisiert.
  • Die erfindungsgemäßen Sonden können in einem Sandwichhybridisierungsassay verwendet werden, das spezifisch ist für Stämme von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae oder Campylobacter jejuni und Campylobacter coli, jeweils in Kombination mit einer anderen nichtspezifischen oder spezifischen Sonde, die an das gleiche Zielmolekül hybridisiert. Im Sandwichhybridisierungsverfahren können die Sonden gleichzeitig oder nicht zur biologischen Probe zugegeben werden, in der die Ziel-DNA oder -RNA gesucht wird.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist für Neisseria gonorrhoeae
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Neisseria gonorrhoeae durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Neisseria meningitidis in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist für Neisseria meningitidis
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Neisseria meningitidis durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Branhamella catarrhalis in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist für Branhamella catarrhalis
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Branhamella catarrhalis durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Haemophilus ducreyi in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist für Haemophilus ducreyi
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Haemophilus ducreyi durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Haemophilus influenzae in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist Haemophilus influenzae für
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Haemophilus influenzae durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Bordetella pertussis in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist für Bordetella pertussis
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Bordetella pertussis durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Streptococcus agalactiae in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist für Streptococcus agalactiae
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Streptococcus agalactiae durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Streptococcus pneumoniae in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist für
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Streptococcus pneumoniae durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für ein Sandwichhybridisierungsassay zum in-vitro-Nachweis von Stämmen von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • wenigstens zwei Sonden, die auf das gleiche Nukleinsäuremolekül zielen und von denen wenigstens eine spezifisch ist für Campylobacter jejuni und Campylobacter coli
  • den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind für die Herstellung des Puffers, der es erlaubt, die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und der DNA und/oder RNA eines Stammes von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli durchzuführen,
  • eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierungsreaktion ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die erfindungsgemäßen Sonden können auch mit einem Konkurrenzhybridisierungsprotokoll verwendet werden.
  • Bei einer Konkurrenzhybridisierung besteht eine Konkurrenz zwischen der Hybridbildung der Zielmoleküle mit der spezifischen Sonde und der Hybridbildung der Sonde mit ihrem Komplement. Je mehr Zielmoleküle vorhanden ist, so geringer ist die Menge der Hybrides, das zwischen der Sonde und ihrem Komplement gebildet wird. Ein positives Signal, das anzeigt das das spezifische Zielmolekül vorhanden ist, besteht in einer Verringerung der Hybridisierungsreaktion im Vergleich zu einem System, dem kein Zielmolekül zugegeben wurde. In einer bestimmten Ausführungsform wird die spezifische Oligonukleotidsonde angemessen markiert und mit dem Zielmolekül hybridisiert. Als nächstes wird die Mischung auf einen Empfänger übertragen (zum Beispiel eine Mikrotiter- Tellervertiefung (microtiter dish well)), in dem ein Oligonukleotid, das komplementär zur spezifischen Sonde ist, fixiert ist, und die Hybridisierung fortgesetzt. Nach dem Waschen werden Hybride zwischen dem komplementären Oligonukleotid und der Sonde gemessen, bevorzugt quantitativ, gemäß der verwendeten Markierung.
  • Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können entweder als Verstärkungsprimer in der Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR, Mullis und Faloona, Methods in Enzymology 155:335-350, 1987) zur Erzeugung spezifischer, enzymatisch verstärkter Fragmente und/oder als Sonden zum Nachweis von Fragmenten, die zwischen dem umklammernden Oligonukleotidprimern verstärkt wurden, verwendet werden.
  • Die Spezifität eines PCR-gestützten Hybridisierungsassays kann auf verschiedenen Ebenen gesteuert werden.
  • Der Verstärkungsprozeß oder der Nachweisprozeß oder beides können spezifisch sein. Der zweite Fall, der die höchste Spezifität ergibt, ist bevorzugt. Ein solcher hochgradig spezifischer, PCR-gestützter Test kann entwickelt werden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden.
  • Es kommt allerdings manchmal vor, daß ein nichtspezifischer Verstärkungsprozeß unter Verwendung von eingefrorenen Primerumklammerungen beim Nachweis der erfindungsgemäßen Sonden, gekoppelt an einen spezifischen Nachweis vorteilhaft sein kann, um den Verstärkungsprozeß in einer solchen Weise zu standardisieren, daß es für eine große Vielfalt von Organismen verwendet werden kann.
  • Verstärkungsprimer, die in einem standardisierten Verstärkungsprozeß verwendet werden sollen, können in der eingefrorenen Region des rRNA-Gens vom Typ 16S und 23S gefunden werden, das die Spacerregion flankiert (siehe Beispiel 1).
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum in-vitro-Nachweis eines Mikroorganismus oder zum gleichzeitigen in-vitro-Nachweis von mehreren Mikroorganismen, die in einer biologischen Probe enthalten sind, unter Verwendung einer beliebigen erfindungsgemäßen Sonde, die spezifisch für die Mikroorganismen ist, die nachgewiesen werden sollen, worin die DNA und/oder RNA, die in der biologischen Probe vorhanden ist (und die Zielsequenz umfaßt), markiert ist, bevorzugt unter Verwendung von enzymatischer Verstärkung mit wenigstens einem Satz von Primern, die die Sondenregion flankieren, und worin die biologische Probe mit einer Membran in Kontakt gebracht wird, auf der eine oder mehrere Oligonukleotidsonden als punktförmige Flecken an bekannten Positionen aufgebracht sind, in einem Medium, das die spezifische Hybridisierung der verstärkten Zielsequenz und der Sonden auf der Membran ermöglicht, und worin die Hybride, die sich aus der Hybridisierung ergeben, durch angemessene Einrichtungen nachgewiesen werden.
  • Wenn eine Verstärkung nötig ist, zielt sie darauf, die Zielsequenz zu verstärken, wodurch die Verstärkung der flankierenden Regionen der Zielsequenz auch auftritt) und nur die verstärkten Regionen zu markieren.
  • Wenn genug Zielsequenz in der biologischen Probe vorhanden ist, ist eine Verstärkung nicht erforderlich.
  • In solchen Fällen muß eine Markierung ausgeführt werden, zum Beispiel entweder chemisch oder durch Zugabe von spezifischen Farbstoffen vor der Hybridisierung, und es ist anzumerken, das alle DNA und/oder RNA, die in der biologischen Probe vorhanden ist, markiert wird.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis eines Mikroorganismus oder den gleichzeitigen in-vitro-Nachweis von mehreren Mikroorganismen, die in einer biologischen Probe vorhanden sind, wobei der Ausrüstung folgendes enthält:
  • wenigstens eine der erfindungsgemäßen Sonden, die spezifisch für die Mikroorganismen, die nachgewiesen werden sollen, ist und auf einer Membran als punktförmige Flecken aufgebracht ist,
  • die erforderlichen Primer zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die in der Zielsequenz der genannten Sonde enthalten ist, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind, um den Puffer zu erzeugen, der die enzymatische Verstärkung ermöglicht und/oder die Hybridisierungsreaktion ermöglicht zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs der Mikroorganismen, die nachgewiesen werden sollen, durchzuführen.
  • die Einrichtung zum Nachweis der sich bei der vorhergehenden Hybridisierung ergebenden Hybride, wenn es angemessen ist.
  • Das vorstehend genannte Verfahren und die vorstehend genannte Ausrüstung nutzen ein dot-blot-Assay mit umgekehrter Hybridisierung, wie zum Beispiel das Dot-blot-Assay mit umgekehrter Hybridisierung, das beschrieben wurde von Saiki et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6230-6234, 1989).
  • In diesem Fall können die Zielsequenzen zuerst enzymatisch verstärkt werden unter Verwendung von PCR mit am 5'-Ende biotinylierten Primern. In einem zweiten Schritt werden die verstärkten Produkte durch Hybridisierung mit spezifischen Oligonukleotiden nachgewiesen, die auf einem festen Träger immobilisiert sind. Mehrere Modifikationen dieser Technik können vorausgesehen werden, wie zum Beispiel die, die in Beispiel 2 beschrieben ist. Zum Beispiel kann diese Technik insbesondere vorteilhaft sein für die gleichzeitigen und spezifischen Nachweis einer Vielfalt von Mikroorganismen, die in einer bestimmten klinischen Probe vorhanden sein können, nach PCR mit universellen Primern, die die Spacerregion flankieren, und Hybridisieren mit einer Membran, auf der verschiedene spezifische Oligonukleotidsonden für die interessierenden Organismen als punktförmige Flecken aufgebracht sind. Einige Beispiel von vorteilhaften Feldern aus spezifischen Oligonukleotidsonden, die in einem Assay mit umgekehrter Hybridisierung verwendet werden können, wie es vorstehend beschrieben wurde, sind:
    • (i) Sputum-panel:
  • Moraxella (Branhamella) catarrhalis
  • Streptococcus pneumoniae
  • Haemophilus influenzae
    • (ii) CSF-panel:
  • Neisseria meningitides
  • Haemophilus influenzae
  • Streptococcus pneumoniae
    • (iii) Urogenitales Panel: Neisseria gonorrhoeae
  • Haemophilus ducreyi
  • Chlamydia trachomatis
  • Treponema pallidum
  • Offensichtlich können diese Felder erweitert werden durch Zusetzen von Sonden für andere klinisch relevante Mikroorganismen. Auch Felder für andere klinische Proben, wie zum Beispiel Proben, die von Zahntaschen oder Blutproben kommen, können interessant sein.
  • Für das PCR können auch nichtuniverselle, eingefrorene Primer, zum Beispiel Primer, die in der Spacerregion selbst lokalisiert sind, verwendet werden, und das PCR kann durchgeführt werden entweder mit einem Satz von Primer oder mit verschiedenen Sätzen von Primern im selben Reaktionsgefäß.
  • Umgekehrte Hybridisierung kann auch durchgeführt werden ohne einen Verstärkungsschritt. In diesem besonderen Fall müssen die in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren markiert oder spezifisch oder nicht spezifisch modifiziert werden, zum Beispiel chemisch oder durch Zugabe von spezifischen Farbstoffen vor der Hybridisierung.
  • In den meisten Fällen ist die Anzahl der spezifischen Sonden für die interessierenden Organismen, die von den Spacerregionen abgeleitet werden können, nicht auf die in diesen Text beschriebenen Sonden begrenzt.
  • Für einige Organismen werden nur eine oder zwei Sonden beschrieben zur Demonstration der Eignung der Spacerregionen für das Entwickeln hochgradig spezifischer und hochgradig empfindlicher Sonden für eine Vielzahl von Bakterien. Die einzige Ausnahme ist Bordetella pertussis, für die nur eine bestimmte Region (von Nukleotid 271 bis 299 in der Bordetella-pertussis-Sequenz, Fig. 2, oberste Zeile) der Spacerregion eine spezifische Sequenz besitzt. Allerdings können von der Sequenz der Spacerregion der Bordetella pertussis Sonden abgeleitet werden, die wertvoll beim gleichzeitigen Nachweis von eng verwandten Bordetella-Spezies sein können. Sonden, die Bordetella-Spezies nachweisen, die nicht Bordetella pertussis darstellen, können auch von den Sequenzen abgeleitet werden, die in Fig. 2 offenbart sind. In gleicher Weise können potentiell spezifische Sonden für Moraxella nonliquefaciens und Haemophilus influenzae, Biogruppe aegyptius, von der Spacerregionsequenz, die in Fig. 7 und Fig. 8 dargestellt ist, abgeleitet werden.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Neisseria gonorrhoeae in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Neisseria gonorrhoeae sind, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Neisseria gonorrhoeae ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Neisseria meningitidis in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Neisseria meningitidis, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Neisseria meningitidis ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Haemophilus ducreyi in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Haemophilus ducreyi, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Haemophilus ducreyi ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Branhamella catarrhalis in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Branhamella catarrhalis, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Branhamella catarrhalis ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Bordetella pertussis in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Bordetella pertussis, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Bordetella pertussis ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Haemophilus influenzae in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Haemophilus influenzae, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Haemophilus influenzae ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Streptococcus pneumoniae in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Streptococcus pneumoniae, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Streptococcus pneumoniae ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Streptococcus agalactiae in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Streptococcus agalactiae, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Streptococcus agalactiae ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Ausrüstung für den in-vitro-Nachweis von einem oder mehreren Stämmen von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung enthält:
  • Wenigstens eine Sonde, die ausgewählt ist aus denen, die der Erfindung entsprechen und spezifisch sind für Campylobacter jejuni und Campylobacter coli, und die an einen festen Träger gebunden ist,
  • die Primer, die zum Durchführen der enzymatischen Verstärkung der DNA und/oder RNA, die die Zielsequenz der genannten Sonde enthalten, benötigt werden, wenn es angemessen ist,
  • die Puffer oder die Bestandteile, die erforderlich sind zur Herstellung der Puffer, die die Durchführung der enzymatischen Verstärkung und/oder einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der DNA und/oder RNA eines Stammes der Campylobacter jejuni und Campylobacter coli ermöglichen,
  • die Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben, wenn es angemessen ist.
    • Bedingungen für die Verwendung der Sonden
  • Die erfindungsgemäßen Sonden sind bevorzugt markiert. Es kann eine beliebige konventionelle Markierung verwendet werden Die Sonden können markiert werden mit Hilfe von radioaktiven Tracern, wie zum Beispiel ³²P, ³&sup5;S, ¹²&sup5;I, ³H und ¹&sup4;C.
  • Die radioaktive Markierung kann durchgeführt werden gemäß einem beliebigen konventionellen Verfahren, wie zum Beispiel der terminalen Markierung an der 3'- oder 5'-Position unter Verwendung eines radiomarkierten Nukleotides, einer Polynukleotidkinase (mit oder ohne Dephosphorylierung durch eine Phosphatase), einer Terminaltransferase oder einer Ligase (gemäß dem zu markierenden Ende). Eine der erfindungsgemäßen Sonden kann die Matrix für die Synthese einer Kette darstellen, die aus mehreren radioaktiven Nukleotiden oder mehreren radioaktiven und nicht radioaktiven Nukleotiden besteht.
  • Die erfindungsgemäßen Sonden können auch hergestellt werden durch chemische Synthese unter Verwendung von einem oder mehreren radioaktiven Nukleotiden. Ein anderes Verfahren zur radioaktiven Markierung ist die chemische Iodierung der erfindungsgemäßen Sonden, die zur Bindung von mehreren ¹²&sup5;I- Atomen an die Sonde führt.
  • Wenn eine der erfindungsgemäßen Sonden radioaktiv gemacht wird, um für die Hybridisierung verwendet zu werden mit einer nicht radioaktiven RNA oder DNA, hängt das Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung vom verwendeten radioaktiven Tracer ab. Im allgemeinen werden Autoradiografie, Flüssigscintillation, Gammazählung oder ein anderes beliebiges konventionelles Verfahren verwendet, das es ermöglicht, ionisierende Strahlen nachzuweisen, die vom radioaktiven Tracer abgeben werden.
  • Nicht radioaktive Markierung kann auch verwendet werden, indem die erfindungsgemäßen Sonden mit Resten assoziiert werden, die folgendes besitzen:
  • Immunologische Eigenschaften (das heißt, Antigen oder Hapten), eine spezifische Affinität gegenüber bestimmten Reagenzien (das heißt, Ligand), Eigenschaften, die eine nachweisbare Enzymreaktion bereitstellen (zum Beispiel Enzym, Coenzym, Enzymsubstrat oder Substrat, das an einer nachweisbaren Enzymreaktion teilnimmt), oder physikalische Eigenschaften, wie zum Beispiel Fluoreszenz, Emission oder Absorption von Licht irgendeiner Wellenlänge. Antikörper, die spezifisch die durch die Sonde und das Target gebildeten Hybride nachweisen können, können auch verwendet werden.
  • Eine nicht radioaktive Markierung kann bereitgestellt werden, wenn eine erfindungsgemäße Sonde chemisch synthetisiert wird, wobei die Adenosin-, Guanosin-, Cytidin-, Thymidin- und Uracylreste derselben leicht an andere chemische Reste gekuppelt werden können, was den Nachweis der Sonde oder der Hybride, die zwischen der Sonde und dem komplementären DNA- oder RNA-Fragment gebildet werden, ermöglicht.
  • Allerdings würde die Nukleotidsequenz der Sonde, wenn sie durch Kupplung von einem Nukleotid oder mehreren Nukleotiden an andere chemische Reste modifiziert würde, die gleiche sein, wie die Nukleotidsequenz einer der erfindungsgemäßen Sonden.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum Nachweis von RNA und/oder DNA mit den erfindungsgemäßen Sonden durch Hybridisierung, die markiert wurden und die, wie vorstehend beschrieben, nachgewiesen werden können. Unter Bezug darauf können konventionelle Verfahren der Hybridisierung verwendet werden.
  • Zum Nachweis der Zellen, die aus lebenden Organismen abgeleitet sind oder selber solche darstellen, kann die RNA und/oder DNA dieser Zellen, wenn nötig, verfügbar gemacht werden durch teilweise oder völlige Lysis der Zellen unter Verwendung von chemischen oder physikalischen Prozessen und mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Sonden in Berührung gebracht werden, die nachgewiesen werden können. Dieses In-Berührung-bringen kann ausgeführt werden auf einem angemessenen Träger, wie zum Beispiel einer Nitrocellulose, einer Cellulose, einem Nylonfilter in einem flüssigen Medium oder in Lösung. Dieser Kontakt kann stattfinden unter unteroptimalen, optimalen oder restriktiven Bedingungen (das heißt, den Bedingungen, die die Hybridbildung nur ermöglichen, wenn die Sequenzen perfekt homolog auf die Länge eines Moleküls sind). Solche Bedingungen schließen die Temperatur, die Konzentration der Reaktanten, die Gegenwart von Verbindungen, die die optimale Temperatur der Paarung von Nukleinsäuren verringern (zum Beispiel Formamid, Dimethylsulfoxid und Harnstoff) und die Gegenwart von Verbindungen, die augenscheinlich das Reaktionsvolumen verringern und/oder die Hybridbildung beschleunigen (zum Beispiel Dextransulfat, Polyethylenglycol oder Phenol).
  • Die Beseitigung einer erfindungsgemäßen Sonde, die nicht hybridisiert hat, kann durchgeführt werden durch Waschen mit Pufferlösung angemessener Ionenstärke und angemessener Temperatur, mit oder ohne Behandlung mit S1- Nuklease oder einem anderen Enzym, das einsträngige DNA oder RNA verdaut aber nicht RNA-DNA-Hybride oder doppelsträngige DNA verdaut.
  • In einem flüssigen Medium können die Hybride der erfindungsgemäßen Sonde, gepaart mit zellulären DNA- oder RNA-Fragmenten, auf verschiedene Arten vom Rest des flüssigen Mediums getrennt werden, wie zum Beispiel durch Chromatografie über Hydroxyapatit.
  • Dann werden die hybridisierten Sonden mit Hilfe der Markierung auf der Sonde nachgewiesen.
  • Um auf die chromosomale DNA-Fragmente abzuzielen, wird nach Behandlung von RNA mit einem oder mehreren Enzymen und Denaturierung der DNA-Fragmente (das heißt, Trennung der beiden Ketten) eine der erfindungsgemäßen Sonden mit den DNA-Fragmenten unter den Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Hybridisierung ermöglichen, und nach der Zeit, die erforderlich ist, um das Ende der Hybridisierung zu erreichen, werden die nicht hybridisierten Fragmente von den hybridisierten Fragmenten getrennt, und die Markierung wird, wie vorstehend beschrieben, zum Nachweis der Zellen nachgewiesen.
  • Allgemein gesprochen können die verschiedenen erfindungsgemäßen Sonden auch in rekombinierender DNA enthalten sein, was ihre Klonierung ermöglicht, wenn die Gegenwart einer heterologen DNA nicht eine Störung für die Spezifität der Sonden in der vorgesehenen Anwendung darstellt.
  • In Fig. 1 bis 10 werden Ausrichtungen von Spacerregion (vollständig oder teilweise sequenziert), die in verschiedenen Mikroorganismen gefunden werden, als Beispiel dargestellt. Treffer und Lücken werden durch ":"beziehungsweise"-" angezeigt. Für alle Sequenzen wird der nicht kodierende Strang in der 5'-3'- Orientierung dargestellt.
  • Das 5'-Ende befindet sich nahe dem rRNA-Gen vom Typ 16S, das 3'-Ende ist in der Nähe des rRNA-Gens vom Typ 23S.
  • Es ist darauf hinzuweisen, daß jede Nukleinsäuresequenz der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem vom Typ 23S jedes entsprechenden Organismus, auf den sich in Figg. 1 bis 10 bezogen wird, (mit Ausnahme der von E. coli) neu ist.
  • In Fig. 1 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung des Endes der Spacerregion in der Nähe der 16S-rRNA zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA- Gen vom Typ 23S von Neisseria gonorrhoeae Stämmen NCTC 8375 (obere Linie) und ITM 4367 (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 2 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Bordetella pertussis ATCC 10380 (obere Linie) und Bordetella bronchiseptica NCTC 452 (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 3 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Neisseria meningitidis NCTC 10025 (obere Linie) und Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375 (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 4 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375 (obere Linie) und Bordetella pertussis ATCC 10380 (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 5 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Branhamella catarrhalis ITM 4197 (obere Linie) und Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375 (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 6 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Haemophilus ducreyi CIP 542 (obere Linie) und Escherichia coli (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 7 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Branhamella catarrhalis ITM 4197 (obere Linie) und Moraxella nonliquefaciens ATCC 19975 (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 8 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Haemophilus influenzae (Biogruppe influenzae) NCTC 8143 (obere Linie) und Haemophilus influenzae (Biogruppe aegyptius) ITM 859 (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 9 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Streptococcus pneumoniae S90-5122 (obere Linie) und Streptococcus agalactiae U90-2817 (untere Linie) dargestellt.
  • In Fig. 10 ist die Nukleinsäuresequenzausrichtung des Endes der Spacerregion in der Nähe der 23S-rRNA zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S von Campylobacter jejuni ATCC 33560 (obere Linie) und Campylobacter coli ATCC 33559 (untere Linie) dargestellt.
  • Die verwendeten Stämme können bei den entsprechenden Kultursammlungen erhalten werden:
  • ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA.
  • CIP: Collection de l'Institut Pasteur, Paris, Frankreich.
  • ITM: Institute of Tropical Medicine, Antwerpten, Belgien.
  • NCTC: National Collection of Type Cultures, Central Public Health Laboratory, London, England.
  • Die folgenden Beispiele beziehen sich auf die Herstellung von erfindungsgemäßen Sonden und die experimentellen Ergebnisse bezüglich der Spezifität und der Empfindlichkeit der Sonden unter Verwendung verschiedener Hybridisierungsprotokolle. Die folgenden Organismen mit klinischer Relevanz wurden ausgewählt: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae und Bordetella pertussis.
  • Die Beispiele veranschaulichen, daß speziesspezifische und hochgradig empfindliche Sonden in der Spacerregion aller untersuchter Organismen leicht gefunden werden konnten. Darüber hinaus wird gezeigt, daß die Sonden aus dieser Region für Organismen hergestellt werden konnten, für die keine speziesspezifischen hochgradig empfindlichen Sonden im 16S- und/oder im 23S-rRNA-Molekül gefunden werden konnten. Die verwendeten Verfahren sind im wesentlichen die gleichen, wie sie von Rossau et al., J. Gen. Microbiol., 135:1735-1745, 1989 oder in der europäischen Patentanmeldung Nr. 8940/045.3 beschrieben wurden, so lange nichts anderes angegeben ist. Alle verwendeten Verfahren mit der möglichen Ausnahme der enzymatischen Verstärkung von rRNA-Genfragmenten und der umgekehrten Hybridisierung sind zur Zeit dem Fachmann bekannt. Die enzymatische Verstärkung von rRNA-Genfragmenten, die die Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S überspannen, wurden durch Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR) erhalten, durchgeführt nach den Empfehlungen, die in der "Gene Amp"-Ausrüstung von Perkin Elmar Cetus gegeben wurden. Nukleotide entsprechend den eingefrorenen oder halbeingefrorenen Regionen in den rRNA-Molekülen wurden als PCR-Primer verwendet. Das Prinzip und das Protokoll des umgekehrten Dot-blot wird von Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6230-6234 (1989) beschrieben.
    • Beispiel 1
  • Neisseria meningitides und Neisseria gonorrhoeae sind beide wichtige menschliche Pathogene, die verantwortlich für Meningitis beziehungsweise Gonorrhoeae sind. Diese Organismen sind sehr eng verwandt und ihre Differenzierung voneinander und anderen Neisseria-Spezies ist fehlergefährdet. Die DNA-Sonden, die spezifisch für Neisseria meningitides und Neisseria gonorrhoeae sind, können die korrekte Differenzierung zwischen beiden Neisseria-Spezies unterstützen und verwendet werden für den direkten Nachweis dieser Spezies in klinischen Proben.
  • Eine Anzahl von DNA-Sonden wurden beschrieben zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae (Europäische Patentanmeldungen Nrr. 0272009 und 0337896; Urdea et al., Clin. Chem. 35:1571-1575, 1989; Totten et al., J. Infect. Dis. 148:462- 471, 1989; Donegan et al., Mol. Cell. Probes 3:13-26, 1989; Kolberg et al., Mol. Cell. Probes 3:59-72, 1989). Allerdings wurde gefunden, daß einige dieser Sonden kreuzreagieren mit Stämmen, die nicht Neisseria gonorrhoeae darstellen, oder nicht sehr empfindlich sind. Keine dieser Sonden wurden aus der Spacerregion zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und vom Typ 23S abgeleitet.
  • Eine DNA-Sonde, die Stämme von Neisseria meningitides nachweist, wurde auch beschrieben (Kolberg et al., Mol Cell. Probes 3:59-72, 1989). Diese Sonde, die vom Pilin-Gen von Neisseria meningitides abgeleitet wurde, war weder hochgradig spezifisch noch empfindlich für Neisseria meningitides.
  • Die Sequenz der Spacerregion zwischen dem rRNA- Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S der Stämme vom Typ Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitides wurde bestimmt unter Verwendung von kloniertem Material, das aus einem PCR-Fragment herstammte, dar die Spacerregion überspannte.
  • Die Ausrichtung der beiden Sequenzen, die in Fig. 3 dargestellt ist, ergab mehrere potentielle Sondensequenzen.
  • Eine unerwartete, eingeschobene Sequenz von etwa 60 Basenpaaren wurde in der Spacerregion des Stammes von Neisseria meningitides nachgewiesen. Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen wurden von dieser eingeschobenen Sequenz abgeleitet:
  • Auch in einem anderen Gebiet der Spacerregion (von Basenpaar 365 bis 386 in der Sequenz von Neisseria meningitides in Fig. 3) wurde ein bedeutender Anteil von Abweichungen zwischen Neisseria meningitides und Neisseria gonorrhoeae aufgefunden. Aus diesem Gebiet wurden zwei 0ligonukleotidsonden (NMI3 und NGI1 zum Nachweis von Neisseria meningitides beziehungsweise Neisseria gonorrhoeae) chemisch synthetisiert.
  • Diese Nukleotide wurden an ihren 5'-Enden unter Verwendung von Polynukleotidkinase ³²P-markiert oder an ihren 3'-Enden mit digoxigeniertem UTP unter Verwendung einer Terminaltransferase verlängert und als Hybridisierungssonden verwendet. Als Target wurde als punktförmige Flecken aufgebrachte, denaturierte genomische DNA von einer großen Anzahl von Stämmen von Neisseria meningitides und Neisseria gonorrhoeae verschiedener Herkunft und mehrere Stämme anderer bakterieller Taxone verwendet.
  • Die Hybridisierungsmischung bestand entweder aus 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer pH 7, deionisiertem Formamid (20% v/v), Ficoll (0,02% w/v), Rinderserumalbumin (0,02% w/v), Polyvinylpyrrolidon (0,02% w/v) und durch Scherkräfte denaturierter Lachssperma-DNS (0,1 mg/ml), oder entsprach der Lösung, die im Protokollblatt der Markier- und Nachweisausrüstung für nichtradioaktive DNA (Boehringer Mannheim), mit der Ausnahme, daß 3 x SSC (1 x SSC - 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) anstelle von 5 x SSC verwendet wurde und Formamid auf 20% (v/v) zugegeben wurde. Die Waschlösung enthielt 3 x SSC, 20% Formamid und 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1.
  • Die Hybridisierungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Die Hybridisierung und Waschtemperatur für jede Sonde sind in Klammern angegeben. Alle geprüften Sonden erwiesen sich als hochgradig spezifisch und hochgradig empfindlich für Neisseria gonorrhoeae (Sonde NGI1) oder Neisseria meningitides (Sonden MNI1, NMI2 und NMI3). Taxon Anzahl der positiven Stämme Anzahl der geprüften Stämme Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria polysaccharea Neisseria lactamica Neisseria cinerea Neisseria mucosa Neisseria macacae Neisseria flavescens Neisseria subflava Neisseria sicca Neisseria elongata Neisseria canis Neisseria animalis Neisseria denitrificans Kingella denitrificans Kingella kingae Simonsiella muelleri Simonsiella crassa Simonsiella steedae Alvsiella filiformis Eikenella corrodens Chromobacterium violaceum Iodobacter fluviatile Aquaspirilum dispar Comamonas testosteroni Haemophilus influenzae Haemophilus ducrevi Kingella indologenes Moraxella lacunata Moraxella nonliquefaciens Moraxella catarrhalis Moraxella cuniculi Moraxella caviae Moraxella ovis Moraxella osloensis Escherichia coli
  • Die Spezifität des Nachweises mit den Sonden NMI3 und NGI3 wurde auch geprüft nach enzymatischer Verstärkung des Spacerregionen mit dem folgenden Verstärkungsprimern:
  • die am 3'-Ende des rRNA-Gens vom Typ 16S und am 5'-Ende des rRNA-Gens vom Typ 23S positioniert waren. 100 ng genomische DNA von Stämmen von Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Haemophilus ducreyi, Bordetella pertussis und Branhamella catarrhalis wurden in der PCR-Reaktion verwendet. Nach Verstärkung wurde 1/10 der Ausbeute auf Agarosegel aufgebracht, elektrophoretisiert und auf eine Nylonmembran aufgepunktet.
  • Die Membranen wurde aufeinanderfolgend mit den Sonden NGI1 und NMI3 hybridisiert.
  • Signifikante Hybridisierungssignale konnten nur in den Bahnen nachgewiesen werden, in denen Material von Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis anwesend war, wenn NGI1 beziehungsweise NMI3 als Sonden verwendet wurden.
    • Beispiel 2
  • Bordetella pertussis ist der Verursacher von Keuchhusten. Als Ergebnis wiederholter Kampagnen zur Schutzimpfung ist diese Krankheit ein geringeres Problem in den industrialisierten Ländern geworden. In der dritten Welt allerdings bleibt Bordetella pertussis eine Hauptursache der Kindersterblichkeit.
  • Stämme von drei Bordetellaspezies (Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis und Bordetella bronchiseptica) sind extrem eng verwandt (Kloos et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 31:173-176, 1981; de Ley et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 36:405-414, 1986) und sollten als zu einer Genospezies gehörig betrachtet werden. Diese genotypische Verwandtschaft spiegeit sich auch in vielen anderen Eigenschaften dieser Bakterien wider, wodurch ihre phenotypische Differenzierung schwierig wird.
  • Klinische Symptome von pertussis sind oft atypisch und eine aufwendige Diagnose ist erforderlich. Bisher existiert kein empfindlicher, spezifischer und schneller Test. Kultivierung bliebt immer noch das Verfahren der Wahl aber die Erholungsgeschwindigkeiten sind niedrig und die Ergebnisse sind üblicherweise erst 3 bis 7 Tage nach der Inokulierung erhältlich (Friedman, Clin. Microbiol. Rev. 4:365-376, 1988; Halperin et al., J. Clin. Microbiol. 27:752-757, 1989). Ein Assay auf Grundlage von DNA-Sonden kann die Diagnose von Infektionen durch Bordetella pertussis erheblich verbessern.
  • Sonden für den Nachweis von Bordetella pertussis sind in der Literatur beschrieben (Park et al., FEMS Microbiol. Lett. 52:19-24, 1988; McPheat und McNally, J. Gen. Microbiol. 133:323-330, 1987 und FEMS Microbiol. Lett. 41:357-360, 1987; McLafferty et al., Abstracts of the Annual Meeting of the American Society for Microbiology C-168, 1986 und C-322, 1987). Die von McLafferty et al. (1986 und 1987) beschriebene Sonde ist nicht hochgradig spezifisch. Für die anderen beschriebenen Sonden sind die vorgestellten Daten zu dürftig, um den Spezifitätsgrad und die Empfindlichkeit abzuleiten.
  • Teile des ribosomalen RNA-Gens folgdenden Stämme wurden enyzmatisch verstärkt und in einem Plasmidvektor kloniert: Bordetella pertussis ATCC 10380, Bordetella parapertussis NCTC 5952 (Stammtyp) und Bordetella bronchiseptica NCTC 452 (Stammtyp). Die klonierten Fragmente der verschiedenen Spezies wurden teilweise sequenziert unter Verwendung des Dideoxykettenterminierungsverfahrens und ihre Sequenzen wurden verglichen. Die Sequenzinformationen das rRNA-Gen vom Typ 16S betreffend, die verfügbar wurden, zeigten, daß keine speziesspezifischen Sonden abgeleitet werden konnten (Rossau et al., unveröffentlicht). Allerdings, wie in der Ausrichtung in Fig. 2 dargestellt, wurde ein nichthomologes Gebiet (von Basenpaar 271 bis ungefähr 300) in der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S der Stämme von Bordetella pertussis und Bordetella bronchiseptica gefunden.
  • Die Sequenz der Spacerregion des Stammes von Bordetella parapertussis war scheinbar identisch mit dem der Sequenz von Bordetella bronchiseptica (Rossau et al., unveröffentlicht).
  • Aus dem Gebiet zwischen Nukleotid 271 und 295 der Spacerregion von Bordetella pertussis wurde eine Oligonukleotidsonde mit der folgenden Sequenz abgeleitet:
  • CCACACCCAT CCTCTGGACA GGCTT BPI1
  • Die Oligonukleotidsonde wurde chemisch synthetisiert und mit Digoxigenin-UTP markiert unter Verwendung einer Terminaltransferase. Die Ergebnisse, die mit als punktförmige Flecken aufgebrachter, denaturierter, genomischer DNA als Target erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Taxon Hybridisierung mit BPI1 bei 55ºC Anzahl der positiven Stämme/ Anzahl der geprüften Stämme Bordetella parapertussis Bordetella bronchiseptica Alcaligenes denitrificans Alcaligenes paradoxus Oligella ureolytica Oligella urethralis Taylorella equigenitalis Pseudomonas cepacia Pseudomonas solanacearum Comamonas testosteroni Neisseria meningitidis Branhamella catarrhalis Haemophilus influenzae
  • Unter den verwendeten Bedingungen stellte sich die Sonde BPI1 als 100% spezifisch und 100% empfindlich für Bordetella pertussis heraus.
  • Die Hybridisierungsmischung war, wie sie im Protokollblatt des Ausrüstung für Markierung und Nachweis nichtradioaktiver DNA (Boehringer Mannheim) beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß 3 x SSC (1 x SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) anstelle von 5 x SSC verwendet wurden und Formamid bis auf 20 Vol.-% zugegeben wurde. Die Waschlösung enthielt 3 x SSC, 20% Formamid und 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1. Die Hybridisierungs- und Waschtemperatur betrug 55ºC.
  • Im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie die, die in der vorstehenden Tabelle dargestellt sind, wurden erhalten, wenn ein umgekehrtes Dot-blot-Assay verwendet wurde. Dieses Assay wurde wie folgt durchgeführt:
  • 1 ng bakterielle DNA aus einer Vielfalt von Stämmen, die von verschiedenen bakteriellen Spezies erhalten wurden, wurde enzymatisch verstärkt, wie vom Hersteller der "Gene Amp"-Ausrüstung empfohlen (Perkin Elmar Cetus), mit der Ausnahme, daß Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim) zur Verstärkungsmischung gegeben wurde bis zu einer Endkonzentration von 40 µM. 30 Zyklen (1 min/95ºC, 1 min/50ºC, 1 min/72ºC) mit den Primern AP16 und AP 23 (siehe Beispiel 1) wurden in einer Gesamtmenge von 50µl durchgeführt, wonach 5 µl jeder PCR-Mischung zu 1 ml Hybridisierungsmischung (Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben) in der Gegenwart einer Membran gegeben wurden, an der 0,2 pmol, 0,02 pmol und 0,002 pmol der Sonde BPI1 befestigt waren. Die Hybridisierung ging 1 h voran bei 25ºC. Der Waschschritt wurde bei der selben Temperatur 10 min lang durchgeführt. Der Nachweis wurde durchgeführt, wie in der Markierungs- und Nachweisausrüstung für nichtradioaktive DNA beschrieben (Boehringer Mannheim). Obwohl eine bestimmte Bande in allen Proben beobachtet werden konnte, wenn sie nach Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung unter Verwendung des umgekehrten Dot-blot-Protokolls untersucht wurden, wurde ein klares positives Signal ausschließlich mit Proben erhalten, in denen DNA von Bordetella pertussis vorhanden war.
    • Beispiel 3
  • Branhamella catarrhalis, auch bekannt als Moraxella catarrhalis oder Neisseria catarrhalis ist ein wählerisches, biochemisch ziemlich inertes Bakterium. Kürzlich wurde sein wichtiges pathogenes Potential erkannt.
  • Branhamella catarrhalis scheint häufig in ernsthafte Infektionen des Atmungsbereiches verstrickt zu sein (Hager et al., Rev. Infect Dis. 9:1140-1149, 1987). Die Diagnose von Branhamella catarrhalis erfordert die Kultivierung der Organismen, die behindert sein kann durch Überwachsen mit weniger wählerischen Mikroorganismen, und eine Batterie phenotypischer Tests, die diesen Organismus von Schmarotzern wie zum Beispiel Neisseria-Spezies unterscheidet, die in der Mundhöhle vorhanden sind.
  • In einigen Erscheinungen sind die phenotypischen Tests nicht aussagekräftig, was die Indentität der vermutlichen Isolierung von Branhamella catarrhalis betrifft, da es nur eine begrenzte Anzahl von Tests gibt, die Branhamella catarrhalis von den phenotypisch ähnlichen Bakterien unterscheidet (Riou und Guibourdenche, Drugs 31 [suppl.3]:1-6, 1986). Die Verwendung eines Assays auf Grundlage von DNA-Sonden kann die Laboratoriumsdiagnose von Branhamella catarrhalis bemerkenswert vereinfachen. Eine DNA-Sonde für Branhamella catarrhalis, die von einem unspezifizierten DNA-Fragment abgeleitet und mit DNA von Neisseria caviae kreuzhybridisierte, wurde von Beaulieu und Roy (Abstracts of the Annual Meeting of the American society for Microbiology, Abstract Nr. D- 249, 1989) beschrieben.
  • Ein Teil des rRNA-Gens von Branhamella catarrhalis ITG 4197 wurde enzymatisch durch die Polymerasekettenreaktionstechnik verstärkt und in einem Plasmidvektor kloniert. Das Fragment, das die Spacerregion zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und vom Typ 23S überspannt, wurde nachfolgend durch das Dideoxykettenterminierungsverfahren sequenziert. Die Sequenz ist in Fig. 7 (oberste Zeile) dargestellt. Aus den Sequenzierungsdaten wurden die folgenden Oligonukleotide ausgewählt und chemisch synthetisiert:
  • TTAAACATCT TACCAAAG BCI1
  • Das Oligonukleotid wurde an seinem 5'-Ende mit Polynukleotidgenase ³²P- markiert und als Hybridisierungssonde verwendet. Als Target wurde als punktförmige Flecken aufgetragene, denaturierte, genomische DNA von 31 Stämmen von Branhamella catarrhalis aus verschiedenen Herkunft und 19 Stämmen anderer bakterieller Taxone verwendet.
  • Die Hybridisierungsmischung bestand aus 3 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) 25 mM Phosphatpuffer pH 7, deionisiertem Formamid (20% v/v), Ficoll (0,02% w/v), Rinderserumalbumin (0,02% w/v), Polyvinylpyrrolidon (0,02% w/v) und durch Scherkräfte denaturierter Lachssperma- DNA (0,1 mg/ml). Die Waschlösung enthielt 3 x SSC, 20% Formamid und 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1. Die Hybridisierung- und Waschtemperatur betrug 30ºC.
  • Unter den verwendeten Bedingungen hybridisierte die Sonde BCI1 mit allen Stammen der Branhamella catarrhalis. Keine der getesteten Stämme, die zu anderen Bakterienspezies gehörte, gab signifikante Hybridisierungsignale mit der Sonde
  • Die Stämme, die nicht Branhamella catarrhalis sind und geprüft wurden, sind: Moraxella lacunata Moraxella bovis Moraxella nonliquefaciens Neisseria cuniculi Neisseria ovis Neisseria caviae Moraxella osloensis "Moraxella paraphenylpyruvica" "Moraxella camembertii" Psychrobacter immobilis Acinetobacter calcoaceticus Escherichia coli Haemophilus influenzae Eikenella corrodens Xanthomonas maltophilia Xanthomonas campestris
    • Beispiel 4
  • Haemophilus ducreyi, der Verursacher von weichem Schanker, ist ein wählerisches Gram-negatives Bakterium. Die Kultivierung des Organismus ist sowohl schwierig als auch unempfindlich, doch ist es immer noch das Verfahren der Wahl für die Diagnose von Infektionen durch Haemophilus ducreyi. Die Verwendung von hochgradig spezifischen Sonden kann die Kultivierung vermeiden und die Empfindlichkeit die Diagnose verstärken. Klonierte DNA-Sonden für Haemophilus ducreyi zeigen schwache Kreuzreaktionenfähigkeit mit anderen Haemophilus- und Pasteurella-Spezies und Zielgene, die Proteine kodieren, wurden von Parsons et al. (J. Clin. Microbiol. 27:1441-1445, 1989) beschrieben.
  • Teile des rRNA-Gens aus dem Stamm vom Typ Haemophilus ducreyi CIP 542 wurde durch die Polymerasekettenreaktion enzymatisch verstärkt und in einem Plasmidvektor kloniert.
  • Die Sequenz des Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S wurde durch die Dideoxykettenterminierungstechnik erhalten. Von der Nukleinsäuresequenz wurde das folgende Oligonukleotid ausgewählt und chemisch synthetisiert:
  • TTATTATGCG CGAGGCATAT TG HDI1
  • Das Oligonukleotid wurde an seinen 5'-Enden ³²P-markiert oder es wurde an seinen 3'-Enden unter Verwendung der Terminustransferase mit digoxigeniertem UTP verlängert und als Hybridisierungssonde verwendet.
  • Als Target wurden als Punkte aufgetragen Flecken denaturierter genomischer DNA von 41 Stämmen von Haemophilus ducreyi verschiedene Herkunft und mehrere Stämme anderer bakterieller Taxone verwendet. Die Oligonukleotidsonde hybridisierte ausschließlich mit allen geprüften Stämmen von Haemophilus ducreyi.
  • Die Hybridisierungsmischung bestand entweder aus 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer pH 7, deionisiertem Formamid (20% v/v), Ficoll (0,02% w/v), Rinderserumalbumin (0,02% w/v), Polyvinylpyrrolidon (0,02% w/v) und durch Scherkräfte denaturierter Lachssperma-DNA (0,1 mg/ml), oder entsprach der Lösung, die im Protokollblatt der Markier- und Nachweisausrüstung für nichtradioaktive DNA (Boehringer Mannheim), mit der Ausnahme, daß 3 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) anstelle von 5 x SSC verwendet wurde und Formamid auf 20% (v/v) zugegeben wurde. Die Waschlösung enthielt 3 x SSC, 20% Formamid und 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1. Die Hybridisierungs- und Waschtemperatur betrug 40ºC.
  • Die geprüften Stämme, die nicht Haemophilus ducreyi waren:
  • Escherichia coli MC 1061
  • Escherichia coli B
  • Actinobacillus actinomycetemcomitans NCTC 9710
  • Actinobacillus lignieresii NCTC 4189
  • Haemophilus aphrophilus NCTC 5906
  • Haemophilus influenzae NCTC 8143
  • Histonhilus ovis HIM 896-7
  • Pasteurella multocida NCTC 10322
  • Branhamella catarrhalis ITM 4197
  • Comamonas testosteroni ATCC 17407
  • Oligella urethralis LMG 6227
  • Neisseria gonorrhoeae ITM 4437
  • Campylobacter jejuni CCUG 11284
  • Acinetobacter calcoaceticus ATCC 23055
  • Unidentified strain ITM 3565
    • Beispiel 5
  • Die Gram-negativen bakteriellen Spezies Haemophilus influenzae können in zwei Biogruppen unterteilt werden: influenza und aegyptius (Casin et al., Ann. Inst. Pasteur Microbiol. 137B:155-163, 1986). Organismen der Biogruppe influenza sind wichtige Pathogene des Atmungsorgane und auch die Verursacher von Meningitis und Otitis bei Kindern. Die Isolierungen der Biogruppe aegyptius sind die Verursacher der bakteriellen Konjunktivitis in heißem Klima und scheinen mit der Brasilianischen Purpurfieber verknüpft zu sein (Brenner et al., J. Clin. Microbiol. 26:1524-1534, 1988). Ein schneller Nachweis von typisierbaren und nicht typisierbaren Stämmen von Haemophilus influenzae kann mit Nukleinsäuresonden erreicht werden.
  • DNA-Sonden für diese Spezies wurden in der Literatur beschrieben (Terpstra et al., Scand. J. Infect Dis. 19:641-646, 1987; Malouin et al. J. Clin. Microbiol. 26:2132-2138, 1988). Keine dieser Sonden wurde von der Spacerregion zwischen den rRNA-Genen vom Typ 16S und 23S abgeleitet.
  • Ein Teil des rRNA-Gens vom Stamm vom Typ Haemophilus influenzae NCTC 8143 wurde enzymatisch durch eine Polymerasekettenreaktion verstärkt und in einem Plasmidvektor kloniert.
  • Die Sequenz der Spacerregion zwischen dem rRNA-Gen vom Typ 16S und dem rRNA-Gen vom Typ 23S wurde durch die Dideoxykettenterminierungstechnik erhalten. Aus der Nukleinsäuresequenz wurden die folgenden Nukleotide ausgewählt und chemisch synthetisiert
  • Die Oligonukleotide wurden an ihren 5'-Enden ³²P-markiert und als Hybridisierungssonden verwendet. Als Target wurde punktförmig aufgetragene denaturierte genomische DNA bakterieller Taxone verwendet.
  • Die Hybridisierungsergebnisse beider Sonden sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Bei den verwendeten Hybridisierungs- und Waschtemperaturen hybridisierte die Sonde HII1 nicht mit Haemophilus influenzae der Biogruppe aegyptius. Sonde HII2 hybridisierte mit Stämmen beider Biogruppen. Beide Sonden hybridisierten auch bei den angegebenen Temperaturen mit 15 anderen klinischen Isolierungen von Haemophilus influenzae, die vom Institut für Tropenmedizin, Antwerpten, Belgien, erhalten wurden.
  • Die Hybridisierungsmischung bestand aus 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer pH 7, deionisiertem Formamid (20% v/v), Ficoll (0,02% w/v), Rinderserumalbumin (0,02% w/v), Polyvinylpyrrolidon (0,02% w/v) und durch Scherkräfte denaturierter Lachssperma-DNA (0,1 mg/ml). Die Waschlösung enthielt 3 x SSC, 20% Formamid und 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1. Taxon Sonde Haemophilus influenzae (biogroup influenzae) Haemophilus influenzae (biogroup aegyptius) Haemophilus parahaemolyticus Haemophilus parainfluenzae Haemophilus aphrophilus Haemophilus ducreyi Pasteurella multocida Pasteurella picida Actinobacillus lignieresii Actinobacillus actinomycetemcominitans Histophilus ovis Pseudomonas cepacia Acinetobacter calcoaceticus Branhamella catarrhalis Bordetella pertussis Escherichia coli Neisseria meningitidis

Claims (53)

1. Sonde, die mindestens 15 Nukleotide der transkribierten Spacerregion zwischen rRNS-Genen vom Typ 16S und 23S von prokaryotischen Organismen umfaßt.
2. Sonde nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Hybridisierungsassay, worin die Sonde ausreichend komplementär ist, um zu einer Sequenz der Spacerregion zwischen den rRNS-Genen zu hybridisieren, und die Sequenz der Spacerregion zwischen den rRNS-Genen erhalten werden kann, indem
(a) die Nukleotidsequenz der Spacerregion zwischen den rRNS-Genen des untersuchten Organismus mit der Nukleotidsequenz der Spacerregion zwischen den rRNS-Genen der nächsten Nachbarn verglichen wird und
(b) eine Sequenz von mindestens 15 Nukleotiden in der Spacerregion zwischen den rRNS-Genen des untersuchten Organismus ausgewählt wird, die mindestens an einer Stelle keine Übereinstimmung mit der Spacerregion zwischen den rRNS-Genen von mindestens einem der nächsten Nachbarn darstellt,
-oder indem
(c) die tRNS-Gene in der Spacerregion zwischen den rRNS-Genen des zu untersuchenden Organismus entfernt werden, um eine verkürzte Spacerregion zu erhalten, und
(d) durch Versuch und Irrtum eine spezifische Nukleotidsequenz von mindestens 15 Nukleotiden aus der verkürzten Spacerregion ermittelt wird, wobei die Sequenz in der Lage ist, spezifisch mit den Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) des untersuchten Organismus zu hybridisieren.
3. Sonde nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der prokaryotische Organismus ein Bakterium ist.
4. Sonde nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Sonde 15 bis 100 Nukleotide umfaßt.
5. Sonde nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Sonde von 15 bis zur maximalen Anzahl der Nukleotide in der Spacerregion besitzt.
6. Sonde nach Anspruch 2, worin im Schritt (c) die Signalsequenzen entfernt werden.
7. Sonde, die folgendes umfaßt:
-entweder eine Sequenz, die zu einer Nukleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nukleinsäuren ausgewählt ist, und die von 15 bis zur maximalen Anzahl der Nukleotide der ausgewählten Nukleinsäuren einschließt: Gruppe NGI1 Gruppe NGI2 Gruppe NMI1 Gruppe NMI2 Gruppe NMI3 Gruppe NMI4 Gruppe NMI5 Gruppe NMI6 Gruppe HDI1 Gruppe BCI1 Gruppe BCI2 Gruppe BPI1 Gruppe HII1 Gruppe HII2 Gruppe SAI1 Gruppe SAI2 Gruppe SIA3 Gruppe SIA4 Gruppe SPI1 Gruppe SPI2 Gruppe SPI3
-oder eine variante Sequenz, die sich von jeder der vorstehenden Sequenzen unterscheidet:
entweder durch Hinzufügen oder Entfernen eines Nukleotides oder einiger Nukleotide an beziehungsweise von jedem ihrer jeweiligen äußersten Enden
oder durch Ändern eines oder mehrerer Nukleotide innerhalb jeder der Sequenzen
oder durch beides,
vorausgesetzt daß unter jedem der vorstehenden Umstände die Sonde noch mit dem gleichen RNS- oder DNS-Target hybridisiert wird wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
8. Verfahren zum Nachweis von Neisseria-Gonorrhoeae-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde, die aus der Gruppe der NGI1-Sonden, NGI2-Sonden und deren Varianten, wie sie in Anspruch 7 definiert sind, ausgewählt wurde, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Neisseria-Gonorrhoeae-Stämme ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
9 Verfahren nach Anspruch 8, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern verstärkt wird.
10 Verfahren nach Anspruch 9, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
11. Verfahren nach Anspruch 8 zum Nachweis von Neisseria Gonorrhoeae in einer biologischen Probe, wobei dieses Berührungsverfahren stattfindet in:
einem Hybridisierungsmedium, das ungefähr 3 x SSC, (SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0), ungefähr 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,1, 20% deionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll , 0,02% Serumalbumin vom Rind, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und ungefähr 0,1 mg/ml scherzerkleinerte, denaturierte Lachssperma-DNS enthält, und/oder einem Waschmedium, das ungefähr 3 x SSC, 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,1 und 20% deionisiertes Formamid enthält, und worin die verwendete Sonde aus der Gruppe der NGI1-Sonden, NGI2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, und geeigneterweise die Hybridisierungstemperatur auf ungefähr 50ºC und/oder die Waschtemperatur auf ungefähr 50ºC eingestellt ist.
12. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Neisseria-Gonorrhoeae-Stämme in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der NGI1-Sonden, NGI2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Neisseria Gonorrhoeae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Neisseria Gonorrhoeae spezifisch ist und aus der Gruppe der NGI1-Sonden, NGI2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Neisseria Gonorrhoeae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der NGI1-Sonden, NGI2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Neisseria Gonorrhoeae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
13. Verfahren zum Nachweis von Neisseria-Meningitidis-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, zum Nachweis der Nukleinsäure mit einer Sonde, die aus der Gruppe der NMI1-Sonden, NMI2-Sonden, NMI3-Sonden, NMI4-Sonden, NMI5-Sonden, NMI6-Sonden und deren Varianten, wie sie in Anspruch 7 definiert sind ausgewählt wurde, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Neisseria-Meningitidis-Stämme ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern verstärkt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
16. Verfahren nach Anspruch 13 zum Nachweis von Neisseria Meningitidis in einer biologischen Probe, wobei dieses Berührungsverfahren stattfindet in:
einem Hybridisierungsmedium, das ungefähr 3 x SSC, (SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0), ungefähr 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,1, 20% deionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll , 0,02% Serumalbumin vom Rind, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und ungefähr 0,1 mg/ml scherzerkleinerte denaturierte Lachssperma-DNS enthält, und/oder einem Waschmedium, das ungefähr 3 x SSC, 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,1 und 20% deionisiertes Formamid enthält, und worin die verwendete Sonde aus der Gruppe der NMI1-Sonden, NMI2-Sonden, NMI3-Sonden, NMI4-Sonden, NMI5-Sonden, NMI6-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, und geeigneterweise die Hybridisierungstemperatur auf ungefähr 40 bis 58ºC und/oder die Waschtemperatur auf ungefähr 40 bis 58ºC eingestellt ist.
17. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Neisseria-Meningitidis-Stämme in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der NMI1-Sonden, NMI2-Sonden, NMI3-Sonden, NMI4-Sonden, NMI5-Sonden, NMI6-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Neisseria Meningitidis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hyhride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Neisseria Meningitidis spezifisch ist und aus der Gruppe der NMI1-Sonden, NMI2-Sonden, NMI3-Sonden, NMI4- Sonden, NMI5-Sonden, NMI6-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Neisseria Meningitidis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der NMI1-Sonden, NMI2-Sonden, NMI3-Sonden, NMI4-Sonden, NMI5-Sonden, NMI6-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Neisseria Meningitidis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
18. Verfahren zum Nachweis von Haemophilus-Ducreyi-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde, die aus der Gruppe der HDI1-Sonden und deren Varianten, wie sie in Anspruch 7 definiert sind, ausgewählt wurde, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Haemophilus-Ducreyi-Stämme ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern verstärkt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
21. Verfahren nach Anspruch 18 zum Nachweis von Haemophilus Ducreyi in einer biologischen Probe, wobei dieses Berührungsverfahren stattfindet in:
einem Hybridisierungsmedium, das ungefähr 3 x SSC, (SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0), ungefähr 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,1, 20% deionisiertes Formamid 0,02% Ficoll , 0,02% Serumalbumin vom Rind, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und ungefähr 0,1 mg/ml scherzerkleinerte, denaturierte Lachssperma-DNS enthält, und/oder einem Waschmedium, das ungefähr 3 x SSC, 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,1 und 20% deionisiertes Formamid enthält, und worin die verwendete Sonde aus der Gruppe der HDI1-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, und geeigneterweise die Hybridisierungstemperatur auf ungefähr 40ºC und/oder die Waschtemperatur auf ungefähr 40ºC eingestellt ist.
22. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Haemophilus-Ducreyi-Stämme in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der HDI1-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Haemophilus Ducreyi durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Haemophilus Ducreyi spezifisch ist und aus der Gruppe der HDI1-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Haemophilus Ducreyi durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der HDI1-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Haemophilus Ducreyi durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
23. Verfahren zum Nachweis von Branhamella-Catarrhalis-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde, die aus der Gruppe der BCI1-Sonden, BCI2-Sonden und deren Varianten, wie sie in Anspruch 7 definiert sind, ausgewählt wurde, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Branhamella- Catarrhalis-Stämme ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
24. Verfahren nach Anspruch 23, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern verstärkt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
26. Verfahren nach Anspruch 23 zum Nachweis von Branhamella Catarrhalis in einer biologischen Probe, wobei dieses Berührungsverfahren stattfindet in:
einem Hybridisierungsmedium, das ungefähr 3 x SSC, (SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0), ungefähr 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,1, 20% deionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll , 0,02% Serumalbumin vom Rind, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und ungefähr 0,1 mg/ml scherzerkleinerte, denaturierte Lachssperma-DNS enthält, und/oder einem Waschmedium, das ungefähr 3 x SSC, 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,1 und 20% deionisiertes Formamid enthält, sind worin die verwendete Sonde aus der Gruppe der BCI1-Sonden, BCI2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, und geeigneterweise die Hybridisierungstemperatur auf ungefähr 30 bis 42ºC und/oder die Waschtemperatur auf ungefähr 30 bis 42ºC eingestellt ist.
27. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Branhamella-Catarrhalis-Stämme in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der BCI1-Sonden, BCI2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Branhamella Catarrhalis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Branhamella Catarrhalis spezifisch ist und aus der Gruppe der BCI1-Sonden, BCI2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Branhamella Catarrhalis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der BCI1-Sonden, BCI2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Branhamella Catarrhalis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
28. Verfahren zum Nachweis von Bordetella-Pertussis-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde, die aus der Gruppe der BPI1-Sonden und deren Varianten, wie sie in Anspruch 7 definiert sind, ausgewählt wurde, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Bordetella-Pertussis-Stämme ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern verstärkt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 29, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
31. Verfahren nach Anspruch 28 zum Nachweis von Bordetella Pertussis in einer biologischen Probe, wobei dieses Berührungsverfahren stattfindet in:
einem Hybridisierungsmedium, das ungefähr 3 x SSC, (SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0), ungefähr 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,1, 20% deionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll , 0,02% Serumalbumin vom Rind, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und ungefähr 0,1 mg/ml scherzerkleinerte, denaturierte Lachsperma-DNS enthält, und/oder einem Waschmedium, das ungefähr 3 x SSC, 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,1 und 20% deionisiertes Formamid enthält, und worin die verwendete Sonde aus der Gruppe der BPI1-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, und geeigneterweise die Hybridisierungstemperatur auf ungefähr 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf ungefähr 55ºC eingestellt ist.
32. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Bordetella-Pertussis-Stämme in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der BPI1-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Bordetella Pertussis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Bordetella Pertussis spezifisch ist und aus der Gruppe der BPI1-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Bordetella Pertussis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der BPI1-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Bordetella Pertussis durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
33. Verfahren zum Nachweis von Haemophilus-Influenzae-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde, die aus der Gruppe der HII1-Sonen, HII2-Sonden und deren Varianten, wie sie in Anspruch 7 definiert sind, ausgewählt wurde, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Haemophilus- Influenzae-Stämme ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
34. Verfahren nach Anspruch 33, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern verstärkt wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
36. Verfahren nach Anspruch 33 zum Nachweis von Haemophilus Influenzae in einer biologischen Probe, wobei dieses Berührungsverfahren stattfindet in:
einem Hybridisierungsmedium, das ungefähr 3 x SSC, (SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0), ungefähr 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,1, 20% deionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll , 0,02% Serumalbumin vom Rind, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und ungefähr 0,1 mg/ml scherzerkleinerte, denaturierte Lachssperma-DNS enthält, und/oder einem Waschmedium, das ungefähr 3 x SSC, 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,1 und 20% deionisiertes Formamid enthält, und worin die verwendete Sonde aus der Gruppe der HII1-Sonden, HII2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, und geeigneterweise die Hybridisierungstemperatur auf ungefähr 35 bis 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf ungefähr 35 bis 55ºC eingestellt ist.
37. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Haemophilus-Influenzae-Stämme in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der HII1-Sonden, HII2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Haemophilus Influenzae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Haemophilus Influenzae spezifisch ist und aus der Gruppe der HII1-Sonden, HII2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Haemophilus Influenzae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der HII1-Sonden, HII2-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Haemophilus Influenzae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
38. Verfahren zum Nachweis von Streptococcus-Pneumoniae-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde, die aus der Gruppe der SPI1-Sonden, SPI2-Sonden, SPI3-Sonden und deren Varianten, wie sie in Anspruch 7 definiert sind, ausgewählt wurde, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Streptococcus-Pneumoniae-Stämme ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
39. Verfahren nach Anspruch 38, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern verstärkt wird.
40. Verfahren nach Anspruch 39, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
41. Verfahren nach Anspruch 38 zum Nachweis von Streptococcus Pneumoniae in einer biologischen Probe, wobei dieses Berührungsverfahren stattfindet in:
einem Hybridisierungsmedium, das ungefähr 3 x SSC, (SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0), ungefähr 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,1, 20% deionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll , 0,02% Serumalbumin vom Rind, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und ungefähr 0,1 mg/ml scherzerkleinerte, denaturierte Lachssperma-DNS enthält, und/oder einem Waschmedium, das ungefähr 3 x SSC, 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,1 und 20% deionisiertes Formamid enthält, und worin die verwendete Sonde aus der Gruppe der SPI1-Sonden, SPI2-Sonden, SPI3-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, und geeigneterweise die Hybridisierungstemperatur auf ungefähr 45ºC und/oder die Waschtemperatur auf ungefähr 45ºC eingestellt ist.
42. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Streptococcus-Pneumoniae-Stämme in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der SPI1-Sonden, SPI2-Sonden, SPI3-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Streptococcus Pneumoniae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Streptococcus Pnemoniae spezifisch ist und aus der Gruppe der SPI1-Sonden, SPI2-Sonden, SPI3-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Streptococcus Pneumoniae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der SPI1-Sonden, SPI2-Sonden, SPI3-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Streptococcus Pneumoniae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
43. Verfahren zum Nachweis von Streptococcus-Agalactiae-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde, die aus der Gruppe der SAI1-Sonen, SAI2-Sonden, SAI3-Sonden, SAI4-Sonden und deren Varianten, wie sie in Anspruch 7 definiert sind, ausgewählt wurde, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Streptococcus-Agalactiae-Stämme ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
44 Verfahren nach Anspruch 43, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit zwei Primern verstärkt wird.
45. Verfahren nach Anspruch 44, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
46. Verfahren nach Anspruch 43 zum Nachweis von Streptococcus Agalactiae in einer biologischen Probe, wobei dieses Berührungsverfahren stattfindet in:
einem Hybridisierungsmedium das ungefähr 3 x SSC, (SSC = 0,15 mol NaCl, 0,015 mol Natriumcitrat, pH-Wert 7,0), ungefähr 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,1, 20% deionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll , 0,02% Serumalbumin vom Rind, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und ungefähr 0,1 mg/ml scherzerkleinerte, denaturierte Lachssperma-DNS enthält, und/oder einem Waschmedium, das ungefähr 3 x SSC, 25 mmol Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 7,1 und 20% deionisiertes Formamid enthält, und worin die verwendete Sonde aus der Gruppe der SAI1-Sonden, SAI2-Sonden, SAI3-Sonden, SAI4- Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, und geeigneterweise die Hybridisierungstemperatur auf ungefähr 35 bis 45ºC und/oder die Waschtemperatur auf ungefähr 35 bis 45ºC eingestellt ist.
47. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Streptococcus-Agalactiae-Stämme in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der SAI1-Sonden, SAI2-Sonden, SAI3-Sonden, SAI4-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Streptococcus Agalactiae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben.
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Streptococcus Agalactiae spezifisch ist und aus der Gruppe der SAI1-Sonden, SAI2-Sonden, SAI3-Sonden, SAI4- Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Streptococcus Agalactiae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde, die aus der Gruppe der SAI1-Sonden, SAI2-Sonden, SAI3-Sonden, SAI4-Sonden und deren Varianten nach Anspruch 7 ausgewählt ist, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Streptococcus Agalactiae durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
48. Sonde zum Nachweis von einem oder mehreren Campylobacter-Jejuni- und Campylobacter-Coli-Stämmen, die eine Sequenz von 15 bis zur maximalen Anzahl von Nukleotiden, die aus der Spacersequenz zwischen der rRNSn vom Typ 16S und 23S stammen, wie es in Fig. 10 dargestellt ist, oder ihr Komplement enthalten, vorausgesetzt, daß die Sonde ausschließlich mit der DNS und/oder der RNS aus den Campylobacter-Jejuni- und Campylobacter-Coli-Stämmen und nicht mit der DNS und/oder der RNS aus anderen Organismen hybridisiert.
49. Verfahren zum Nachweis von Campylobacter-Jejuni- und Campylobacter- Coli-Stämmen in einer biologischen Probe, worin das Verfahren das In-Kontakt- Bringen der biologischen Probe, in der die Nukleinsäuren (DNSn und/oder RNSn) der Stämme einer Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, mit einer Sonde nach Anspruch 48 unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den komplementären Nukleinsäuren der Campylobacter-Jejuniund Campylobacter-Coli-Stämmen ermöglichen, und den Nachweis der gebildeten Hybride umfaßt.
50. Verfahren nach Anspruch 49, worin die nachzuweisende Nukleinsäure vor einer Hybridisierung unter Verwendung der Polymerasekettenreäktion mit zwei Primern verstärkt wird.
51. Verfahren nach Anspruch 50, worin die beiden Primer zwei evolutionär eingefrorene Primer sind, die die Targetsequenz der Sonde flankieren.
52. Ausrüstung zum in vitro Nachweis der Campylobacter-Jejuni- und Campylobacter-Coli-Stämmen in einer biologischen Probe, wobei die Ausrüstung folgendes umfaßt:
entweder
mindestens eine Sonde nach Anspruch 48
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn der Campylobacter Jejuni und der Campylobacter Coli durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorhergehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens zwei Sonden, die das gleiche Nukleinsäuremolekül als Target haben und von denen mindestens eine für Campylobacter Jejuni und Campylobacter Coli spezifisch ist und in Anspruch 48 definiert ist,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen des Puffers notwendig sind, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Campylobacter Jejuni und der Campylobacter Coli durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, die sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben,
oder
mindestens eine Sonde nach Anspruch 48, die auf einen festen Träger fixiert ist,
die Primer, die zum Durchführen einer enzymatischen Verstärkung der DNS und/oder der RNS benötigt werden, die die Targetsequenz der vorstehend erwähnten Sonde enthält,
einen Puffer oder Komponenten, die zum Herstellen der Puffer benötigt werden, der es ermöglicht beziehungsweise die es ermöglichen, daß eine enzymatische Verstärkung stattfindet und/oder daß eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNSn und/oder den RNSn eines Stammes der Campylobacter Jejuni und Campylobacter Coli durchgeführt wird, und
eine Einrichtung zum Nachweis der Hybride, sich aus der vorstehenden Hybridisierung ergeben.
53. Verfahren zum gleichzeitigen in vitro Nachweis mehrerer Mikroorganismen, die in einer biologischen Probe enthalten sind, unter Verwendung beliebiger Sonden nach Anspruch 7, die spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus beziehungsweise die nachzuweisenden Mikroorganismen sind, worin die DNS und/oder die RNS, die in der biologischen Probe vorhanden sind (und die Targetsequenz umfassen), markiert wird und die biologische Probe mit einer Membran in Kontakt gebracht wird, auf der eine oder mehrere Oligonukleotid-Sonden an einer bekannten Stelle festgesetzt sind, und zwar in einem Medium, das eine spezifische Hybridisierung der verstärkten Targetsequenz und der Sonden auf der Membran ermöglicht, und die sich aus der Hybridisierung ergebenden Hybride durch eine geeignete Einrichtung nachgewiesen werden.
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