DE69006851T2 - Blutgerinnungshemmende zusammensetzungen aus faktor xa. - Google Patents
Blutgerinnungshemmende zusammensetzungen aus faktor xa.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft auf dem Koagulans-Faktor-Xa basierende Mittel zur Verwendung als ein Antikoagulationsmittel
- Die Koagulation ist das Endergebnis einer komplexen Reihe von Reaktionen, bei welchen das Endprodukt jeder Reaktion die nächste Reaktion in Gang setzt. Nach einer Gefäßverletzung erfolgt eine rasche Aktivierung eines ansonsten in hohem Maße passiven Verfahrens zur Herbeiführung einer Antwort bzw. eines Ansprechens an der Verletzungsstelle. Es gibt die verschiedensten Modulationsvorgänge, die das Verfahren in positiver oder negativer Weise zur Erhaltung einer Gefäßunversehrtheit unter Erhaltung der allgemeinen Plasmafließfähigkeit steuern. Gemäß der in jüngster zeit erfolgtenzusammenfassung von Kenneth G. Mann in "Membrane-Bound Complexes in Blood Coagulation" Progress in Hemostasis and Thrombosis, Herausgeber T.H. Spaet, Seiten 1-23 (Grune & Stratton 1984) kann das umfassende Netzwerk (wechselseitig) abhängiger Proteinwechselwirkungen als eine Sammlung von 4 Reaktionskomplexen dargestellt werden: Hagemann Factor Prekallikrein HMW Kininogen Faktor XI "Oberfläche" Faktor VII Gewebefaktor "Phospholipid" Ca&spplus;&spplus; Faktor IX Faktor IXa Faktor VIII, Faktor X Faktor Xa Faktor Xa, Faktor V, "Phospholipid" Ca&spplus;&spplus; Faktor II Faktor IIa
- Faktor II (Prothrombin), Faktor X, Faktor IX und Faktor VII sind Vitamin K-abhängige Proteine, die normalerweise als zu trypsinartigen Enzymen mit Serin und Histidin als aktiver Stelle aktivierbare Zymogene zirkulieren. Im Blut ist Prothrombin in in etwa mikromolaren Konzentrationen vorhanden. Faktor V und Faktor X sind in einer Menge von etwa einem zehntel dieser Menge (10&supmin;&sup7;M) vorhanden. Die Geschwindigkeit der Faktor II zu IIa (Thrombin) umwandelnden Reaktion ist etwa 278 000mal größer, wenn sämtliche Komponenten des Komplexes in Wechselwirkung treten (d.h. Faktor II, Faktor V, Ca&spplus;&spplus;, und das Phospholipid oder die Membranoberfläche) (Nesheim und Mitarbeiter in "J.Biol.Chem", 254, 10952-10062) (1979)). Das Fehlen irgendeiner Komponente im Komplex führt zu einer drastischen Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit.
- Obwohl die Mechanismen zur Steuerung der Koagulation zur Verhinderung einer Thrombose üblicherweise recht wirksam sind, können sie durch Erkrankung, einen angeborenen Defekt oder eine Fehlfunktion oder einen entzündlichen Reiz, der die Freisetzung von Entzündungsvermittlern, z.B. der Monokine Tumornekrosefaktor (TNF) und Interleukin 1 (IL-1), auslöst, unterbrochen werden.
- Es gibt die verschiedensten pathologischen Zustände einschließlich Sepsis, insbesondere gram-negativer septischer Schock, β-Streptococcus- und Staphylococcus aureus- Blutvergiftung, sowie Verletzungen mit erheblicher Gewebeschädigung, z.B. Verbrennungen und zerstrünerungsverletzungen, die eine Freisetzung von Entzündungsmediatoren hervorzurufen vermögen. Entzündungsmediatoren werden auch bei respiratorischem Insuffizienzsyndrom bei Erwachsenen und Wiederdurchblutungsentzündungs-Syndrom freigesetzt.
- Bei einem septischen Schock umfaßt das Ansprechen des Endothels auf die Entzündungsreize sowohl eine Koagulopathie als auch eine abnormale Permeabilität. Der Reiz aktiviert zirkulierende Monozyten und die fixierten Gewebemakrophagen in der Leber und den Lungen. Nach einer Verzögerungsdauer von etwa 2 bis 4 Stunden setzen diese Blutkörperchen die monokinen Entzündungsvermittler Tumornekrosefaktor (TNF) und Interleukin 1 (IL-1) frei. Diese Entzündungsreize führen zur Umwandlung von Endothelzellenoberflächen aus einem Antikoagulans- zu einem Prokoagulanszustand unter intravaskulärer Koagulation. Wenn diese Fehlfunktion systemisch ist, wird sie als dißseminierte intravaskuläre Koagulopathie (DIC) bezeichnet. Bei der DIC verliert die Endothelzelle ihre Fähigkeit zur selektiven Porositätssteuerung. Die Endothelzellen quellen und Fluidum beginnt in das umgebende Gewebe auszusikkern, was zu Sauerstoffmangel und Parenchymschädigung führt. Dies wird von einem erhöhten peripheren Wiederstand, verringertem venösem Rückstrom und, in zahlreichen Fällen, Schocktod begleitet.
- Ein septischer Schock kann in einem klinischen Modell durch Infusions-Verabreichung einer letalen Dosis von Escherichia coli an einen Pavian simuliert werden (vgl. F.B. Taylor "Baboon model of E. coli Septic shock staging and observations on the role of the vascular endothelium" Kapitel 13 "Critical Care State of the Art", Herausgeber B.F. Fuhrman und W.C. Schoemaker, Band 10 (Soc.Critical Care Medicine 1989)). Der klinische Verlauf ist als vierstufiges Verfahren gekennzeichnet. Stufe 1 beginnt mit dem Entzündungsreiz, beispielsweise einer letalen Infusion von Escherichia coli, und läuft etwa 120 min ab. In dieser Stufe werden die Fängerzellen (Monozyten und Makrophagen) und polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMNLs) aktiviert und die Entzündungsvermittler (TNF, IL-1, freie Hydroxylradikale, Elastase und dgl.) freigesetzt. Danach beginnt Stufe II, sie dauert etwa 4 h oder reicht von 2 bis 6 h nach dem Insult. Während dieser Stufe veranlassen die Vermittler bzw. Mediatoren die Endothelzellen, sich zu entzünden oder "beunruhigt zu werden", wobei sie von einem Antikoagulans- zu einem Prokoagulanszustand übergehen. Der Fibrinogengehalt sinkt, während der Anteil an Fibrinabbauprodukten steigt. Fibrinolytische Aktivität von Vollblut steigt über 1 h oder 2 h deutlich an und sinkt dann nahezu augenblicklich 3 h nach dem Insult. Die Stufe III setzt etwa 6 h nach dem Insult ein und dauert etwa 4 h. In dieser Stufe verlieren die Endothelzellen ihre Fähigkeit zur selektiven Permeabilitätssteuerung, während Fluidum unter Schädigung von Zielorganen in das Gewebe auszusickern beginnt. In der vierten und letzten Stufe produziert das Parenchym einen Nebenschluß, peripheren und eventuell zentralen Sauerstoffmangel und einen verminderten mittleren systemischen arteriellen Druck. Der Tod tritt in typischer Weise etwa 24 bis 32 h nach dem Insult ein.
- Die Behandlung für diese Störungen unter Beteiligung von Entzündungsvermittlern umfaßt üblicherweise die Verabreichung yon Antikoagulationsmitteln. Antikoagulationsmittel werden auch zur Verhinderung eines Reverschlusses nach einer Gefäßplastik, einer akuten Organabstoßung und einer tiefliegenden Venenthrombose nach einer Operation, sowie zur Behandlung instabiler Angina, wandständiger Thrombose, eines Schlaganfalls, eines Herzinfarkts und von Lungenembolie eingesetzt.
- Es gibt derzeit eine Reihe bekannter und in der Medizin akzeptierter Antikoagulationsmittel. Die weiteste Verbreitung als Antikoagulationsmittel finden Heparin und Vitamin K-Antagonisten, wie Cumarin und Aspirin. Heparin wirkt in Verbindung mit einem weiteren Plasmaprotein, Antithrombin III als Koagulationshemmer. Eine Heparinbehandlung ist nicht in sämtlichen Fällen wirksam, da bei schwerem Schock und anderen "verbrauchenden" Koagulationsverfahren Antithrombin III oftmals (nur) in geringer Menge vorhanden ist. Darüber hinaus können Patienten Gegenreaktionen gegen Heparin einschließlich einer heparininduzierten Thrombozytopenie zeigen. Schließlich hat sich auch die Erhaltung einer wirksamen Heparindosis in vivo als schwierig erwiesen.
- Cumarinarzneimittel zeigen nur eine langsame Wirkung, es dauert mehrere Tage, bevor antithrombotische Wirkungen zu beobachten sind. Blutungen sind eine übliche Komplikation einer Behandlung mit einem Vitamin K-Antagonisten. Wie bei Heparin läßt sich (auch hier) die wirksame Dosis nur schwierig überwachen, da die erforderliche Dosis sowohl durch die Nahrung als auch durch andere in dem Patienten vorhandene Arzneimittel, insbesondere Antibiotika, beeinflußt wird. Darüber hinaus gibt es eine seltene Komplikation, die zu einer Hautnekrose und einem möglichen Gliedmaßenverlust oder, in Ausnahmefällen, dem Tod des Individuums führt (vgl. C.T. Esmon und Mitarbeiter "Anticoagulant Proteins C and S" in New Dimensions of Warfarin Prophylaxis, Herausgeber Wessler und Mitarbeiter, Plemum Publishing Corp., New York, 47-54, 1987). Aspirin ist auf die Hemmung einer Plättchenaggregation beschränkt und bei der Behandlung von Patienten mit schwerem Thromboserisiko (nur) von geringem Nutzen.
- Eine (bereits) vorgeschlagene Alternativmethode zur Gerinnungsunterdrückung besteht in der direkten Verabreichung von thrombinhemmenden Verbindungen. Es wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, bei denen die aktive Stelle der Koagulationsenzyme in vitro mit Hilfe der verschiedensten Inhibitortypen, insbesondere niedrigmolekularen Serinesteraseinhibitoren, wie Diisopropylfluorphosphat (DFP), gehemmt wird. So benutzten beispielsweise Skogen und Mitarbeiter gemäß "J. Biol. Chem." 259(4), 2306-2310 (1984) den Serinesteraseinhibitor (p- Amidinophenyl)methansulfonylfluorid (pPMSF) zur Hemmung der aktiven Stelle des Faktors Xa sowohl in seiner nativen Form als auch in modifizierter Form zur Bestimmung der Rolle des bei der Bildung des Prothrombinasekomplexes eine Bindung mit dem Faktor Xa eingehenden Faktors Va.
- Hanson und Mitarbeiter benutzten gemäß "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 85:3184-3188 (1988) ein synthetisches Antithrombin D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginyl-chlormethylketon (PPACK) zur Blockade einer arteriellen Thrombose durch spezielle Wechselwirkung mit Thrombin. Ein Nachteil dieses Versuchs ist jedoch das Erfordernis, hohe Dosen an reaktionsfähigen Verbindungen mit unbekannten Nebenwirkungen verabreichen zu müssen. Darüber hinaus werden diese kleinen Verbindungen rasch aus dem Blutstrom geklärt, wobei die Überwachung einer Erhaltungsdosis komplex ist.
- Es gibt zahlreiche Schwierigkeiten beim Versuch aus in vitro Untersuchungen bezüglich einer Hemmung von Koagulationsfaktoren auf einen in vivo Einsatz eines gehemmten Proteins als Antikoagulationsmittel zu extrapolieren. Modifizierte Proteine, z.B. ein inaktivierter Koagulationsfaktor, können weit rascher durch Zellen des Retikuloendothelialsystems aus dem Blut "entnommen" werden als die unmodifizierten Proteine. Der Koagulationsprozeß ist komplex und umfaßt Wechselwirkungen zwischen Proteinen in den endogenen und exogenen Bahnen und Zelloberflächenrezeptoren. In vitro sind die Proteine üblicherweise in reiner Form vorhanden, wobei im allgemeinen Zelloberflächenrezeptoren oder sonstige Plasmaproteinkomponenten, die Wechselwirkungen mit dem inhibierten Protein verändern können, fehlen. So belegten beispielsweise in vivo Untersuchungen unter Verwendung von Thrombin mit inaktivierter aktiver Stelle, daß die Infusion dieses proteolytisch inaktiven Proteins in der Tat einen Prokoagulanszustand induzierte, und zwar möglicherweise aufgrund einer Bindung mit endogenen Koagulationshemmern, wie Thrombomodulin.
- Ein rasches und wirksames Antikoagulans mit relativ langer Halbwertszeit in vivo, das nicht mit den Nebenwirkungen und Nachteilen der derzeit benutzten (Antikoagulationsmittel) behaftet ist, würde sich zur Verhinderung eines Reverschlußes nach einer Gefäßplastik, einer akuten Organabstoßung sowie einer tiefliegenden postoperativen Venenthrombose sowie zur Behandlung instabiler Angina, wandständiger Thrombose, eines Schlaganfalls, von Herzinfarkt und Lungenembolie eignen.
- Der Erfindung lag folglich die Aufgabe zugrunde, eine sichere, wirksame und rasch wirkende zubereitung zum in vivo Gebrauch als Antikoagulationsmittel zu entwikkeln. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Antikoagulans- Zubereitungen zur in vivo Applikation. Schließlich liegt der Erfindung auch noch die Aufgabe zugrunde, Zubereitungen zur Verwendung im Rahmen eines Verfahrens zur Behandlung von Patienten, die eine entsprechende Behandlung benötigen, mit einer wirksamen Menge einer Antikoagulationsmittelzubereitung zu entwickeln.
- Eine Antikoagulans-Zubereitung mit einer wirksamen Menge Faktor Xa, dessen aktive Serinstelle inaktiviert wurde, vermag in vivo rasch und wirksam eine Koagulation zu unterdrücken. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der Faktor Xa, eine Serinesterase, die mit dem Faktor Va, Ca&spplus;&spplus; und einem Phospholipid zur Katalyse der Prothrombinaktivierung einen Komplex bildet, zunächst mit einem Inhibitor für eine aktive Stelle, z.B. Dansyl-Glu- Gly-Arg-Chlormethylketon unter Bildung von inaktiviertem Faktor Xa (fXai) inaktiviert. Bei einer anderen Ausführungsform wird der Faktor Xa aus einer Gensequenz, bei der die Stelle mit Codierung für den aktiven Serinbereich modifiziert ist, exprimiert. Das inaktivierte Protein behält seine Fähigkeit zur in vivo Bindung an dem endogenen Faktor Va. Eine Verabreichung von inaktivem Faktor Xa an das Blut eines Patienten führt zur in vivo Bildung von inaktiver Faktor Xa-Va-Komplexen unter Hemmung einer Koagulation.
- Bei einem bevorzugten Verfahren zur Hemmung einer Koagulation wird eine zur Hemmung der Koagulation durch Bindung an freien Faktor Va wirksame Menge an inaktiviertem Faktor Xa in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger an einen Patienten verabreicht. In einigen Fällen, wie im Falle eines septischen Schocks, bei welchem inaktivierter Faktor Xa alleine zur Behandlung der Permeabilitätsstörungen unwirksam ist, kann es zweckmäßig sein, den inaktivierten Faktor Xa mit anderen Verbindung, z.B. Antikörpern gegen Tumornekrosefaktor (TNF), Antithrombin III (ATIII), und aktiviertem Protein C, einem natürlich vorkommenden Antikoagulans, zu kombinieren.
- Überraschender Weise besitzt der modifizierte Faktor Xa, wie bei an einem septischen Schock-Primatenmodell durchgeführte Untersuchungen gezeigt haben - eine in vivo Halbwertszeit von etwa 10 h, so daß das Antikoagulans zur Gerinnungshemmung lediglich einmal oder zweimal pro Tag verabreicht werden muß.
- Figur 1 ist die Aminosäuresequenz für Faktor X, bearbeitet nach Leytus und Mitarbeiter in "Biochemistry" 25, 5101 (1986), aus der die aktive Serinstelle 185 und die Spaltungsstelle zur Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa hervorgehen.
- Die Figuren 2A und 2B sind graphische Darstellungen, in denen die Wirkung von inaktiviertem Faktor Xa (Figur A) gegen unbehandelte Kontrollen (Fig. B) bei Pavianen als Antwort auf die Verabreichung letaler Dosen von E. coli verglichen wird. Gezeigt sind die Klärungsgeschwindigkeit für verabreichten inaktiven Faktor Xa (-o-), der prozentuale Fibrinogengehalt relativ zum Basisgehalt (-X- -X-), und der Gehalt an Tumornekrosefaktor (TNF) (- -- -) als Funktion der Zeit (h).
- Es wurde nun gezeigt, daß inaktivierter Faktor Xa als in vivo rasch wirksames Antikoagulans durch Komplexbildung mit dem endogenen Faktor Va zu wirken vermag. Der exogen verabreichte inaktivierte Faktor Xa konkurriert mit dem und vermindert den zur Komplexbildung mit endogenem Faktor Xa verfügbaren freien Faktor Va. Die Verminderung des verfügbarer Faktor Va-Pools hemmt wirksam das Koagulationsverfahren.
- Antikoagulantien mit in vivo Halbwertszeiten von mindestens 5 min und vorzugsweise mehr als 1 h sind in hohem Maße erwünscht. Wie bei dem septischer Schock-Pavian-Modell gezeigt wurde, beträgt die in vivo Halbwertszeit des modifizierten inaktivierten Faktors Xa etwa 10 h. Die normale in vivo Halbwertszeit des Faktors X liegt in der Größenordnung von 10 h. Im Gegensatz dazu beträgt die normale in vivo Halbwertszeit des Faktors Xa lediglich etwa 30 s. Die signifikant längere Halbwertszeit des modifizierten inaktivierten Faktors Xa erhöht in hohem Maße dessen Brauchbarkeit als Antikoagulans, da es an einem Patienten einmal oder zweimal und nicht in weit häufigeren Intervallen verabreicht werden kann und (trotzdem) seine Wirksamkeit entfaltet.
- Eine geeignete Faktor Xa Zubereitung zur Verabreichung an einen Patienten erhält man entweder durch Inaktivieren des Faktors Xa unter Verwendung eines Serinesteraseinhibitors oder des Fab-Teils eines Antikörpers zu dem aktiven Serinbereich des Faktor Xa (Asp-His-Ser) oder durch Modifizieren des Proteins zur Beseitigung oder Inaktivierung des aktiven Serinbereichs. Die Sequenz des Faktors Xa ist seit einer Reihe von Jahren bekannt und das Gen geklont (vgl. Leytus und Mitarbeiter in "Biochemistry" 25, 5098-5102 (1986)) (vgl. Figur 1). Da der proteolytisch aktive Bereich bekannt ist, kann ein Fachmann die Nucleotidsequenzen mit Kodierung für diesen Proteinbereich zur Exprimierung eines Polypeptids mit Faktor Xa-Aktivität, das proteolytisch inaktiv ist und folglich Prothrombin nicht zu Thrombin zu aktivieren vermag, deletieren. Zur Isolierung und Charakterisierung der Gensequenz für den Faktor X kann man sich rekombinanter Maßnahmen, z.B. der von Leytus und Mitarbeitern in "Biochemistry" 25, 5098-5102 (1986) angewandten Maßnahmen oder ähnlicher Maßnahmen, wie sie bei der Expression des Faktors IX durchgeführt wurden (vgl. Kaufman und Mitarbeiter "Expression, purification and Characterization of Recombinant gamma-Carboxylated Factor IX synthesized in Chinese Hamster Ovary Cells" in "J. Biol. Chem." 261, 9622-9628, (1986)), bedienen.
- Diese Maßnahmen werden teilweise wie folgt zusammengefaßt:
- Zu Faktor X homologe Oligonucleotidsequenzen werden synthetisiert und zur Verwendung als Hybridisierungssonden markiert. Die erhaltenen Sonden dienen zur Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek, z.B. der lambda Charon 4A Bibliothek von Lawn und Mitarbeitern in "Cell" 1157-1174 (1978) und der lambda EMBL3 Bibliothek von Yoshitake und Mitarbeitern in "Biochemistry" 24, 3736-3750 (1985) unter Durchführung einer Plague-Hybridisierung (vgl. Benton & Davis in "Science" 196, 180-182 (1977) und Woo " Methods Enzymol." 68, 389-395 (1979)). Genome DNA-Inserte werden aus gereinigter rekombinanter Phagen-DNA durch Restriktionsenzymverdauung freigesetzt und nach dem Verfahren von Vieira & Messing in "Gene" 19, 259-268 (1982) in einen Plasmidvektor, z.B. pUC, subgeklont. Plasmid-DNA erhält man nach dem von Micard und Mitarbeitern gemäß "Anal. Biochem." 148, 121-126 (1985) modifizierten Methode des alkalischen Extraktionsverfahrens von Birnboim & Doly in "Nucleic Acids Res." 7, 1513-1523 (1979). Genome DNA-Inserte werden durch einzelne und doppelte Restriktionsenzymverdauung und anschließende Agarose-Gelelektrophorese, Southern blotting (Southern, "J. Mol. Biol." 98, 503-517 (1975)) und Hybridisierung zu radioaktiv markierten cDNA-Sonden, die durch nick-Translation (Rigby und Mitarbeiter in "J. Mol. Biol." 113, 237-251 (1977)) von aus Agarosegelen isolierten DNA-Fragmenten kartiert. Ausgewählte Fragmente aus Restriktionsenzymverdauungen von rekombinanten Plasmiden werden nach dem Verfahren von Messing "Methods Enzymol." 101, 20-78 (1983) in M13 Bakteriophagenvektoren subgeklont. Danach werden genome Subklone in M13 Vektoren, die zu cDNA- Sonden für den Faktor X hybridisieren, isoliert und durch das Didesoxykettenterminationsverfahren von Sanger und Mitarbeitern in "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A." 74, 5463- 5467 (1977) unter Verwendung synthetischer Oligonucleotidprimer sequenziert. Schließlich werden die Gensequenzen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in einem Bakterienwirt oder einem eukaryotischen Wirt exprimiert.
- Die Anwesenheit von Faktor X läßt sich durch Gerinnungstests, immunchemische Tests unter Verwendung von Antifaktor X Antikörpern oder mit einem Festphasen-enzymverknüpften Immunsorbenstestsystem bestimmen.
- So läßt sich beispielsweise die Faktor X-Koagulansaktivität mit einem zweistufigen Test unter Verwendung eines Plasmas mit fehlendem Faktor X bestimmen. Eine Einheit von Faktor X-Aktivität entspricht der Menge an Faktor X in 1 ml normalem gepooltem Humanplasma. Der Gerinnungstest spiegelt die Geschwindigkeit der Thrombinproduktion wider. Lösungen von Faktor Xa werden in Gegenwart oder Abwesenheit der sonstigen Komponenten des Prothrombinasekomplexes ohne Prothrombin inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird mit 0,1 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH- Wert: 7,6 auf das Volumen gebracht bzw. aufgefüllt. Nach 5minütiger Herstellung eines Gleichgewichts wird Prothrombin zugesetzt und eine Stoppuhr gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden aliquote Teile in fibrinogenhaltige (2,5 mg/ml Endkonzentration) Gerinnungsröhrchen eingetragen. Die Gerinnungszeit wird aufgezeichnet. Die Thrombineinheiten werden aus mit Hilfe von gereinigtem Thrombin einer spezifischen Aktivität von 1200 Einheiten/Absorptionseinheit bei 280 nm aufgestellten Standardkurven errechnet. Dananch wird die Geschwindigkeit der Thrombinbildung für jede Inkubation berechnet und als Mole an gebildetem Thrombin pro min/Molfaktor Xa ausgedrückt. Bei Reaktionen, bei denen größere Mengen an Thrombin gebildet werden, werden die Proben vor Zugabe zu dem Fibronogen in 0,1 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,5 verdünnt.
- Die Sequenz für den Faktor X ist in Figur 1 dargestellt. Allgemeine Verfahren zur seitengerichteten Mutagenese sind bekannt. Diese können zur Modifizierung des Genbereichs mit Kodierung für das aktive Serin zur Gewinnung eines proteolytisch inaktiven Faktors Xa benutzt werden. Eine seitengerichtete Mutagenese ist als Änderung der Nucleotidsequenz eines Gens an einer speziellen Stelle auf eine festgelegte Weise definiert. In der Regel wird eine kurzes Oligonucleotid (20-30 Basen von DNA), das die gewünschte Mutation enthält, synthetisiert und zu der komplementären Matrize mit der Wildtyp-DNA-Sequenz hybridisiert. Das kurze Oligo wird dann unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von exogen zugesetzten Desoxyribonucleotidtriphosphaten (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) extendiert. Das erhaltene Produkt besteht aus einem Heteroduplex-Molekül mit einem nicht-passenden Bereich (mismatch) entsprechend der gewünschten Mutation in einem Strang des DNA-Duplex. Dieses Produkt wird dann durch Transformation in ein Bakterium (üblicherweise E. coli) eingeschleust. Die Mutation wird in dem Bakterium als Ergebnis einer Replikation fixiert. Nach der Replikation wird in dem Bakterium sowohl Wildtyp- als auch Mutanten- Duplex-DNA produziert. Die die Mutanten-DNA-Moleküle beherbergenden Bakterienkolonien werden identifiziert und gezüchtet. Die gewünschten DNA-Moleküle werden extrahiert. Nach Bestätigung der Mutation durch DNA-Sequenzierung wird das mutante Gen in einen Expressionsvektor subgeklont und zur Herstellung des Mutanteproteins in eine geeignete Zellinie transfektiert.
- Der inaktivierte Faktor Xa kann aus aus Plasma derselben oder einer unterschiedlichen Art des zu behandelnden Subjekts isoliertem Faktor X hergestellt werden. So lassen sich beispielsweise die in den Antikoagulans-zubereitungen verwendbaren Polypeptide aus Pferde-, Rinder-, Schweine-, Schaf-, Ziegen-, Human- oder Affenblut gewinnen. Eine Wirksamkeit zwischen (verschiedenen) Spezies wurde bei einigen Spezies, beispielsweise Mensch und Rind, belegt. Eine Langzeitverabreichung oder eine Kreuzspeciesverabreichung von inaktiviertem Faktor Xa sollte jedoch vermieden werden, da dann die Gefahr einer möglichen Immunreaktion existiert. Andererseits können der Faktor X oder Polypeptide mit Faktor X-Aktivität, die durch Aktivierung der Verwendung eines Faktor X aktivierenden Enzyms aus Russell-Viperngift mit Faktor Xa-Aktivität ausgestattet werden können, Faktor IXa in Kombination mit Phospholipid und Ca&spplus;&spplus; oder Faktor VIIa, Gewebefaktor und Ca&spplus;&spplus; aus dem geklonten Gen für den Faktor X exprimiert werden.
- So kann beispielsweise der Faktor X aus Plasma nach dem Verfahren von Owen und Mitarbeitern in "J. Biol. Chem." 249, 594-605 (1974) isoliert werden. Spuren an Verunreinigungen werden durch Chromatographieren des wiederaufgelösten Ammoniumsulfat (15-55%ige Sättigung) -Niederschlags auf einer Ultragel 44 -Säule (1,5x100cm), die in 0,1 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, 5 mM Benzamidin/HCl, pH- Wert: 7,5 ins Gleichgewicht gesetzt wurde, entfernt. Fraktionen mit Faktor X-Aktivität werden gesammelt und auf eine m-Aminobenzamidin-Sepharose -Säule (2x20 cm), die in dem selben Puffer ins Gleichgewicht gesetzt wurde, appliziert. Der Faktor X wird auf der Säule mit 2,0 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, 0,02 M Benzamidin/HCl, pH-Wert: 7,5 eluiert. Fraktionen mit Faktor X-Aktivität werden gesammelt und gegen 0,1 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH-Wert: 7,5 dialysiert. Der Faktor X wird nach dem Verfahren von Bachmann und Mitarbeitern in "Thromb. Diath. Haemmorrh." 2, 24-38 (1958) getestet. Der Faktor X kann mit dem aus Russel-Viperngift gereinigtem X-Koagulansprotein zu Faktor Xa aktiviert werden (vgl. die Ph.D.-Dissertation von C.T. Esmon, Washington University (1973)) und nach Bajaj und Mann in "J. Biol. Chem." 248, 7729-7741 (1973) getestet werden. Der Faktor Xa wird auf QAE-Sephadex weiter gereinigt
- Monoklonale Antikörper werden wie folgt hergestellt:
- BALB/c-Mäuse erhalten eine peritoneale Injektion von 50-100 ug des gereinigten Proteinantigens in vollständigem Freund'schem Hilfsmittel. Die Mäuse werden nach 3 Wochen mit in unvollständigem Freund'schem Hilfsmittel emulgiertem Proteinantigen und nach 6 Wochen mit Proteinantigen in TBS (0,1 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH-Wert: 7,5) erneut immunisiert. 4 Tage später werden Milzzellen mit einer Mäusemyelomzellinie, z.B. PX63AG8-653, unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol 1450 nach Standardtechniken, wie sie von M. Laurell, K. Ikeda, S. Lindgren und J. Stenflo in "FEBS Letters" 191, 75-81 (1985); K. Wakabayashi, Y. Sakata und N. Aoki in "J. Biol. Chem." 261, 11097-11105 (1986); C. A. K. Borrebaeck und M. E. Etzler in "J. Biol. Chem." 256, 4723-4725 (1981) und G. Kohler und C. Milstein in "Nature" 256, 495-497 (1975) beschrieben sind, verschmolzen.
- Zellen werden in HAT-Medium zur Hybridomselektierung wachsen gelassen. Nach 4 Wochen werden die Überstände aus verschmolzenen zellen mittels Festphasen-enzymverknüpftem Immunadsorptionstest (ELISA) in Gegenwart und Abwesenheit von 5 mM Ca&spplus;&spplus; auf eine antigenspezifische Antikörperbildung durchgetestet. Kulturüberstände werden zum Test 1:4 in Puffer mit entweder 5 mM CaCl&sub2; oder 5 mM EDTA verdünnt. Sämtliche Reagentien (Antigen, Waschpuffer, Nachweisantikörper) enthalten die geeigneten Calcium- oder EDTA-Konzentrationen.
- Interessierende Klone (basierend auf positivem ELISA-Ergebnissen) werden dann mindestens zweimal durch Verdünnungsbegrenzung auf bei Maus-Bauchhöhlendurchspülung gewonnenen Mastzellen regeklont. Zur Gewinnung von Bauchwasserflüssigkeit werden BALB/c Mäuse zunächst mit Pristan vorbereitet. 14 Tage später erhalten sie eine peritoniale Injektion von 0,1 ml 10 mg/ml Cyclophosphamid Zur-Herbeiführung eines Immunkompromisses beim jeweiligen (Versuchs)Tier. 24 h später werden 3-6x10&sup6; Zellen intraperitonial injiziert. Nach 7-10 Tagen wird Bauchwasserflüssigkeit gesammelt.
- Die monoklonalen Antikörper werden aus Bauchwasserflüssigkeit durch NH&sub4;SO&sub4;-Fraktionierung (die Bauchwasserflüssigkeit wird mit Wasser 1:1 verdünnt, dann erfolgt eine Fällung durch Zusatz gleicher Volumina gesättigter NH&sub4;SO&sub4;), anschließendes Chromatographieren auf QAE-Sephadex Q-50 (der Ammoniumsulfatniederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, in 0,027 M Tris PO&sub4;, pH-Wert: 6,3 entsalzt, auf einer Säule im Verhältnis 1 ml Harz/ml Bauchwasser chromatographiert, in 0,027 M Tris PO&sub4;, pH- Wert: 6,3 ins Gleichgewicht gesetzt, mit einem dem fünffachen Säulenvolumen entsprechenden linearen Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl über etwa 8 h entwickelt), anschließende Fällung des teilweise gereinigten Antikörpers mit 50% NH&sub4;SO&sub4; und Sephadex G200-Säulenchromatographie 0,1 M NaCl 1 mM MOPS, pH-Wert: 7,5 gereinigt.
- Fab-Fragmente von IgG werden durch 2stündige Verdauung des Antikörpers bei 37ºC mit immobilisiertem Papain (Pierce) hergestellt. Die erhaltenen Fab-Fragmente werden bis zur Homogenität durch Absorption gegen immobilisiertes Staph-Protein A und Geldurchdringungschromatographie (Sephadex 150; Pharmacia) gereinigt.
- Es ist wichtig, daß der modifizierte oder inhibierte Faktor Xa die Faktor Va-Bindungsaktivität behält. Der Faktor Xa reagiert etwa im Molverhältnis 1/1 mit dem Faktor Va. Vorzugsweise sollte er auch seine Fähigkeit zur Bindung an Phospholipid behalten. Es ist nicht bekannt, welche der Faktor Xa-Sequenzen die Faktor Va-Bindeaktivität aufweisen. Es wurde gezeigt, daß eine Blockade des aktiven Serins mit einem Serinesteraseinhibitor die Bindungsaktivität nicht stört. Eine Bindung von Antithrombin III an Faktor Xa stört die Faktor Va-Bindung. Der Ausdruck "inaktivierter Faktor Xa" bedeutet im vorliegenden Falle einen entweder modifizierten oder inhibierten Faktor Xa oder Faktor Xa-Polypeptide mit normaler Bindungsaffinität für den Faktor Va, jedoch mit (nur) geringer oder keiner Serinesteraseaktivität.
- Der Faktor Xa kann mit 5-(Dimethylamino)naphthalinsulfonylglutamylglycylarginyl(DEGR)chlormethylketon zu DEGR-Xa, einem analogen des Faktors Xa mit einem an der aktiven Stelle kovalent gebundenen fluoreszierenden Farbstoff, umgesetzt werden, um die Verfügbarkeit der Faktor Va-Bindungsstelle nach Inaktivierung der aktiven Serinstelle zu ermitteln (vgl. Husten und Mitarbeiter in "J. Biol. Chem." 262(27), 12953-12960 (1987)). Wenn DEGR- Xa mit Phosphatidylcholin/Phosphatidylserinbläschen mit Octadecylrhodanin titriert wird, erfolgt eine Fluoreszenzenergieübertragung zwischen den Donorfarbstoffen an den aktiven Stellen der membrangebundenen Enzyme und den Akzeptorfarbstoffen an der Aussenfläche der Phospholipiddoppelschicht. Basierend auf der Abhängigkeit der Wirkung einer Singulett-Singulett-Energieübertragung von der Akzeptordichte und unter der Annahme, daß k² = 2/3, beträgt der Abstand der engsten Annäherung zwischen der Aktivstellensonde und der Oberfläche der Phospholipiddoppelschicht durchschnittlich 6,1 nm (61 Angstrom) in Abwesenheit von Faktor Va und 6,9 nm (69 Angstrom) in Anwesenheit von Faktor Va. Eine Vereinigung von Faktor Xa mit Faktor Va auf der Membranoberfläche zur Bildung des Prothrombinasekomplexes führt zu einer beträchtlichen Bewegung der aktiven Stelle des Enzyms relativ zur Meinbranoberfläche.
- Inhibitoren, die eine kovalente Bindung mit dem Faktor Xa eingehen, werden bevorzugt. Ein Polypeptid mit Faktor Xa-Aktivität kann unter Benutzung von dem Fachmann bekannten Inhibitoren für die aktive Stelle inaktiviert werden. Beispiele für bekannte Inhibitoren für die aktive Stelle sind (p-Aminophenyl)methylsulfonylfluorid (PMSF), Diisopropylfluorphosphat (DFP) und Dansyl-glu-gly-arg- chlormethylketon (Dns-Glu-Gly-Arg). Die selektive irreversible Hemmung von Faktor Xa unter Verwendung von Dns- Glu-Gly-Arg wird von Nesheim und Mitarbeitern in "J. Biol. Chem" 256(13), 6537-6540 (1981) und im folgenden Beispiel beschrieben.
- Die Antikoagulans-Behandlungsmethoden, bei denen von der vorliegenden Erfindung Gebrauch gemacht werden kann, benützen eine Arzneimittelzubereitung mit einem Polypeptid mit der Fähigkeit zur Bindung des Faktors Va und gleichzeitig der Unfähigkeit, als Protease zur Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin zu wirken, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Verabreichung an das zu behandelnde Subjekt, vorzugsweise einem Träger zur intravenösen Verabreichung, wie physiologischer Kochsalzlösung, Phosphat gepufferter Kochsalzlösung oder einem "synthetischen Plasma". Die Menge an inaktiviertem Faktor Xa ergibt sich aus der Menge an aus dem Koagulationsverfahren zu entfernenden Faktor Va. In der Regel reagiert der Faktor Xa mit dem Faktor Va in einem 1/1-Verhältnis. Man kann die erforderliche Dosis auf der Basis einer Konzentration des Faktors V in Blut und Plättchen in der Größenordnung von 10&supmin;&sup7; M berechnen, obwohl der Faktor V zum größten Teil nicht in aktiviertem Zustand vorliegt. Folglich dürfte man im allgemeinen eine weit unter 10&supmin;&sup7; M liegende Menge an inaktiviertem Faktor Xa verabreichen. In der Regel liegt die wirksame Menge an inaktiviertein Faktor Xa im Bereich zwischen 1 ng inaktivierter Xa/inl Blut bis zu 10 ug inaktivierter Faktor Xa/ml Blut.
- Die inaktivierte Faktor Xa-Zubereitung kann auch zur Verhinderung eines Wiederverschlusses nach einer Gefäßplastik, einer akuten Organabstoßung und einer tiefliegenden Venenthrombose nach Operationen eingesetzt werden. Darüber hinaus eignen sich die Antikoagulans-Zubereitungen zur Behandlung instabiler Angina, wandständiger Thrombose, eines Schlaganfalls, eines Herzinfarkts und von Lungenembolien.
- In einigen Fällen kann es zweckmäßig sein, den inaktivierten Faktor Xa mit anderen Verbindungen zu kombinieren, und zwar insbesondere bei der Behandlung von septischem Schock, bei dem die Verabreichung von inaktiviertem Faktor Xa alleine einen Tod auf Grund einer Permeabilitätsänderung bei Infusion gram-negativer Bakterien nicht zu verhindern vermag. Wie aus der mit "Treatment of Dysfunctional Vascular Endothelium Using Activated Protein C" betitelten US-Patentanmeldung mit der Serialnumber 139 922, Anmeldetag: 31. Dezember 1987, Anmelder Fletcher B. Taylor, Jr. und Charles T. Esmon (nunmehr US-A-50 09 889) kann aktiviertes Protein C (APC) in Kombination mit Antikörpern gegen TNF (erhältlich von Cetus Corporation) oder ATIII verabreicht werden.
- Sofern nicht anders angegeben, sind die verschiedenen Reagentien, Koagulationsfaktoren und Inhibitoren von Firmen, wie Calbiochem, Sigma Chemical Company, Cetus und Eli Lilly, erhältlich.
- Der Faktor X wurde wie folgt aus Rinderblut isoliert und gereinigt. Kurz gesagt, wurden Rinderblut in Oxalat als Antikoagulans gesammelt, die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und das Plasma auf BaSO&sub4; adsorbiert. Danach wurde der teilweise gereinigte Faktor X mit Citrat eluiert und auf QAE-Sephadex und blauer Sepharose chromatogrophiert, um das reine Protein zu gewinnen (vgl. im Detail bei E.R. Guinto in ihrer Ph.D. Dissertation, University of Oklahoma, Health Sciences Center, Oklahoma City, OK (1983)).
- Danach wurde der gereinigte Faktor X mit Faktor X aktivierendein Enzym, das aus gemäß Esmon CT, Ph.D.-Dissertation, Washington University, St. Louis, MO (1973) gewonnenem Rassell-Viperngift (Vipera russellii) gereinigt worden war, zur Herstellung des Faktors Xa aktiviert. Der Faktor Xa wurde dann durch Ionenaustauschchroinatographie auf QAE-Sephadex isoliert.
- 0,65 mg/ml Faktor Xa wurden anschließend mit 1,2 ml Dansyl-glu-gly-arg-chlormethylketon (Calbiochem) in einer Menge von 1 mg/ml 30 min lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, wobei inaktivierter Faktor Xa (DERG-Xa) erhalten wurde. Überschüssiger Inhibitor wurde durch erschöpfende Dialyse in 0,1 M NaCl, 0,001 M Tris-HCl, pH- Wert: 7,5 entfernt. Obwohl weniger als 0,1% der Aktivität erhalten blieb, wurde die Probe (9,2 ml, 0,65 mg/ml) zur Hemmung jeglicher Restfaktor Xa-Aktivität mit Antithrombin III (0,25 ml, 1,75 mg/ml) behandelt.
- Humanfaktor Xa, der durch Blockade der aktiven Stelle mit DEGR (Xa-i) inaktiviert worden war, wurde in 0,02 M Tris, 0,1 M NaCl, pH-Wert: 7,5 dialysiert. Dieses Human Xa-i wurde unter Verwendung von Enzymobeads (Biorad) nach den Anweisungen des Herstellers radiojodiert. Kurz gesagt, wurden in ein 5 ml fassendes Polystyrolröhrchen 0,8 ml Xa-i (0,79 mg, 14 uM), 10 ul 2,76 M Tris-HCl, pH-Wert: 7,2, 100 ul Enzymobeads, 2 ul Na¹²&sup5;I (0,2 mCi) und 100 ul β-Glucose eingetragen, wobei 14 uCi/MM Xa-i erhalten wurden. Der Röhrcheninhalt wurde vermischt und 18 min lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Umsetzung wurde durch Entsalzen der Lösung unter Verwendung einer PD-10 Säule (Pharmacia), die in 0,02 M Tris, 0,1 M NaCl ins Gleichgewicht gesetzt worden war, abgebrochen. Nach Aufgabe der Xa-i-Lösung auf die Säule wurde mit 0,02 M Tris, 0,1 M NaCl eluiert. 0,5 ml Fraktionen wurden aufgefangen. Aliquote Teile jeder Fraktion wurden in einem gamma-Zähler (Nulear Enterprises NE 1600) gezählt. Die 0,5 ml Fraktion mit der höchsten Konzentration an ¹²&sup5;I wurde bei den Pavian-Untersuchungen verwendet. Die Xa-i- Konzentration betrug 0,79 mg/ml, die ¹²&sup5;I-Konzentration betrug 230 CPM/ul (114,750 CPM insgesamt).
- Paviane erhielten eine Infusion letaler Dosen von E. coli (vgl. US-Serial No. 139 922 mit dem Titel "Treatment of Dysfunctional Vascular Endothelium Using Activated Protein C", angemeldet am 31. Dezember 1987 von Fletcher B. Taylor, Jr. und Charles T. Esmon). Radioaktiv markiertes DEGR-Xa wurde in einer Menge von 1 ml/kg Körpergewicht infundiert. Die Fibrinogen- und Tumornekrosefaktorgehalte wurden als Funktion der Zeit (h) aufgezeichnet. Ebenfalls gemessen wurde der Gehalt an radioaktivem DEGR- Xa.
- Die Ergebnisse sind in Figuren 2A und 2B dargestellt. Die Figuren enthalten eine graphische Aufzeichnung % radiaokativ markierter Faktor Xa, % Fibrinogen, ng TNF/ml Blut und die Überlebensrate über 10 h hinweg.
- Es wurde mit 8 Versuchstieren gearbeitet. Sämtliche acht erlagen dem E. coli. Bei den Versuchstieren, die eine Infusion mit inaktiviertem Faktor Xa (fXa-i) erhalten haben, blieben die Fibrinogenspiegel über eine Dauer von 10 h hinweg bei über 80% im Vergleich zu einer 50%igen Abnahme über 3 h und zu nahezu keinem nachweisbaren Fibrinogen nach 6 h bei den Kontrolltieren.
- Sehr oft verlieren modifizierte Proteine in vivo rasch ihre pharmakoligische Brauchbarkeit. Wie jedoch aus Figur 2A hervorgeht, verschwindet das DEGR-Xa aus dem Kreislauf mit einer Halbwertszeit über 10 h.
- Trotz der Wirksamkeit von inaktiviertein Faktor Xa als Antikoagulans - was durch die Aufrechterhaltung der Fibrinogenspiegel belegt wurde - war die Freigabe von TNF sowohl bei den Kontrolltieren als auch bei den behandelten Versuchstieren sehr ähnlich. Die Versuchstiere gingen ein, und zwar möglicherweise als Ergebnis von Permeabilitätsstörungen.
- Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse im Rahmen eines Pavianmodells eines gram-negativen septischen Schocks, daß inaktivierter Faktor Xa einen Fibrinogenverbrauch blockiert und ein wirksames Antikoagulans einer Halbwertszeit von mindestens 10 h darstellt. Weiterhin hat es sich auch gezeigt, daß inaktivierter Faktor Xa von einer anderen Spezies als derjenigen des (zu behandelnden) Subjekts als Antikoagulans wirksam ist.
Claims (13)
1. Zubereitung, umfassend
Faktor Xa oder ein Polypeptidfragment desselben, bei
welchem die aktive Serinstelle inaktiviert wird, mit der
Fähigkeit zur Bindung von endogenem Koagulationsfaktor Va
und
einen pharmazeutisch akzeptablen Träger,
wobei der inaktivierte Faktor Xa in einer Dosis
vorliegt, bei der in vivo über einen Zeitraum von mehr als 5
min hinweg wirksam eine Faktor Va-Bindung mit
proteolytisch aktivem Faktor Xa gehemmt wird, zur Verwendung als
ein Antikoagulationsmittel.
2. Antikoagulans-Zubereitung nach Anspruch 1, wobei der
Faktor Xa durch enzymatische Spaltung von isoliertem
Faktor X hergestellt wurde.
3. Antikoagulans-Zubereitung nach Anspruch 2, wobei der
Faktor X aus Plasma einer Tierspezies, ausgewählt aus
Pferden, Rindern, Schweinen, Menschen, Schafen, Ziegen
und nicht-menschlichen Primaten, isoliert wurde.
4. Antikoagulans-Zubereitung nach Anspruch 1, wobei der
Faktor Xa oder das Faktor Xa-Fragment durch rekombinante
Technologie hergestellt wurde.
5. Antikoagulans-zubereitung nach Anspruch 1, wobei der
Faktor Xa Phospholipid bindet.
6. Antikoagulans-Zubereitung nach Anspruch 1, wobei die
aktive Serinstelle mit einem Inhibitor, ausgewählt aus
Chlormethylketonen, Fluorphosphaten,
Sulfonylfluoridinhibitoren und Antikörpern oder Fragmenten derselben, die
mit der aktiven Stelle des Faktor Xa ohne Blockade der
Faktor Va-Bindeaktivität reagieren, inaktiviert wurde.
7. Antikoagulans-Zubereitung nach Anspruch 6, wobei der
Inhibitor aus Dansyl-glu-gly-arg-chlormethylketon, para-
Amidinophenylmethylsulfonylfluorid und
Diisopropylfluorphosphat ausgewählt ist.
8. Antikoagulans-Zubereitung nach Anspruch 1, wobei der
Träger aus Wasser, physiologischer Kochsalzlösung,
synthetischem Plasma und zur intravenösen Verabreichung
geeigneten physiologischen Puffern ausgewählt ist.
9. Antikoagulans-Zubereitung nach Anspruch 1, mit
zusätzlichen Verbindungen, ausgewählt aus Antithrombin III,
aktiviertem Protein C und Antikörpern zu
Tumornekrosefaktor in einer zur Aufrechterhaltung oder Wiederherstellung
einer Gefäßpermeabilität bei disseminierter
intravaskulärer Koagulation wirksamen Dosis.
10. Antikoagulans-Zubereitung nach einem der Ansprüche 1
bis 9 zur Verwendung als Arzneimittel.
11. Verwendung der Zubereitung nach einem der Ansprüche
1 bis 9 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur
Koagulationshemmung.
12. Verwendung der Zubereitung nach Anspruch 1 bei der
Herstellung eines Arzneimittels zur Koagulationshemmung,
wobei der Faktor Xa-Phospholipid-Bindungsbereich
nichtinaktiviert oder entfernt wurde.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 oder 12,
wobei die Menge der an einen Patienten zur
Koagulationshemmung zu verabreichenden Antikoagulans-Zubereitung von
etwa 1 ng inaktivierter Faktor Xa/ml Blut bis zu 10 ug
inaktivierter Faktor Xa/ml Blut reicht.
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