DE4237105A1 - Verfahren zur eindimensionalen Auftrennung und Identifizierung von Glycanen, sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Erstellung von Datenbanken und zur Strukturermittlung von Glycanen - Google Patents
Verfahren zur eindimensionalen Auftrennung und Identifizierung von Glycanen, sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Erstellung von Datenbanken und zur Strukturermittlung von GlycanenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur genauen und reprodu
zierbaren eindimensionalen Auftrennung von Glycanen mittels der
Kapillarelektrophorese, sowie die Verwendung dieses Verfahrens
zur Erstellung von Datenbanken und zur Strukturermittlung von
Glycanen.
Vor allem auch im Zusammenhang mit gentechnisch hergestellten
biologisch wirksamen Glycoproteinen wird die Strukturanalyse
der Zuckeranteile, die bekanntlich wesentlich variabler sind
als die Protein "backbones", immer bedeutungsvoller. Die
Nachfrage nach einfachen, schnellen und vor allem gut reprodu
zierbaren Verfahren nimmt daher ständig zu.
Bekannte aufwendige Verfahren, die zudem ein hohes Maß an
Expertise und instrumenteller Infrastruktur verlangen, sind z. B.
die Methylierungsanalyse/GC-MS, FAB-MS und hochauflösende
1H-NMR-Spektroskopie.
In jüngerer Zeit wurde auch die Verwendung von chromatographi
schen Verfahren bekannt. Chromatographische Verfahren können
allerdings nur dann zur Strukturaufklärung eingesetzt werden,
wenn entweder bei jedem Lauf alle bekannten (z. B. N-) Glycane
als Standards mitlaufen gelassen werden, oder wenn für die
bekannten Verbindungen Datenbanken erstellt werden können.
Unerläßliche Voraussetzung für solche Datenbanken ist aller
dings die hochpräzise und vor allem sehr gut reproduzierbare
Messung der Retentions- bzw. Migrationszeiten. In Hermentin et
al. (Anal. Biochem. (1992) 203, 281-289) wurde gezeigt, daß die
Reproduzierbarkeit der Retentionszeit in der "high-pH anion
exchange chromatography with pulsed amperometric detection"
(HPAE-PAD) für die Verwendung im Zusammenhang mit einer ent
sprechenden HPAE-PAD-Datenbank bei besser als 0.5% liegen muß.
Die Trefferquote bei der Vermessung der nativen N-Glycane von
rekombinantem Erythropoetin aus BHK-Zellen mittels HPAE-PAD lag
beim Abgleich der gemessenen und korrigierten Retentionszeiten
der einzelnen N-Glycane mit den Retentionszeiten der N-Glycane
bekannter Struktur einer HPAE-PAD-Mapping-Datenbank bei kleiner
als 0.7%.
Es hat sich jedoch gezeigt, daß sich die Reproduzierbarkeit
beim Vermessen von N-Glycanen mittels HPAE-PAD als relativ
schwierig erweist, da hierbei nicht nur apparativ bedingte
Faktoren, sondern auch die Qualität der verwendeten Eluenten,
die Wechselwirkung der zu trennenden Zucker mit den Anionen
austauscher-Gruppen, der zugrundeliegenden Polystyrol-Divinyl
benzol-Matrix und den membranartig aufgezogenen Latex-Partikeln
von erheblicher Bedeutung sind. Demgemäß spielen der jeweilige
Zustand der Austauscher-Matrix, Regenerations- und Elutions
bedingungen, sowie Alterungs- oder Vergiftungsphänomene der
Trennsäule für die zu erzielende Trennleistung eine wichtige
Rolle.
Neuerdings findet die Kapillarelektrophorese (CE) zunehmend
Anwendung zur Auftrennung und Charakterisierung von Mono-, Di-
und Oligosacchariden und Glycanen.
Hierzu wird das Mono-, Di- oder Oligosaccharid oder Glycan am
reduzierenden Ende mit einer Aminogruppen-haltigen UV- bzw.
Fluoreszenz-aktiven Verbindung wie z. B. 2-Aminopyridin (Hase
et al., J. Biochem. (1984) 95, 197-203) derivatisiert und
fluorometrisch detektiert. Die erforderliche Reduktaminierung
der Zucker, insbesondere der komplexen N-Glycane, gestaltet
sich relativ aufwendig, erfordert zusätzliche Reinigungs
schritte und führt in der Regel zu Ausbeuten von lediglich ca.
70% (Hase et al., J. Biochem. (1984) 95, 197-203. Die Redukt
aminierung Neuraminsäure-haltiger Glycane führt darüber hinaus
zum partiellen Verlust terminal gebundener Neuraminsäure (Hase
et al., J. Biochem. (1984) 95, 197-203), so daß diese Art der
Derivatisierung für die Bestimmung nativer oder rekombinanter
sialylierter Glycane nicht geeignet ist. Zudem führt selbst
eine vorgeblich verbesserte Derivatisierungsmethode (Kondo et
al., Agric. Biol. Chem. (1990) 54, 2169-2170) nicht zu quan
titativen Ausbeuten.
Die Reduktaminierung mit z. B. 2-Aminopyridin beschränkt sich
daher bislang auf die Derivatisierung neutraler Zucker und
Glycane (siehe z. B. Honda et al.), oder die Aminopyridin-
Derivate werden vor der Vermessung in der CE desialyliert
(Suzuki et al., Anal. Biochem. (1992) 205, 227-236). In dem
Falle, daß die Aminopyridin-Derivate sialylierter N-Glycane in
der CE vermessen werden (Nashabeh und El Rassi, J. Chromato
graphy (1991) 536, 31-43), wird der potentielle Verlust termi
naler Neuraminsäure ignoriert.
Taverna et al. (Electrophoresis (1992) 13, 359-366) haben
kürzlich gezeigt, daß sich N-Glycane aus Glycoproteinen in der
CE in 50 mM Tricin/2.5 mM Putrescin, pH 8.2 (bei 20°C) oder
200 mM Borat/1.25 mM Putrescin, pH 8.2 (bei 30°C) gut auf
trennen und bei 200 Nanometer detektieren lassen. Somit war ein
Verfahren gefunden, welches die Vermessung sialylierter N-
Glycane in der CE ohne Derivatisierung erlaubt. Allerdings
mußte die Kapillare zur Erzielung der Trennungen mit 3-
Mercaptopropyl-trimethoxysilan chemisch verändert worden.
Von Taverna et al. (ibid.) wurden keine Angaben zur relativen
Standardabweichung der Migrationszeiten der vermessenen N-
Glycane in der CE gemacht. Jedoch finden sich Angaben zur
Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten der detektierten Peaks
(Glycoformen) des Glycopeptids "GP2" aus rekombinantem Gewebs
plasminogen-Aktivator. Die elektrophoretische Mobilität wurde
über Benzylalkohol als Marker für den elektroosmotischen Fluß
kalkuliert. Die Standardabweichung der Retentionszeiten der
Hauptpeaks in 6 aufeinanderfolgenden Läufen betrug bei Verwen
dung eines 150 mM Borat-Puffers, pH 9.0 - 9.2 weniger als 1.4%
und bei Verwendung eines 100 mM Phosphat-Puffers, pH 6.6
zwischen 1.7-2.0%. In Gegenwart von 2.5 mM Putrescin betrug
die relative Standardabweichung der Retentionszeiten der
Hauptpeaks weniger als 2.3%, war also im Vergleich zu den
Messungen ohne Putrescin leicht erhöht.
Suzuki et al. (Anal. Biochem. (1992) 205, 227-236) erzielten
bei ihrer Vermessung von 2-Aminopyridin-Derivaten von asialo-
N-Glycanen eine relative Standardabweichung der Migrationszeit
von 0.86% in Phosphat-Puffer (100 mM Phosphat-Puffer pH 2.5,
Gegenwart von 0.1% w/w Hydroxpropylcellulose) und von 1.03% in
Borat-Puffer (200 mM Borat-Puffer pH 10.5). Die relative Stan
dardabweichung der RT der N-Glycane konnte durch Korrektur über
die Migrationszeit von Pyridyl-aminierter Glucose als interna
lem Standard auf 0.80% im Phosphat-Puffer und 0.50% im Borat-
Puffer verbessert werden. Jeder Peak wurde durch Co-Elektro
phorese mit der jeweils authentischen Probe bekannter Struktur
identifiziert.
Es bestand daher die Aufgabe, die Kapillarelektophorese für
N-Glycane so zu verbessern, daß auf die von Suzuki et al. ver
wendete Derivatisierung der N-Glycane verzichtet werden konnte
(analog Taverna et al., ibid.), jedoch die relativ hohe Stan
dardabweichung der Migrationszeit von Taverna et al. auf die
von Suzuki et al. angegebene geringe Standardabweichung von 0.5-
0.8% verbessert werden konnte.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich sialylierte
N-Glycane (ohne Derivatisierung) in einem Puffer, bestehend aus
80 mM Ammoniumsulfat, 20 mM Natriumphosphat und 2 mM 1,5-
Diaminopentan oder 1,4-Diaminobutan, welcher mit Schwefelsäure
oder Phosphorsäure auf pH 7.0 eingestellt wird, vorteilhaft bei
einer konstanten Temperatur zwischen 25 und 35°C, in der CE
vermessen lassen, wobei sich eine Temperatur von 30°C als
optimal erwies.
Ferner wurde gefunden, daß sich sialylierte N-Glycane - unter
Verzicht auf jegliche Derivatisierung - bei 190 nm bis hinab zu
Konzentrationen im Femtomol-Bereich in der CE vermessen und
detektieren lassen.
Weiter wurde gefunden, daß sich die Standardabweichung der
Migrationszeiten (Retentionszeiten) in der CE auf unter 0.20%
reduzieren läßt, wenn man die N-Glycane in Gegenwart zweier
internaler Standards vermißt, die man so zu wählen hat, daß das
zu vermessende N-Glycan zwischen den beiden internalen Stan
dards liegt, und wenn man die RT des N-Glycans sowohl gegen den
ersten als auch gegen den zweiten Standard korrigiert, mit der
zuvor definierten Standard-Retentionszeit abgleicht, und aus
den beiden korrigierten Werten den Mittelwert nimmt.
Tabelle 1 zeigt 58 aufeinanderfolgende Trennungen in der CE des
über Hydrazinolyse gewonnenen N-Glycan-Pools von humanem
-1-saurem Glycoprotein (AGP). Die Mittelwerte der Retentions
zeiten von 17 verschiedenen Peaks sind im Vergleich zu den
jeweils korrigierten Werten und den jeweiligen Standardabwei
chungen und Variationskoeffizienten aufgeführt.
Man sieht, daß sich die Standardabweichung der unkorrigierten
Peaks in den aufeinanderfolgenden Läufen zwischen 0.67% und
0.95% bewegt und somit vergleichbar zu den von Suzuki et al.
(ibid.) für derivatisierte N-Glycane angegebenen Werten liegen,
jedoch deutlich genauer sind als die von Taverna et al. (ibid.)
für nicht derivatisierte N-Glycane angegeben Werte.
Die in Frage kommende internalen Standards sind dadurch cha
rakterisiert, daß sie einmal vor und einmal nach der zu ver
messenen Probe in der CE erscheinen und unter den verwendeten
Detektionsbedingungen detektiert werden.
Bei nicht derivatisierten Glycanen sind die zu verwendenden
Standards dadurch charakterisiert, daß sie im Wellenlängenbe
reich zwischen 180 und 210 nm detektiert werden können, wobei
eine Detektion im Bereich von etwa 190 nm bevorzugt ist.
Für die CE nicht derivatisierter sialylierter N-Glycane eignet
sich als bevorzugter Standard mit früher Retentionszeit bei
spielsweise Mesityloxid. Jedoch können als Standards mit früher
RT auch andere unpolare aromatische Verbindungen, die sich
unter den CE-Bedingungen mit dem verwendeten Elektrophore
se-Puffer vermischen, wie etwa Benzylalkohol, verwendet werden.
Des weiteren kann selbst der sogenannte Puffer-Peak, welcher in
der CE die Lauffront markiert bzw. ein Maß für den
elektroosmotischen Fluß ist, als internaler Standard verwendet
werden.
Als bevorzugter Standard mit später Retentionszeit eignet sich
in der CE nicht derivatisierter sialylierter N-Glycane bevor
zugterweise N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac). Jedoch können als
Standards mit später RT auch andere zwischen 180 und 210 nm
absorbierende und unter den Pufferbedingungen negativ geladen
Verbindungen, wie beispielsweise N-Glycolylneuraminsäure oder
Neuraminyl-Lactose oder im Puffer lösliche kurzkettige Carbon
säuren verwendet werden.
Weiter wurde gefunden, daß sich die Meßgenauigkeit in der CE
entscheidend erhöhen läßt, wenn man die Korrektur der Meßwerte
über die beiden internalen Standards auf möglichst genau defi
nierte Standardwerte bezieht, die über Mittelwertbildung
repetitiver Standardläufe ermittelt wurden, und das arithme
tische Mittel der jeweils über die beiden internalen Standards
korrigierten Meßwerte bildet. Tabelle 1 belegt, daß die sol
cherart errechneten Mittelwerte der Retentionszeiten der 17
aufgelisteten Peaks der N-Glycane von AGP auf Variationskoef
fizienten kleiner als 0.20% vermindert sind, während sich die
Standardabweichung der unkorrigierten Peaks in den aufeinan
derfolgenden Läufen zwischen 0.67% und 0.95% bewegt.
Weiter wurde gefunden, daß die über die beiden definierten
Standards korrigierten und gemittelten Retentionszeiten so
genau sind, daß sie den Aufbau einer validierten CE-Mapping-
Datenbank sialylierter N-Glycane bekannter Struktur ermögli
chen.
Ferner wurde gefunden, daß die auf diese Weise erstellte CE-
Mapping-Datenbank so genau ist, daß sie die strukturelle
Zuordnung der Peaks selbst bei Vermessung an verschiedenen,
selbst Monate auseinanderliegenden Tagen und in verschieden
langen Kapillaren erlaubt.
Tabelle 2 belegt, daß die Wiederfindung der beispielhaft
aufgelisteten N-Glycane der CE-Mapping-Datenbank nach Korrektur
der Retentionszeiten in jedem Falle mit einem Variationskoef
fizient kleiner als 0.20% erfolgt, während sich die
unkorrigierten Retentionszeiten - trotz Vermessung in derselben
Kapillare - im Mittel bisweilen um ca. 5% unterscheiden.
Tabelle 3 zeigt, daß die Wiederfindung der beispielhaft aufge
listeten N-Glycane der CE-Mapping-Datenbank nach Korrektur der
Retentionszeiten selbst dann mit einer mittleren Abweichung von
kleiner als 0.20% exakt ist, wenn zwei Kapillaren verschiedener
Länge, im gezeigten Beispiel etwa der halben bzw. doppelten
Länge, verwendet werden.
Ferner wurde gefunden, daß die auf diese Weise erstellte CE-
Mapping-Datenbank so genau ist, daß sie die strukturelle
Zuordnung der N-Glycane natürlicher oder rekombinanter
Glycoproteine ermöglicht, wobei die N-Glycane vom Glycoprotein
auf enzymatischem Wege oder mittels Hydrazinolyse gewonnen sein
können.
In diesem Zusammenhang wurde überraschenderweise gefunden, daß
die über die beiden definierten Standards korrigierten und
gemittelten Retentionszeiten der N-Glycane natürlicher oder
rekombinanter Glycoproteine in der CE so genau sind, daß sie
sich von den über die beiden definierten Standards korrigierten
und gemittelten Retentionszeiten der N-Glycane der CE-Mapping-
Datenbank stets weniger, als 0.20%, meist weniger als 0,15% und
oft selbst weniger all 0.10% unterscheiden.
Tabelle 4 zeigt das Ergebnis der Strukturermittlung der auf
enzymatischem Wege (mittels Glycopeptidase F bzw. PNGase F,
Boehringer Mannheim, Tutzing, Deutschland) gewonnenen N-Glycane
von rekombinantem Erythropoietein aus BHK-Zellen (Merckle GmbH,
Ulm, Deutschland). Wie Tabelle 4 zu entnehmen ist, konnten
durch Abgleich mit der CE-Mapping-Datenbank 6 der insgesamt 7
in der CE detektierten Peaks strukturell zugeordnet werden -
und zwar in 5 Fällen jeweils mit weniger als 0.25% Abweichung
von den jeweiligen Werten in der Datenbank. Nur in einem Falle
betrug die Abweichung wegen der Überlagerung zweier Peaks zwi
schen 0.25 und 0.5%. Die Zuordnung der Peaks mittels CE war
somit genauer und eindeutiger als die in der Literatur be
schriebene Zuordnung der Peaks mit Hilfe einer HPAE-PAD-
Mapping-Datenbank (Hermentin et al., Anal. Biochem. (1992) 203,
281-289).
Tabelle 5 zeigt das Ergebnis der Strukturermittlung der über
Hydrazinolyse mit dem GlycoPrep 1000TM(Oxford GlycoSystems,
Abingdon, England) gewonnenen und über Sephadex G-25TM
(Pharmacia, Uppsala, Schweden) entsalzten Glycane von Fetuin
aus Rinderserum (Sigma, München, Deutschland). Wie Tabelle 5 zu
entnehmen ist, konnten durch Abgleich mit der CE-Mapping-
Datenbank 6 der 9 in der CE detektierten Hauptpeaks strukturell
zugeordnet werden - und zwar jeweils mit weniger als 0.25%
Abweichung von den jeweiligen Werten in der Datenbank. Dabei
konnten 3 dieser 6 Hauptpeaks sogar jeweils mit weniger als
0.10% Abweichung von den jeweiligen Werten in der Datenbank
zugeordnet werden.
Somit wurde gefunden, daß sich die CE in hervorragender Weise
zur Struktur-Zuordnung von N-Glycanen eignet und der Struk
tur-Zuordnung von N-Glycanen mittels HPAE-PAD sowohl bezüglich
der Meßgenauigkeit und Reproduzierbarkeit als auch bezüglich
der erforderlichen Menge an N-Glycan eindeutig überlegen ist.
Es wurde nämlich weiterhin gefunden, daß zur Vermessung mittels
CE etwa 4000mal weniger N-Glycan-Material benötigt wird als
zur Vermessung mittels HPAE-PAD unter den von Hermentin et al.
(ibid.) beschriebenen Bedingungen.
Es liegt auf der Hand, daß sich die hier beschriebene hohe
Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der CE - bei der Verwendung
zweier internaler Standards und der beschriebenen Korrektur -
nicht nur auf die Vermessung von Glycanen beschränkt. Vielmehr
läßt sich durch das hier beschriebene Verfahren die CE ganz
allgemein, insbesondere jedoch bei der Vermessung von Peptiden
und Glycopeptiden äußerst vorteilhaft anwenden und trägt somit
erheblich zur vorteilhaften Anwendung der CE im Zusammenhang
mit biochemischen und pharmakologischen Fragestellungen bei.
Aufgrund der ausgezeichneten Reproduzierbarkeit und der damit
verbundenen hohen Auflösung des erfindungsgemäßen Verfahrens
konnte eine Methode zur Strukturermittlung auch unbekannter
bzw. nicht in einer Datenbank enthaltenen Glycane ausgearbeitet
werden.
Dabei kann die Strukturermittlung unbekannter bzw. nicht in
einer Datenbank enthaltenen Glycane durch Exoglycosidase-Abbau
und Vermessung der dabei erhaltenen, in spezifischer Weise
veränderten Glycane und den Abgleich der neu erhaltenen
Retentionszeiten mit den Retentionszeiten einer Datenbank
unterstützt werden.
Überraschenderweise zeigte sich dabei, daß die Migrationszeiten
der Glycane bei gegebener Ladung mit zunehmendem Stokes′schen
Radius kürzer wird.
Einige Regeln, die mit Hilfe der CE-Mapping-Datenbank gefunden
wurden, sind nachfolgend aufgeführt und in Tabelle 6 schema
tisch zusammengefaßt, erheben jedoch keinen Anspruch auf
Vollständigkeit:
Die Entfernung eines N-Acetylneuraminsäure-Restes vermindert
die Retentionszeit (RT) eines N-Glycans um ∼3 min für tetraantennäre
(C4-4*) bzw. ∼4 min für triantennäre (C3-3*) bzw.
∼5 min für biantennäre (C2-2*) Strukturen.
Die Einführung eines oder zweier N-Acetyllactosamin-Repeats in
C4-4*-Strukturen vermindert die RT um ca. 1.2 bzw. 2.2 min. Die
Einführung eines N-Acetyllactosamin-Repeats in ein C4-3*-Isomer
verkürzt die RT um ca. 0.9 min.
Analog verkürzt die Anknüpfung eines Galα1,3-Restes an OH-3 des
β-glycosidisch verknüpften Galctose-Restes eines C4-3*-Isomers
die RT um ca. 0.5 min. Und die Einführung zweier Galα1,3-Reste
in ein C4-2*-Isomer verkürzt die RT um ca. 0.8 min.
In umgekehrter Weise führt die Entfernung eines β-Galactose-
Restes zu einer Erhöhung der RT um ca. 0.5 min.
Die Abspaltung der proximal verknüpften Fucose vermindert die RT
um ca. 0.5 min.
Der Ersatz eines N-Acetylneuraminsäure-Restes durch eignen N-
Glycolylneuraminsäre-Rest führt zu keiner Änderung der RT.
Die Einführung einer Sulfatgruppe erhöht die RT um ca. 6-7 min.
Strukturelle Sialylisomere, welche Neu5Ac in α2,3- statt
α2,6-Verknüpfung zu β-Galactose enthalten, wandern pro Verknüp
fungswechsel um ca. 0.3 min früher als die korrespondierenden
α2,6-Isomere. Interessanterweise ist dieses Verhalten umge
kehrt wie bei der Vermessung mittels HPAE-PAD.
Die Neu5Acα2,3-verknüpften trisialo-triantennären fucosylierten
Isomere (C3-335301.30.A4M3 und C3-335300.30.A6M6) sind in der
CE um ca. 0.3 min getrennt ( . . . A4M3 < . . . A6M6), während sich
bei der Vermessung mittels HPAE-PAD keine Auftrennung der
beiden Isomere erzielen läßt. Wiederum erweist sich somit die
Vermessung in der CE der Vermessung mittels HPAE-PAD als
überlegen.
Somit wurde für die Vermessung nicht derivatisierter
sialylierter N-Glycane unter den bevorzugten und beispielhaft
genannten Bedingungen folgende allgemeine Regeln erkannt:
Bei gegebener Ladung korrespondiert die Einführung eines Mono
saccharid-Bausteins jeweils mit einer Verkürzung der Retenti
onszeit des betrachteten Glycans um ca. 0.5-0.6 min pro
Monosaccharid-Baustein bzw. um ca. 1.0-1.2 min pro Disaccha
rid-Baustein.
So erlaubt beispielsweise die Beobachtung, daß der Wechsel von
einer Neu5Acα2,3- zu einer Neu5Acα2,6-Verknüpfung bei einem
N-Glycan zu einer Vergrößerung der Migrationszeit führt, die
Schlußfolgerung, daß der Stokes′sche Radius bei einem N-Glycan
mit α2,3-verknüpfter Neu5Ac größer ist als bei dem korrespon
dierenden N-Glycan mit α2,6-verknüpfter Neu5Ac.
Analog läßt sich überraschenderweise auch ableiten, daß der
Stokes′sche Radius des triantennären Trisialo-Isomers
C3-335301.30.A4M3 größer ist als der des korrespondierenden
C3-335301.A6M6-Isomers, weil die Migrationszeit des
. . . A4M3-Isomers ca. 0.3 min kürzer ist als die des korrespon
dierenden . . . A6M6-Isomers.
Hierdurch eröffnen sich für die Kapillarelektrophores im Verein
mit einer validierten CE-Mapping-Datenbank völlig neue und
überraschende forschungsmäßige Anwendungsmöglichkeiten, was den
Wert der vorliegenden Erfindung in besonderer Weise belegt.
Darüber hinaus wurde die CE durch das beschriebene erfindungs
gemäße Verfahren in Verbindung mit einer erfindungsgemäßen
CE-Mapping-Datenbank als die schnellste, billigste, genaueste,
verläßlichste, mit geringsten Mengen arbeitende und bis dato
interessanteste und vielleicht zukunftsträchtigste Methode zur
strukturellen Zuordnung sialylierter N-Glycane erkannt.
Das neue Verfahren zur Strukturermittlung von N-Glycanen
mittels der CE unter Verwendung einer validierten CE-Mapping-
Datenbank wird nachfolgend durch verschiedene Beispiele erläu
tert. Diese Beispiele schränken die Erfindung jedoch nicht ein.
Validierung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit CE-Läufe
unter den in Beispiel 1 beschriebenen Pufferbedingungen durch
58fache repetitive Injektion des mittels Hydrazinolyse aus
alpha1-saurem Glycoprotein gewonnenen N-Glycan-Pools.
Die Mittelwerte der Retentionszeiten der 17 numerierten Peaks
sind im Vergleich zu den jeweils korrigierten Werten und den
jeweiligen Standardabweichungen und Variationskoeffizienten
aufgeführt.
Standard 1: Puffer-Peak
Standard 2: N-Acetylneuraminsäure
RT, Retentionszeit; Stdabw, Standardabweichung; VK, Variati onskoeffizient; Korr, nach Korrektur; Std, Standard.
Standard 1: Puffer-Peak
Standard 2: N-Acetylneuraminsäure
RT, Retentionszeit; Stdabw, Standardabweichung; VK, Variati onskoeffizient; Korr, nach Korrektur; Std, Standard.
Wiederfindung der beispielhaft aufgelisteten N-Glycane der
CE-Mapping-Datenbank nach Korrektur der Retentionszeiten -
bei Vermessung an verschiedenen Tagen in derselben Kapillare.
Wiederfindung der beispielhaft aufgelisteten N-Glycane der
CE-Mapping-Datenbank nach Korrektur der Retentionszeiten -
unter Verwendung zweier Kapillaren verschiedener Länge (im
gezeigten Beispiel etwa der halben bzw. doppelten Länge).
Strukturermittlung der auf enzymatischem Wege gewonnenen N-
Glycane von rekombinantem Erythropoietein aus BHK-Zellen
(CE-Lauf siehe Abb. 2).
Strukturermittlung der mittels Hydrazinolse gewonnenen Glycane
von bovinem Fetuin (CE-Lauf siehe Abb. 3).
Mit Hilfe der CE-Mapping-Datenbank gefundene Regeln für die
strukturelle Zuordnung von N-Glycanen unter Verwendung des in
Beispiel 1 beschriebenen Puffers.
Beispielhafter CE-Läufe des mittels Hydrazinolyse aus -1-saurem
Glycoprotein gewonnenen N-Glycan-Pools unter den in Beispiel 1
beschriebenen Pufferbedingungen.
Standard 1: Puffer-Peak
Standard 2: N-Acetylneuraminsäure.
Standard 1: Puffer-Peak
Standard 2: N-Acetylneuraminsäure.
Die Ergebnisse der insgesamt 58 repetitiven Läufe sind in
Tabelle 1 zusammengefaßt.
CE-Lauf zur Strukturermittlung der auf enzymatischem Wege
gewonnenen N-Glycane von rekombinantem Erythropoietein aus
BHK-Zellen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen
Puffers (Auswertung siehe Tabelle 4).
Standard 1: Mesityloxid
Standard 2: N-Acetylneuraminsäure.
Standard 1: Mesityloxid
Standard 2: N-Acetylneuraminsäure.
CE-Lauf zur Strukturermittlung der mittels Hydrazinolyse
gewonnenen Glycane von bovinem Fetuin unter Verwendung des in
Beispiel 1 beschriebenen Puffers (Auswertung siehe Tabelle 5).
Standard 1: Mesityloxid
Standard 2: N-Acetylneuraminsäure.
Standard 1: Mesityloxid
Standard 2: N-Acetylneuraminsäure.
Die Isolierung des N-Glycan-Pools mittels Hydrazinolyse er
folgte in Auftragsarbeit durch die Firma Oxford GlycoSystems,
Abingdon, England, in an sich bekannter Weise aus 50 mg α1-
saurem Glycoprotein (Charge 281184, Behringwerke AG).
Die Vermessung des N-Glycan-Pools erfolgte mit einer Kapillar
elektrophorese-Apparatur 270A von Applied Biosystems unter
Verwendung einer "fused-silica" Kapillare mit Innendurchmesser
50 µm, Außendurchmesser 365 µm und Länge 100 cm) der Fa.
Sulpeco, Bellefonte, PA, USA, im einem Puffer, bestehend aus 80
mM Ammoniumsulfat, 20 mM Natriumphosphat, 2.0 mM 1,5-Diamino
pentan, eingestellt mit Schwefelsäure auf pH 7,0. Die Läufe
erfolgten bei einer Temperatur von 30°C und einer Spannung von
20 kV bzw. einem resultierenden Stromfluß von 68 µA.
Die Läufe wurden bei 190 nm detektiert und mittels eines Perkin
Elmer Interphases der Serie 900 unter Verwendung der Software-
Version 5.1 aufgezeichnet.
Die neue Kapillare wurde vor den Läufen für 2 Stunden mit 1 M
Natronlauge equilibriert und danach 15 min mit Wasser und dann
30 min mit Elektrophorese-Puffer equilibriert. Zwischen den
einzelnen Läufen wurde die Kapillare jeweils für 5 min unter
Verwendung eines 5-inch-Vakuums am kathodischen Kapillarenende
mit dem Elektrophorese-Puffer gespült. Der Probenauftrag am
anodischen Kapillarenende (jeweils 5 nl) erfolgte durch Vaku
uminjektion.
Ca. 60 N-Glycane wurden, wie in Hermentin et al. (Anal. Bio
chem. (1992), 203, 281-289) beschrieben, aus gereinigten
Glycoproteinen isoliert und über Methylierungsanalyse, FAB-MS
und 1H-NMR-Spektroskopie strukturell analysiert.
Weitere N-Glycane wurden, soweit erhältlich, von Oxford Glyco-
Systems, Abingdon, England, und von Dionex, Sunnyvale, USA,
käuflich erworben.
Die Vermessung der Glycane erfolgte analog Beispiel 1, wobei
jedoch anstelle einer Kapillare der Länge 100 cm bisweilen auch
eine Kapillare der circa halben Länge verwendet wurde.
Der Aufbau der Datenbank erfolgte mittels des Kalkulationspro
gramms Lotus 1-2-3.
Die verwendete Nomenklatur für N-Glycane ist wie in Hermentin
et al. (Anal. Biochem. (1992), 203, 281-289) beschrieben.
Die Isolierung der N-Glycane erfolgte auf enzymatischem Wege
unter Verwendung von Glycopeptidase F (PNGase F, Boehringer
Mannheim, Tutzing, Deutschland) und Entsalzung mittels Sephadex
G-25 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), wie an anderer Stelle
beschrieben (Hermentin et al., Anal. Biochem. (1992), 203,
281-289).
Die Vermessung in der CE erfolgte analog Beispiel 1.
Die Isolierung des Glycan-Pools mittels Hydrazinolyse erfolgte
unter Verwendung des automatischen Hydrazinolyse- und Glycan-
Isolierungsgeräts GlycoPrep1000 (TM) der Firma Oxford Glyco-
Systems, Abingdon, England, mit ca. 2 mg bovinem Fetuin (Sigma,
München, Deutschland) unter Verwendung der Originalchemikalien
und Utensilien der Firma Oxford GlycoSystems und des apparati
ven Routineprogramms.
Die Vermessung in der CE erfolgte analog Beispiel 1.
Claims (15)
1. Verfahren zur genauen und reproduzierbaren eindimensionalen
Auftrennung und Identifizierung von Glycanen, das die folgenden
Schritte einschließt:
- a) die Auftrennung erfolgt mit Hilfe der Kapillarelektropho rese,
- b) die Migration erfolgt dabei in einem Puffer ausgewählt aus
der folgenden Gruppe von Puffern:
- i) Phosphatpuffer, 10-130 mMol/l, pH 2-8
- ii) Phosphat/Sulfatpuffer, 50-150 mMol/l, pH 4-10
- iii) Tricinpuffer, 20-100 mM/l, pH 6-10
- iv) Boratpuffer, 50-250 mM/l, pH 7-12;
- der Puffer enthält bevorzugt 0.5-2.5 mM/l eines oder mehrerer Diaminoalkane mit 2-6 Kohlenstoffatomen, bevorzugterweise 1,4- Diaminobutan und/oder 1,5-Diaminopentan,
- c) mit jeder Probe werden mindestens 2 Standardproben (in terne Standards) chromatographiert,
- d) die Detektion erfolgt bei derivatisierten Glycanen in den bekannten Wellenlängenbereichen, bei underivatisierten Glycanen in einem Wellenlängenbereich zwischen 180 und 210 nm, bevorzugt bei etwa 190 nm,
- e) die Auswertung der Retentionszeiten erfolgt nach Korrektur
mit Hilfe der internen Standards (korrigierte Retentions
zeiten),
wobei die Standardabweichung der korrigierten Retentionszeiten (inter-assay-Variation in identischer Laufserie) besser als 0.25% ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Standardabweichung der
korrigierten Retentionszeiten besser als 0.20%, bevorzugt
besser als 0.15%, besonders bevorzugt besser als 0.10% ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Glycane N-
Glycane, bevorzugterweise sialylierte N-Glycane sind.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
2 interne Standards verwendet werden, von denen einer vor und
einer nach der Probe in der Elektrophorese erscheint.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei
die Korrektur der gemessenen Retentionszeit(en) der Probe(n)
über das arithmetische Mittel der über die beiden internen
Standards korrigierten Retentionszeit(en) erfolgt.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei
für die beiden internen Standards definierte Standardretenti
onszeiten dadurch festgelegt werden, daß die Retentionszeiten
für die beiden Standards mehrfach ermittelt und dann jeweils
das arithmrtische Mittel daraus gebildet wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei
die beiden Standards so gewählt sind, daß ein Standard zu
Beginn und ein Standard am Ende der Elektrophorese erscheint.
8. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprü
che 1 bis 7 zur Erstellung einer Datenbank, die die Retenti
onszeiten bekannter Glycane enthält.
9. Datenbank, welche die mit einem Verfahren nach mindestens
einem der Ansprüche 1 bis 7 ermittelten Retentionszeiten be
kannter Glycane enthält.
10. Verwendung des Verfahrens nach mindestens einem der An
sprüche 1 bis 7 zur Identifizierung von Glycanen in einer zu
untersuchenden Probe unter Verwendung einer nach Anspruch 8
erstellten Datenbank.
11. Verfahren zur Strukturermittlung von Glycanen, wobei die
nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 bestimmten Reten
tionszeiten mit den Retentionszeiten bekannter Glycane in einer
nach den Ansprüchen 8 oder 9 definierten Datenbank verglichen
werden und daraus die Struktur des jeweils zu bestimmenden
Glycans ermittelt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Glycane N-Glycane
sind, bevorzugterweise sialylierte N-Glycane.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Glycane N-Glycane vom
komplexen Typ sind.
14. Verfahren zur relativen Ermittlung der Stokes′schen Radien
von Glycanen, wobei die nach mindestens einem der Verfahren
nach Anspruch 1 bis 7 ermittelte Retentionszeit mit einer aus
der Retentionszeit mindestens eines bekannten Glycans gewonne
nen Bezugswert verglichen und daraus der Stokes′sche Radius der
untersuchten Glycane ermittelt wird.
15. Verfahren zur relativen Ermittlung der Stokes′schen Radien
von Glycanen, wobei die nach mindestens einem der Verfahren
nach Anspruch 1 bis 7 ermittelte Retentionszeit mit einer aus
den Retentionszeiten bekannter Glycane gewonnenen Standardkurve
verglichen und daraus der Stokes′sche Radius der untersuchten
Glycane ermittelt wird.
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EP93116944A EP0596321A3 (de) | 1992-11-03 | 1993-10-20 | Verfahren zur eindimensionalen Auftrennung und Identifizierung von Glycanen, sowie die Verwendung dieses Verfahrens zur Erstellung von Datenbanken und zur Strukturermittlung von Glycanen sowie zur relativen Ermittlung der Stokes'schen Radien von Glycanen |
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