DE3586778T2

DE3586778T2 - Lipolytisches enzym abgeleitet von einem aspergillus-mikroorganismus, mit einem beschleunigungseffekt auf die kaesearomaentwicklung.

Info

Publication number: DE3586778T2
Application number: DE8585304126T
Authority: DE
Inventors: Michael Vincent Arbige; Clifford E Neubeck
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: DSM Delft BV
Priority date: 1984-06-25
Filing date: 1985-06-11
Publication date: 1993-03-18
Anticipated expiration: 2005-06-12
Also published as: EP0167309A2; US4726954A; CA1237687A; US4636468A; DK284985A; NZ212522A; DK284985D0; AU595481B2; JPS6115683A; AU4383585A; JPH0634703B2; DE3586778D1; ATE81868T1; EP0167309B1; EP0167309A3; GR851481B

Description

Fachgebiet

Die Erfindung betrifft einen neuen Aspergillus Mikroorganismus und ein neues, sich davon ableitendes, lipolytisches Enzym. Käse, der in Gegenwart einer niedrigen Konzentration dieses lipolytischen Enzyms altert, reift schneller als mit herkömmlichen lipolytischen Enzymen und ohne jegliche, mit einem lipolytischen Enzym verbundene, Ranzigkeit.

Technischer Hintergrund

Die Beschleunigung der Käsealterung zur Verbesserung der Kosteneffektivität durch eine Verringerung von Lagerraum wird für die Käseindustrie wichtiger. Zur Zeit werden Lipasen aus zwei verschiedenen Quellen, pregastrischen Drüsen von Tieren und tierischen Bauchspeicheldrüsen, als Beschleuniger zu Käsequark bzw. Käsebruch hinzugegeben. Eine dritte Quelle, mikrobielle Lipasen, wurde bereits bei der Herstellung von stark riechenden Käsen, aber nicht von milden Käsen verwendet.
Lipasen aus der pregastrischen Drüse von jungen Ziegen, Kälbern und Lämmern werden zur Zeit zur Beschleunigung der Reifung bei Käse vom italienischen Typ (Provolone, Romano, Parmesan) bei dem der charakteristische ranzige Aroma niedermolekularer freier Fettsäuren (z. B. Buttersäure) wünschenswert ist, hinzugegeben. Wenn jedoch diese prägastrischen Lipasen zur Beschleunigung bei mild riechendem Käse, z. B. Cheddar, verwendet werden, bilden sich zu viele niedermolekulare Fettsäuren und es entwickelt sich ein ranziges Aroma. Wenn die tierischen Pankreaslipasen in hoher Konzentration verwendet werden, bilden sich im Käse sehr große Mengen Laurinsäure, die einen seifigen Geschmack verursachen. Darüberhinaus können die Lipasen, wenn sie nicht hoch gereinigt sind, ein Übermaß an Protease enthalten, die, obwohl sie in kleinen Mengen das Weichwerden des Käses fördert, in größeren Mengen ein bitteres Fehlaroma bildet.
Auf der Suche nach Lipasen mit wünschenswerten Reifungseigenschaften wurden bereits zahlreiche Organismen wie Pseudomonas fragii, P. fluorescens, Staphylococcus aureus, Clostridium lipolytica, Geotrichium candidum, Penicillium roqueforti, Aspergillus niger, A. flavus, A. oryzae, Candida cylindracea und Rhizopus oligosporous bei Laborstudien verwendet. Viele dieser mikrobiellen Lipasen sind noch nicht käuflich erhältlich. Bei einer Untersuchung von verschiedenen Lipasen zur Käsereifung, Harper, W.J., [J. Dairy Science 40, 556 (1957)] sind hinsichtlich einer selektiven Freisetzung freier Fettsäuren aus 20%iger Butterfett-Creme die folgenden Werte entwickelt worden. Tabelle 1 Freisetzung von Fettsäure aus 20%iger Butterfett-Creme Lipasenquelle Mol. Buttersäure % Bildung in 3 Std. 35ºC Capronsäure Capryls. Caprins. Laurins. Importiertes Lab junger Ziegen (Paste) Prägastrische Esterasen junge Ziegen Lamm Kalb Lab von Hauskälbern Spuren Milchlipase Pankreaslipase Lipase von A. niger
Über die Beziehung zwischen spezifischen freien Fettsäuren und Geschmacksintensität bei Käse ist wenig Information vorhanden, obwohl die Anwesenheit von Buttersäure gewöhnlich mit der Entwicklung einer starken Ranzigkeit in scharfem Käse in Verbindung gebracht wird, und das Vorliegen großer Mengen Laurinsäure zu einem seifigen Geschmack führen kann. Längerkettige Fettsäuren sind mit fruchtigen Aromen in Verbindung gebracht worden. Im allgemeinen wird beobachtet, daß alle freien Fettsäuren mit gerader Kohlenstoffzahl vorhanden sind, aber die Konzentration spezieller Fettsäuren in verschiedenen Typen von Käse variiert.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung betrifft isolierte Kulturen eines ausgewählten mutierten Stammes von Aspergillus fungus. Wenn er in einem geeigneten Nährmedium unter richtiger Belüftung und unter Schütteln kultiviert wird, bildet er ein neues lipolytisches Enzym. Für die Aufgaben der Erfindung soll dieser Typ von Enzym als Lipase bezeichnet werden, obwohl dieser Ausdruck auch Esterasen einschließt.
Der neue erfindungsgemäße Stab von Fungus wurde als ein neuer Stab von Aspergillus identifizierte. Er wurde in der America Type Culture Collection 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America unter der Nr. 20719 hinterlegt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird darum eine biologisch reine Kultur eines Stammes von Aspergillus mit der Hinterlegungsnummer ATCC 20719 bereitgestellt.
Der erfindungsgemäße Aspergillus-Organismus produziert bei Kultivierung in einem Medium auf Olbasis in derselben Weise wie bekannte Aspergillus-Organismen eine neue und besonders brauchbare Lipase. Jedoch hydrolisiert die Lipase vom neuen Aspergillus längerkettige C&sub6;- und C&sub8;-Triglyderide, wie Tricaproin und Tricaprylin, rascher als kurzkettige C&sub4;-Triglyceride wie Tributyrin.
Eine Lipase mit dieser Eigenschaft scheint als Reifungsbeschleuniger bei der Herstellung von geschmacklich mildem Käse, wie Cheddarkäsesorten geeignet zu sein. Die weniger rasche Hydrolyse der kürzeren C&sub4;-Triglyceride unterdrückt die Entwicklung ranziger Aromastoffe, die bei milden Käsesorten unerwünscht sind.
Wenn sie auf dem vorliegenden Aspergillus-Organismus bei richtigen Verdünnungs-, Schüttel-, pH- und Salzkonzentrationsbedingungen isoliert wird, liegen neben der vorliegenden Lipase geringe Mengen Protease vor, die den Käse ohne Bildung bitterer Aromastoffe weich machen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Auswirkung der Mycelkonzentration auf die Lipasefreisetzung.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Temperaturauswirkung auf die Lipaseaktivität bei pH 6,2.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Auswirkung des pH-Wertes auf die Lipaseaktivität bei 33ºC.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Temperaturauswirkung auf die Lipaseaktivität bei verschiedenen pH-Werten.
Fig. 5a-f sind graphische Darstellungen der Auswirkung der Zeit auf die Lipaseaktivität bei verschiedenen Temperaturen und pH-Werten.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der Auswirkung der Zeit auf die Hydrolyse von Tricaprylin durch die vorliegende Lipase bei 40ºC.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der Auswirkung der Zeit auf die Tricaprylinhydrolyse durch die vorliegende Lipase bei 50ºC.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung des Hydrolyseprozentsatzes einer spezifischen freien Fettsäure zur Gesamtmenge freier Fettsäuren in Käsesorten, denen Enzym zugesetzt worden ist.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung des Hydrolyseprozentsatzes einer spezifischen freien Fettsäure zur Gesamtmenge freier Fettsäuren in Käsesorten, denen Enzym zugesetzt worden ist.

Ausführungsformen der Erfindung

Kultivierung des Organismus

Der Aspergillus-Organismus wird auf einem sterilen Boden unter Kühlung aufbewahrt. Teile des vorrätigen Bodens werden zur Verwendung als erste Impfkultur für die Schüttelgefäß und Fermenteanzucht auf Kartoffeldextroseagar (PDA) übergeführt und bei 20 bis 35ºC, vorzugsweise bei 30ºC 4-5 Tage wachsen lassen.
Die Lipase kann in einem Schüttelgefäß durch direkte Überimpfung von der PDA Schrägkultur in 100 ml steriles Medium bei pH 5,1 (5,0-5,2), das 6% Sojabohnenmehl, 5% einbasiges Ammoniumphosphat, 0,5% Magnesiumsulphat (kristallin), 2% Sojabohnenöl in 1 l Erlenmeyerkolben enthält, gebildet werden. Nach 3-5 Tagen bei 30ºC und einer Schüttelgeschwindigkeit von 265 UPM, wird die Kultur abfiltriert. Bevorzugte Bereiche für Kulturzutaten sind: 1-10% Öl; > 0,1-1% Sulphat; 1-5% Phosphat; und 3-8% Sojabohnenmehl. Die Konzentrationen an MgSO&sub4;, (NH&sub4;)H&sub2;PO&sub4; und Öl sind für die optimale Ausbildung der Lipaseaktivität wichtig. Der Anfangs-pH darf nicht unter 5,0 liegen.
Die Herstellung in einem Fermenter erfordert einige Modifikationen. Die Mediumbestandteile sind dieselben wie für Schüttelgefäße beschrieben, aber es ist nötig, eine Zwischenstufe der Impfkultur zu verwenden, um die Wachstumszeit auf den Zeitraum von 3-5 Tagen zu verringern. Das verwendete Impfkulturvolumen beträgt 5% (1 zu 10) einer Nährlösung mit 4% Vollkornweizenmehl und 8% aufgebrühter Getreidelösung bei pH 5,5. Die sterile Impfkulturnährlösung wird mit der PDA-Schrägkultur angeimpft und bei 30ºC
30-50 Stunden wachsen gelassen und dann in das Wachstumsmedium übergeführt. Hier kann das Öl Getreide- oder Sojaöl sein und die Konzentration kann 1-6% betragen. Das ganze Öl kann bereits am Anfang vorhanden sein, oder nach Wachstumsbeginn in Portionen zugegeben werden.

Aufbereitung der Lipase

Die Lipase wird zweckmäßigerweise durch Abfiltrieren des Pilzmycels isoliert. Die Lipaseaktivität der Rohkultur bei der Ernte (pH 4,5-5,0) ist an das Mycel gebunden. Das mycelfreie Kulturfiltrat enthält im wesentlichen keine Lipaseaktivität (< 5%) und alle löslichen extracellulären Bestandteile, die eine negative Auswirkung auf das Käsearoma haben können. Die Freisetzung von Lipaseaktivität aus dem Mycel in ein zweites Extraktionsfiltrat hängt von der Mycelkonzentration, dem pH-Wert, der Puffersalzkonzentration des Extraktionsfiltrates (0,5-3,0% PO&sub4; bei optimalem pH), der Konzentration an oberflächenaktiven Mitteln (vorzugsweise < 1%) und der Behandlungszeit ab.
Fig. 1 erläutert, wie die Lipasemenge, die unter Verwendung von Ethofot 242/25 oberflächenaktiven Substanzen an das Extraktionsfiltrat abgegeben wird, mit den Mycelkonzentrationen variiert. Alle diese Daten wurden bei pH 6,2 erhalten. Eine optimale Gewinnung von Lipase aus Mycel wird normalerweise bei pH 6,2 erreicht, weil die Lipase (mycelfrei) über lange Zeiträume eine ausgezeichnete Stabilität zeigt. Wenn der pH steigt, ist die Lipase weniger stabil und sie wird oberhalb eines pH-Wertes von 7,5 rasch zerstört. Beispielsweise zeigte ein Filtrat bei 4-5ºC nach 42 Stunden 94%, 87% und 74% Aktivitätsretention bei pH-Werten von 6,3, 6,8 bzw. 7,4. Nach einer Behandlung unter optimalen Bedingungen können etwa 80-90% der Lipaseaktivität aus dem Mycelfiltrat gewonnen werden.
Die Lipase im Extraktionsfiltrat kann direkt zur Modifikation von Käsearoma verwendet werden oder alternativ in vacuo oder durch Ultrafiltration vor der Käsezugabe konzentriert werden. Das Filtrat oder Konzentrat kann im Vakuum bei 0-35ºC getrocknet werden oder zur Herstellung eines Trockenkonzentrats, das mit anderen bei der Käseherstellung routinemäßig verwendeten Bestandteilen, z. B. Natriumchloridphosphate etc., sprühgetrocknet werden. Die Konzentrations- und Trocknungsverfahren sind herkömmliche, an sich bekannte, Techniken.

Test auf Lipaseaktivität

Zwei verschiedene Tests wurden bereits für die Lipaseaktivität verwendet. In dem ersten wird eine potentiometrische Titration durchgeführt, wodurch die Lipase-Einheiten der Kardia (LFUs) bestimmt werden. Eine LFU gleicht der Aktivität, die 1,5 umol Buttersäure pro Minute freisetzt, Food Chemical Codex 3rd Ed., National Academic Press, 1981.
Das Titrationssubstrat wird durch Dispersion einer zu 600 mg Casein äquivalenten Menge Natriumcaseinat in 95 ml Wasser in einem 1 1/2 Pint Gefriergefäß, auf das der Kopfteil eines geeigneten Hochgeschwindigkeitsmixers paßt, hergestellt. Die Dispersion wird mit 0,5 g hydroxyliertem Lecithin vermischt. Schließlich werden 5,0 ml Tri-n-butyrin zugegeben und 60 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit gemixt. Das Substrat muß auf 33ºC gehalten werden und innerhalb von 4 Stunden verwendet werden.
Die Probe wird durch Suspendieren oder Auflösen einer genau abgewogenen Menge des Enzyms in Wasser hergestellt.
Zum Abmessen wird der Titrator mit 0,05 N Natriumhydroxid gefüllt, und das Instrument wird nach den Herstellerangaben calibriert. Das Substrat wird etwa 15 Sekunden lang mit einem magnetischen Rührer gemischt und dann werden 20,0 ml in das Reaktionsgefäß des Titrators pipettiert. Ein ml der Probe wird hinzugegeben und 15 Minuten lang equilibriert. Die Geschwindigkeit in ml pro Minute, mit der das Titrationsmittel während der Titration zugetropft wurde, wird bestimmt und als R aufgezeichnet. Die Aktivität des Enzyms wird nach der Formel:
LFU/g = R·0,025·10³/(W·1,25)
berechnet, in der W das Gewicht in g, der Enzymzubereitung, die in den 1,0 ml der zur Analyse genommenen Probe enthalten ist, bedeutet Es sollte angemerkt werden, daß die Fähigkeit des Enzyms Tricaproin (C6), Tricaprylin (C8), Tricaprin (C10) zu hydrolisieren, in einfacher Weise durch Ersatz von Tri-n-butyrin durch das gewünschte Substrat, gemessen werden kann.
Der zweite Test ist das Creme-Säure-Titrationsverfahren. Ein Aliquot (20,0 ml) 0,5%iges Butterfett Half and Half wird in 2-Unzen-Glasbehälter gegeben und in einem thermostatisierten Wasserbad auf 33ºC erhitzt. Nachdem sich ein Temperaturgleichgewicht eingestellt hat (etwa 10 Minuten), wird 1,0 ml einer Enzymlösung hinzugegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Dann werden 10 ml Ethanol (denaturierte Formel 2A ist geeignet) hinzugegeben, um die Reaktion vor der Titration mit 0,05N NaOH bei pH 9,5 zu stoppen. Die Titration sollte mit einer Glaselektrode ausgeführt werden, und das Inkubationsgemisch plus Alkohol sollte mit einem Magnetrührer gerührt werden.
Eine Substratkontrolle (20 ml Half& Half plus 10 ml Wasser) wird titriert, um die zur Neutralisation der in der Creme vorhandenen Salze erforderliche Menge an Alkali zu korrigieren.
Eine Enzymkontrolle wird ebenfalls titriert, um die zur Neutralisation erforderliche Menge an Alkali, die zur Neutralisation der im Enzym vorhandenen Salze erforderlich ist, zu korrigieren.
Die Aciditätszunahme, die einer 1%igen Hydrolyse des Butterfetts entspricht, ist einer Titrationsdifferenz von 1,65 ml 0,05N NaOH äquivalent. Die Aktivität wird aus der folgenden Beziehung errechnet:
CLU = 0.05N NaOH eingebracht in 20 ml Substrat/g verwendetes Enzym

Auswirkungen von pH-Wert, Temperatur und Zeit auf die Lipaseaktivität

Die Auswirkungen von Temperatur und pH-Wert auf die Tributyrinhydrolyse durch die vorliegende Lipase Enzym sind in den Fig. 2-4 aufgezeigt. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, beträgt die für die Enzymaktivität optimale Temperatur etwa 42,5ºC, während Fig. 3 zeigt, daß das pH-Optimum nahe bei 7,0 liegt. Ein scharfer Aktivitätsabfall kann bei Erhöhung der Temperatur in Fig. 4 beobachtet werden, wobei die Auswirkung bei Zunahme des pH-Wertes dramatischer ist. Die in Fig. 5a-f gezeigten Plots zeigen auch, daß eine Verlängerung der Zeit die ungünstige Wirkung der pH-Werte über 6,2 betont, obwohl pH 7,0 bei Temperaturen unter 60ºC eindeutig optimal ist.

Triglyceridhydrolyse

Die Lipase wurde zur Hydrolyse spezifischer Triglyceride (Tricaprylin, Tricaproin und Tributyrin) zu ihren entsprechenden freien Fettsäuren (FFAs) (Capryl-, Capron- und Buttersäure) verwendet. Herkömmliche Gaschromatographietechniken können zum Messen dieser FFAs verwendet werden.
Die Hydrolyse wurde in der folgenden Weise gemessen. 5 g Triglycerid wurden mit 100 ml Phosphatpuffer (pH 6,5, 0,05 m) mit 1% Gummi arabicum zur Bildung einer Emulsion, die mit 2,0 ml Lipase aus Pilzen (100 mg) bei 33ºC 4 Stunden lang geschüttelt wird, vermischt. Um die Reaktionen zu stoppen, wurden 10 ml Ethanol hinzugegeben und die erhaltenen freien Fettsäuren durch Gaschromatographie gemessen.
Die Hydrolyseergebnisse der freien Triglyceride sind wie folgt: Tabelle 2 Enzymbehandeltes Substrat % Freie Fettsäure Verhältnis Tributyrin Tricaproin Tricaprylin
Die vorliegende Lipase hydrolisiert sowohl Tricaproin und Tricaprylin rascher als Tributyrin. Der Hydrolyse-Typ kann dadurch gezeigt werden, daß ein Verhältnis der zwei Zahlen (C/C&sub4;) genommen wird. Eine erhöhte Hydrolysegeschwindigkeit kann durch das Verhältnis TC/TB gezeigt werden. Typischerweise führt die erhöhte Geschwindigkeit der Aktivität zu einer äquivalenten C&sub8;/C&sub4;-Bildung. Diese Spezifität gilt nur für die vorliegende Lipase.
Die folgende Tabelle zeigt das Hydrolyseverhältnis (TC/TB) von Tricaprylin (TC) zu Tributyrin (TB) für bekannte Lipasen, wie es von bekannten Autoren zitiert wird. Tabelle 3 RELATIVE AKTIVITÄT VON LIPASEZUBEREITUNGEN WIE IN DER LITERATUR ANGEGEBEN Herstellung Aktivität vs. Tributyrin Tricaprylin Zitat Schweinepankreas Enzymologia Menschliche Milch Rinderpankreas Freisetzung von FFA aus Milchfett mol % Milchlipase Nelson J. H. Steapsin J Oil Pankreaslipase Chem Soc Kalb-Esterase Esterasepankreatin Prägastrische Kalb-Esterase Farnham et al. 1956 Esterase junger Ziegen Lamm-Esterase % Summe freier Fettsäuren (bezogen auf Microäquivalente) nach 3 Stunden bei 35ºC auf Milchfett Importierte rohe Labpaste junger Ziegen Harper W. J. Dairy Sci Gereinigte Labpaste vom Hauskalb Spuren Orale Lipase von Kälbern junger Ziegen Lämmern Aspergillus-Lipase Milchlipase Pankreatische Lipase Ü mol freigesetzter FFA/ml Enzym Syncephalastrum racemosum Chopra et al. ml 0,1N in 2 Stunden gebildete Säure bei 30ºC Penicillum roqueforti Aspergillus niger Shipe, W. F. Arch. Bioch. 3 165 (1951)
Die Fig. 6 und 7 erläutern die eindeutig bessere TC-Hydrolyse gegenüber der TB-Hydrolyse der vorliegenden Lipase und wie sie mit der Temperatur verstärkt werden kann. Bei 40ºC und pH 7,0 beträgt das TC/TB Verhältnis 1,73, während es bei 50ºC und pH 7,0 sogar größer als 2,49 ist.

Hydrolyse von Milchtriglycerid

Die vorliegende Lipase wurde auf Hydrolyse von solchen Triglyceriden getestet, die natürlicherweise in Milch vorhanden sind. Für den Hydrolysetest wurden 180 ml 10,5%ige Butterfett-Creme mit 0,36 g (0,2%) und 0,90 g (0,5%) entweder der vorliegenden Lipase oder Kalblipase behandelt. Die Proben wurden 15 Tage lang bei 0-3ºC gehalten, bevor die freien Fettsäuren (C4 bis C12) gaschromatographisch bestimmt wurden. Eine Kontrollcremeprobe ohne Enzym wurde bei dem Experiment ebenfalls durchgeführt. Die Ergebnisse des Milchtests sind wie folgt. Tabelle 4 Mg FFA/ml Creme Spezifische FFA Kontrolle 0,2% vorliegende Lipase Kalblipase Tabelle 5 % Hydrolyse eines spezifischen Glycerids Spezifische FFA Kontrolle 0,2% vorliegende Lipase Kalblipase Tabelle 6 % Hydrolyse eines spezifischen Glycerids (Korrigiert mit der in der Kontrolle vorhandenen FFA) Spezifische FFA Kontrolle 0,2% vorliegende Lipase Kalblipase
Obwohl die FFA-Bildung durch die vorliegende Lipase für die C4-Bildung fast identisch mit der FFA-Bildung durch Kalblipase ist, zeigen alle anderen FFA-Daten, daß die vorliegende Lipase die C6-, C8- und C10-Glyceride in einem viel größeren Ausmaß hydrolysiert. Beispielsweise zeigt die vorliegende Lipase 5,8·, 4,6· beziehungsweise 2,7· mehr C6, C8 beziehungsweise C10 als die Kalblipase bei einer Konzentration von 0,20% und 2,8·, 3,4· und 13,4· soviel bei einer Konzentration von 0,50%.

Triglyceridhydrolyse in Ölen

Die vorliegende Lipase wurde auch auf die Bildung von 5%igen Emulsionen von Soja-, Butter-, und Kokosnußöl getestet. Die Chromatographie der behandelten Emulsionen (4 Stunden bei 33ºC) zeigt die Fähigkeit dieser Lipase zur Hydrolyse eines gesamten Bereichs von Triglyceriden. Der Gehalt bestimmter Triglyceride in den Gemischen und die Fähigkeit zum vollständigen Emulgieren der Substrate kann die Geschwindigkeitsrate einer freigesetzten spezifischen freien Fettsäure, wie in Tabelle 7 erläutert, verändern. Bestimmte freie Fettsäure Sojaöl % FFA Butteröl Kokosnußöl **ND = nicht detektiert

Käseherstellung

Käse wurde mit der vorliegenden Lipase in der folgenden Weise hergestellt. Milch wird von einer Molkerei bezogen, portionsweise bei 62,5ºC (145ºF) 30 Minuten lang pasteurisiert und verbleibt dann bis zum folgenden Tag bei 2,5ºC (36ºF) (Colby-Käse wurde unter Verwendung von Hansen CH 60YTM als Starter hergestellt). Äquivalente Aktivitätsmengen der vorliegenden Lipase und Miles 600-Kalb-Lipase (durch Creme-Enzymtest) werden vorgewogen und mit Salz vermischt, um zwei Gew.-% Salz zu ergeben. Acht Behandlungen des Käses werden unter Verwendung von 20 Pfund Blöcken vorgenommen. Kontrollblöcke mit Salz, aber ohne Enzym, werden ebenfalls bearbeitet.
Von den erhaltenen Käsen werden nach 1, 28, 72, 102, und 198 Tagen Proben entnommen. Sie werden organoleptisch bewertet und auf freie Fettsäuren durch Gaschromatographie, durch bekannte Tests auf den Wert des Säuregrades (ADV) und auch durch die Stickstoff-Tests, bei denen 12% TCA - gelöst werden, analysiert.
Nach 72 Stunden haben die Käse mit 0,048% der vorliegenden Lipase und 0,128% Kalblipase etwa denselben ADV-Wert und Gesamt-FFA-Wert, der 50-70% größer als der der Kontrolle ist. Jedoch sind nach 102 und 198 Tagen die Konzentrationen des verwendeten Enzyms (und für die Daten in der Tabelle angegeben sind) dadurch, daß sich zuviel freie Fettsäure entwickelt hat, für ein gutes Aroma zu hoch. Die Kalblipase produziert zuviel Buttersäure und die vorliegende Lipase ebenfalls zuviel freie Fettsäure C14-C18.
Bei niedrigeren Konzentrationen (0,012 und 0,024%) ergibt die vorliegende Lipase ein gutes Reifungsaroma ohne Ranzigkeit, die bei 102 Tagen in Verbindung mit Buttersäure auftritt. Die Kontrolle hat zu diesem Zeitpunkt ein schwaches Aroma, während sich mit der Kalblipase die typische Ranzigkeit, die in Verbindung mit Buttersäure nach einiger Zeit auftritt, sogar mit niedrigen Konzentrationen der Enzymzubereitung (0,064 und 0,032%) zeigte.
Die Fig. 8 und 9 erläutern die Daten der Triglyceridhydrolyse für den Kontrollkäse und für die Käse, die mit 0,048% MM 313 Lipase und mit 0,128% Kalblipase hergestellt worden sind. Es zeigt sich sofort, daß bei 72 Tagen und 102 Tagen der Buttersäuregehalt in dem Käse, der mit der Kalblipase hergestellt worden ist, im Vergleich zum Buttersäuregehalt der Kontrolle stark erhöht ist. Andererseits gleicht der Käse, der mit der vorliegenden Lipase hergestellt worden ist, was die Konzentrationen an Buttersäure betrifft, mehr dem Kontrollkäse.
Die vorliegende Lipase reduziert den Reifeprozeß des milden Käses um das 2-5-fache. Nach 102 Tagen zeigt der Käse, dem die vorliegende Lipase zugesetzt worden ist, einen größeren Gehalt an C16, C18, C18-1 und C18-2 als der Kontrollkäse, wodurch eine Beschleunigung (das heißt, eine raschere Aromaentwicklung) des gewöhnlichen Reifungsprozesses angezeigt wird. Somit entwickeln die Käse, die mit der vorliegenden Lipase hergestellt worden sind, ein Cheddar-artiges Aroma, während sich bei dem Käse, der mit der Kalblipase hergestellt worden ist, ein Aroma vom Italien-Typ bildet. Es ist klar ersichtlich, daß die Lipase, die aus dem vorliegenden Aspergillus-Organismus kommt, hinsichtlich der Verkürzung der Lagerzeit, die für Cheddar und andere Käsesorten mit mildem Aroma benötigt wird, unerreicht ist.

Claims

1. Biologisch reine Kultur eines Stamms von Aspergillus mit der Hinterlegungsnummer ATCC 20719.

2. Lipolytisches Enzym erhältlich aus der Kultur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es dazu imstande ist, die Reifungsgeschwindigkeit von Käse ohne Erhöhung seiner Ranzigkeit und Bitterkeit zu steigern.

3. Verfahren zur Herstellung eines milden Käses, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufe der Zugabe eines lipolytischen Enzyms nach Anspruch 2 zu Käsequark oder zu Milch einschließt.

4. verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der milde Käse Cheddar-Käse ist.