DE2440948A1 - Protein prodn. by fermentation - in presence of methanol and nitrogen source using Bacillus, Pseudomonas or Flavobacterium, giving prod. useful as animal foodstuff - Google Patents

Abstract

Novel process for prepn. of protein using methanol as the C source by fermentation of strains of the microorganisms Bacillus, Pseudomonas or Flavobacterium, or their mutants or variants, at pH 4.9-9.0 with a source of N and with a methanol concn. in the logarithmic growth phase of the microorganisms of 10-150 ppm based on the culture suspension. Pref. 50-100 ppm of methanol is present, 0.3-0.6 vol. of air per vol. of suspension per minute is pref. added and the suspension is agitated at 50-210 revs. per minute. The agitation may be achieved mechanically, hydrodynamically or pneumatically. The concn. of methanol is controlled by measuring the liberation of CO2. Suitable sources of Nare KNO3, (NH4)2 SO4, (NH4)3PO4, NH3, urea or soya flour. The incubation temp. is pref. 20-45 degrees C, esp. 30-37 degrees C. Suitable microorganisms are Bacillus subtilis or polymixa, and Pseudomonas aeruginosa. Prod. is useful as foodstuff or forage for animals. The dried prod. contains much less crude residue than in known prods. and only 5-10 wt. % nucleic acids.

Description

Verfahren zur fermentativen Herstellung von Protein Es sind biosynthetische Verfahren bekannt, in denen Mikroorganismen, z.B. bestimmte Bakterienstämme, in einem s-ynthetische Nährmedium, welches als einzige Kohlenstoff-Quelle Methanol enthält, fermentatis vermehrt werden. Solche Verfahren können sowohl diskontinuierlich als auch kontinuierlich durchgeführt werden. Die so gewonnenen Bakterienzellen enthalten im sogenannten "Rohprotein" (errechnet durch Multiplizieren des elementaranalytisch gefundenen Wertes für Stickstoff mit dem emprischen Faktor 6,25) üblicherweise 1+0 - 75 Gewichts-% Aminosäuren und 8 - 16 Gewichts-% Nukleinsäuren, Ein so hoher Anteil an Nukleinsäuren ist jedoch unerwunsoht, da aus ihnen insbesondere im menschlichen Organistnus Harnsäure entsteht, die Gicht verursacht. Außerdem wird die Flora des Magen-Darm-Traktes ungünstig beeinflußt.Process for the fermentative production of protein They are biosynthetic Process known in which microorganisms, e.g. certain bacterial strains, in a synthetic nutrient medium, which is the only carbon source methanol contains, fermentatis are propagated. Such processes can be both batchwise as well as continuously. The bacterial cells obtained in this way contain in the so-called "crude protein" (calculated by multiplying the elemental analysis found value for nitrogen with the expressive factor 6.25) usually 1 + 0 - 75% by weight of amino acids and 8-16% by weight of nucleic acids, such a high proportion of nucleic acids, however, is undesirable, since they are made up of them, especially in the human The organism produces uric acid, which causes gout. In addition, the flora of the Gastrointestinal tract adversely affected.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Bakterien mit Methanol als Kohlenstoff-Quelle und einer Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen /i,0 und 9,0 gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Bakterienstämme der Gattungen Bacillus, Pseudonomas und Flavobacterlum, deren Mutanten oder Varianten so fermentiert, daß die Konzentration an Methanol in der Phase des logarithmischen Wachstums der Bakterienzellen zwischen 5 und 200 ppm, bezogen auf die Kultursuspension, liegt.There has now been a method of making bacteria using methanol as a carbon source and a nitrogen source under aerobic conditions found a pH between 1.0 and 9.0, which is characterized in that one bacterial strains of the genera Bacillus, Pseudonomas and Flavobacterlum, whose Mutants or variants fermented so that the concentration of methanol in the Phase of logarithmic growth of the bacterial cells between 5 and 200 ppm, based on the culture suspension.

Bevorzugt wird eine Konzentration an Methanol, die zwischen 10 und 150 ppm liegt.A concentration of methanol between 10 and 150 ppm.

Das Verfahren wird zweckmäßig in Fermentationsreaktoren durchgeführt, welche ein Nährmedium enthalten, das neben dem erwähnten Methanol als Stickstoffquelle Salze wie Kaliumnitrat, Ammonsulfat, Awenonphosphat oder Ammoniak, Harnstoff oder SoJamehl enthalten Außerdem enthält es Phosphate wie Kaliumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat sowie Magnesiunt- und Kalium-Salze und Spurenelemente, wie sie z.B.The process is expediently carried out in fermentation reactors, which contain a nutrient medium, in addition to the aforementioned methanol as a nitrogen source Salts such as potassium nitrate, ammonium sulfate, avenon phosphate or ammonia, urea or Soy flour also contains phosphates such as potassium dihydrogen phosphate or Disodium hydrogen phosphate as well as magnesium and potassium salts and trace elements, as they e.g.

auch im Leitungswasser enthalten sind. So sind z.B. Eisen-, Kupfer-, Molybdä.nsalze in Spuren vorhanden.are also contained in tap water. For example, iron, copper, Molybdenum salts present in traces.

Es kann zwecksmäßig sein, insbesondere den Vorkulturen Nährstoffe wie Hefeextrakt, Fleischextrakt, Leberextrakt, Glucose oder andere zuzusetzen.It can be expedient, especially the precultures nutrients such as yeast extract, meat extract, liver extract, glucose or others to be added.

Das Verfahren wird zweckmäßig ei Temperaturen zwischen 200 und 450C, vorzugsweise zwischen 30° und 370C durchgeführt.The process is expediently carried out at temperatures between 200 and 450C, preferably carried out between 30 ° and 370C.

Als Bakterienstämme werden Bacillus-Arten verwendet, insbesondere so bekannte Bacilius-Stämme wie B. subtilis oder B. polymyxa, weiterhin Pseudomonas-Arten, wie Pseudomonas aeruginosa. Auch Flavobakterien können verwendet werden.Bacillus species are used as bacterial strains, in particular well-known Bacilius strains such as B. subtilis or B. polymyxa, furthermore Pseudomonas species, such as Pseudomonas aeruginosa. Flavobacteria can also be used.

Die Kultursuspension im. Reaktor wird mit O,i bis 1,5 1 Luft pro Liter Kulturlösung und Minute (vvm), vorzugsweise mit 0,3 bis 0,6 vvm, belüftet. Um eine gute Aufnahme des Sauerstoffs durch die Zellen zu gewährleisten kann intensiv gerührt werden; es können auch Emulgatoren zugesetzt werden.The culture suspension im. Reactor is with 0.1 to 1.5 1 air per liter Culture solution and minute (vvm), preferably 0.3 to 0.6 vvm, aerated. To a good uptake of oxygen through the cells to ensure can be stirred intensely; emulsifiers can also be added.

In anderen Reakorsystemen als Rührkessein muß entsprechend für eine genügende Luftmenge gesorgt werden, wobei bei der Flüchtigkeit des Methanols eine Rückführung der Luft günstig ist. In konventionellen Systemen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, einen oder besser noch zwei oder mehrere Rührer in einem Fermentationskessel zu verwenden. Weiterhin ist es vcrteilhaft, zwei Rührer, insbesondere Lochscheibenrührer, so im Fermentationskessel anzuordnen, daß die Rührerabstände etwa einen Rührerdurchmesser betragen. Das Verhältnis von Rührerdurchmesser zu Kesseldurchmesser liegt zweckmäßig zwischen 0,35 und 0,65, vorzugsweise zwischen 0,45 und C,55. Die Umlaufgeschwindigkeit der Kultursuspension beträgt zweckmäßig mehr als 7 m/s.In other reactor systems than a stirred tank, it must be Sufficient amount of air can be provided, with the volatility of the methanol a Recirculation of the air is favorable. In conventional systems it has been found to be beneficial proved to have one or even better two or more stirrers in a fermentation kettle to use. It is also advantageous to have two stirrers, in particular perforated disc stirrers, To be arranged in the fermentation kettle so that the stirrer distances are approximately one stirrer diameter be. The ratio of the stirrer diameter to the bowl diameter is appropriate between 0.35 and 0.65, preferably between 0.45 and C.55. The speed of rotation the culture suspension is expediently more than 7 m / s.

Falls Schaumbildung eintritt, empfiehlt sich eine chemische oder mechanische Schaumbekämpfung, zum Beispiel durch Zusatz von 0,01 bis 0,1 Gewichts-% eines Entschaum.ers wie Octanol, Ester der Ölsäure und Laurinsäure mit Glykol, Glycerin oder Sorbit, alkoholische Cholesterinlösung oder Silikone wie Polydimethylsiloxan.If foaming occurs, chemical or mechanical is recommended Foam control, for example by adding 0.01 to 0.1% by weight of a defoamer such as octanol, esters of oleic acid and lauric acid with glycol, glycerine or sorbitol, alcoholic cholesterol solution or silicones such as polydimethylsiloxane.

Die Methanol-Konzentration zwischen 5 und 200 ppm, vorzugsweise zwischen 10 und 150 ppm, kann kontinuierlich durch verschiedene Maßnahmen gesteuert werden, z.B. durch Messung des Stickstoffverbrauchs, des Zellmasseanteils oder vorzugsweise durch Messung des Kohlendioxidausstoßes. Hierbei ist eine feine Dosierung der Methanolzugabe mit schneller Reaktion auf den bei Kohlenstoffmangel absinkenden Kohlendioxidausstoß möglich.The methanol concentration between 5 and 200 ppm, preferably between 10 and 150 ppm, can be continuously controlled by various measures, e.g. by measuring the nitrogen consumption, the cell mass percentage or preferably by measuring carbon dioxide emissions. Here is a fine dosage of the addition of methanol with a quick reaction to the lower carbon dioxide emissions in the case of carbon deficiency possible.

Vorzugsweise kann diese Steuerung über die Messung des gasförmigen Methanols mittels Flammenionisationsdetektor erfolgen.This control can preferably be via the measurement of the gaseous Methanol using a flame ionization detector.

Wenn der pH-Wert der Kultursuspension unter den vorgeschriebenen Wert sinkt, wird er durch Zugabe von Alkali, z.B. Natronlauge oder Kalilauge wieder auf den vorgeschriebenen Wert gebracht Ebenso wird ein zu hoher pH-Wert durch Zugabe von Saure, 9 Salzsäure oder Schwefelsäure reguliert.When the pH of the culture suspension falls below the prescribed value drops, it is raised again by adding alkali, e.g. caustic soda or potassium hydroxide Bringing the prescribed value Likewise, an excessively high pH value is caused by adding regulated by acid, hydrochloric acid, or sulfuric acid.

Zur Kontrolle des Verfahrens werden aus der Kultursuspension Proben entnommen, um das Trockengewicht und den Stickstoffgehalt in der Bakterienzellmasse zu bestimmen. Danach können die Wachstumsrate und die Verdopplungszeit der Zellmasse bestimmt werden. Wenn das Trockengewicht der Zellen bei aufeinander folgenden Probeentnahmen nicht mehr logarithmisch zunimmt, wird die Fermentation bei Chargenfahrweise beendet. Bei kontinuierlicher Fahrweise wird über die Vordünnungsrate die Biomasseproduktion im Reaktor kontrolliert.To control the process, samples are taken from the culture suspension taken to find the dry weight and nitrogen content in the bacterial cell mass to determine. After that, the growth rate and the doubling time of the cell mass to be determined. When the dry weight of cells in consecutive samples no longer increases logarithmically, the fermentation is terminated in the batch mode. In the case of continuous operation, the pre-dilution rate is used to increase the biomass production controlled in the reactor.

Die Abtrennung der BakterienmAsse erfolgt in ublicher Weise durch Zentrifugieren unter mehrmaligem Waschen mit Wasser.The bacterial masses are separated off in the usual way Centrifuge, washing several times with water.

Auch haben sich Verfahren bewährt, wobei durch Flocculation mit Salzen bei bestimmtem pH-Wert die Zellmasse konzentriert werden kanne Man erhält so eine pastenartige Bakterienzellmasse, die noch 75 bis 90 Gewichts-°% Wasser enthält. Die Trocknung kann auf ai verschiedene Weise erfolgen, z.B. durch Walzentrocknung, Wirbelbettrocknung oder Sprühtrocknung. Das so getrocknete Produkt enthält lediglich 2 - 5 Gewichts-% Wasser und 60 bis 80 Gewichts-% Rohprotein. In diesem Rohprotein betragt der Anteil an Aminosauren 90 bis 95 Gewichts-%.Processes have also proven themselves, whereby by flocculation with salts at a certain pH the cell mass can be concentrated paste-like bacterial cell mass that still contains 75 to 90% by weight of water. Drying can take place in a number of different ways, e.g. by roller drying, Fluidized bed drying or spray drying. The product dried in this way only contains 2 - 5% by weight of water and 60 to 80% by weight of crude protein. In this crude protein the proportion of amino acids is 90 to 95% by weight.

Dabei ist bemerkenswert, daß nicht nur dieser Anteil An Aminosäuren allgemein, sondern insbesondere der Gehalt an essentiellen und semiessentiellen Aminosäuren höher als bei vergleichbaren Produkten nach dem Stand der Technik liegen.It is noteworthy that not only this proportion of amino acids in general, but especially the content of essential and semi-essential Amino acids are higher than in comparable products according to the state of the art.

Außerdem liegt der Rohaschegehalt der erfindungsgemäß erhaltonen getrockneten Zellmasse deutlich niedriger als der bekannter Produkte. Des erfindungsgemäß erhaltene Rohprotein enthält weiterhin nur 5 bis 10 Gweichts-% Nukleinsäuren, während bekannte Produkte 8 bis 16 oder mehr Gewichts-% Nukleinsäuren enthalten.In addition, the crude ash content is the dry ash content obtained according to the invention Cell mass significantly lower than that of known products. The obtained according to the invention Crude protein still contains only 5 to 10% by weight nucleic acids, while known ones Products contain 8 to 16 or more% by weight of nucleic acids.

Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene trockene Bakterienmasse ist daher in besonderem Maße geeignet, als Eiweißquelle in Lebensmitteln und Tierfutter zu dienen.The dry bacterial mass obtained by the method according to the invention is therefore particularly suitable as a source of protein in food and animal feed to serve.

Beispiel 1: Der Stamm Pseudomonas sp. ATCC 31061 (FH-B-5163), der auf Schrägagarröhrchen der Zusammensetzung 2,5 % Fleischextrakt 1,0 % Methanol 5,0 % Hefeextrakt 0,2 % NaNO 10,0 % Fleischpepton 0,02 % MeSO4 # 7 H2O 10 % 10,0 % Glucose + 90 % 0,02 % Na2HP04 10,0 % NaCl 0,009 % NaHZ2PO4 2,5 % Agar 0,004 % KCl 0,00015% CaCl2 G,0001 % FeSO4: 7H20 Spuren CuSO4 # 5H2O " H2BO3 " MnSO4 # 5H2O " ZnSO4 # 7H2O " Na2HOO4 # 2H2O (pH 6,6) gehalten wird, wird mit 4ml destilliertem Wasser oder physiologischer kochsalzlösung abgeschwemmt und in einen 2 l Erlenmoyerkolben steril überimpft, der 250 ml Vorkultur-Nährlösung folgender Zusammensetzung enthält: 0,53 % (NH4)2SO4 0,4 % KH2PO4 0,2 % NaoHP04 b 12 H20 0,2 % MgSO4 # 7 H2O 0,02 % KCl i,5 % Methenol und 0,1 % Spurenelemente (pH 6,8) Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem 14 Liter fasseltden Fermentationskessel ausgeführt, der mit 10 Litern der nachstehenden Nährlösung beschickt ist: 1 % (NH4)2SO4 0,4 % KH2PO4 0,2 % Na2HPO4 12 H20 0,02 % MgSO4 7 H20 0,02 D KC1 Der pH-Wert der Nährlösung beträgt G,8. Sie wird 45 Minuten lang bei 121°C steriliisiert. Außerdem werden 50 g (0,5 Gewichtsprozent) Methanol vor dem Beimpfen der Hauptkultur der Nährlösung zugesetzt.Example 1: The strain Pseudomonas sp. ATCC 31061 (FH-B-5163), der on slants of the composition 2.5% meat extract 1.0% methanol 5.0 % Yeast extract 0.2% NaNO 10.0% meat peptone 0.02% MeSO4 # 7 H2O 10% 10.0% glucose + 90% 0.02% Na2HP04 10.0% NaCl 0.009% NaHZ2PO4 2.5% agar 0.004% KCl 0.00015% CaCl2 G, 0001% FeSO4: 7H20 traces of CuSO4 # 5H2O "H2BO3" MnSO4 # 5H2O "ZnSO4 # 7H2O "Na2HOO4 # 2H2O (pH 6.6) is maintained with 4ml of distilled water or physiological saline solution and placed in a 2 l Erlenmoyer flask sterile inoculated, which contains 250 ml preculture nutrient solution of the following composition: 0.53% (NH4) 2SO4 0.4% KH2PO4 0.2% NaoHP04 b 12 H20 0.2% MgSO4 # 7 H2O 0.02% KCl i, 5% methenol and 0.1% trace elements (pH 6.8) The inventive The process is carried out in a 14 liter fermentation kettle is filled with 10 liters of the following nutrient solution: 1% (NH4) 2SO4 0.4% KH2PO4 0.2% Na2HPO4 12 H20 0.02% MgSO4 7 H20 0.02 D KC1 The pH value of the nutrient solution is G, 8. It is sterilized at 121 ° C for 45 minutes. In addition, 50 g (0.5 Percent by weight) methanol was added to the nutrient solution before inoculating the main culture.

Zum Beimpfen der Nährlösung werden unter sterilen Bedingungen 2 x 250 ml der Vorkultur, die 24 - 48 Stunden lang bi 3000 gesch ttelt wurde, verwendet. Die so beimpfte Nährlösung wird bei Chargenfahrweise 24 - 36 Stunden lang bei 300C unter Belüftung mit 0,6 vvm Luft mit einem Turbinenrührer gerührt.To inoculate the nutrient solution, 2 x 250 ml of the preculture, which was shaken up to 3000 for 24 - 48 hours, was used. The nutrient solution inoculated in this way is kept at 300C for 24-36 hours in the batch mode stirred with a turbine stirrer with aeration with 0.6 vvm air.

Eine pH-Wert-Korrektur erfolgt nötigenfalls durch Zugabe von 2 n steriler HCI, Während der logarithmischen Phase der batch-Fermentation sowie bei kontinuierlicher Fahrweise wird eine Konzentration von Methanol zwischen 5 bis 150 ppm Gewichts-% eingehalten. Dazu werden bei einer Verminderung des 002 Ausstoßes der Zellen weitere Anteile Methanol automatisch zudosiert, bis der CO2-Ausstoß wieder ansteigt. Dies kann ebenso durch Messung des gasförmigen methanolanteils in der Abluft durch ein FID Flammnionisationsdetektor) geschehen.If necessary, the pH value is corrected by adding 2 N sterile HCI, during the logarithmic phase of batch fermentation as well as during continuous Driving mode is a concentration of methanol between 5 to 150 ppm weight% adhered to. In addition, if the 002 output of the cells is reduced, more Parts of methanol are automatically added until the CO2 emissions rise again. this can also be achieved by measuring the gaseous methanol content in the exhaust air through a FID flame ionization detector).

Das Fortschreiten des Verfahrens wird durch Probe entnahmen zur Bestimmung des Trockengewichts und des Stickstoffs der Bakterienzellmasse kontrolliert.The progress of the procedure is determined by taking samples the dry weight and nitrogen of the bacterial cell mass are controlled.

Nach Beendigung der logarithmischen Wachstumsphase wird die Aufarbeitung in üblicher Weise durch Zentrifugieren oder Flocculieren, Waschen der Zellen mit Wasser und anschließende Sprühtrocknung vorgenommen. Das so erhaltene Produkt hat einen Rohrproteingehalt von 71,87 Gewichts-%, einen Aminosäuregehalt von 66,55 Gewichts-% und einen Nukleinsäureanteil von 9,8 Gewichts-%. Die essentiellen und semiessentiellen Aminosäuren maschen allein 46,47 Gewichts-% (mit Glycin) aus.After the logarithmic growth phase has ended, the work-up in the usual way by centrifugation or flocculation, washing the cells with Water and subsequent spray drying made. The product thus obtained has a raw protein content of 71.87% by weight, an amino acid content of 66.55% by weight and a nucleic acid content of 9.8% by weight. The essential and semi-essential Amino acids alone mesh 46.47% by weight (with glycine).

Ausführliche Angaben finden sich in der nachstehenden Tabelle 1.Detailed information can be found in Table 1 below.

TABELLE 1 Produkt Bakterien FH-E-5163 Rohrprotein (N x 6,25) % 71,87 Wassergehalt Rohasche % Rohfett % Rohfaser % Aminosäuregehalt % 66,55 Aminosäuren g/16 g N Asp 9,50 Thi 4,63 Ser 3,08 Glu 11,57 Pro 4,15 Gly 6,05 Ala 8,41 Cys n.b. Val 6,19 Met 3,85 Ile 3,92 Leu 7,45 Tyr 2,09 Phe 3,55 His 1,89 Lys 5, Arg 7,33 Try n.b. Nukleinsäuregehalt % 9,8 Beispiel 2: Der Stamm Pseudomonas aeruginosa ATCC 21996 (FH-N-845) wird wie in Beispiel 1 angezüchtet. Weiter werden in einen 14 1 fassenden Fermentationskessel 9 1 Nährlösung der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung gegeben und p,5 Gewichts-% Methanol hinzugefügt. Die Nährlösung wird wie in Beispiel l angegeben beimpft und bei 3 0C unter Belüftung mit 0,6 wm Luft mit einem Turbinenrührer mit 210 Upm gerührt. Der pH-Wert wird gegebenefalls durch Zugabe von steriler HCI bei pH 8,0 gehalten.TABLE 1 Product bacteria FH-E-5163 Tube protein (N x 6.25)% 71.87 Water content Raw ash % Crude fat% Crude fiber% Amino acid content% 66.55 Amino acids g / 16 g N Asp 9.50 Thi 4.63 Ser 3.08 Glu 11.57 Per 4.15 Gly 6.05 Ala 8.41 Cys nb Val 6.19 Met 3.85 Ile 3.92 Leu 7.45 Tyr 2.09 Phe 3.55 His 1.89 Lys 5, Arg 7.33 Try nb Nucleic acid content% 9.8 Example 2: The strain Pseudomonas aeruginosa ATCC 21996 (FH-N-845) is grown as in Example 1. In addition, 9 l nutrient solution of the composition given in Example 1 are placed in a 14 l fermentation kettle and p, 5% by weight of methanol are added. The nutrient solution is inoculated as indicated in Example 1 and stirred at 3 ° C. with aeration with 0.6 wm air with a turbine stirrer at 210 rpm. If necessary, the pH is kept at pH 8.0 by adding sterile HCl.

Währond der logarithmischen Phase der fermentation wird eine Konzentration von Methanol zwischen 50 und 100 ppm eingehalten.During the logarithmic phase of fermentation there is a concentration of methanol between 50 and 100 ppm.

Die Regelung dieser Konzentration, die Kontrolle des Verfahrens sowie die Abtrennung und Aufarbeitung der. erhaltener Zellmasse erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach Sprühtrocknung erhalt man ein Produkt mit einem Rohrproteingehalt von 75,8 Gewichts-%, einem Aminosäuregehalt von 67,0 Gewichts-% und einem Nukleinsäuregehalt von 8,5 Gewichts-%.The regulation of this concentration, the control of the process as well the separation and processing of the. cell mass obtained takes place as in example 1 described. After spray drying, a product is obtained with a cane protein content of 75.8% by weight, an amino acid content of 67.0% by weight and a nucleic acid content of 8.5% by weight.

Beispiel 3; Der Stamm Flavobacterium sp. ATCC 31062 (FH-B-5108) wird wie in Beispiel 1 beschrieben zunächst in einem 10 1 fassenden Fermentationskessel angezüchtet. Die so erhaltene Kultursuspension wird dann in einen 200 1 fassenden Fermentationskessel übertragen, der mit 150 1 der nachstehenden Nährlösung beschickt ist; 1 % (NH4)2SO4 0,4 % KH2PO4 0,2 % K2HP04 0,2 % Na2HPO4#12 H20 0,02 % NaCl 0,02 % MgSO4#7 H2O 0,5 % methanol Der pH-Wert der Nährlösung wird mit halbkonzentrierter Phosphorsäure auf 6,5 eingestellt. Anschließend sterilisiert man bei 1200C und l,4 atü 20 Minuten lang. Nach dem Sterilisieren beträgt der pH 6,7. Methanol wird getrennt zugegeben.Example 3; The strain Flavobacterium sp. ATCC 31062 (FH-B-5108) will as described in Example 1, initially in a 10 l fermentation kettle bred. The culture suspension obtained in this way is then poured into a 200 l Transfer to fermentation kettle, which is charged with 150 l of the nutrient solution below is; 1% (NH4) 2SO4 0.4% KH2PO4 0.2% K2HP04 0.2% Na2HPO4 # 12 H20 0.02% NaCl 0.02 % MgSO4 # 7 H2O 0.5% methanol The pH of the nutrient solution will be with half-concentrated phosphoric acid adjusted to 6.5. Then sterilized one at 1200C and 1.4 atm for 20 minutes. After sterilization, the pH is 6.7. Methanol is added separately.

Anschließend wird die Kultur 24 bis 36 Stunden lang bei 35°C unter Belüftung von 1,1 vvm bei einem Druck von 0,3 atü unter Rühren mit 2 Rührern mit 250 Upm fermentiert. Wahrend der logaritmiwschen Phase der Fermentation wird eine Konzentration von Methanol zwischen 50 und 120 ppm eingehalten, in dem bei einer Verminderung des Kühlendioxidausstoßes weitere Anteile Methanol zugegeben werden, bis der Kohlendioxidausstoß wieder ansteigt. Der pH-Wert wird durch Zugabe steriler HCl zwischen 7,9 und 8,4 gehalten. Das Fortschreiten des Verfahrens und der Zeitpunkt seiner Beendigung werden wie in Beispiel l angegeben bestimmt.The culture is then kept at 35 ° C for 24 to 36 hours Aeration of 1.1 vvm at a pressure of 0.3 atü while stirring with 2 stirrers Fermented at 250 rpm. During the logarithmic phase of fermentation, a Concentration of methanol between 50 and 120 ppm complied with, in which at a Reduction of the cooling dioxide emissions, further proportions of methanol are added, until the carbon dioxide emissions rise again. The pH becomes more sterile by adding HCl kept between 7.9 and 8.4. The progress of the procedure and the timing its termination are determined as indicated in Example I.

Die so erhaltene Kultursuspension wird als Impfmaterial für einen 2000 1 fassenden Fermentationskessel verwendet. Die Nährlösung hat die gleiche Zusammensetzung und den gleichen pH-Wert wie vorstehend für. die zuletzt geschilderte Fermentation angegeben. Der Fermentationsreaktor wird 20 Minutert lang bei 12000 und 1,4 atü unter Rühren mit 210 Upm sterilisiert Nach der Sterilisation betrugt der pH-Wert 6,8.The culture suspension thus obtained is used as an inoculum for a 2000 1 fermentation kettle used. The nutrient solution has the same composition and the same pH as above for. the fermentation described last specified. The fermentation reactor is 20 minutes at 12000 and 1.4 atm Sterilized with stirring at 210 rpm. After the sterilization, the pH was 6.8.

Die anschließende Fermentation wird bei 35°C, Belüftung mit 0,6 rnn, einem Druck von 0,3 atü und 2 Rührern mit 210 Upm durchgeführt. Der pH-Wert wird während der Fermentation mit steriler HCi zwischen 7,9 und 8,4 gehalten.The subsequent fermentation is carried out at 35 ° C, aeration at 0.6 mm, carried out a pressure of 0.3 atü and 2 stirrers at 210 rpm. The pH will be Maintained between 7.9 and 8.4 during the fermentation with sterile HCl.

Das Fortschreiten des Verfahrens wird durch Probe entnahmen zur Prüfung der Sterilität, zur pH-messung, zur Bestimmung des Trockengewichts und des Stickstoffs der Bakterienzellmasse überwacht.The progress of the process is indicated by taking samples for testing sterility, pH measurement, determination of dry weight and nitrogen the bacterial cell mass monitored.

Die Konzentration an Methanol wird während der logarithmischen Wachstumsphase zwischen 10 und 150 ppm gehalten und wie vorstehend beschrieben nach maßgabe des Konlendioxidausstoeu ergänzt.The concentration of methanol is during the logarithmic growth phase held between 10 and 150 ppm and as described above according to the Konlendioxidausstoeu supplemented.

Nach Beendigung der logarithmischen Wachstumsphase wird die Kultursuspension kurze Zeit auf 55°C erhitzt unX dann auf 180C gekühlt. Der pH-Wert liegt zwischen 8,0 und 8,5.After the logarithmic growth phase has ended, the culture suspension becomes Heated to 55 ° C for a short time and then cooled to 180 ° C. The pH is between 8.0 and 8.5.

2000 1 der so erhaltenen Kultursuspension mit einem Gehalt.2000 1 of the culture suspension thus obtained with a content.

von 20 g pro 1 Trockenmasse werden in einer Röhrenzentrifuge bei 15 000 g mit einem Durchsatz von 400 l/h zentrifugiert.of 20 g per 1 dry matter are placed in a tube centrifuge at 15 Centrifuged 000 g with a throughput of 400 l / h.

Die so abgetrennten feuchten Bakterienzellen werden in entsalztem Wasser zu einer Suspension mit einem Gehalt von 10 bis 15 Gewichts.-% Trockenmasse aufgeschwemmt und in einem geeigneten Behälter bei 15 bis 18°C kräftig gerührt. Dabei werden während etwa einer Stunde Begleitstoffe und Bestandteile der Nährlösung herausgewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren wird mit entsalztem Wasser eie 20 bis 25 Gewichts-%ige Bakteriensuspension hergestellt, diese unter den-gleichen Bedingungen gerührt und wieder zentrifugiert. Die so gewaschenen Bakterienzellen werden zu einer 40 bis 50 Gewichts-%igen Suspension aufgeschwemmt und der Sprübtrocknung unterworfen.The moist bacterial cells separated in this way are then desalinated Water to a suspension with a content of 10 to 15 wt .-% dry matter Suspended and stirred vigorously in a suitable container at 15 to 18 ° C. Accompanying substances and components of the nutrient solution are removed for about an hour washed out. After centrifuging again, a 20 up to 25% by weight bacterial suspension produced, this under the same conditions stirred and centrifuged again. The bacterial cells washed in this way become one 40 to 50% by weight suspension floated and subjected to spray drying.

Man erhält so 37 kg eines hellen, geruchlosen Zallproduktes, das 73,7 Gewichts-% Rohrprotein, 61,0 Gewichts-% Aminosäuren - davon 49,0 Gewichts-% essentielle Aminosäuren - ferner 10,5 Gewichts-% Nukleinsäuren enthält.This gives 37 kg of a light-colored, odorless zinc product which is 73.7 Weight-% tube protein, 61.0 weight-% amino acids - of which 49.0 weight-% essential Amino acids - also contains 10.5% by weight nucleic acids.

Claims (9)

Patentansprüche:Patent claims: 1. Verfahren zur Herstellung von Protein aus Bakterien mit Methanol als Kohlenstoff-Quelle und einer Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen bei eine pH-Wert zwischen 4,0 und 9,0, durch gekennzeichnet, daß man Bakterienstänime der Gattungen Bacillus, Pseudomonas und Flavobacterium, deren Mutanten oder Varianten so fermentiert, daß die Konzentration an Methanol in der Phase des logarithmischen Wachstums der Bakterienzellen zwischen 10 und 150 ppm, vorzugsweise zwischen 50 - 100 ppm, bezogen auf die Kultursuspension liegt.1. Process for the production of protein from bacteria with methanol as a carbon source and a nitrogen source under aerobic conditions a pH value between 4.0 and 9.0, characterized in that one bacterial strains of the genera Bacillus, Pseudomonas and Flavobacterium, their mutants or variants fermented so that the concentration of methanol in the phase of logarithmic Growth of the bacterial cells between 10 and 150 ppm, preferably between 50 - 100 ppm, based on the culture suspension. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Methanol zwischen iO und 150 ppm liegt.2. The method according to claim l, characterized in that the concentration of methanol is between OK and 150 ppm. 3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultursuspension mit 0,3 bis 0,6 Volumen Luft pro Volumensuspension und Minute belüftet wird.3. Process according to Claims 1 and 2, characterized in that the culture suspension with 0.3 to 0.6 volumes of air per volume suspension per minute is ventilated. 4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultursuspension mit 50 bis 210 Umdrehungen pro Minute gerührt wird.4. Process according to Claims 1 to 3, characterized in that the culture suspension is stirred at 50 to 210 revolutions per minute. 5. Verfahren nach Ansprüchen l bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation in einem Kessel durchgeführt wird, d wenigstens 2 Lochscheibenrührer enthält, wobei das Verhältnis von Rührerdurchmesser zu Kesseldurchmesser zwischen 0,35 und 0,65 liegt und wobei der Abstand zwischen 2 Rührern einen Rührerdurchmesser beträgt.5. Process according to Claims l to 4, characterized in that the fermentation is carried out in a kettle, d at least 2 perforated disc stirrers contains, the ratio of stirrer diameter to bowl diameter between 0.35 and 0.65 and the distance between 2 stirrers being one stirrer diameter amounts to. 6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation i Reaktoren durchgeführt wird, die sowohl mechanisch, hydrodynamisch und pneumatisch umgowälzt werden können.6. Process according to Claims 1 to 5, characterized in that the fermentation is carried out in reactors, both mechanical, hydrodynamic and can be pneumatically circulated. 7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gakennzeichnet, d-al3 Pseudomonas species, deren Mutanten oder Varianten verwendet werden.7. The method according to claims 1 to 6, characterized in that d-al3 Pseudomonas species, the mutants or variants of which are used. 8. Verfahren nach Ansprüchen l bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus species, deren Mutanten oder Varianten verwendet werden.8. The method according to claims l to 6, characterized in that Bacillus species, the mutants or variants of which are used. 9. Verfahren nach Ansprüchen l bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Flavobacterium species, deren Mutanten oder Varianten verwendet werden.9. The method according to claims l to 6, characterized in that Flavobacterium species, the mutants or variants of which are used.