DE2314984A1 - Verfahren zur herstellung von proteinhydrooysat mit hohem gehalt an freien aminosaeuren und dessen verwendung als wuerze oder lebensmittelzusatz - Google Patents

Verfahren zur herstellung von proteinhydrooysat mit hohem gehalt an freien aminosaeuren und dessen verwendung als wuerze oder lebensmittelzusatz

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DE2314984A1 DE19732314984 DE2314984A DE2314984A1 DE 2314984 A1 DE2314984 A1 DE 2314984A1 DE 19732314984 DE19732314984 DE 19732314984 DE 2314984 A DE2314984 A DE 2314984A DE 2314984 A1 DE2314984 A1 DE 2314984A1
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Description

2314384
POS- 30 011
KIKKOMAN SHOYU CO., LTD.,
Noda, Japan
11 Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysat mit hohem Gehalt an freien Aminosäuren und dessen Verwendung als V/ürze oder Lebensmittelzusatz
Priorität: 27. März 1972, Japan, Nr. 29 825/72
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysat mit einem hohen Gehalt an freien Aminosäuren und somit verbessertem Aroma.
Proteinhydrolysat ist ein in der pharmazeutischen und der Lebensmittelindustrie viel verwendetes Produkt. Bei seiner Verwendung als Würze oder V/ürzmittelbestandteil in der Lebensmittelindustrie Ist ein möglichst hoher Gehalt an freien Aminosäuren, wie Glutaminsäure, wünschenswert, da diese eine ausgeprägte Aromasteigerung bewirken.
Die Hydrolyse von Eiweißstoffen wird entweder mit Säuren oder . enzymatisch unter Verwendung eines proteolytischen Enzympräparats bzw. einer Aspergillus-Kultur durchgeführt, wobei das letztere Verfahren eine bessere Produktqualität ermög.licht.
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Andererseits ist bekannt, daB bei Verwendung proteolytischer Enzympräparate Hydrolysate mit einem niedrigen Verhältnis von freien Aminosäuren zu insgesamt in Form löslicher Verbindungen vorliegendem Stickstoff (im folgenden: Aminosäureverhältnis) entstehen. Um die Eiweißstoffe im erforderlichen Ausmaß enzymatisch abzubauen, ist es daher erforderlich, proteolytische Enzyme mit breiter Substratspezifität oder eine Vielzahl von Enzymen mit verschiedener Substratspezifität einzusetzen. Da jedoch übliche Enzympräparate weder Enzyme mit breiter Substratspezifität noch eine Vielzahl von Enzymen in ausreichender Menge enthalten, galt bisher ein niederes Aminosäureverhältnis als unabdingbarer Nachteil der enzymatischen Hydrolyse.
Das sogenannte Koji-Verfahren ermöglicht dagegen ein im Vergleich zu proteolytischen Enzymen hohes Aminosäureverhältnis. Es handelt sich hierbei um eine Abwandlung des enzyraatischen Verfahrens, bei dem Eiweißstoffe mit Hilfe von Koji hydrolysiei'-t werden, das durch Züchten einer zur Produktion von proteolytischen Enzymen befähigten Aspergillus-Kultur auf einem damit beimpften Proteinsubstrat, z.B. Sojasud, hergestellt wurde. Das Aminosäureverhältnis des auf diese Weise hergestellten Produkts liegt jedoch immer noch zu niedrig.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysat mit einem hohen Gehalt an freien Fettsäuren und daher verbessertem Geschmack zu schaffen.
Es wurde gefunden, daß aus Sojamaische oder anderen Nährböden isolierte, salzresistente Milchsäurebakterien bei Anwesenheit von Natriumchlorid in hohen Konzentrationen, also z.B. in Soja-
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sud, das von den proteolytischen Enzymen erzeugte und im Proteinhydrolysat enthaltene Protein-Teilhydrolysat (durch übliche proteolytische Enzyme nicht hydrolysierbare Peptide) nicht weiter hydrolysieren. Dagegen entfalten diese Bakterien in Abwesenheit oder in Gegenwart von höchstens 12 Gewichtsprozent Natriumchlorid ausgeprägte hydrolytische Wirkung und bauen das Teilhydrolysat zu freien Aminosäuren ab.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Proteinliydrolysat mit hohem Gehalt an freien Aminosäuren durch Hydrolyse von -Eiweißstoffen mit Hilfe proteolytischer Enzyme, das dadurch gekennzeichnet' ist, daß man das Hydrolysesystem, das gegebenenfalls, bezogen auf das Volumen des wäßrigen Mediums, bis zu 12 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthält, mit salzresistenten Milchsäurebakterien beimpft und diese darin züchtet oder mit Zellen dieser Bakterien in Berührung bringt.
Als Eiweißstoffe sind im Verfahren der Erfindung beliebige pflanzliche Eiweißstoffe, z.B. Sojabohnen oder Weizenkleber, tierische Eiweißstoffe, z.B. Milcnqasein, Fischmehl oder Rindfleisch, und eiweißhaltige Mikroorganismen, z.B. Hefe, geeignet.
Die Hydrolyse dieser Materialien erfolgt auf übliche Weise mit Hilfe proteolytischer Enzyme; vgl. z.B. K. Mogi, "Journal of Fermentation Technology" Bd. 36 (1958), S. 125. Die Eiweißstoffe können etwa auf geeignete V/eise denaturiert und hierauf durch Zusatz eines geeigneten proteolytischen Enzyms hydrolysiert werden oder aber man beimpft den denaturierten Eiweißstoff mit einer zur Produktion von proteolytischen Enzymen befähigten Aspergillus-Kultur und fermentiert ihn zu Koji, das dann die Hydro -
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23
lyse bewirkt.
Als proteolytische Enzyme sind solche aus tierischen, pflanzlichen und mikrobiellen Quellen geeignet, jedoch verwendet man vorzugsweise hitze- und/oder säureresistente Enzyme, um die zur Hydrolyse erforderliche Zeit zu verkürzen. Spezielle Beispiele für geeignete proteolytische Enzyme sind die von Aspergillus z.B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus sojae, bzw. .Streptomyces, z.B. Streptomyces griseus, produzierten Enzyme sowie Pepsin und Papain.
Spezielle Beispiele für die im Verfahren der Erfindung eingesetzten salzresistenten Milchsäurebakterien sind im folgenden zusammengestellt: Bei den Hinterlegungsstellen ist "Ferm-P" das Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 5-chome 8-1, Inage, Chiba-shi, Japan; "ATCC" ist die American Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive Rockville, Maryland, V.St.A., "IAM" ist das Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo, Tokyo, Japan; "IFO" ist das Institute for Fermentation, Osaka, Japan; "AHU" ist die Faculty of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, Japan und "HD" ist das Institute of Medical Science, vormals Institute for Infectious Diseases, University of Tokyo, Tokyo, Japan:
Pediococcus halophilus (FERM-P Nr. 1414; ATCC 21786), Pediococcus sojae (IAM 1675; ATCC 13 621), Pediococcus sojae (IAM 1 681; ATCC 13 622), Pediococcus sojae (IAM 1 685; ATCC 13 623), Tetracoccus sojae (FERM-P Nr. 1401; ATCC 21 787), Streptococcus thermophilus (IAM 1 047), Streptococcus thermophilus (ATCC 19 282), Streptococcus lactis (IFO 3 434) ,
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Streptococcus lactis (AHU 1 091), Streptococcus lactis (HD 7 963) und Streptococcus lactis (ATCC 19 435).
Die vorstehenden salzresistenten Milchsäurebakterienstämme, sind gegenüber einer Natriumchloridkonzentration von mindestens 10 Prozent, bezogen auf das Volumen eines wäßrigen Mediums, resistent, und können in einer derartigen Natriumchloridlösung wachsen. Die mycologischen Eigenschaften der Bakterienstämme sind im einzelnen in folgenden Literaturstellen beschrieben: A. Nakagawa, K. Kitahara, J. Gen. Appl. Microbiol., Bd. 5 (1959), S. 95, (Pediococcus halophilus); Kenji Sakaguchi, Bull. Agr. Ghem. Soc. Japan, Bd. 22 (1958), S. 353 (Pediococcus Sojae); Hakko Kogaku Zasshi, Bd. 39 (1961),S.36O (Tetracoccus Sojae); Bergey, Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage 1957 (Streptococcus thermophilus und Streptococcus lactis). Die mit "IAM"-Hinterlegungsnuramern gekennzeichneten Stämme finden sich im JFCC -Catalogue of Cultures, Zusatzausgabe 1966 der Japanese Federation of Culture Collection of Microorganisms, die mit "IFO11-, "AHU"- und "IID"-Hinterlegungsnummern gekennzeichneten Stämme finden sich im JFCC - Catalogue of Cultures, Zusatzauflage 1968 und die mit 11ATCC"-Hinterlegungsnummern gekennzeichneten Stämme sind im ATCC-Catalogue of Strains, 9. Auflage, 1970, beschrieben. Alle Stämme sind der Öffentlichkeit zugänglich.
Neben den vorstehend genannten salzresistenten Milchsäurebakterien sind im Verfahren der Erfindung all jene Bakterien verwendbar, die den Gehalt des von proteolytischen Enzymen erzeugten Proteinhydrolysats bei einem Gehalt von gegebenenfalls bis zu 12 Gewichtsprozent Natriumchlorid, bezogen auf das Volumen
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des wäßrigen Mediums, zu steigern vermögen. Salzresistente Bakterien, die gegenüber Natriumchlorid in einer Konzentration von mindestens 10 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen eines wäßrigen Mediums, resistent sind und in dieser Natriumchloridlösung wachsen können, sind hierbei besonders bevorzugt.
Unter den salzresistenten Milchsäurebakterien sind aus Sojamaische isolierte b2W.hitzeresistente Stämme besonders bevorzugt.
Im Verfahren der Erfindung beimpft man das Proteinhydrolysesystem mit den salzresistenten Milchsäurebakterien und züchtet diese darin oder aber man versetzt das System mit einer großen Zellmenge der Bakterien. Die Beimpfung und Züchtung der salzresistenten Michsäurebakterien bzw. die Zugabe von Zellen kann entweder vor oder nach vollständiger Hydrolyse der .Eiweißstoffe durch das proteolytische Enzym erfolgen. Der Zeitpunkt hängt in erster Linie von den Hydrolysebedingungen, z.B. der Temperatur und dem p^-Wert, ab; vorzugsweise setzt man die Bakterien nach im wesentlichen beendeter Hydrolyse der Eiweißstoffe durch die proteolytischen Enzyme ein.
Im Verfahren der Erfindung ist es erforderlich, die Natriumchloridkonzentration im Proteinhydrolysesystera im Bereich von 0 bis 12 Gewichtsprozent des wäßrigen Mediums zu halten.
Aus den folgenden Versuchen geht die Abhängigkeit des Gehalts an freien Aminosäuren im Proteinhydrolysat von der angewandten Natriumchloridkonzentration hervor.
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Versuch 1
Entfettete Sojabohnen, die vorher denaturiert wurden, werden mit Hilfe eines proteolytischen Enzympräparats, das durch Trocknen des beim Versetzen eines wäßrigen Weizenkleie-Roji-Extrakts mit der dreifachen Volumenmenge Äthanol entstandenen Niederschlags hergestellt worden ist, auf übliche Weise hydrolysiert. Hierbei entsteht ein Proteinhydrolysat mit einem Gesamtgehalt an "gelöstem"Stickstoff (TN) von 2,0 Prozent (G/V), einem Gehalt an freien Aminosäuren, ausgedrückt als Aminostickstoff (AN), von 0,86 Prozent (G/V) und einem Aminosäureverhältnis (AN/TN) von 0,43. Der Aminostickstoff ergibt sich aus der Differenz des nach der Conway-Mikrodiffusionsmethode bestimmten Ammoniumstickstoffs und des durch Formoltitration bestimmten Formolstickstoffs. Der Gesamtgehalt an Stickstoff wird nach der Kjeldahl-Methode bestimmt; vgl. I. Umeda, "Shoyu" Sankyo Shuppan Co., Tokyo (1961), S. 138.
Das' erhaltene Proteinhydrolysat wird dann 5 Minuten auf 900C erhitzt, um das proteolytische Enzym zu desaktivieren, und filtriert. Man versetzt das klare Filtrat mit verschiedenen Mengen Natriumchlorid und erhält so Proteinhydrolysatiösungen (ρττ 6,0) mit den in Tabelle I genannten Natriumchloridkonzentrationen. Jede der Lösungen wird mit Pediococcus sojae (IAM 1673; ATCC 13621) beimpft und 10 Tage bei 2.0 bis 300C bebrütet. Die erzielte prozentuale Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren (AN) ist in Tabelle I angegeben. Auch nach längerem Stehen der beimpften und bebrüteten Proteinhydrolysatlösung bleibt die prozentuale Steigerung des Gehalts an freien Aminosäuren im wesentlichen gleich.
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INSPECTED
2"-
' Tabelle I
NaCl-Konzen-
tration,
% (G/V)		 0 3,5 . 7,0 10,-5 12,0 13,0 14,0 15,0
Zunahme des
Gehalts an
freien Amino
säuren, % 		22,5 16,0 18,0 20,0 16,0 4,0 4,0 2,0
Versuch 2
Eine wie im Versuch 1 hergestellte klare Proteinhydrolysatlösung wird mit verschiedenen Mengen Natriumchlorid versetzt, so daß Proteinhydrolysatesungen (p„ 6,0) mit den in Tabelle II gezeigten Natriumchioridkonzentrationen entstehen. Jede der Lösungen wird pro ml mit 10 Zellen von Pediococcus sojae (IAM 1673; ATCC 13621) versetzt, die 120 Stunden bei 300C in einem Nährmedium aus 1,0 Prozent (G/V) Glucose, 0,5 Prozent (G/V) Pepton,'0,5 Prozent (G/V) Hefeextrakt und der in Tabelle II genannten Natriumchloridkonzentration gezüchtet worden sind Die Lösung wird 5 Stunden unter langsamem Rühren bei 45°C gehalten, so daß eine gleichmäßige Verteilung der Zellen gewährleistet ist. Die erzielte prozentuale Zunahme des Gehaltes an freien Aminosäuren (AN) ist in Tabelle II wiedergegeben. Auch nach längerem Stehen der Proteinhydrolysatlösung bleibt die prozentuale Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren im wesentlichen gleich.
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Tabelle II
23 -ί -.
NaCl-Konzen
trati ση,
% (G/V)		 0 3,5 7,0 10,5 12,0 13,0 I
15,0
Zunahme des Ge
halts an freien
Aminosäuren, % 		19,0 18,0 17,2 18,0 16,0 4,0 2,0
Versuch 3
Gemäß Versuch 1 wird die prozentuale Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren ermittelt, jedoch werden die in Tabelle III genannten Bakterienstämme eingesetzt und die ebenfalls angegebenen Natriumchloridkonzentrationen der Proteinhydrolysatlösung angewandt. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt. Auch nach längerem Stehen der Proteinhydrolysatlösung ist in etv/a dieselbe prozentuale Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren festzustellen.
Tabelle III
Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren, %
Bakterienstamm "~"~~~—-—-__^___^ 0 VJl 10 12 , ,,
15
Pediococcus halophilus
(FEHM-P Nr. 1414~; ATCC 21786)		 25 20 18 13 3
Tetracoccus sojae
(FfJRM-P Nr. 1401; ATCC 21787)		 22 20 18 13 2
Stret>tococcus thermophilus
(ATCC 19282)		 15 15 13 10 0
Streptococcus lactls
(ATCC 19435)		 14 16 15 11
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ORJGlNAL (NSPECTED
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-IC-
Aus den Versuchen 1 bis 3 geht hervor, daß bei der Überimpfung und Züchtung von salzresistenten Milchsäurebakterien bzw. beim Vermischen dieser Bakterien mit einem unter Verwendung proteolytischer Enzyme erhaltenen Proteinhydrolysat nur dann eine Steigerung des Gehalts an freien Aminosäuren zu beobachten ist, wenn die Natriumchloridkonzentration im Hydrolysat innerhalb des Bereiches von 0 bis 12 Prozent (G/V) liegt. Bei Natriumchlor i dkonz entrationen oberhalb dieser Grenze lassen sich keine befriedigenden Ergebnisse erzielen. Dasselbe gilt für den Fall, daß salzresistente Milchsäurebakterien vor im wesentlichen beendeter Hydrolyse in das Reaktionsgemisch überimpft und dort gezüchtet werden, bzw. Bakterienzellen mit dem Reaktionssystem vermischt werden.
Die vox" im wesentlichen beendeter Hydrolyse in das Reaktionsgemisch bzw. nach praktisch vollständiger Hydrolyse in das Hydrolysat überimpften salzresistenten Milchoäurebakterien werden im Verfahren der Erfindung im allgemeinen 1 bis '15 Tage bei Temperaturen von 15 bis 600C und einem pH~¥ert von 5 bis 8, vorzugsweise 5,5 bis 7,0, gezüchtet. Die Züchtung erfolgt hierbei auf übliche Weise, z.B. in Rührfermentern oder als Schüttelkultur, aerobe Kultur oder stationäre Kultur.
Vermischt man das Reaktionsgemisch vor im wesentlichen beendeter Hydrolyse bzw. das Hydrolysat nach praktisch vollständiger Hydrolyse mit Zellen der salzresistenten Milchsäurebakterien, so ist eine separate Züchtung der Bakterien erforderlich. In diesem Fall kommt als Kulturmedium entweder die genannte Protcinhydrolysatlösung oder ein anderes übliches Kulturmedium für _Milchsäurebakterien in Frage. Derartige Medien enthalten z.B. :-·ν^ϊ-Λ",ί JJflM 2 ; 1 ° 8 S ORIGINAL iNSPEOTE©
23 U :34 - 11 -
eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Fructose, Mannose, Maltose oder Dextrin, eine Stickstoffquelle, wie Pepton, Casein- Aminosäuren, Fleischextrakt oder Hefeextrakt, und andere Bestandteile, z.B. anorganische Phosphate, anorganische Calciumsalze, Vitamine, Wachstumsstimulantien und Natriumchlorid. Während der Züchtung wird die Natriumchloridkonzentration vorzugsweise bei 12 Prozent (G/V) oder niedriger gehalten; der Pjr-Wert liegt vorzugsweise im Bereich von 6,0 bis 8,0. Die Züchtung erfolgt . unter den für Milchsäurebakterien üblicherweise angewandten Bedingungen, z.B. unter leichtem Rühren ohne Belüftung oder durch 2- bis 7-tägiges Stehenlassen bei 15 bis 600C.
Nach beendeter Aufzucht werden die Zellen auf übliche Weise abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren. Gegebenenfalls erfolgt die Abtrennung unter sterilen Bedingungen: außerdem können die Bakterienzellen mit Wasser nachgewaschen v/erden.
Die abgetrennten Zellen der salzresistenten Milchsäurebakterien werden dem Reaktionsgemisch vor im wesentlichen beendeter Hydrolyse bzw. dem Hydrolysat nach praktisch vollständiger Hydrolyse vorzugsweise in einer Menge zugegeben, daß das Medium pro ml etwa 108 bis 1010 Zellen enthält.
Nach Versetzen des Mediums mit den Bakterienzellen rührt man das Gemisch 10 bis 72 Stunden bei 15 bis 6O0C mit Hilfe einer geeigneten Vorrichtung und sorgt so für ein gründliches Durchmischen. Der P1J wird hierbei im Bereich von 5»0 bis 8,0 gehalten.
Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsgemisch als solches oder nach Abtrennen der Zellen eingeengt und gegebenenfalls pulverisiert. Das erhaltene Produkt dient als Würze oder als Zu-
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KS INSPECTED
23; ■
satz bei der Lebensmittelverarbeitung. ■
Das im Verfahren der Erfindung erhaltene Proteinhydrolysat zeigt sowohl bei der Beimpfung und Züchtung mit salzresistenten Milchsäurebakterien als auch- beim Vermischen mit den Bakterienzellen eine Steigerung des Aminosäureverhältnisses (AN/TN) von 10 bis 25 Prozent. Ein derartig hoher Gehalt an freien Aminosäuren läßt sich durch übliche enzymatische Hydrolyse nicht erreichen. Das erfindungsgemäße Proteinhydrolysat ist daher im Aroma den bekannten - Produkten überlegen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
4 kg thermisch denaturierte entfettete Sojabohnen werden mit 1 kg Weizenkleie-Koji, das auf übliche Weise aus Aspergillus oryzae hergestellt worden ist, und 25 Liter Leitungswasser versetzt. Durch 15-stündiges Rühren bei 55 bis 6Ö°C wird die Hydrolyse durchgeführt. Hierauf filtriert man das Hydrolysat, wobei eine klare Lösung mit einem Gesamtstickstoffgehalt (TN) von 1,01 Prozent (G/V) und einem Verhältnis von Aminostickstoff zu Gesamtstickstoff (AN/TN) von 0,42 anfällt.
1 Liter des Hydrolysats wird bis zu einer Konzentration von 7,5 Prozent (G/V) mit Natriumchlorid versetzt. Man stellt einen pH-Wert von 6,0 ein und sterilisiert 10 Minuten bei 1200C. Dann wird die Hydrolysatlösung mit 10 ml einer Kulturflüssigkeit beimpft, die durch Züchtung von Pediococcus halophilus (FERM-P Nr. 1414; ATCC 21786), eines aus Soja isolierten Milchsäurebakteriums, in einem verdünnten Soja-Fermentationsmedium hergestellt worden ist, das 5,0 Prozent (G/V) Natriumchlorid
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23U ";34
enthält und einen Gesamtstickstoffgehalt (TN) von 0,4 Prozent (G/V) aufweist. Die "beimpfte Hydrolysatlösung wird anschließend als stationäre Kultur bei 300C bebrütet. Nach 12 Tagen weist die Hydrolysatlösung ein Aminosäureverhältnis (AN/TN) von 0,52 und damit eine prozentuale Steigerung des Gehalts an freien Aminosäuren von 23,8 Prozent auf. Das erhaltene Proteinhydrolysat besitzt ein gegenüber bekannten Produkten kräftigeres Aroma.
Zum Vergleich wird das vorstehende Proteinhydrolysat auf gleiche Weise behandelt und 12 Tage bei 30°C stehengelassen, jedoch nicht mit dem salzresistenten Milchsäurebakterium beimpft. Das Äminosäureverhältnis (AN/TN) des erhaltenen Proteinhydrolysats unterscheidet sich nicht von dem der klaren Hydrolysatlösung unmittelbar nach der Hydrolyse.
Beispiel2
500 g handelsüblicher Weizenkleber der Shinshin Shokuryo Co. wird mit 10 g eines proteolytischen Enzympräparats und 5 Liter Leitungswasser versetzt. Das trockene pulverförmige Enzympräparat wird aus 7/eizenkleie-Koji gewonnen, indem man einen wäßrigen Extrakt des aus Aspergillus oryzae hergestellten Weizenkleie-Koji mit dem dreifachen Volumen Äthanol versetzt und den entstandenen Niederschlag trocknet. Die Hydrolyse erfolgt durch 12-stündiges Rühren des Gemisches bei 55 bis 600C. Anschließend zentrifugiert man die unlöslichen Bestandteile ab und erhält so eine klare Hydrolysatlösung, mit einem Gesamtstickstoffgehalt von 1,15 Prozent (G/V) und einem Aminosäureverhältnis (AN/TN) von 0,41. Nach Einstellen des pH~Werts auf 6,5 und Sterilisation des Gemisches wird 1 Liter der Hydrolysatlösung mit 10 ml einer Kulturflüssigkeit beimpft, die durch Züchtung von
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ORIGINAL INSPECTED
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Pediococcus sojae (IAM 1673; ATCC 13621) in einer Nährflüssigkeit hergestellt worden ist, welche 1,0 Prozent (G/V) Glucose, 0,5 Prozent (G/V) Pepton und 0,5 Prozent (G/V) Hefeextrakt enthält. Die beimpfte Hydrolysatlösung wird 2 Wochen bei 25°C bebrütet. Das Aminosäureverhältnis (AN/TN) der Hydrolysatlösung steigt hierbei auf 0,49, was einer prozentualen Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren von 19,5 Prozent entspricht. Das Proteinhydrolysat besitzt einen ausgezeichneten Geschmack.
Zum Vergleich wird das vorstehende Proteinhydrolysat auf die gleiche Weise behandelt und 2 Wochen bei 25°C stehengelassen, jedoch nicht mit dem salzresistenten Milchsäurebakterium beimpft. Das Aminosäureverhältnis (AN/TN) des erhaltenen Proteinhydrolysats unterscheidet sich nicht von dem der klaren Hydroiysatlösung unmittelbar nach der Hydrolyse.
Beispiel 3
In einer 2prozentigen (G/V) Lösung von Milchcasein der Merck Co. (pH 7,0)
/wird ein proteolytisches Enzym ("Pronase" der Kaken Chemical Co.) bis zu einer Konzentration von 2000 Einheiten/ml gelöst. Man
-führt die Hydrolyse 10 Stunden bei 45°C durch und erhält so eine Hydrolysatlösung mit einem Gesamtstickstoffgehalt (TN). von 0,28 Prozent (G/V) und einem Aminosäureverhältnis (AN/TN) von 0,36. Nach Einstellen des ppj-Werts auf 6,5 und Sterilisieren des Gemisches werden 100 ml der Hydrolysatlösung mit'zwei Platinschleifen voll Zellen von Pediococcus sojae (TAM 1685; ATCC 13623) beimpft und 10 Tage stationär bei 300C bebrütet. Nach beendeter Bebrütung weist die Hydrolysatlösung ein Aminosäure verhältnis (AN/TN) von 0,45 auf und besitzt einen ausgezeichneten Geschmack.
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Zum Vergleich wird die vorstehende Hydrolysatlösung auf dieselbe Weise behandelt und 10 Tage bei 300C stehengelassen, jedoch nicht mit dem salzresistenten Milchsäurebakterium beimpft. Das Aminosäureverhältnis (AN/TN) der erhaltenen Hydrolysatlösung unterscheidet sich nicht von dem der Hydrolysatlösung unmittelbar nach der Hydrolyse.
Beispiel 4
1 Liter einer Weizenkleber-Hydrolysatlösung mit einem Gesamtstickstoff gehalt (TN) von 1,15 Prozent (G/V), die gemäß Beispiel
2 hergestellt worden ist und eine Natriumchloridkonzentration von 5,0 Prozent (G/V) aufweist, wird mit Zellen von Tetracoccus sojae (PERM-P Nr. 1401; ATCC 21787) versetzt, die durch Züchtung in einem Nährmedium aus 1,0 Prozent (G/V) Glucose, 0,2 Prozent (G/V) Fleischextrakt, 0,5 Prozent (G/V) C-.aseinaminosäure und 0,5 Prozent (G/V) Hefeextrakt erhalten worden
ist, so daß die Hydrolysatlösung pro ml 10 Zellen enthält. Dieses Gemisch wird 10 Stunden bei 45 C gerührt, um die Hydrolysatlösung gründlich mit den Zellen zu durchmischen. Im Anschluß an diese Behandlung weist die Hydrolysatl'ösung ein Aminosäureverhältnis (AN/TN) von 0,47 auf, was einer prozentualen Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren von 14,6 Prozent entspricht. Man trennt die Zellen von der Hydrolysatlösung ab, konzentriert diese und erhält durch Sprühtrocknen 120 g einer pulverförmigen Würze von ausgezeichnetem Geschmack.
Zum Vergleich wird eine Weizenkleber-Hydrolysatlösung auf dieselbe Weise behandelt und 10 Stunden bei 450C gerührt, jedoch nicht mit Zellen des genannten salzresistenten Milchsäurebakteriums in Berührung gebracht. Die so erhaltene Hydrolysatlösung
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ORIGINAL INSPECTED
23H884
unterscheidet sich im Aminosäureverhältnis (AN/TN) nicht von der unmittelbar nach der Hydrolyse entstandenen klaren Hydrolysatlösung.
Beispiel 5
10 g Fischmehl der Taiyo Fishery Co. werden mit 10 g eines aus Aspergillus oryzae hergestellten Weizenkleie-K'oji und 100 ml Leitungswasser versetzt. Nach Einstellen des pH~¥erts auf 6,0 wird das Gemisch 24 Stunden unter Rühren bei 55°C hydrolysiert. Nach Abtrennen der unlöslichen Bestandteile wird die erhaltene Hydrolysatlösung mit einem Gesamtstickstoffgehalt (TN) von 0,85 Prozent (G/V) und einem Aminosäureverhältnis (AN/TN) von 0,32 mit Zellen von Streptococcus thermophilus (IAM 1047) versetzt, die in dem Medium aus Beispiel 4 gezüchtet worden sind, so daß die Hydrolysatlösung pro ml 10 Zellen enthält. Das erhaltene Gemisch wird 6 Stunden bei 50 C gerührt, um die Lösung gründlich mit den Zellen zu durchmischen. Die auf diese Weise erhaltene Hydrolysatlösung weist ein Aminosäureverhältnis (AN/TN) von 0,40 auf, was einer prozentualen Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren von 25 Prozent entspricht, und besitzt einen ausgezeichneten Geschmack.
Zum Vergleich wird die vorstehende Proteinhydrolysatlösung auf dieselbe Weise behandelt und 6 Stunden bei 500C gerührt, jedoch nicht mit Zellen des genannten salzresistenten Milchsäurebakteriums" in Berührung gebracht. Das Aminosäureverhältnis (AN/TN) der so erhaltenen Proteinhydrolysatlösung unterscheidet sich nicht von dem der klaren Hydrolysatlösung unmittelbar nach der Hydrolyse.
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Beispiel 6
10 g handelsübliche Bäckerhefe ("Witten".trockene Hefe) werden mit 10 g eines aus Aspergillus oryzae hergestellten Weizenkleie-Koji und 100 ml Leitungswasser versetzt. Nach Einstellen des pH-Werts auf 6,0 wird das Gemisch 20 Stunden bei 55°C hydrolysiert. Nach dem Abtrennen unlöslicher Bestandteile weist die erhaltene Hydrolysatlösung einen Gesamtstickstoffgehalt (TN) von 0,65 Prozent (G/V) und ein Aminosäureverhältnis (AN/TN) von 0,43 auf. Man stellt hierauf den p^-Wert auf 6,5 ein, sterilisiert die Hydrolysatlösung und impft sie mit einer Platinschleife voll Tetracoccus sojae (FERM-P Nr. 1401; ATCC 21787). Nach 10-tägiger Bebrütung bei 300C beträgt das Aminosäureverhältnis (AN/TN) 0,54, was einer prozentualen Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren von 25,6 Prozent entspricht. Die bebrütete Hydrolysatlösung wird anschließend mit Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 18 Prozent (G/V) und hierauf mit Sojahefe versetzt. Man bebrütet die erhaltene Lösung 7 Tage bei 30 C und erhält so eine flüssige Würze mit So ja-ar tieren Aroma.
Zum Vergleich wird die vorstehende Hydrolysatlösung auf dieselbe Weise behandelt und 7 Tage bei 30 C stehengelassen, jedoch nicht mit der Reinkultur des genannten salzresistenten Milchsüurebakteriums beimpft. Das Aminosäureverhältnis (AN/TN) der entstandenen Hydrolysatlösung unterscheidet sich nicht von dem der klaren Hydrolysatlösung unmittelbar nach der Hydrolyse.
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Beispiel? ·
Ein Gemisch aus 10 g Fischmehl der Taiyo Fishery Co. und 10 g eines aus Aspergillus oryzae hergestellten Weizenkleie-Koji wird mit 100 ml Leitungswasser versetzt. Nach Zugabe von Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 6S5 Prozent (G/V) und Einstellen" des p-u-Werts auf G9O wird das Gemisch 17 Stunden unter Rühren bei 45 C hydrolysiert. Nach Abtrennen der unlöslichen Bestandteile weist die Hydrolysatlösung einen Gesamtstickstoff gehalt (TN) von 0,85 Prozent (G/V) und ein Aminosäureverhältnis (AN/IN) von 0,36 auf« Die Hydrolysatlösung wird mit Zellen von Tetracoccus sojae (FERM-P Nr. 1401; (ATCC 21787)
versetzt, so daß sie pro ml 10 Zellen enthält= Das Gemisch wird 10 Stunden bei 45°C gründlich durchmischt, worauf die Hydrolysatlösung ein Aminosäureverhältnis (AN/IN) von O545 aufweist, was einer prozentualen Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren von 25,0 Prozent entspricht. Nach Abtrennen der unlöslichen Bestandteile und der Bakterienzellen erhält man ein Proteinhydrolysat von ausgezeichnetem Geschmack.
Zum Vergleich wird die vorstehende Hydrolysatlösung auf dieselbe Weise behandelt und 10 Stunden bei 45°C gerührt, jedoch nicht mit Zellen des genannten salzresistenten Milchsäurebakteriums in Berührung gebracht. Das Aminosäureverhältnis (AN/tN) der entstandenen Hj^drolysatlösung unterscheidet sich nicht von dem der Hydrolysatlösung unmittelbar nach der Hydrolyse.
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Beispiele
Das Verfahren von Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch wird Streptococcus lactis(IFO 3434) anstelle von Pediococcus sojae eingesetzt. Das entstandene Proteinhydrolysat weist ein Aminosäureverhältnis (ΑΝ/ΤΝ) von 0,4? auf, was einer prozentualen Zunahme des Gehalts an freien Aminosäuren von 14,6 Prozent entspricht, und besitzt ein ausgezeichnetes Aroma.
Beispiel 9
In 10 Liter Leitungswasser werden 1 kg entfettete Sojabohnen suspendiert, die vorher thermisch denaturiert worden sind. Die Suspension wird mit 50 g des proteolytischen Enzympräparats aus Beispiel 2 sowie Zellen von Pediococcus sojae (IAM 1681; ATCC 13622) versetzt, die in dem Nährmedium aus Beispiel 2 gezüchtet worden sind, so daß die Suspension pro ml 10 Zellen enthält. Man bebrütet die Suspension 4 Tage unter leichtem Rühren bei 400C und zentrifugiert sie dann. Der erhaltene Überstand weist einen Gesamtstickstoffgehalt (TN) von 0,7 Prozent (G/V) und ein Aminosäureverhältnis (ΑΝ/ΤΝ) von 0,49 auf und besitzt einen ausgezeichneten Geschmack.
Im Gegensatz dazu weist eine Hydrolysatlösung mit einem Gesamtstickstoff gehalt (TN) von 0,7 Prozent (G/V), die. auf dieselbe Weise hergestellt worden ist, jedoch nicht mit Zellen von Pediococcus sojae versetzt wurde, ein Aminosäureverhältnis (ΑΝ/ΤΝ) von nur 0,42 auf.
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Claims (12)

2 3 ί ^ ,84 P a t e η t a η s p r ü c h e
1. Verfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysat mit hohem Gehalt an freien Aminosäuren durch Hydrolyse von Eiweißstoffen mit Hilfe proteolytischer Enzyme, dadurch ge k e η η zeichne t, daß man das Hydrolysesystem, das gegebenenfalls, bezogen auf das Volumen des wäßrigen Mediums, bis zu 12 Gewichtsprozent Natriumchlorid enthält, mit saizresistenten Milchsäurebakterien beimpft und diese darin züchtet oder mit Zellen dieser Bakterien in Berührung bringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hydrolysesystem nach praktisch vollständiger Hydrolyse der Eiweißstoffe mit den saizresistenten Milehsäurebakterien beimpft und diese darin züchtet bzw, mit Zellen dieser Bakterien in Berührung bringt,
3. Verfahren nach Anspruch Λ , dadurch gekennzeichnet, daß man salzresistente Milehsäurebakterien einsetzt, die gegen Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von mindestens 10 Prozent, bezogen auf das Volumen eines wäßrigen Mediums, resistent sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man salzresistente Milehsäurebakterien der Gattungen Pediococcus, Tetracoccus und/oder Streptococcus einsetzt, v
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man salzresistente Milehsäurebakterien der Arten Pediococcus halophilus, Pediococcus sojae, Tetracoccus sojae, Streptococcus thermophilus und/oder Streptococcus lactis einsetzt.
C31-:«:^N ::-,-^:λ ORRSiNAL
~ 21 -
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Pediococcus halophilus (FERM-P Nr. 1414; ATCC 21786) Pediococcus sojae (IAM 1673; ATCC 13621), Pediococcus sojae (IAM 1681; ATCC 13622), Pediococcus sojae (IAM 1685; ATCC 13623), Tetracoccus sojae (FERM-P Nr. 1401; ATCC 21787), Streptococcus thermophilus (IAM 1047), Streptococcus thermophilus (ATCC 19282), Streptococcus lactis (IFO 3434), Streptococcus lactis (AIIU 1091), Streptococcus lactis (HD 7963), und/oder Streptococcus lactis (ATCC 19435) als salzresistente Milchsäurebakterien einsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die salzresistenten Milchsäurebakterien 1 bis 15 Tage bei Temperaturen von 15 bis 6O0C und einem pjj-Wert von 5 bis 8 züchtet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hydrolysesystem 10 bis 72 Stunden bei Temperaturen von 15 bis 6O0C und einem p^-Wert von 5 bis 8 mit den salzresistenten Bakterien in Berührung bringt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen der salzresistenten Milchsäurebakterien in einer Menge zugibt, daß das Hydrolysesystem pro ml 10 bis 10 Zellen enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von Aspergillus oder Streptomyces produzierte Enzyme, Pepsin und/oder Papain als proteolytische Enzyme verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Sojabohnen, Veizenkleber, Milchcasein, Fischmehl, Rindfleisch und/oder Hefe als Eiweißstoffe verwendet.
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• - ■ 22 - '
12. Verwendung des im Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11 erhaltenen Proteinhydrolysats als Würze oder Lebensmittelzusatz.
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