DE19854973A1 - Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren - Google Patents

Abstract

Zubereitungen von Partikeln mit einer Glasoberfläche, wobei mehr als 75 Gew.-% dieser Partikel eine Korngröße von zwischen 0,5 und 15 mum haben sowie mit einer Glasoberfläche, welche einen Anteil von zwischen 2 und 6 Mol-% Zinkoxid enthält, haben sich als besonders vorteilhaft in Nukleinsäurereinigungsverfahren erwiesen. Insbesondere wird eine erhöhte Nukleinsäureausbeute erreicht.

Description

Gegenstand der Anmeldung ist eine Zubereitung von Partikeln mit einer Glasoberfläche, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zubereitung sowie ein Verfahren zur Reini­ gung von Nukleinsäuren mit Hilfe dieser Zubereitung.

Nukleinsäuren sind in jüngerer Zeit immer mehr in den Blickpunkt des Interesses der medizinischen Diagnostik gerückt. So wurden mittlerweile eine Vielzahl von Nachweisver­ fahren erarbeitet, bei denen die Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Nukleinsäuren als Anzeichen für eine Erkrankung bewertet wird. Hierzu gehören z. B. Nachweise infek­ tiöser Organismen, z. B. von Viren oder Bakterien in Körperflüssigkeiten, aber auch der Nachweis von Mutationen in genomischen Nukleinsäuren, z. B. in der Onkologie. Nuklein­ säuren liegen in dem üblicherweise verwendeten Probenmaterial jedoch in sehr geringen Konzentrationen vor. Aus diesem Grund wurden verschiedene Verfahren zur Isolierung der Nukleinsäuren von anderen Probenbestandteilen, wie Proteinen oder anderen zellulären Bestandteilen, die teilweise die anschließenden Nachweisverfahren stören, erarbeitet. Ein Teil dieser Verfahren verwendet festphasengebundene Fangsonden, die mit den abzu­ trennenden Nukleinsäuren hybridisieren können und diese an der Festphase zurückhalten, während die übrigen Probenbestandteile entfernt werden. Ein solches Verfahren ist bei­ spielsweise in EP-B-0 305 399 beschrieben. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß sie sich jeweils nur für die Reinigung von Nukleinsäuren mit einer ganz speziellen Nukleotidsequenz eignen.

In WO 91/12079 ist ein Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäuren mit Hilfe von Magnetpartikeln aus Zellulose und Eisenoxid beschrieben, wobei die Partikelgröße mit zwischen 1 und 10 µm angegeben ist. Diese Partikel enthalten keine Glasoberfläche und sind nur für eine Isolierung unter Präzipitation von Nukleinsäuren geeignet. Durch Aggre­ gation werden jedoch eine Vielzahl von Probenbestandteilen eingeschlossen, die spätere Verfahrensschritte stören.

In EP-B-0 389 063 wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem die Probe mit einem Ge­ misch eines chaotropen Guanidiniumsalzes und Silicapartikeln gemischt wird. Unter diesen Bedingungen binden Nukleinsäuren relativ sequenzunabhängig an die Silica-Oberfläche. Die übrigen Probenbestandteile können abgewaschen und die Nukleinsäuren anschließend eluiert werden.

In WO 96/41811 werden magnetische Partikel mit einer im wesentlichen porenfreien Glas­ oberfläche zur sequenzunabhängigen Reinigung von Nukleinsäuren beschrieben. Die dort verwendeten Partikel haben eine bevorzugte Korngröße von zwischen 10 und 60 µm.

In WO 96/41840 werden Pigmente beschrieben, die eine Glasoberfläche einer Dicke von mindestens 0,8 µm aufweisen. Als eine glasbildende Komponente werden auch Verbindun­ gen von Zink vorgeschlagen. Es entstehen dabei Pigmentpartikel mit einer Teilchengröße von vorzugsweise 2 bis 20 µm.

Es hat sich nun herausgestellt, daß bei den bisher beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Partikeln nach dem Sol-Gel-Prozeß, bei dem Kernpartikel einer vorgegebenen Größe mit einem Gel beschichtet werden und anschließend eine Verdichtung zu einer Glasober­ fläche stattfindet, ein hoher Anteil von Partikeln gebildet wird, die kein Kernpartikel ent­ halten. Dies führt entweder dazu, daß bei mit solchen Zubereitungen durchgeführten Nukleinsäurenachweisverfahren große Verluste an Nukleinsäuren stattfinden oder die Feinanteile zur Erhöhung der Ausbeute aufwendig abgetrennt werden müssen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, den vorliegenden Stand der Technik ganz oder teilweise zu verbessern, insbesondere Partikel mit einer relativ engen Korngrößenverteilung herzu­ stellen und die Ausbeute bei Nukleinsäurereinigung weiter zu erhöhen.

Gegenstand der Erfindung ist eine Zubereitung enthaltend Partikel mit einer Glasober­ fläche, wobei mehr als 75 Gew.-% dieser Partikel eine Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm haben.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung von Partikeln enthaltend einen Kern ummantelt mit einer Gelschicht oder einer Glasschicht und ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren mit Hilfe der erfindungsgemäßen Zu­ bereitung.

Als Partikel bezeichnet der Fachmann feste Materialien mit einem geringen Durchmesser. Bevorzugt haben diese Partikel eine im wesentlichen kugelige Oberfläche. Um für die Reinigung von Nukleinsäuren besonders gut geeignet zu sein, ist es wünschenswert, daß das Partikel einen Kern (Pigmentanteil) aufweist, der bevorzugt magnetisch ist und der mit einer Glasschicht ummantelt ist. Solche Kerne enthalten bevorzugt Metalloxide, wie Alu­ miniumoxid, Eisenoxid, Chromoxid, Kupferoxid, Manganoxid, Bleioxid, Zinnoxid, Titan­ oxid, Zinkoxid und Zirkoniumoxid. Die Zusammensetzung dieses Kerns ist für die er­ findungsgemäßen Partikel weniger wesentlich, da der Kern mit einer Glasoberfläche um­ mantelt wird, so daß der Kern nicht direkt mit der Probe, aus der die Nukleinsäure isoliert werden soll, in Berührung kommt. Solche Kerne sind kommerziell erhältlich. Sofern der Kern Fe₃O₄ (Magnetit) oder Fe₂O₃ (Maghämit) enthält, sind diese Kerne magnetisch.

Eine Glasoberfläche im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einem silizium­ haltigen amorphen Material. Das Glas enthält bevorzugt neben Siliziumoxid einen oder mehrere der folgenden Komponenten (in mol%):

B₂O₃ (0-30%), Al₂O₃ (0-20%), CaO (0-20%), BaO (0-10%), K₂O (0-20%), Na₂O (0-20%), MgO (0-18%), Pb₂O₃ (0-15%), ZnO (0-6%).

In geringerem Umfang von 0-5% können auch eine Vielzahl anderer Oxide, wie z. B. Na₂O, Mn₂O₃, TiO₂, As₂O₃, Fe₂O₃, CuO, ZrO₂, CoO usw. enthalten sein. Als besonders wirksam haben sich Oberflächen einer Zusammensetzung von SiO₂, B,O₃, Al₂O₃, CaO, K₂O, und ZnO erwiesen. Unter dem Gesichtspunkt der Ausbeute an Nukleinsäuren be­ sonders bevorzugte Borsilikatgläser haben einen Zinkoxidgehalt von 2-6, bevorzugt von ca. 4 mol%. Besonders bevorzugt besteht die Glasschicht aus 68-79 mol% SoO₂, 15-5 mol% B₂O₃, 6-2.5 mol% Gesamtmenge an K₂O und Na₂O, 4-1 mol% CaO, 8-2 mol% Al₂O₃, 6-2 mol% ZnO. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung sind Gläser, die durch den sogenannten Gel-Sol-Prozeß und anschließendes Trocknen und Verdichten der ge­ bildeten Schicht gebildet werden. Dieser Prozeß ist in seinen Grundzügen bekannt und wurde z. B. in C. J. Brinker, G. W. Scherer "Sol Gel science - The physics and chemistry of Sol Gel Processing", Academic Press Inc. 1990 und Sol-Gel Optics, Processing and Applications Lisa C. Klein Ed. Kluwer Academic Publishers 1994, Seite 450 ff. sowie in DE-A-19 41 191, DE-A-37 19 339, DE-A-41 17 041 und DE-A-42 17 432 beschrieben. Im Gel- Sol-Prozeß werden Alkoxide von netzwerksbildenden Komponenten, z. B. SiO₂, B₂O₃, Al₂O₃, TiO₂, ZrO, und ZnO zusammen mit Oxiden und Salzen anderer Komponenten, z. B. in alkoholischer Lösung, vorgelegt und hydrolysiert.

Durch die Zugabe von Wasser wird der Hydrolyseprozeß der Ausgangskomponenten in Gang gesetzt. Die Reaktion verläuft relativ rasch, da die Alkaliionen katalytisch auf die Hydrolysegeschwindigkeit des Kieselsäureesters einwirken. Nach Ablauf der Gelbildung kann das entstehende Gel getrocknet und durch einen thermischen Prozeß zu einem Glas verdichtet werden.

Das Mengenverhältnis Sol/Pigment hat einen erheblichen Einfluß auf die Ausbeute an er­ findungsgemäßen magnetischem Pigment. Grenzen sind dadurch gegeben, daß der Pigmentanteil so gering ist, daß eine noch pump- und sprühfähige Masse entsteht. Bei zu geringem Pigmentanteil wird der Feinanteil, z. B. von nicht-magnetischem Material zu groß und stört. Als im Hinblick auf die Pigmentausbeute zweckmäßige Mengenverhält­ nisse wurden 10 bis 45 g Pigment/100 ml Sol gefunden.

Die Aufschlämmung wird zur Entstehung eines Pulvers bevorzugt durch eine Düse ver­ sprüht und das Aerosol auf einer Fallstrecke getrocknet. Die Düse wird bevorzugt geheizt, um die Trocknung der Aufschlämmung zu beschleunigen. Abhängig von der Geometrie der Düse beträgt die Düsentemperatur bevorzugt ca. 120 bis 250°C. Ein Kompromiß wird gefunden durch ausreichende Verdampfungsgeschwindigkeit, jedoch Vermeiden von Ver­ spritzen.

Im Hinblick auf die Ausbeute ist die Verdichtungstemperatur möglichst hoch zu wählen. Ist sie jedoch zu hoch, verkleben die Partikel untereinander und es bilden sich Agglome­ rate, die herausgesiebt werden sollten. Ein Zusatz von Zink in der Schicht erhöht jedoch überraschenderweise den Schmelzpunkt, so daß eine höhere Verdichtungstemperatur (zwischen 710 und 800°C) möglich ist. Die Nachbehandlung unter Luft führt bei zu hohen Temperaturen zu einem Verlust der magnetischen Eigenschaften, weshalb zu hohe Temperaturen vermieden werden sollten. Auch hier sind bei Zusatz von Zink andere Temperaturen möglich (bevorzugt zwischen 150 und 250°C).

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zubereitung wird eine Zubereitung von Kern­ partikeln, in der mehr als 75 Gew.-% der Kernpartikel eine Korngröße von zwischen etwas weniger als 0.5 und etwas weniger als 15 µm haben, in den Sol/Gel-Prozeß eingesetzt. Die Kernpartikel müssen um soviel kleiner sein als die glasummantelten Partikel, wie die Dicke der Glasschicht ausmacht. Die Glasschicht wird nach dem erfindungsgemäßen Ver­ fahren zwischen 5 nm und 1 µm groß sein, abhängig von den jeweils gewählten Um­ ständen, wie Verhältnis Gel zu Kernpartikel. Im Durchschnitt dürfte die Glasschicht zwischen 0.2 und 0.3 µm dick sein.

Besonders bevorzugt ist eine Zubereitung enthaltend Partikel mit einer Glasoberfläche wo­ bei mehr als 75 Gew.-% dieser Partikel eine Korngröße von zwischen 2 und 15 µm haben. Besonders bevorzugt ist der Anteil der Partikel mit der bestimmten Korngröße größer als 90 Gew.-%.

Besonders bevorzugt werden magnetische Kernpartikel eingesetzt. Die erfindungsgemäße Zubereitung hat den Vorteil, daß bevorzugt mehr als 95 Gew.-% der Partikel mit einer Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm, bevorzugt zwischen 2 und 15 µm magnetisch sind. Dies bedeutet, daß gegenüber den bekannten Verfahren der Anteil von nicht-kern­ haltigen Partikeln drastisch reduziert ist. Dies kann man daran erkennen, nur wenig nicht- magnetische Partikel enthalten sind. Dies führt dazu, daß es praktisch nicht mehr erforder­ lich ist, die gebildeten nicht-magnetischen Partikel von den magnetischen Partikeln abzu­ trennen, bevor die Zubereitung in Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren eingesetzt wird. Dies bedeutet eine Vereinfachung im Herstellprozeß.

Außerdem kann die erfindungsgemäße Zubereitung dadurch charakterisiert werden, daß bevorzugt weniger als 50% der Partikel eine Korngröße von weniger als 2 µm haben. Dies hat zur Folge, daß der nicht-magnetische Feinanteil, der bei kleinen Korngrößen einen hohen relativen Anteil ausmacht, stark reduziert ist. Besonders bevorzugt haben weniger als 2% der Partikel eine Korngröße von weniger als 0.5 µm.

Bevorzugt sind nicht mehr als 10%, besonders bevorzugt zwischen 10 und 40% der Partikel der Zubereitung Partikel mit einer Korngröße von mehr als 10 µm.

Die erfindungsgemäße Zubereitung kann neben den erfindungsgemäßen Partikeln noch weitere nicht-glashaltige Bestandteile enthalten, wie z. B. Puffersubstanzen oder ein Suspensionsmittel, z. B. Wasser oder alkoholische Lösungen von Wasser.

Die Glasschicht der Partikel der erfindungsgemäßen Zubereitung enthält bevorzugt einen Anteil von zwischen 2 und 6 mol%, besonders bevorzugt 4 mol% Zinkoxid. Dies kann dadurch erreicht werden, daß der Anteil von Zinkoxid an der festen Masse des Sols, ver­ glichen mit den Anteilen der übrigen festen Komponenten, in diesem Größenordnungs­ bereich liegt. Der Anteil von Zinkoxid vergrößert sich mit Reduzierung des Anteils von Boroxid, insbesondere bei längerem Erhitzen, da Boroxid unter den Herstellbedingungen schon flüchtig ist.

Partikel, die eine Glasschicht aufweisen, in der der Anteil von Zinkoxid zwischen 2 und 6 mol% liegt, haben sich als besonders wirksam bei der Reinigung von Nukleinsäuren her­ ausgestellt. Die Ausbeute an Nukleinsäuren konnte, verglichen mit derselben Glasschicht ohne Zinkoxid, teilweise um 50% erhöht werden.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung von Partikeln mit einem Kern ummantelt mit einer Gelschicht enthaltend weniger als 5 Gew.-% kernlose Partikel enthaltend die Schritte Suspendieren von Kernpartikeln in einem Sol unter Verwendung einer Kernpartikelzubereitung und Sprühtrocknen der Suspension unter Gelbildung, wobei die Kernpartikelzubereitung zu 75 Gew.-% aus Partikeln mit einer Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm, bevorzugt zwischen 2 und 15 µm besteht.

Zur Durchführung des Gel/Sol-Prozesses, welchen das erfindungsgemäße Herstellungsver­ fahren benutzt, wird auf die Beschreibung im Stand der Technik verwiesen. Der wesent­ liche Unterschied der Erfindung zu dem Vorbeschriebenen, ist der Einsatz einer be­ stimmten Kernpartikelzubereitung, durch welche eine Zubereitung mit weniger als 5 Gew.-% kernloser Partikel hergestellt werden kann. Als besonders vorteilhaft hat sich ein Verfahren erwiesen, bei dem zunächst ein Sol aus Tetraalkylorthosilikaten, Alkylboraten, Aluminiumalkoholaten und Alkalialkoholaten in Ethanol hergestellt wird und diese Mischung mit Kalzium erhitzt wird. Anschließend wird die Mischung durch Zusatz von Wasser hydrolysiert. In das so gebildete Sol werden die Kernpartikel in Festform zugegeben und, bevorzugt mit Ultraschall, suspendiert. Anschließend wird die Suspension unter Gelbildung in einem Sprüh-Trocknungsverfahren, bei dem die Düse geheizt wird, und bei dem im wesentlichen Partikel entstehen, in denen 1 bis nur wenige Kernpartikel pro Partikel enthalten sind (bevorzugt enthalten weniger als 1% der Partikel mehr als 10 Kernpartikel), versprüht. Das Sprühprodukt wird anschließend erhitzt, um das Gel zu einem Glas zu verdichten. Auch hier hat der Zusatz von Zinkoxid zum Gel einen erheblichen Vorteil. Die Verdichtung kann bei höheren Temperaturen als bei solchen ohne Zinkzusatz durchgeführt werden, da der Erweichungspunkt des entstehenden Glases höher liegt. Dadurch lassen sich organische Restbestandteile aus den eingesetzten Materialien leichter austreiben.

Da nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Zubereitung mit einem sehr geringen Anteil von kernlosen Partikeln entsteht, ist im allgemeinen keine anschließende Frak­ tionierung nach kernlosen/kernhaltigen Partikeln mehr erforderlich.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren durch nicht-kovalente Bindung der Nukleinsäuren aus einer Probe an Partikel mit einer Glasoberfläche, Entfernen nicht-gebundener Probenbestandteile und Elution der gebun­ denen Nukleinsäuren von der Glasoberfläche, wobei eine erfindungsgemäße Zubereitung eingesetzt wird. Das Verfahren wird besonders einfach, wenn die Partikel magnetisch sind.

Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren mit Hilfe magnetischer Partikel mit einer Glasoberfläche sind in WO 96/41811 beschrieben. Auf diese Offenbarung wird hier voll inhaltlich Bezug genommen. Als Proben für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren kommen insbesondere klinische Proben, wie Blut, Serum, Mundspülflüssigkeit, Urin, Zerebralflüssigkeit, Sputum, Stuhl, Plasma, Punktate oder Knochenmarksproben in Frage. Bevorzugtes Probenmaterial ist Serum. Zur Reinigung der Nukleinsäuren wird die Probe, erforderlichenfalls nach Lyse eventuell enthaltender zellulärer Strukturen und Verdau von strörenden Probenbestandteilen, mit der erfindungsgemäßen Zubereitung versetzt, z. B. in Form einer bestimmten Menge einer Suspension der Partikel. Nach einer Inkubationszeit, während derer die Nukleinsäuren an die Glasoberfläche sequenzunspezifisch binden, wird die Flüssigkeit zusammen mit den nicht-gebundenen Probenbestandteilen entfernt und die Partikel gewünschtenfalls gewaschen, um Reste zu entfernen. Die noch daran gebundenen Nukleinsäuren werden durch Elution mit einer Flüssigkeit, in der sich die Nukleinsäuren gut lösen, von der Oberfläche entfernt. Die resultierende Flüssigkeit kann nun beliebig weiter bearbeitet werden, insbesondere in Amplifikationsverfahren eingesetzt werden, wie z. B. die PCR, da während des Reinigungsverfahrens die meisten Enzyminhibitoren abge­ trennt wurden.

Sofern die Partikel magnetisch sind, ist die Entfernung der Flüssigkeit von Partikeln mit den Nukleinsäuren besonders einfach, da die Partikel mit Hilfe eines Magneten gesammelt und festgehalten werden können, während die Flüssigkeit entfernt wird. Wenn die Partikel nicht magnetisch sind, können sie von der Flüssigkeit durch Filtration mit einem geeigneten Filter abgetrennt werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Sol zur Herstellung einer zinkfreien Schicht (74 SiO₂ × 15 B₂O₃ × 4 K₂O × 2 CaO × 5 Al₂O₃)

In einen 5 Liter Rundkolben werden 1750 ml Tetraethylorthosilikat (Hersteller: Wacker, Burghausen) vorgelegt und bei Raumtemperatur unter Rühren (500 U/min) zügig zuge­ geben:

541 ml Triethylborat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
250 ml Kaliummethanolat (25%ig in Methanol (Hersteller: Fluka, Deisenhofen))
261 g Aluminium-sec.-Butylat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
292 ml Ethanol und
8,49 g Calcium (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)

Die Mischung wird anschließend unter Rühren erhitzt bis zum starken Rückfluß. Über 30 Minuten wird eine Mischung von insgesamt 583 ml Ethanol und 233 ml Wasser zuge­ tropft. Nach Abkühlen auf < 50°C wird das Sol umgefüllt in einen offenen Behälter und 1200 g Pigment IRIODIN 600 Black Mica (Hersteller: Merck, Darmstadt) dazugegeben. Das Sol wird nach vollständiger Pigmentzugabe noch 1 Minute bei 500 U/min gerührt und anschließend 5 Minuten mit Ultraschall behandelt. Nach der Ultraschallbehandlung wird das Sol-Pigment-Gemisch mit einem Dissolverrührer bei ca. 500 U/min gerührt, bis die gesamte Menge aufgebraucht ist.

Beispiel 2 Herstellung von glasbeschichtetem Pigment (MGP)

Versprüht wird in einem Sprühturm der Fa. Nubilosa, Konstanz, mit einem Durchmesser von 0,75 m, einer Höhe von 2,5 m und einer Verdunstungsleistung (bezogen auf Wasser) von 1-3 Liter/Stunde. Die Lufteinlaßtemperatur beträgt 270°C, die Auslaßtemperatur ca. 130°C. Der Durchsatz der Luft ist 7,2 m³/min. Zum Sprühen wird eine Zweistoffdüse ver­ wendet mit einem Sprühdruck von 2 bar. Die Förderleistung der verwendeten Kugelventil­ membranpumpe beträgt 60 g Sol/min.

Das Sprühprodukt wird in einem Zyklon abgefangen, an Luft bei 250°C 1 Stunde vorver­ dichtet und anschließend in einem Stickstoffofen mit einer Heizrate von 1 K/min auf eine Temperatur von 675°C gebracht, 1 Stunde dort gehalten und abgekühlt auf 300°C. Bei 300°C wird Sauerstoff zudosiert, 1 Stunde gehalten, dann abgekühlt auf Raumtemperatur. Nach dem Abkühlen erfolgt eine Siebung mit einem Sieb mit einer Maschenweite von 50 µm zur Entfernung von eventuell vorhandenen Aggregaten. Damit ist die Herstellung abgeschlossen.

Beispiel 3 Sol zur Herstellung einer zinkhaltigen Schicht (70,67 SiO₂ × 14,33 B₂O₃ × 4 K₂O × 2 CaO × 5 Al₂O₃ × 4 ZnO)

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wird ein zinkhaltiges Sol bereitet. Dazu werden folgende Ädukte eingewogen und analog behandelt:

1258 ml Tetraethylorthosilikat (Hersteller: Wacker, Burghausen)
387 ml Triethylborat (Hersteller. Aldrich, Steinheim)
188 ml Kaliummethanolat 25%ig in Methanol (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
196 g Aluminium-sec.-Butylat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
1285 ml Ethanol
6,39 g Calcium (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
58,5 g Zinkacetat dehydriertes Dihydrat (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)

Nach dem Kochen unter Rückfluß werden 178 ml H₂O zusammen mit 444 ml Ethanol binnen 30 Minuten zugetropft. Nach dem Abkühlen werden 1200 g Pigment zugesetzt. Ansonsten siehe Beispiel 1.

Beispiel 4 Herstellung von zinkhaltigen glasbeschichtetem Pigment

Das pigmenthaltige Sol aus Beispiel 3 wird analog Beispiel 2 verarbeitet. Die Ver­ dichtungstemperatur beträgt jedoch 750°C.

Beispiel 5 Herstellung von zinkhaltigen glasbeschichtetem Pigment mit modifizierter Nachbe­ handlung (MGP)

Das pigmenthaltige Sol aus Beispiel 3 wird analog Beispiel 2 verarbeitet. Die Ver­ dichtungstemperatur beträgt jedoch 750°C und die Temperatur bei der Behandlung in Sauerstoff beträgt 200°C.

Beispiel 6 Ermittlung der Ausbeute von DNA bzw. RNA mit radioaktivem ³²P

Zum direkten Nachweis von gebundener bzw. nicht-gebundener DNA bzw. RNA werden ³²P-markierter HIVgag RNA Standard mit 1,4 kb bzw. ³²P-markierter Lambdaamplikons mit 3 kb eingesetzt. Als Probe dient Negativplasma (human) enthaltend jeweils 10⁹ Kopien.

Durchführung der Probenvorbereitung

In ein 2 ml Eppendorf-Gefäß werden 500 µl Negativplasma mit 10⁹ Kopien ³²P gelabelte Lambdaamplikons gegeben. Dazu werden 480 µl Bindepuffer/Proteinase K-Lösung (5 : 1) zupipettiert, gevortext und bei 70°C für 10 Minuten inkubiert. Nach Abkühlen auf Raum­ temperatur werden 400 µl isopropanolische MGP-Suspension mit einem Gesamtinhalt von 3 mg MGP zupipettiert. Unmittelbar darauf wird durch Vortexen gemischt. Die Probe wird dann für 15 Minuten auf einem Mischer, z. B. Thermomischer 5436 von Eppendorf, inku­ biert.

Die MGP werden durch Überführung der Probe in einen Magnetseparator konzentriert. Nach 1 Minute wird der Überstand vollständig abpipettiert.

5 ml Waschpuffer werden zu den MGPs pipettiert. Die Probe wird gevortext und dann in den Magnetseparator überführt. Der Überstand wird nach 1 Minute abpipttiert. Die Wasch­ prozedur wird noch 2 × wiederholt.

Zu den MGP werden 200 ml Elutionspuffer zugesetzt. Bei 80°C wird 10 Minuten auf einem Thermomischer bei 1400 RPM inkubiert. Die Probe wird in den Magnetseparator überführt und nach 1 Minute wird das gesamte Eluat abgenommen. Das Eluat wird dann in ein neues Gefäß überführt und in einem Szintilationszähler vermessen.

Aus dem Verhältnis der Radioaktivität des Eluates zu der Radioaktivität der Probe vor der Reinigungsprozedur kann die Ausbeute ermittelt werden.

Ergebnisse mit MGPs unterschiedlicher Beschichtung:

Beispiel 7 Black Mica als Pigmentbasis

Gemäß Beispiel 1 wird eine Charge gefertigt, bei der das Pigment Black Mica (BM) ist.

Beispiel 8 Black Mica als Pigmentbasis

Gemäß Beispiel 1 wird eine Charge gefertigt, bei der das Pigment MMB (Microna Matte Black (Hersteller: Merck, Darmstadt)) ist.

Beispiel 9 Signalhöhe nach Amplifikation bei Probenvorbereitung mit MGP auf verschiedener Pigmentbasis

MGP gemäß den Beispielen 7 und 8 wird bei einer Probenvorbereitung eingesetzt. Als Probe dient Humanplasma mit 100 Kopien/ml HCV-Viren. Das Eluat der Probenvorberei­ tung wird einer Amplifikation unterworfen und das Amplifikationsergebnis mit einem Elektrolumineszenzverfahren detektiert. In einem weiteren Versuch war die Probe Human­ plasma mit 600 Kopien/ml HBV-Viren.

Claims (13)

1. Zubereitung enthaltend Partikel mit einer Glasoberfläche, wobei mehr als 75 Gew.-% dieser Partikel eine Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm haben.

2. Zubereitung gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß mehr als 95 Gew.-% der Partikel mit einer Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm magnetisch sind.

3. Zubereitung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß weniger als die Hälfte der Partikel eine Korngröße von weniger als 2 µm haben.

4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß weniger als 2% der Partikel eine Korngröße von weniger als 0.5 µm haben.

5. Zubereitung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Partikel einen magnetischen Kern aufweisen, der mit Glas ummantelt ist.

6. Zubereitung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nicht mehr als 10% dieser Partikel Partikel mit einer Korngröße von mehr als 10 µm sind.

7. Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel einen Glasmantel aufweisen, der einen Anteil von zwischen 2 und 6 mol% Zinkoxid enthält.

8. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung von Partikeln mit einem Kern um­ mantelt mit einer Gelschicht enthaltend weniger als 5 Gew.-% kernlose Partikel, enthaltend die Schritte

• - Suspendieren von Kernpartikeln in einem Sol unter Verwendung einer Kern­ partikelzubereitung
• - Sprühtrocknen der Suspension unter Gelbildung

dadurch gekennzeichnet, daß die Kernpartikelzubereitung zu 75 Gew.-% aus Partikeln mit einer Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm besteht.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8. dadurch gekennzeichnet, daß das Sol Zink enthält.

10. Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren durch nicht-kovalente Bindung der Nukleinsäuren aus einer Probe an Partikel mit einer Glasoberfläche, Entfernen nicht­ gebundener Probenbestandteile und Elution der gebundenen Nukleinsäuren von der Glasoberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kontakt gebracht wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel magnetisch sind und bei Entfernung der Probenbestandteile durch einen Magneten festgehalten werden.

12. Verwendung von Zinkoxid in nach dem Sol/Gel-Prozeß erzeugten Glasschichten zur Erhöhung der Bindefähigkeit der Glasoberfläche für Nukleinsäuren.

13. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung von Partikeln mit einem Kern um­ mantelt mit einer Glasschicht enthaltend weniger als 5 Gew.-% kernlose Partikel, ent­ haltend die Schritte

• - Suspendieren von Kernpartikeln in einem Sol unter Verwendung einer Kern­ partikelzubereitung
• - Sprühtrocknen der Suspension unter Gelbildung
• - Verdichtung des Gels zum Glas

dadurch gekennzeichnet, daß die Kernpartikelzubereitung zu 75 Gew.-% aus Partikeln mit einer Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm besteht.