DE19847690A1 - Verfahren und Substanzen für die Diagnose und Therapie von Sepsis und sepsisähnlichen systemischen Infektionen - Google Patents

Abstract

Verwendungen von rekombinantem Procalcitonin 3-116 im Rahmen der Diagnose und Therapie von septischen Erkrankungen sowie die Messung von anderen Prohormonen als Procalcitonin sowie von Dipeptidyl Peptidase IV als Biomarker im Rahmen der Sepsisdiagnose.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Diagnose- und Thera­ piemöglichkeiten, die sich aus neuen, experimentell abgesi­ cherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Procalcitonin bzw. Procalcitonin-Teilpeptiden bei Sepsis und sepsisähnlichen schweren systemischen Infektionen ableiten ließen.

Aus den Patenten DE 42 27 454 bzw. EP 0 656 121 B1 bzw. US 5,639,617 ist es bekannt, daß die Bestimmung des Prohormons Procalcitonin bzw. von sich davon ableitenden Teilpeptiden in einem Serum oder Plasma eines Patienten, bei dem ein Sepsisrisiko besteht bzw. bei dem sepsistypische Krankheits­ erscheinungen festgestellt werden, ein wertvolles diagnosti­ sches Hilfsmittel zur Früherkennung, d. h. zur Erkennung von Infektionen, die zu Sepsis führen können, und deren Abgren­ zung von nicht-infektiösen Ätiologien, zur Erkennung des Schweregrads und zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurtei­ lung von Sepsis und sepsisähnlichen systemischen Infektionen darstellt. Besonders wertvoll hat sich die genannte Bestim­ mung zur differentialdiagnostischen Unterscheidung von Krankheitserscheinungen, die auf systemische mikrobielle Infektionen zurückzuführen sind, von anderen Krankheits­ erscheinungen nicht-infektiöser Ätiologie erwiesen, die aufgrund ihres klinischen Erscheinungsbildes auf eine Sepsis hindeuten könnten, jedoch in Wirklichkeit nicht auf eine systemische mikrobielle Infektion zurückzuführen sind, z. B. von Krankheitserscheinungen, die auf nicht-infektiöse Ent­ zündungen einzelner Organe, auf postoperative Abstoßungs­ reaktionen oder Krebserkrankungen zurückzuführen sind. Auch können systemische Entzündungen von lokalen abgegrenzt werden.

Bezüglich eines Überblicks über den jüngeren Erkenntnisstand wird verwiesen auf W. Karzai et al. in Infection, Vol. 25 (1997), 6, S. 329-334 und die darin zitierte bzw. erwähnte weitere Fachliteratur.

Procalcitonin ist bekanntgeworden als Prohormon von Calcito­ nin, und seine vollständige Aminosäuresequenz ist seit längerem bekannt (FEBS 167 (1984), S. 93-97). Procalcitonin wird unter normalen Umständen in den C-Zellen der Schild­ drüse produziert und dann spezifisch in das Hormon Calcito­ nin sowie die weiteren Teilpeptide Katacalcin und einen N­ terminalen Rest aus 57 Aminosäuren ("Aminoprocalcitonin") gespalten.

Da bei Sepsis stark erhöhte Procalcitonin-Spiegel auch bei Patienten beobachtet werden, denen die Schilddrüse völlig entfernt wurde, mußte der Schluß gezogen werden, daß das im Blut von Sepsispatienten nachweisbare Procalcitonin außer­ halb der Schilddrüse gebildet wird, wobei bezüglich der Organe bzw. Zellen oder der Gewebe, die für die Procalcito­ nin-Produktion bei Sepsis bestimmend sind, in der Fachlite­ ratur unterschiedliche Vermutungen, die teilweise durch experimentelles Material gestützt wurden, geäußert wurden.

Was die Natur des bei Sepsis als "Procalcitonin" bestimmten Peptids angeht, so wurde zwar in den o. g. Patenten von Anfang an klargestellt, daß das bestimmte Peptid nicht völlig mit dem bekannten Procalcitonin-Peptid voller Länge identisch sein muß, das in den Schilddrüsen als Calcitonin- Vorläufer gebildet wird. Die Frage, ob sich das im Falle von Sepsis gebildete Procalcitonin von dem in den Schilddrüsen gebildeten Procalcitonin unterscheidet, blieb jedoch bisher ungeklärt. Als mögliche Unterschiede waren posttranslatio­ nale Modifikationen des bekannten Procalcitonins wie Glyko­ sylierungen, Phosphorylierungen oder Veränderungen der Primärstruktur denkbar, jedoch auch modifizierte, verkürzte oder verlängerte Aminosäuresequenzen. Da die bisher ange­ wandten analytischen Bestimmungsverfahren keine Unterschiede zwischen dem als Calcitonin-Vorläufer bekannten Procalcito­ nin und dem bei Sepsis gebildeten Procalcitonin erkennen ließen, wurde vorläufig allgemein davon ausgegangen, daß das bei Sepsis gebildete Procalcitonin mit dem Calcitonin-Vor­ läufer identisch ist und somit ein Peptid mit der bekannten Procalcitonin-Sequenz von 116 Aminosäuren (Procalcitonin 1-116) darstellt.

Wie die nachfolgend im experimentellen Teil dieser Anmeldung genauer erläuterten Bestimmungen im Labor der Anmelderin ergeben haben, unterscheidet sich das bei Sepsis gebildete Procalcitonin jedoch zwar geringfügig, jedoch signifikant von dem in der Schilddrüse gebildeten vollständigen Procal­ citonin 1-116. Aus den festgestellten Unterschieden ergaben sich dann eine Reihe von wissenschaftlichen Schlußfolgerun­ gen, die in neue diagnostische und therapeutische Verfahren, darin verwendbare Substanzen bzw. weiterverfolgbare wissen­ schaftliche Ansätze umgesetzt werden konnten.

Ausgangspunkt für den in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindungskomplexes ist die überraschende Er­ kenntnis, daß das bei Sepsis und sepsisähnlichen systemi­ schen Infektionen im Serum von Patienten in vergleichsweise hohen Konzentrationen nachweisbare Procalcitonin nicht das vollständige Procalcitonin 1-116 mit 116 Aminosäuren ist, sondern ein am Aminoterminus um ein Dipeptid verkürztes, ansonsten jedoch identisches Procalcitonin mit einer Amino­ säuresequenz von nur 114 Aminosäuren (Procalcitonin 3-116).

Das gegenüber dem vollständigen Procalcitonin fehlende Dipeptid weist die Struktur Ala-Pro auf. Das Fehlen eines Dipeptids mit einem Prolinrest als zweite Aminosäure des Amino-Terminus des vollständigen Procalcitoninsequenz gab Anlaß zu der Vermutung, daß bei der Erzeugung des bei Sepsis nachweisbaren Procalcitonins 3-116 eine bestimmte Peptidase eine Rolle spielt, und zwar die sogenannte Dipeptidyl-(Ami­ no)-Peptidase IV (DP IV oder DAP IV bzw. CD26). Über die Spezifität der genannten Dipeptidyl-Aminopeptidase IV exi­ stiert eine umfangreiche Literatur, die zusammengefaßt ist in dem Buch von Bernhard Fleischer, "Dipeptidyl Peptidase IV (CD26) in Metabolism and the Immune Response", 1995, Sprin­ ger-Verlag, Heidelberg, (ISBN 3-40-60199-6). Hervorste­ chende Eigenschaft der Dipeptidyl-Aminopeptidase IV ist es, von Peptiden am Aminoterminus Dipeptide der Struktur Xaa-Pro sowie außerdem Xaa-Ala abzuspalten. Die Dipeptidyl-Amino­ peptidase IV (nachfolgend wird normalerweise die Abkürzung DAP IV verwendet) stellt ein Membranprotein mit einer kurzen hydrophoben N-terminalen Sequenz dar und wird in unter­ schiedlichen Geweben produziert. Es gibt Erkenntnisse, daß Dipeptidyl-Aminopeptidase IV T-Lymphozyten aktivieren kann und somit Teil eines "alternativen Wegs" der T-Zellaktivie­ rung ist.

Zur Bestimmung einer möglichen Rolle der Dipeptidyl-Amino­ peptidase IV im Rahmen von systemischen Infektionen bzw. von Sepsis haben die Erfinder daher experimentell geprüft, ob eine Korrelation der physiologischen DAP IV Konzentrationen mit dem Nachweis einer Sepsis möglich ist, und aus den erhaltenen Ergebnissen, die eine derartige Korrelation zeigten, wurde der Schluß gezogen, daß das Auftreten hoher Procalcitonin-Konzentrationen bei Sepsis und systemischen Infektionen eng mit einer gegenüber einem gesunden Normalzu­ stand modifizierten Dipeptidyl-Aminopeptidase IV-Aktivität verknüpft ist. In einem weiteren Folgeschluß wurde dann postuliert, daß diese modifizierte DAP IV Aktivität mögli­ cherweise nicht nur zu der bekannten Erhöhung der Procalci­ tonin-Spiegel in Patientenseren führt, sondern daß in ähn­ licher Weise auch erhöhte Konzentrationen anderer Prohormone meßbar sein könnten, so daß die Bestimmung derartiger Pro­ hormone eine mögliche Alternative zur Procalcitonin-Bestim­ mung darstellt bzw. geeignet ist, die Procalcitonin-Bestim­ mung in Einzelfällen zu ergänzen oder in diagnostisch signi­ fikanter Weise weiter abzusichern.

Die Erkenntnis, daß bei Sepsis nicht das vollständige Pro­ calcitonin 1-116 im Serum von Patienten gefunden wird, sondern ein verkürztes Procalcitonin 3-116, ist schließlich auch von potentiellem Interesse für die Sepsis-Therapie. In einem Artikel von Eric S Nylen et al., Crit Care Med 1998, Vol. 26, No. 6, S. 1001-1006 werden experimentelle Befunde beschrieben, die darauf hindeuten, daß das bei Sepsis auf­ tretende Procalcitonin nicht nur ein diagnostisch wichtiger Marker ist, der z. B. als Stoffwechsel-Abfallprodukt ent­ standen ist, sondern in einem infektiös bedingten Entzün­ dungsgeschehen eine aktive Rolle als Mediator zu spielen scheint, indem Procalcitonin eine Entzündungsreaktion auf­ rechterhalten und verstärken kann. Diese Rolle von Procalci­ tonin wird gegenwärtig kontrovers diskutiert, und die be­ kannt gewordenen Versuchsergebnisse ergeben kein einheitli­ ches Bild.

Die o. g. Erkenntnis, daß bei Sepsis ein am Aminoterminus um zwei Aminosäuren verkürztes Procalcitonin auftritt, legt nunmehr die Vermutung nahe, daß das Procalcitonin, das im Falle von Sepsis und anderen entzündlichen systemischen Infektionen eine aktive Rolle spielt, dieses verkürzte Procalcitonin 3-116 sein dürfte, und daß Untersuchungen, die mit dem Procalcitoninpeptid voller Länge durchgeführt wur­ den, u. a. aus diesem Grunde abweichende oder widersprüchli­ che Ergebnisse lieferten. Es ist durchaus bekannt, daß viele physiologisch aktive Peptide durch Spaltung, z. B. eine einleitende Abspaltung eines kurzen Peptidrests, in ihre eingentliche aktive Form überführt werden. Ein bekanntes Beispiel ist Angiotensin, bei dem aus dem nichtaktiven Angiotensinogen mit 14 Aminosäuren, durch sukzessive Ab­ spaltung erst eines Tetrapeptids und dann eines Dipeptids sowie schließlich einer einzelnen Aminosäure Peptide mit erheblich unterschiedlichen physiologischen Aktivitäten gebildet werden. Daß relativ geringfügige Modifikationen am N-Terminus von physiologisch aktiven Peptiden, auch unter Einfluß von DAP IV, im Rahmen des Immungeschehens eine Rolle spielen und zur erheblichen Aktivitätsveränderungen bei den entsprechenden Peptiden führen können, wird durch eine Reihe von Veröffentlichungen aus der jüngsten Zeit unterstrichen, in denen jedoch keine Beziehung zu septischen Krankheits­ geschehen hergestellt wird (vgl. z. B. J Immunol 1998, Sept. 15, 161(6): 2672-5; Biochemistry 1998, Sept. 8, 37(36): 12672-80; FEBS Lett 1998, Juli 31, 432 (1-2): 73-6; J Biol Chem 1998, März 27; 273 (13): 7222-7; J Exp Med 1997, Dec 1; 186 (11): 1865-72).

Geht man davon aus, daß Procalcitonin 3-116 aktiv an einem Entzündungsgeschehen beteiligt ist und für dieses verkürzte Procalcitonin spezifische molekulare Rezeptoren oder ähn­ liche spezifische Binder existieren, eröffnen sich neue therapeutische Möglichkeiten zur Beeinflussung des Verlaufs einer Sepsis unter Einsatz des Procalcitonins 3-116 bzw. von Agonisten und Antagonisten, die mit den Rezeptoren für das Procalcitonin 3-116 wechselwirken und damit die von diesem ausgelösten physiologischen Reaktionen und damit auch ein Entzündungsgeschehen beeinflussen können. Auch der Einsatz von spezifischen Bindern von Procalcitonin 3-116, z. B. selektiven Antikörpern, stellt einen therapeutischen Ansatz dar, der durch die hierin vermittelten Erkenntnisse eröffnet wird.

Schließlich ergibt sich aus der Rolle, die die Dipeptidyl- Aminopeptidase IV bei der Generierung des Procalcitonins 3-116 bei Sepsis und systemischen Infektionen zu spielen scheint, die weiterführende Folgerung, daß eine Sepsis oder ein sepsisähnliches Entzündungsgeschehen auch dadurch thera­ peutisch beeinflußt werden kann, daß man die für die Frei­ setzung von Procalcitonin 3-116 verantwortliche Dipeptidyl- Aminopeptidase IV in ihrer Wirkung beeinflußt, indem man sie z. B. durch geeignete selektive Binder, Antikörper oder ähnliche Rezeptoren-Moleküle blockiert.

Es ist Ziel der vorliegenden Patentanmeldung, die sich aus den obigen neuen Erkenntnissen und daraus abgeleiteten Schlußfolgerungen ergebenden neuen technischen Lehren pa­ tentrechtlich abzusichern, soweit diese unter Berücksichti­ gung des derzeitigen Erkenntnisstandes einem Patentschutz zugänglich sind.

Die beigefügten Patentansprüche fassen derartige schutz­ fähige Lehren vorläufig zusammen. Weitere schutzfähige Lehren können sich für den Fachmann aus dem Gesamttext der vorliegenden Anmeldung unter Berücksichtigung der im experi­ mentellen Teil angeführten Versuchsbedingungen und Versuchs­ ergebnisse sowie den zugehörigen Erläuterungen ergeben. Die Beanspruchung derartiger Lehren durch zusätzliche Ansprüche bleibt ausdrücklich vorbehalten.

Nachfolgend wird unter Bezugnahme auf mehrere Diagramme ausgewähltes experimentelles Material vorgelegt, das die neuen Erkenntnisse untermauert bzw. das für die Richtigkeit der daraus abgeleiteten Annahmen spricht.

In den Figuren zeigen:

Fig. 1 die Ergebnisse einer Procalcitonin-Isolierung und Aufreinigung per HPLC aus einem Mischserum aus gesammelten Seren von verschiedenen Patienten mit schwerer Sepsis;

Fig. 2 die Ergebnisse einer massenspektroskopischen Un­ tersuchung derjenigen Fraktionen des Mischserums aus Fig. 1, die eine hohe Procalcitonin-Immunreak­ tivität aufwiesen;

Fig. 3 Ergebnisse der Bestimmung der Enzymaktivität von Dipeptidyl-Aminopeptidase IV in septischen Seren und Normalseren; sowie

Fig. 4 die Ergebnisse der Bestimmung von Procalcitonin in septischen Seren und Normalseren in Gegenüberstel­ lung mit Ergebnissen der Bestimmung eines weiteren Prohormons, nämlich pro-Gastrin-Releasing-Peptide (proGRP), in den gleichen Seren.

EXPERIMENTELLER TEIL A. Isolierung und Charakterisierung des endogenen Procal­ citonin-Peptids aus Seren septischer Patienten

Durch Vermischen von Serumproben von verschiedenen Patienten mit schwerer Sepsis wurde ein Mischserum mit einem Gesamt­ volumen von 68 ml hergestellt. Die Procalcitonin-Konzen­ tratin in dem erhaltenen Mischserum wurde mit Hilfe eines kommerziellen Procalcitonin-Assays (LUMItest PCT, B.R.A.H.M.S Diagnostica) zu 280 ng/ml (Gesamtmenge 19 µg) ermittelt. Das Mischserum wurde mit einem gleichen Volumen eines Puffers (68 ml; 10mM EDTA, 1 mg/ml Maus-IgG, 2 mg/ml Schaf-IgG, 2 mg/ml bovines IgG, 0,1 rnNol Leupeptin, 50 µM Amastatin in PBS) vermischt, und das in der Probe enthaltene Procalcitonin wurde affinitätschromatographisch isoliert und gereinigt.

Hierzu wurde die gesamte Mischprobe bei einer Durchflußrate von 0,5 ml/min viermal hintereinander über eine Affinitäts­ säule (0,5 × 1 cm, Anti-Calcitonin-Antikörper, gebunden an Carbolink der Firma Pierce, Procalcitonin-Bindekapazität ca. 20 µg) gepumpt. Anschließend wurde die Säule mit 30 ml PBS gewaschen, und das gebundene Peptid wurde mit Hilfe von 50 mM Essigsäure (pH ca. 2,0) eluiert. Der Säulenausfluß wurde kontinuierlich auf Absorption bei 280 nm überwacht, und die von der Essigsäure eluierte Proteinfraktion wurde aufgefan­ gen (Endvolumen 2,0 ml).

Das auf diese Weise gesammelte Material wurde über Umkehr­ phasen-HPLC an einer rpC₁₈-Säule µ Bondapak 0,4 × 30 mm (Firma Waters) gereinigt. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1 ml/min. Laufmittel und Elutionsbedingungen sind der folgenden Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1: Elutionsbedingungen rp-HPLC Procalcitonin

Der Säulenausfluß wurde kontinuierlich auf seine Absorption bei 214 nm vermessen und in Fraktionen von 0,25 ml gesam­ melt. Mit Hilfe eines handelsübliche Procalcitonin-Assays (LUMItest PCT, B.R.A.H.M.S Diagnostica) wurden diejenigen Fraktionen bestimmt, in denen eine PCT-Immunreaktivität nachweisbar war. Es zeigte sich, daß die Haupt-Immunreakti­ vität in der 51. Fraktion als scharfe Bande eluiert wurde. Außerdem wurden heterogen zusammengesetzte Proteinfraktionen mit geringeren PCT-Immunreaktivitäten in den Fraktionen 39 bis 49 erhalten.

Fig. 1 zeigt die ermittelte PCT-Immunreaktivität (ausge­ drückt als ng PCT/ml) für die einzelnen gesammelten Fraktio­ nen der rp HPLC-Chromatographie, überlagert einer Kurve, die die optische Dichte (OD) der eluierten Fraktionen darstellt.

Alle Fraktionen, die eine positive Procalcitonin-Immunreak­ tivität aufwiesen, wurden durch Begasen mit Stickstoff getrocknet. Anschließend wurden die Proben massenspektrome­ trisch analysiert und einer N-terminalen Sequenzierung unterworfen.

Bei der massenspektrometrischen Untersuchung (MALDI-TOF- Methode) wurde für die Fraktionen 50-52 das in Fig. 2 gezeigte Profil erhalten, aus dem sich eine Molmasse von 12640 +15 ergab. Sämtliche anderen massenspektrometrisch untersuchten Fraktionen (36-49, 53-59) ergaben heterogene Massenverteilungen mit Molmassen <12640. Ihre Einzelmasse ergab im Vergleich zur Intensität der Masse der Fraktion 50- 52 eine Intensität von <2%. Damit wurde nachgewiesen, daß die Procalcitonin-Immunreaktivität in Seren von Sepsis­ patienten mit einer Masse von 12640±15 assoziiert ist. Keine der gewonnenen Fraktionen wies eine höhere Masse auf.

Die in den Fraktionen 36-59 enthaltenen Peptide wurden einer N-terminalen Sequenzierung unterworfen. Auch hierbei erwies sich der Inhalt der Fraktionen 36-49 und 53-59 als hetero­ gen, d. h. es wurde eine Vielzahl von unterschiedlichen N- Termini ermittelt.

Für die Fraktion 50-52, in denen die überwiegende Procal­ citonin-Immunreaktivität zu finden war, ergab sich, daß die darin enthaltenen Peptide eindeutig folgenden N-Terminus (15 Aminosäuren) aufwiesen:
Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu

Das Peptid aus den Fraktionen 50-52 wurde anschließend mittels Protease Glu-C bzw. Trypsin verdaut, die entstan­ denen Fragmente wurden auf an sich bekannte Weise über SMART-HPLC gewonnen und anschließend massenspektrometrisch und sequenzanalytisch untersucht.

Es wurde eine Sequenz erhalten, die vollständig mit der Sequenz der Aminosäuren 3-116 des bekannten Procalcitonins 1-116 übereinstimmte. Die theoretische Masse dieser Sequenz betrug 12627, was mit der massenspektrometrisch ermittelten Masse von 12640±15 übereinstimmt.

Damit wurde nachgewiesen, daß im Blut von Sepsispatienten ein Procalcitonin-Peptid zirkuliert, das 114 Aminosäuren umfaßt und als Procalcitonin 3-116 zu bezeichnen ist. Das Peptid ist nicht durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen oder Glykosylierungen verändert.

Das Procalcitonin 3-116 wurde bisher in der wissenschaftli­ chen Literatur noch nicht als mögliches endogenes Procalci­ tonin-Teilpeptid diskutiert, und es bestand daher bisher für den Fachmann auch noch keinerlei Veranlassung, dieses Peptid gezielt herzustellen und auf seine Eigenschaften zu unter­ suchen. Die obigen Befunde lieferten nunmehr jedoch einen Anlaß zur gezielten Herstellung des genannten Procalcitonin 3-116 nach gentechnologischen Techniken. Seine Herstellung wird nachfolgend beschrieben.

B. Klonierung, Expression und Aufreinigung von rekonibinan­ tem Procalcitonin 3-116. 1. Klonierung

Die für Procalcitonin 3-116 (nachfolgend abgekürzt PCT 114) codierenden DNA-Fragmente wurden unter Anwendung einer PCR- Amplifikation mit Hilfe geeigneter Oligonukleotidprimer aus einem humanen Schilddrüsen-cDNA-Pool isoliert. Das gewünsch­ te Fragmente wurde mittels gängiger Methoden (Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, und Struhl K (1991), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) kloniert, und die korrekte Nukleotidsequenz wurde durch DNA-Sequenzierung und Vergleich mit der bekannten, für Procalcitonin codierenden DNA-Sequenz verifiziert.

Für die Expression der für PCT 114 codierenden cDNA wurde ein Vektor verwendet, der neben einem T7-Promotor eine Region enthält, die für das Signalpeptid des sog. pelB- Proteins codiert. Dieses pelB-Signalpeptid sorgt dafür, daß ein nach Klonierung und Expression entstandenes Fusions­ protein durch die cytoplasmatische Membran der für die Expression verwendeten Wirtzellen in den periplasmatischen Raum transportiert wird. Bei diesem Transportvorgang wird gleichzeitig das N-terminale Signalpeptid durch eine mem­ branständige Signalpeptidase abgetrennt (Stader JA und Silhavy TJ (1990), Engineering Escherichia coli to secrete heterologous gene products, Methods Enzymol. 185, 166-187). Diese Vorgehensweise garantiert, daß das gefundene Ex­ pressionsprodukt exakt die gewünschte Sequenz aufweist. Bei dieser Vorgehensweise fehlt das bei anderen Methoden zur Expression notwendige N-terminale Methionin.

Nach der Klonierung der cDNA für PCT 114 in einen Vektor der genannten Art und der Transformierung von E. coli mit diesem Vektor wurde Procalcitonin 3-116 exprimiert. Die periplasma­ tische Fraktion mit dem exprimierten Procalcitonin 3-116 wurde auf an sich bekannte Weise isoliert (Neu HC und Heppel LA (1965), The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroblasts, J. Biol. Chem. 240, 3685-3692). Nach einer Zentrifugierung (100.000 g, 30 min. 4°C) und Filtration des flüssigen Über­ stands (0,2 µm) wurde das erhaltene Filtrat durch Anionen- Austauschchromatographie aufgetrennt. Die Fraktionen mit Procalcitonin-Immunreaktivität wurden vereinigt und über Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt, wie im Zusammenhang mit der Isolierung von PCT 3-116 aus septischen Seren beschrieben wurde.

Alle Fraktionen mit Procalcitonin-Immunreaktivität wurden vereinigt und lyophilisiert. Wie eine Überprüfung des Mate­ rials mittels SDS-PAGE ergab, war das so gewonnene Material zu mindestens 95% sauber.

Die Identität des exprimierten und aufgereinigten Peptids als Procalcitonin 3-116 wurde durch Massenspektrometrie und Sequenzanalyse bestätigt.

Das erhaltene rekombinante Procalcitonin 3-116 stellt ein neues rekombinantes Peptid dar und kann in dieser Form zur Herstellung von Immunreagenzien verwendet sowie auf seine Eignung als Therapeutikum bzw. auf seiner Fähigkeit, im Sinne der o. g. Veröffentlichung (Eric S Nylen, a.a.O.) prophylaktisch und therapeutisch zu wirken, untersucht werden.

Zur Herstellung von Kalibratoren für PCT-Assays wurde das oben für die gentechnologische Herstellung von Procalcitonin 3-116 beschriebene Verfahren in im wesentlichen identischer Form auch zur Herstellung des vollständigen Procalcitonins 1-116 und des Procalcitonins 2-116 eingesetzt.

C. Ermittlung der Dipeptidyl-Aminopeptidase IV (DAP IV)- Aktivität in humanen Normalseren bzw. Seren von Patien­ ten mit schwerer Sepsis

Jeweils 20 Serumproben von gesunden Normalpersonen sowie von Sepsispatienten wurden auf ihre für Dipeptidyl-Aminopep­ tidase IV-spezifische Enzymaktivität untersucht. Die DAP IV- Enzymaktivität wurde auf an sich bekannte Weise fluorome­ trisch unter Verwendung von Lys-Pro-4-Methoxybeta-naphthyl­ amid vermessen. Dazu wurden jeweils 2 µl des zu überprüfen­ den Serums mit 3 ml Substrat (50 µg/ml Lys-Pro-4-Methoxy­ beta-naphylamid, 50 mM Tris/HCl, pH 7,5) vermischt, und die auftretende Fluoreszenz wurde kontinuierlich unter Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 340 nm bei einer Emissions­ wellenlänge von 410 nm gemessen. Das Fluoreszenzsignal wurde mittels einer 4-Methoxy-naphthylamin-Lösung kalibriert. Die auf diese Weise ermittelte Enzymaktivität wird in nmol/- min angegeben.

Die erhaltenen Ergebnisse sind Fig. 3 dargestellt.

Es ist klar zu erkennen, daß die DAP IV-Enzymaktivität in den Sepsis-Seren deutlich niedriger liegt als in den Seren von gesunden Normalpersonen (Blutspenderseren). Damit läßt sich die Bestimmung der DAP IV-Enzymaktivität im Plasma oder Serum auch zur Erkennung von Sepsis in Patientenseren her­ anziehen.

Die bei Sepsis deutlich erniedrigte Plasmakonzentration an DAP IV kann einerseits als Beleg dafür angesehen werden, daß DAP IV an einem Sepsis-Geschehen mitbeteiligt ist. Anderer­ seits deuten die Ergebnisse darauf hin, daß es nicht die Konzentration an DAP IV im Plasma sein kann, die für die Bildung von Procalcitonin 3-116 verantwortlich ist. Die erhaltenen Ergebnisse legen vielmehr den Schluß nahe, daß Procalcitonin 3-116 durch gewebs- bzw. zellgebundene DAP IV, möglicherweise intrazellulär, gebildet und aus Procalcito­ nin-erzeugenden oder speichernden Zellen freigesetzt wird.

Die der Literatur entnehmbare Information, daß DAP IV von aktivierten T-Zellen exprimiert wird, (vergleiche Hegen und Oravecz, Protein-Reviews on the WEB; Fleischer, a.a.O.) deutet auf einen engen Zusammenhang zwischen der Expression von DAP IV und dem Aktivierungszustand des Immunsystems hin, das bei einer septischen systemischen Infektion extrem belastet ist und daher typische Reaktionen zeigt, die sich u. a. in einer stark erhöhten Procalcitonin 3-116 Bildung äußern.

Abgesehen von den sich aus den obigen Befunden ergebenden Möglichkeiten, DAP IV im Rahmen der Sepsis-Diagnose zu bestimmen, können die obigen Ergebnisse auch darauf hindeu­ ten, daß die bei einer Sepsis kaskadenartig ablaufenden Vorgänge durch DAP IV-Hemmstoffe therapeutisch zu beeinflußt werden können, wodurch es möglich sein könnte, die Freiset­ zung von Procalcitonin 3-116 sowie anderen Hormonen oder konvertierten Prohormonen unter Sepsis zu verhindern oder zu vermindern, so daß pathologische Konsequenzen dieser Prohormonfreisetzung vermindert oder vermieden werden kön­ nen.

D. Bestimmung der Konzentrationen anderer Prohormone als Procalcitonin bei Sepsis am Beispiel der Bestimmung von proGRP

Die Tatsache, daß bei Sepsis nicht das vollständige Prohor­ mon Procalcitonin, sondern das um ein Xaa-Pro-Dipeptid verkürzte Prohormon freigesetzt wird, sowie die Feststel­ lung, daß DAP IV im Rahmen eines Sepsis-Geschehens eine Rolle zu spielen scheint, führte zu der Hypothese, daß bei Sepsis nicht nur Procalcitonin 3-116 freigesetzt wird, sondern daß Procalcitonin 3-116 nur ein Vertreter aus einer ganzen Gruppe von Prohormonen oder ähnlichen Peptiden, z. B. solchen mit immunmodulatorischen Eigenschaften, ist, die bei Sepsis in erhöhtem Maße und vermutlich in konvertierter Form freigesetzt werden, möglicherweise unter dem Einfluß einer veränderten DAP IV-Aktivität.

Eine Überprüfung bekannter Prohormone und der für diese Prohormone der Literatur entnehmbaren Aminosäuresequenzen zeigte, daß tatsächlich bei den meisten bekannten Prohormo­ nen am Aminoterminus ein Dipeptid zu finden ist, daß als Xaa-Pro definiert werden kann und das daher in einem ähn­ lichen Sinne, wie beim Procalcitonin beobachtet, von DAP IV abgespalten werden kann. Im einzelnen finden sich am Amino­ terminus sehr vieler Prohormone oder Immunmodulatoren Dipep­ tide des genannten Typs. Die nachfolgende tabellarische Übersicht über Literaturdaten gibt einen Überblick über einige ausgewählte Prohormone bzw. Immunmodulatoren, das bei diesen zu am Amino-Terminus zu findende Dipeptid sowie ihre Gesamtzahl der Aminosäuren.

Die in der Tabelle 2 aufgeführten Prohormone stellen Bei­ spiele für Prohormone dar, deren Konzentrationen bei Sepsis erhöht sein können, ohne daß die Aufzählung als erschöpfend anzusehen ist. Bei den Immunmodulatoren ist mit einer Beein­ flussung der Aktivität durch Abspaltung eines Dipeptids zu rechnen.

Tabelle 2

Die bisherigen experimentellen Befunde deuten auf die Mög­ lichkeit hin, daß unter dem Einfluß DAP VI bei den komplexen. physiologischen Reaktionen des Immunsystems, wie sie bei einer systemischen Infektion wie Sepsis ablaufen, Prohormone und/oder Peptid-Immunmodulatoren wie Interleukine unter Ab­ spaltung von Dipeptiden am Amino-Terminus freigesetzt und möglicherweise in ihre physiologisch aktive Form überführt werden, die durch Wechselwirkung mit zugehörigen spezifi­ schen Rezeptoren oder anderen Bindern weitere Folgeschritte in der Kaskade einer Immunantwort auslösen.

Wenn eine derartige Annahme richtig ist, könnten bei Sepsis auch die Konzentration anderer Prohormone als Procalcitonin signifikant erhöht sein.

Es wurde daher parallel zu einer Procalcitonin-Bestimmung in Normalseren und Seren von Sepsis-Patienten auch die Bestim­ mung eines weiteren, eher willkürlich ausgewählten Prohor­ mons, nämlich des pro-Gastrin-Releasing Peptide (proGRP) durchgeführt, für dessen Bestimmung ein Assay im Handel ist und das in einer jüngeren Veröffentlichung als Tumormarker beim kleinzelligen Bronchialkarzinom beschrieben wird (Petra Stieber et al. J Lab Med 1997, 21(6): 336-344). Ein Assay zur Bestimmung von ProGRP wird von der Tonen Corporation unter der Bezeichnung ProGRP ELISA KIT^TM im Handel angeboten.

Unter Verwendung dieses Kits wurden unter Einhaltung der Arbeitsweisen, die in den Gebrauchsinformationen des jewei­ ligen kommerziellen Kits vorgeschrieben wurden, die in Fig. 4 dargestellten Meßergebnisse erhalten.

Ein Vergleich der für Procalcitonin einerseits und ProGRP andererseits erhaltenen Werte zeigt, daß bei Procalcitonin die Unterscheidung zwischen Normalseren und Sepsis-Seren zwar eindeutiger ist, daß aber die ProGRP-Konzentrationen in weitgehend ähnlicher Weise erhöht ist wie die von Procalci­ tonin.

Eine ähnliche Prüfung z. B. der anderen Prohormone und Pep­ tid-Immunmodulatoren der o. g. Aufstellung kann sofort zei­ gen, welche der aufgeführten Substanzen bei Sepsis ähnlich wie PCT erhöht sind. Die genannte Prüfung ist angesichts der hierin offenbarten Ergebnisse als Routinemaßnahme anzusehen, und wenn derartige Prüfungen zu positiven Ergebnissen füh­ ren, wurde von der Lehre der vorliegenden Anmeldung Gebrauch gemacht.

Claims (10)

1. Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung und Erkennung, zur Beurteilung des Schweregrads und zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung von Sepsis und schweren Infektionen, insbesondere sepsisähnlichen systemi­ schen Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit eines Patienten den Gehalts mindestens eines Peptid-Prohormons, das nicht Pro­ calcitonin ist, und/oder eines sich davon ableitenden Teil­ peptids, das nicht das aus dem Peptid-Prohormon erhältliche eigentliche Hormon ist, bestimmt und aus der festgestellten Anwesenheit und/oder Menge des bestimmten Prohormons auf das Vorliegen einer Sepsis oder sepsisähnlichen systemischen Infektion, ihren Schweregrad und/oder den Erfolg einer therapeutischen Behandlung schließt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid-Prohormon ausgewählt ist aus pro-Gastrin-Relea­ sing Peptid (proGRP), pro-Endothelin-1, pro-Brain-Natriure­ tic-Peptid (pro-BNP), pro-Atrial-Natriuretic-Peptid (Pro- ANP), pro-Leptin, pro-Neuropeptid-Y, pro-Somatostatin, pro- Neuropeptid-YY, pro-Opiomelanocortin oder pro-Adrenomedul­ lin.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bestimmung ein Teilpeptid erfaßt wird, das sich von dem bekannten vollständigen Pro­ hormon-Peptid durch das Fehlen eines solchen Dipeptids am Amino-Terminus unterscheidet, wie es von der Dipeptidyl- Aminopeptidase IV (DP IV oder DAP IV oder CD26) vom Ende eines Peptids abspaltbar ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Dipeptid ein Xaa-Pro-Dipeptid ist, wobei Xaa für die aminoterminale Aminosäure des vollständigen Prohormon-Pep­ tids steht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung als Immunoassay oder Präzipitationsassay durchführt und auf Sepsis oder sepsis­ ähnliche schwere Infektionen schließt, wenn die Konzentra­ tion des bestimmten Peptid-Prohormons signifikant über den Werten liegt, die bei gesunden Normalpersonen beobachtet werden können.

6. Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Erkennung des Schweregrads und zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung von Sepsis und sepsisähnlichen systemi­ schen Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer serum- oder Plasmaprobe eines Patienten den Gehalt an Dipep­ tidyl-Peptidase IV (DP IV; Dipeptidyl-Aminopeptidase IV; DAP IV oder CD 26) bestimmt und aufgrund einer gegenüber gesun­ den Normalpersonen signifikant erniedrigten Konzentration das Vorliegen einer Sepsis oder sepsisähnlichen systemischen Infektion diagnostiziert.

7. Gentechnologisch hergestelltes Procalcitonin 3-116.

8. Verfahren zur gentechnologischen Herstellung von Pro­ calcitonin 3-116, bei dem man eine für die 114 Aminosäuren des Procalcitonins 3-116 codierende cDNA-Sequenz in einen geeigneten Vektor inseriert, mit dem gebildeten Vektor geeignete Wirtszellen transformiert, so daß diese Procalci­ tonin 3-116 exprimieren, daß man die Wirtszellen aufarbeitet und eine das exprimierte Procalcitonin 3-116 enthaltende Fraktion isoliert und daraus durch chromatographische Reini­ gung das gentechnologisch hergestellte Procalcitonin 3-116 in wenigstens 90%iger Reinheit gewinnt.

9. Verwendung von rekombinant hergestelltem Procalcitonin 3-116 als Kalibrator in Procalcitonin-Assays oder zur Her­ stellung von Therapeutika zur Vorbeugung und Behandlung von Sepsis und sepsisähnlichen systemischen Infektionen.

10. Verfahren zur Messung von Procalcitonin 3-116 als indikationsunabhängiger Diagnostikparameter.