DE19758598A1 - Verfahren zur Prüfung von Materialien hinsichtlich ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit und der Proliferation von Zellen auf ihrer Oberfläche - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Prüfung von Werkstoffen auf antimikrobielle Wirksamkeit sowie ein Verfahren zur Quantifizierung der Proliferation von Zellen auf Oberflächen bereit.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitati­ ven und qualitativen Untersuchung von Wechselwirkungen zweier Substanzen bzw. Reaktionspartner. Insbesondere können Werkstoffe (z. B. Biomaterialien) bzw. Beschichtungsmaterialien auf antimi­ krobielle Wirksamkeit getestet und diese quantifiziert werden; außerdem kann die Proliferation von lebenden Systemen, wie z. B. Mikroorganismen, auf Oberflächen, insbesondere den Oberflächen von Biomaterialien, quantifiziert werden. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, mit dem eine große Anzahl von Proben simultan unter identischen Bedingungen untersucht wer­ den kann.

In der Forschung und Industrie werden permanent neu- und weiter­ entwickelte Biomaterialien und Werkstoffe auf den Markt gebracht. In der Medizin umfassen diese Biomaterialien den Bereich der Pro­ thetik (Künstliche Gelenke, Klappen, Zahnersatz etc.) und der Intensivmedizin (Zu- und Abführleitungen, Katheter). Weitere ge­ nerelle Industrie-Entwicklungen umfassen Bereiche wie biologische Abbaufähigkeit von Kunststoffen (Umwelttechnik), Widerstandskraft und Haltbarkeit der Werkstoffe, sowie deren biochemische Eigen­ schaften (Inertheit, Hydrophobizität, Biokompatibilität etc.). Durch Forschung und Entwicklung werden Werkstoffe neu kreiert und Oberflächen modifiziert, um die gewünschten Eigenschaften zu erhalten.

Bei der Prüfung von Werkstoffen und Biomaterialien sind besonders die Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit der Werkstoffe/Bio­ materialien einerseits und die Quantifizierung der Adhäsion von (bio)chemischen Substanzen und Zellen auf Werkstoffoberflächen andererseits zu nennen.

Die Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit betrifft hauptsäch­ lich das Gebiet der Medizin. Die Implantation von Biomaterialien ist ein Meilenstein der modernen Medizin. Für den Patienten wer­ den durch Biomaterialien lebenserhaltende Aufgaben wahrgenommen. Gleichzeitig verbirgt sich bei der Anwendung eines der vordring­ lichsten Probleme in der Klinik: die fremdkörper-assoziierte In­ fektion, ausgelöst durch an sich harmlose Hautmikroorganismen, die das Implantat kolonisieren. In den USA werden jährlich allein bis zu 850000 katheterassoziierte Infektionen festgestellt. Die Folgekosten von Katheterinfektionen werden mit 3000-6000 US- Dollar pro Fall beziffert. Neben dem klinischen Bereich findet die Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit beispielsweise Ver­ wendung in der Bier- und Weinindustrie. Auch bei Küchen- und Bad/WC-Einrichtungen, Spülmitteln und Lotionen etc. ist ein Trend zu antimikrobiellen Materialien erkennbar, so daß auch auf diesen Gebieten ein wachsender Bedarf an Prüfungsmethoden für antimikro­ bielle Wirksamkeit besteht.

Die Entwicklung von Materialien mit antimikrobiellen Eigenschaf­ ten ist ein Schwerpunktthema für Forschung und Industrie und bie­ tet durch die Verhinderung von Infektionen das Potential zur Ret­ tung von Menschenleben und zu Einsparungen in Milliardenhöhe. Die Zahl eingeführter neuer Produkte mit antimikrobiellen Eigenschaf­ ten steigt stetig.

Die Quantifizierung der Adhäsion von lebenden Systemen und (bio)chemischen Substanzen auf Werkstoffoberflächen findet sich mit dem gleichen Stellenwert sowohl in der medizinischen For­ schung und Entwicklung als auch in der chemischen/biochemischen Industrie und Werkstoffwissenschaft.

Eine antimikrobielle Wirksamkeit (Aktivität) eines Werkstoffs oder einer Substanz kann grundsätzlich auf zwei, voneinander zu trennende, Eigenschaften des Materials zurückzuführen sein:

• - entweder das Material läßt eine mikrobielle Besiedelung bzw. Anhaftung nicht zu, oder
• - das Material entfaltet Eigenschaften, die zur Abtötung von Mikroorganismen führen, die das Material besiedelt haben.

Die Eigenschaft eines Stoffs, Mikroben abzutöten, muß in vitro in einem Versuchsmodell nachvollziehbar sein (Qualitätskontrolle oder "Screening"). Bei einem entsprechenden Test wird das Mate­ rial zuerst mit Mikroorganismen besiedelt und anschließend das Wachstumsverhalten (Proliferation und Vitalität) der Mikroorga­ nismen verfolgt.

Bei der Quantifizierung der Adhäsion von lebenden Systemen oder (bio)chemischen Substanzen wird die Probe mit dem zu untersuchen­ den Material inkubiert (in vitro), um das Adhäsionsverhalten (Affinität und Chemie der Wechselwirkung) studieren zu können.

Entsprechende Testverfahren sollen idealerweise folgenden Anfor­ derungen genügen:

• - Zur Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit sollten potentiell antimikrobielle Probe und Kontrolle (Probe ohne antimikrobielle Wirkung) unter simultanen Versuchsbedingungen gegenübergestellt werden können.
• - Um eine aussagekräftige Statistik und Fehlerrechnung zu ermög­ lichen und aus Gründen der Ökonomie soll das Verfahren die gleichzeitige Prüfung einer hohen Anzahl von Proben (ca. 100 Pro­ ben) ermöglichen.
• - Für vergleichende quantitative Aussagen muß sichergestellt sein, daß bei allen Proben eine definierte, gleichgroße Fläche gemessen wird.
• - Das Verfahren soll schnell, reproduzierbar (d. h. mit minimalem statistischen Fehler) und kostengünstig sein.
• - Das Verfahren soll in der Lage sein, geringste Unterschiede in den Aktivitäten verschiedener Proben zu erfassen, d. h. hoch sen­ sitiv sein.
• - Die Auswertung der Daten sollte durch ein EDV-gesteuertes auto­ matisiertes Auswerteverfahren erfolgen.
• - Das Wachstumsverhalten (Proliferation) der Mikroorganismen auf den Proben sollte zeitaufgelöst (online) z. B. durch Photometrie (d. h. Messung der optischen Dichte) auswertbar sein.

Bis heute gibt es kein Verfahren, das die oben angesprochenen An­ forderungen auch nur annähernd erfüllt. Die Verfahren, die bis zum heutigen Zeitpunkt in der Wissenschaft/Forschung und Entwick­ lung zur Prüfung von Biomaterialien Anwendung finden, sind nicht eindeutig definiert und mit großen Fehlern behaftet und daher wenig aussagekräftig; außerdem sind sie nicht ökonomisch.

Bekannt sind folgende Methoden:
Eine weltweit angewandte Methode ist der "Semiquantitative" Keimnachweis auf der Oberfläche von Biomaterialien durch Ausroll­ technik nach Maki (Maki D. G., C. E. Weise, H. W. Sarafin: A semi- quantitative culture method for identifying intravenous catheter related infection. N. Engl J. Med. 296 (1977), 1305-1309). Dabei wird das zu prüfende Biomaterial unter möglichst sterilen Bedin­ gungen manuell auf einer Agarplatte mit einer Pinzette hin- und hergerollt (eine Probe pro Agarplatte). Nach anschließender Be­ brütung der Agarplatte kann über das bakterielle Wachstum "semi­ quantitativ" (durch Zählen der Kolonien) die antimikrobielle Wirksamkeit oder Adhäsions-Eigenschaft des Biomaterials bestimmt werden.

Diese Methode weist folgende Nachteile auf:
Die manuelle Durchführung ist nicht zu 100% reproduzierbar; au­ ßerdem bestehen keine simultanen Durchführungsbedingungen. Das Verfahren ist unökonomisch und mit einem hohen statistischen Feh­ ler belegt. Des weiteren gibt es keine definierte Meßfläche.

Ein weiteres Verfahren ist die Flush-Technik nach Cleri et al., (Cleri D. J., M. L. Corrado, und S. J. Seligman:
Quantitative culture of intravenous catheters and other intra­ vaskular inserts. J. Infect. Dis. 141 (1980), 781-786) bei der Biomaterialien (Schläuche) durchspült werden, das Eluat in ver­ schiedenen Verdünnungsstufen (manuell) auf Agarplatten plattiert und die Keimzahlen ausgezählt werden.

Die Methode weist die gleichen Nachteile auf wie die oben be­ schriebene von Maki.

Auch die Ultraschallbehandlung nach Sherertz (Sherertz R. J. et al., 1990: three-Year experience with sonicated vascular catheter cultures in a clinical microbiology laboratory. Jour. of clin. microbiology (1990), 76-82), bei der Bakterien auf der Oberflä­ che von Biomaterialien durch Ultraschall abgelöst (in Bouillon) und anschließend durch Ausplattieren die Anzahl der Keime be­ stimmt wird, findet Verwendung.

Abgesehen von unzureichenden Kenntnissen der Wirkungen von Ultra­ schall auf Mikroorganismen weist diese Methode ebenfalls die oben beschriebenen Nachteile auf.

Auch Hemmhofmessungen, bei denen die Zone der Inhibition mikro­ biellen Wachstums gemessen wird, finden Verwendung (Raad I., R. Darouche, R. Hachem, M. Mansouri, G. P. Bodey: The broad-spectrum activity and efficacy of catheters coated with minocycline and rifampin. J. Infec Dis. 173 (1996), 418-424; und Sampath L. A. et al., 1995: Infection resistance of surface modified catheters with either short-lived or prolonged activity. Jour. of hosp. infection (1995), 201-210). Die Hemmhofmessung ist zur Beurtei­ lung der Besiedelbarkeit von Materialien nur eingeschränkt geeig­ net, weil die potentielle Aktivität unmittelbar auf der Oberflä­ che nicht erfaßt wird. Ein fehlender Hemmhof muß nicht zwangsläu­ fig eine fehlende antimikrobielle Aktivität bedeuten.

Die beschriebenen Verfahren basieren auf Techniken der klassi­ schen Mikrobiologie. Keines der Verfahren erfüllt jedoch die oben angesprochenen Anforderungen. Die Hauptangriffspunkte der aufge­ führten Methoden sind die unzureichend beschriebene Reproduzier­ barkeit, die unvollständige Fehlererfassung der Methode und die fehlende simultane Versuchsdurchführung. Überaus ungenügend ist in vielen Arbeiten die Beschreibung "semiquantitativ", womit die verwendete Methode sich selbst als unzureichend deklariert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Weg aufzu­ zeigen, wie die antimikrobielle Wirksamkeit von gegebenenfalls vorbehandelten Werkstoffen, insbesondere Biomaterialien, getestet werden kann und eine Quantifizierung der Proliferation von Mikro­ organismen und Zellen auf Oberflächen möglich ist, wobei die oben genannten Anforderungen erfüllt sind. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Prüfung so durch zuführen, daß eine große Anzahl von Proben unter identischen Bedingungen simultan unter­ sucht werden kann.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den im Anspruch 1 angegebenen Merkmalen gelöst.

Eine Prüfung von Werkstoffen auf antimikrobielle Wirksamkeit um­ faßt:

• a) Bereitstellung einer Werkstoffprobe definierter Geometrie und Größe,
• b) Inkubation der Probe mit einer Lösung, die den zu testenden Mikroorganismus enthält (Besiedelung der Probe mit dem Mikroorganismus),
• c) Überführung der Probe in ein für den entsprechenden Mikro­ organismus geeignetes Minimalmedium (Entfaltung der potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit),
• d) Überführung der Probe in eine für den Mikroorganismus geeig­ nete Nährlösung (Nachweis des Ausmaßes der antimikrobiellen Wirk­ samkeit),
• e) Bestimmung der optischen Dichte der Nährlösung nach Entnahme der Probe (Endpunktmessung), oder
• f) Entnahme der Probe und Zugabe von 1 bis 1/2000 Volumenanteil Vollmedium zum Minimalmedium,
• g) zeitaufgelöste Bestimmung der optischen Dichte des Mediums (Kinetik).

Fig. 1 zeigt die bakterielle Proliferation, die bei der Prüfung der antimikrobiellen Wirksamkeit gemäß Beispiel 1 nachvollzogen. wird. (1) Prüfling, (2) Proliferation von Mikroben oder Zellen, (3) vitale Tochterzelle, die in das umgebende Milieu entlassen wird.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 1, wie sie die Software des Mikrotiterplatten-Lesegeräts darstellt.

Beim Verfahren zur Prüfung von Werkstoffen auf antimikrobielle Wirksamkeit können die verschiedensten Arten von Werkstoffen ge­ testet werden; besonders interessant ist die Verwendung von Bio­ materialien, d. h. Materialien, die in der Prothetik und Intensiv­ medizin eine Rolle spielen. Die Proben können z. B. in Form von Kunststoff-Schläuchen, Strängen, Borsten und Kügelchen vorliegen. Auch Stoffe und Papiere, wie z. B. Taschentücher, Babywindeln und Tücher für den Klinikbereich können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden. Wichtig für vergleichende Aussagen ist, daß die zu vergleichenden Proben alle die gleiche Geometrie und Größe aufweisen, damit Effekte, die auf unterschiedliche Geo­ metrie und Größe zurückzuführen wären, ausgeschlossen werden kön­ nen. Die zu untersuchenden Proben können auf antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber den unterschiedlichsten Bakterien, Pilzen und Hefen getestet werden. Wichtig im medizinischen Bereich ist z. B. die Wirksamkeit gegenüber Staphylokokken.

Bei den erfindungsgemäß zu untersuchenden Werkstoffproben kann es sich auch um vorbehandelte Werkstoffe handeln; unter Vorbehand­ lung wird z. B. auch eine Beschichtung mit Anstrichen oder Lacken aber auch mit Proteinen oder Detergenzien verstanden. Bei be­ schichteten Werkstoffen ist dann genaugenommen das Beschichtungs­ material die zu untersuchende Probe. Auf diese Weise ist es z. B. möglich, auch Flüssigkeiten und Lotionen auf potentielle anti­ mikrobille Wirksamkeit zu testen. Der "Werkstoff" stellt dann nur einen Träger dar; wichtig ist dabei allerdings, daß eine gleich­ mäßige Beschichtung erreicht wird, bevor die Probe erfindungsge­ mäß getestet werden kann.

Entscheidend für das Verfahren zur Prüfung der antimikrobiellen Wirksamkeit ist die Inkubation mit einem Minimalmedium zur Ent­ faltung und zum Nachweis der potentiellen Aktivität. Das zu ver­ wendende Minimalmedium hängt von dem verwendeten Mikroorganismus ab und kann individuell zusammengesetzt werden, sofern gewährlei­ stet ist, daß das Medium ausreicht, um den Mikroorganismus am Le­ ben zu erhalten aber die Zellteilungsrate stark reduziert ist. Die Inkubationszeit mit dem Minimalmedium kann beliebig variiert werden und z. B. im Bereich von 2 bis 50 Stunden liegen.

Danach wird die Probe in eine Nährlösung ("Vollmedium") über­ führt, die dann einen Proliferationsreiz für den Mikroorganismus darstellt. Die Nährlösung richtet sich nach dem verwendeten Mi­ kroorganismus und kann entweder der Fachliteratur entnommen oder im Labor individuell zusammengestellt werden. Bei der Prolifera­ tion von Zellen auf Oberflächen werden vitale Zellen ins Medium entlassen, was zu einer Trübung führt. Diese Trübung (optische Dichte) kann photometrisch erfaßt werden: Je trüber das Medium ist, desto mehr vitale Zellen wurden abgegeben, d. h. desto gerin­ ger ist die antimikrobielle Wirksamkeit der geprüften Probe.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform wird die Probe aus dem Minimalmedium entfernt und 1 bis 1/100 Volumenanteil, bevorzugt 1 bis 1/10 Volumenanteil Vollmedium zum Minimalmedium zugegeben; danach erfolgt die zeitaufgelöste Bestimmung der optischen Dichte des Mediums (Kinetik). Die online entstehenden Wachstumskurven (EDV-überwacht) reflektieren das Ausmaß der antimikrobiellen Wirksamkeit.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine große Anzahl von Proben (bis 384) simultan untersucht werden, wenn Proben gleicher Geometrie und Größe in eine handelsübliche Mikrotiterplatte mit 96 bis 384 Vertiefungen oder eine entsprechende Vorrichtung ein­ gebracht werden. Die Bestimmung der optischen Dichte kann mit einem kommerziellen EDV-gesteuerten Mikrotiterplatten-Lesegerät erfolgen. Anstelle einer Endpunktmessung kann auch eine zeitauf­ gelöste online Messung erfolgen.

Durch Zugabe kleiner Mengen (1 bis 1/2000 Volumenanteil, bevor­ zugt 1/25 bis 1/1000 Volumenanteil) Vollmedium zum Minimalmedium kann die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter ge­ steigert werden. Dadurch wird die Vitalität der Mikroorganismen so eingestellt, daß auch geringste antimikrobielle Aktivitäten der Probe nachweisbar sind.

Das beschriebene Verfahren wird mit losen Proben durchgeführt, wie das unten beschriebenen Beispiel 1 zeigt. Die Proben werden dabei manuell mit einer sterilen Pinzette von einem Reaktions­ gefäß zum nächsten überführt.

Die einheitliche Geometrie der Proben ist vorzugsweise zylin­ drisch; jedoch sind auch andere Formen wie bananenförmig, birnen­ förmig oder quaderförmig möglich sofern alle Proben die gleiche Geometrie und Größe aufweisen. Der maximale Durchmesser der Pro­ ben ist vorzugsweise so groß wie die Hälfte des Durchmessers der Vertiefungen oder kleiner.

Bei der vorliegenden Erfindung werden antimikrobielle Werkstoffe einer Kontrolle (Werkstoff ohne antimikrobielle Wirkung) unter simultanen Versuchsbedingungen gegenübergestellt. Durch die gleichzeitige Untersuchung einer hohen Anzahl von Proben (z. B. 96 Proben) ist eine aussagekräftige Statistik und Fehlerrechnung möglich und das Verfahren ist außerdem sehr ökonomisch.

Das Verfahren zeichnet sich außerdem dadurch aus, daß bei allen Proben eine definierte gleich große Fläche gemessen wird, wodurch vergleichende quantitative Aussagen möglich sind.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß gering­ ste Unterschiede in der Aktivität erfaßt werden können und das Verfahren damit hochsensitiv ist.

Die Anwender-Freundlichkeit des bereitgestellten Verfahrens ist mit "sehr hoch" einzustufen. Die technischen Anforderungen (Ge­ räte, Software, Laboratorien usw.) zur Anwendung des Verfahrens gehören zur Grundausstattung von Forschungseinrichtungen und er­ fordern keine weiteren größeren Investitionen. So ist z. B. die 96-Loch Mikrotiterplatte mit Deckel, die als Probengefäß dient, seit mehr als 20 Jahren Industriestandard und die EDV-gesteuerte Analyse übernimmt ein herkömmliches Mikrotiterplatten-Lesegerät (gleichzeitig Photometer und "Plattenreader").

Das Verfahren kann in allen Bereichen zur Anwendung gelangen, die sich mit der Entwicklung/Prüfung von Werkstoffen/Biomaterialien, auch von Arzneimittel wie Salben und Lotionen und Oberflächenbe­ schichtungen in Form von Anstrichen, Lacken etc. oder Detergen­ zien, befassen oder die die Wechselwirkung einer Matrix mit Mi­ kroorganismen studieren (Adhäsion), z. B. in der Großindustrie, der Biomedizin und Pharmaindustrie, in mittelständischen Indu­ strieunternehmen, der Lebensmittelindustrie, in Hochschulen, so­ wie in Forschungseinrichtungen für angewandte Forschung und Grundlagenforschung. Die Verfahren können bei der Produktentwick­ lung, -verbesserung und Qualitätskontrolle eingesetzt werden.

Das folgende Beispiel erläutert die Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit von Biomaterialien (Beispiel 1).

In der Klinik für Kinder und Jugendliche der Universität Erlan­ gen-Nürnberg wird seit ca. 5 Jahren an der Entwicklung neuer Ka­ thetermaterialien mit antimikrobieller Wirksamkeit gearbeitet (siehe oben zur Problematik der Katheterinfektionen). Durch Ein­ bringung von Silber in das aus Polyurethan bestehende Katheter­ material wurde ein neues antimikrobielles Biomaterial entwickelt. Mit dem Mikrotiterplatten-Kamm-Modell wurde der neue Katheter- Werkstoff auf antimikrobielle und antiadhäsive Eigenschaften ge­ prüft und Kontrollkathetern gegenübergestellt (silberfreie kom­ merzielle Katheter).

Fig. 1 erläutert schematisch die bakterielle Proliferation 2, wie sie im Verfahren nachvollzogen wird. Es ist eine Probe 1 so­ wie eine an das Medium abgegebene vitale Zelle 3 gezeigt.

Die Fig. 2 zeigt den Ausdruck der Ergebnisse von Beispiel 1, wie er vom EDV-gesteuerten Mikrotiterplatten-Lesegerät erhalten wird.

Beispiel 1 Proliferationsassay zur Prüfung der antibakteriellen Wirksamkeit von Silberpolyurethan (Fig. 2)

Es wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt:

• 1. Bereitstellung von losen Proben: 12 identische Proben Polyu­ rethan (ohne Silber), 12 identische Proben Silberpolyurethan-Pro­ totype I, 12 identische Proben Silberpolyurethan-Prototyp II (alle Prüflinge haben die gleichen Abmessungen) wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gelegt. Die Proben waren zy­ linderförmig mit einer Länge von 1.1 cm und einem Durchmesser von 2 mm.
• 2. Füllen der Mikrotiterplatte mit 20 µl Bakterienlösung pro Ver­ tiefung (Testkeim Staphylokokkus epidermidis, 108 logphase Zellen pro ml Inkubationsmedium (handelsübliches Trypcase Soja) wurden 1 : 20 mit physiologischem Puffer (Phosphat) verdünnt).
• 3. Inkubation bei 37 C für 60 Minuten (37 C).
• 4. Absaugen der Bakterien und 3-maliges Waschen der Probe mit physiologischem Puffer.
• 5. Setzen der Probe in eine mit Minimal-Medium (physiologischer Phosphat-Puffer mit 0.25% Glucose, 0.2%(NH4)SO4, 1% Trypcase Soja Medium) gefüllte Mikrotiterplatte (200 µl/well), Inkubation für 24 Stunden bei 37 C (Nachweis der Proliferationsaktivität, Fig. 1 entsprechend).
• 6. Entnahme und Verwurf der Probe. Zugabe von 50 µl/well Vollme­ dium (Trypcase Soja) zur Titerplatte. Kontinuierliche Trübungs­ messung (48 Stunden, Interval 30 min, 37 C, 578 nm) in einem geeig­ neten Lesegerät. Aufzeichnung der Kinetik der bakteriellen Pro­ liferation.
• 7. Interpretation der Wachstumskurven (Fig. 2) oder statt Nr. 6 und 7
• 8. Überführung der Probe in ein Vollmedium.
• 9. Nach entsprechender Inkubationszeit Entnahme der Probe und Messen der Optischen Dichte.

Die Wachstumskurven zeigen folgendes Ergebnis (Fig. 2):
Reihen 1/2: Polyurethan ohne Silber zeigt keine antimikrobielle Aktivität. Alle Prüflinge zeigen ein rapides logarithmisches Wachstum der Bakterien.
Reihen 3/4: Polyurethan-Silberprototype I zeigt antimikrobielle Aktivität. Alle Prüflinge zeigen eine deutlich verlängerte Lag­ phase. Die ausgedehnte Lagphase deutet auf eine stark verminderte Proliferation der Bakterien. Die Prüflinge zeigen bakteriostati­ sche Aktivität.
Reihe 5/6: Polyurethan-Silberprototyp II zeigt hohe antimikro­ bielle Aktivität. Alle Prüflinge zeigen sich steril, Bakterien wurden vollständig abgetötet, eine Proliferation ist nicht nach­ weisbar. Die Prüflinge zeigen somit bakterizide Aktivität.

Claims (3)

1. Verfahren zur Prüfung der Proliferation von Mikroorganismen, Viren und/oder Zellen auf losen Proben, bei dem die Proben indi­ viduell in einem Gefäß mit den Zellen zwecks Besiedelung inku­ biert werden, gekennzeichnet durch folgende Verfahrens­ schritte:

• a) Bereitstellung einer Vielzahl von losen Proben vorgegebener Geometrie und Größe,
• b) Inkubation der Proben mit einer Lösung, die die zu testenden Zellen enthält,
• c) Überführung der Proben in ein für die Zellen geeignetes Mini­ malmedium,
• d) Überführung der Proben in eine für die Zellen geeignete Nährlösung,
• e) Inkubation und anschließende Bestimmung der optischen Dichte der Nährlösung nach Entnahme der Proben, oder
• f) Entnahme der Proben und Zugabe eines angemessenen Volumenan­ teils Vollmedium zum Minimalmedium,
• g) zeitaufgelöste Bestimmung der optischen Dichte des Mediums.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielzahl von Proben in die Vertiefungen einer Mikrotiter­ platte eingebracht werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der angemessene Volumenanteil 1 bis 1/2000 beträgt.