DD251998A5 - Process for the preparation of a peptide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids. Erfindungsgemaess wird ein Peptid hergestellt, das die Formel (I) aufweist: R1R2R3AlaR5R6R7R8R10R11R12R13LeuR15GlnLeuR18R19R20R21LeuLeuGlnGluR26R27R28ArgY worin R1 ist Tyr, DTyr, Met, Phe, DPhe, Leu, His oder DHis das entweder eine CaMe- oder NaMe-Substitution aufweist oder unsubstituiert ist; worin R2 gleich Ala oder D-Ala ist; R3 ist Asp oder DAsp; R5 ist Ile oder Leu; R6 ist Phe oder Tyr; R7 ist Ser oder Thr; R8 ist Ser, Asn, Thr oder Gln; R9 ist Ala oder Ser; R10 ist Tyr, Phe oder Leu; R11 ist Arg, Orn oder Lys; R12 ist Arg, Orn oder Lys, R13 ist Ile, Leu, Phe oder Val; R15 ist Gly oder Ala; R18 ist Ala oder Ser; R19 ist Ser oder Ala; R20 ist Arg, Orn oder Lys; R21 ist Arg, Orn oder Lys; R26 ist Leu, Ile, Val oder Phe, R27 ist Nle, Nva oder eine natuerliche Aminosaeure; R28 ist Ala, Leu, Asn, Gln oder Ser; und Y ist OH oder NH2; mit der Massgabe, dass wenigstens vier der folgenden Reste R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R15, R18, R19, R20, R21 und R26 verschieden von den Resten sind, die in der entsprechenden Position natuerlicher hGRF auftreten.The invention relates to a process for the preparation of a peptide. According to the present invention, there is prepared a peptide having the formula (I): R1R2R3AlaR5R6R7R8R10R11R12R13LeuR15GlnLeuR18R19R20R21LeuLeuGlnGluR26R27R28ArgY wherein R1 is Tyr, DTyr, Met, Phe, DPhe, Leu, His or DHis which has either a CaMe or NaMe substitution or is unsubstituted; wherein R2 is Ala or D-Ala; R3 is Asp or DAsp; R5 is Ile or Leu; R6 is Phe or Tyr; R7 is Ser or Thr; R8 is Ser, Asn, Thr or Gln; R9 is Ala or Ser; R10 is Tyr, Phe or Leu; R11 is Arg, Orn or Lys; R12 is Arg, Orn or Lys, R13 is Ile, Leu, Phe or Val; R15 is Gly or Ala; R18 is Ala or Ser; R19 is Ser or Ala; R20 is Arg, Orn or Lys; R21 is Arg, Orn or Lys; R26 is Leu, Ile, Val or Phe, R27 is Nle, Nva or a natural amino acid; R28 is Ala, Leu, Asn, Gln or Ser; and Y is OH or NH 2; with the proviso that at least four of the following radicals R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R15, R18, R19, R20, R21 and R26 are different from the radicals in the corresponding position natural hGRF occur.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit Einfluß auf die Funktion der Hirnanhangdrüse bei Menschen und anderen Lebewesen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hersteilung von Peptiden, die die Freisetzung von Wachstumshormonen durch die Hypophyse beschleunigen. ·The present invention relates to a process for producing a peptide having an influence on the function of the pituitary gland in humans and other animals. In particular, the present invention relates to a method for the production of peptides which accelerate the release of growth hormone by the pituitary gland. ·

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß hergestellte Peptide enthalten, werden angewandt als Arzneimittel bei Mensch und Tier sowie für diagnostische Zwecke.Pharmaceutical compositions containing peptides prepared according to the invention are used as medicines in humans and animals as well as for diagnostic purposes.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Die Physiologen haben bereits seit längerer Zeit entdeckt, daß der Hypothalamus die Sekretfunktionen der Adenohypophysis mit vom Hypothalamus produzierten speziellen Substanzen steuert, die die Ausscheidung jedes Hypophysenhormons stimulieren oder inhibieren. Im Jahre 1982 wurden Humanpankreatische (Tumor-)freisetzende Faktoren (hpGRF) aus Extrakten humanpankreatischer Tumore extrahiert, gereinigt, bestimmt, synthetisiert und getestet, wobei gefunden wurde, daß sie die Freisetzung von GH durch die Hypophyse beschleunigen. Seit dieser Zeit wurden entsprechende hypothalamische GH-freisetzende Faktoren von anderen Arten Lebewesen und vom Menschen ebenso bestimmt und synthetisiert. Von menschlichen hypothalamischen GRF (hGRF) wurde gefunden, daß er dieselbe Formel wie hpGRF aufweist, nämlich: H—Tyr-Ala-Asp-Ala —Ile-Phe—Thr-Asn —Ser—Tyr—.··Physiologists have long discovered that the hypothalamus controls the secretory functions of adenohypophysis with hypothalamic-produced specific substances that stimulate or inhibit the secretion of any pituitary hormone. In 1982, human pancreatic (tumor) releasing factors (hpGRF) were extracted from human pancreatic tumor extracts, purified, assayed, synthesized and tested to be found to accelerate the release of GH by the pituitary gland. Since that time, corresponding hypothalamic GH-releasing factors have been similarly determined and synthesized by other species of life and humans. Human hypothalamic GRF (hGRF) has been found to have the same formula as hpGRF, namely: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-.

Arg-Arg- Leu-Leu-AIa-Gln-Leu-Äla-Ser-Arg-Arg-Leu' -Leu-Gln-Asp- lie- Met-Ser-Arg- Gin -Gin- GIy- Glu-Ser-Asn -Gin- GIu- Arg- GIy- AIa- Arg- AIa -Arg-Leu -NH₂.Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu '-Leu-Gln-Asp-lie-Met-Ser-Arg-Gin-Gin- Gly-Glu-Ser-Asn -Gin- GIu-Arg-GIy-AIa-Arg-Ala -Arg-Leu -NH ₂ .

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens, mit dem Peptide hergestellt werden können, die die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hypophyse beschleunigen.The aim of the invention is to provide a simple and economical method by which peptides can be produced which accelerate the release of growth hormone by the pituitary gland.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahrensschritte aufzufinden, welche die Herstellung des gewünschten Peptids ermöglichen.The invention has for its object to find process steps that allow the preparation of the desired peptide.

Erfindungsgemäß wurden synthetische Polypeptide, die Analoge von menschlichem GRF sind, synthetisiert und getestet, die GH von kultivierten Hypophysenzellen freisetzen. Diese Peptide weisen zumindest vier Unterschiede zu den Resten auf, die im natürlichen Hormon zwischen der 5-Position und der 26-Position auftreten.In accordance with the present invention, synthetic polypeptides that are analogs of human GRF have been synthesized and tested that release GH from cultured pituitary cells. These peptides have at least four differences from the residues occurring in the natural hormone between the 5-position and the 26-position.

Die Peptide können auch einen Rest in der 1-Position aufweisen, ausgewählt unter Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, Leu, His und D-His (wobei dieser Rest gegebenenfalls eine Methylsubstitution entweder am alpha-Kohlenstoff oder in der alpha-Aminogruppe aufweisen kann). Diese Peptide können gegebenenfalls D-AIa in der 2-Positioruund/oder D-Asp in der 3-Position haben. Die Peptide weisen vorzugsweise eine Substitution wie Leu, Nie oder Nva für Met in der 27-Position auf.The peptides may also have a residue in the 1-position selected from Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, Leu, His and D-His (which radical may optionally be methyl substituted on either the alpha carbon or in the the alpha-amino group may have). These peptides may optionally have D-Ala in the 2-positioru and / or D-Asp in the 3-position. The peptides preferably have a substitution such as Leu, Nie or Nva for Met in the 27-position.

Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten derartige Analoge, die etwa 29 Reste in der Länge darstellen oder ein nichttoxisches Salz eines dieser, dispergiert in einem pharmazeutisch oder vom tiermedizinischen Standpunkt aus annehmbaren flüssigen oder festen Trägerstoff.Pharmaceutical compositions according to the invention contain such analogs which are about 29 residues in length or a non-toxic salt of any of these dispersed in a pharmaceutically or veterinarily acceptable liquid or solid carrier.

Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können in der klinischen Medizin, sowohl bei Mensch als auch bei Tier, für therapeutische und auch diagnostische Zwecke eingesetzt werden.Such pharmaceutical compositions can be used in clinical medicine, both human and animal, for therapeutic as well as diagnostic purposes.

Die verwendete Nomenklatur zur Definition der Peptide entspricht der von Schroder & Lubke, „The Peptides", Academic Press (1965), worin in Übereinstimmung mit der üblichen Darstellung die Aminogruppe am N-Terminus links und die Carboxygruppe am C-Terminus rechts erscheint. Unter natürlichen Aminosäuren sind solche üblichen, natürlich auftretenden Aminosäuren zu verstehen, die in Proteinen gefunden werden, wie GIy, Ala, VaI, Leu, He, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, GIu, GIn, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp und His. Mit Nie ist Norleucin gemeint und mit Nva Norvalin. Wenn die Aminosäurereste isomere Formen aufweisen, ist es die L-Form der Aminosäure, die dargestellt wird, sofern nichts anderes ausdrücklich genannt wird.The nomenclature used to define the peptides corresponds to that of Schroder & Lubke, "The Peptides", Academic Press (1965), which, in accordance with the usual presentation, the amino group appears at the N-terminus on the left and the carboxy group on the C-terminus on the right Natural amino acids are understood to be those common, naturally occurring amino acids found in proteins such as Gly, Ala, VaI, Leu, He, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, GIn, Cys, Met, Phe Nor is Norleucin meant and Nva Norvalin.When the amino acid residues have isomeric forms, it is the L-form of the amino acid that is shown unless expressly stated otherwise.

Die Erfindung betrifft synthetische Peptide mit der folgenden Sequenz:The invention relates to synthetic peptides having the following sequence:

R₁ - R₂-R3-Ala-R₅-R₆-Ji₇-R₈-Rg-Rio-Rn-Ri₂-FIi₃-Leu-R₁₅-GIn-Leu-R,S-R₁₉-R₂₀-R₂I-LeU-Leu-Gin-GIu-R₂₆-R₂₇-R₂S-R₂8-^Ar9-^Y R ₁ -R ₂ -R 3-Ala-R ₅ -R ₆ -Ji ₇ -R ₈ -Rg -Rio-Rn-Ri ₂ -FIi ₃ -Leu-R ₁₅ -GIn-Leu-R, SR ₁₉ -R ₂₀ -R ₂ I-LeU-Leu-Gin-Glu-R ₂₆ -R ₂₇ -R ₂ SR ₂ 8- ^Ar 9- ^Y

worin R₁ Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe,.Leu, His oder D-His darstellt, das entweder eine CMe- oder N'Me-Substitution aufweist oder unsubstituiert ist;wherein R _{1 is} Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, .Leu, His or D-His, which has either a CMe or N'Me substitution or is unsubstituted;

R₂ ist AIa oder D-AIa; R₃ ist Asp oder D-Asp; R₅ ist He oder Leu; R₆ ist Phe oder Tyr; R₇ ist Ser oder Thr; R₈ ist Ser, Asn, Thr oder Gin; R₉ ist AIa oder Ser; R₁₀ ist Tyr, Phe oder Leu; R₁₁ ist Arg, Orn oder Lys; R₁₂ ist Arg, Orn oder Lys; R₁₃ ist He, Leu, Phe oder VaI; R₁₅ ist GIy oder Ala; R₁₃ ist AIa oder Ser; R₁₉ ist Ser oder Ala; R₂₀ ist Arg, Om oder Lys.R ₂ is Ala or D-Ala; R ₃ is Asp or D-Asp; R ₅ is He or Leu; R ₆ is Phe or Tyr; R ₇ is Ser or Thr; R ₈ is Ser, Asn, Thr or Gin; R ₉ is Ala or Ser; R ₁₀ is Tyr, Phe or Leu; R ₁₁ is Arg, Orn or Lys; R ₁₂ is Arg, Orn or Lys; R ₁₃ is He, Leu, Phe or VaI; R ₁₅ is Gly or Ala; R ₁₃ is Ala or Ser; R ₁₉ is Ser or Ala; R ₂₀ is Arg, Om or Lys.

R₂₁ ist Arg, Orn oder Lys; R₂₆ ist Leu, He, VaI oder Phe; R₂₇ ist Nie, Nva oder eine natürliche Aminosäure; R₂₈ ist AIa, Leu, Asn, GIn oder Ser; und Y ist OH oder NH₂, mit der Maßgabe, daß wenigstens vier der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₅, R₁₈, R₁₉, R₂₀, R₂₁ und R₂₆von den Resten verschieden sind, die in der entsprechenden Position beim natürlichen Molekül auftreten. Bei Ersatz von 4 oder mehr Resten wird vermutet, daß ein verkürztes Analoges gebildet werden kann mit gesteigerter biologischer Potenz gerade ohne einen amidierten C-Terminus.R ₂₁ is Arg, Orn or Lys; R ₂₆ is Leu, He, VaI or Phe; R ₂₇ is Never, Nva or a natural amino acid; R ₂₈ is Ala, Leu, Asn, GIn or Ser; and Y is OH or NH ₂ , with the proviso that at least four of R ₅ , R ₆ , R ₇ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ , R ₁₂ , R ₁₃ , R ₁₅ , R ₁₈ , R ₁₉ , R ₂₀ , R ₂₁ and R ₂₆ are different from the residues occurring in the corresponding position in the natural molecule. When replacing 4 or more residues, it is believed that a truncated analog can be formed with increased biological potency even without an amidated C-terminus.

Die Peptide können durch ein geeignetes Verfahren synthetisiert werden, z. B. allein durch Festphasentechniken, durch teilweise Festphasentechniken, durch Fragmentkondensation oder durch klassische Lösungskupplungen. Es kann auch mit den kürzlich entwickelten rekombinanten DNA-Techniken gearbeitet werden, um ein vollständiges Analoges oder einen Teil eines Analogen herzustellen, uas nur natürliche Aminosäurereste enthält. So sind beispielsweise die Techniken der ausschließlichen Festphasensynthese in „Solid-Phase Peptide Synthesis", Steward und Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969 beschrieben und in der US-PS 4 105 603 vom Ausgabetag 8. August 1978 (VaIe et al.) vertieft. Die klassische Lösungssynthese ist detailliert in demThe peptides can be synthesized by a suitable method, e.g. B. solely by solid phase techniques, by partially solid-phase techniques, by fragment condensation or by classical solution couplings. It is also possible to work with the recently developed recombinant DNA techniques to produce a complete analog or part of an analog containing only natural amino acid residues. For example, Solid-Phase Peptide Synthesis exclusive techniques, Steward and Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, and U.S. Patent 4,105,603, issued Aug. 8, 1978 (VaIe et al The classic solution synthesis is detailed in the

Standardwerk „Methoden der Organischen Chemie (Heuben-Weyl), Synthese von Peptiden", E. Wunsch (Hrsg.), 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD beschrieben. Das Syntheseverfahren der Fragmentkondensation ist in der US-PS 3 972 859Standard work "Methods of Organic Chemistry (Heuben-Weyl), Synthesis of Peptides", E. Wunsch (ed.), 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, FRG.) The synthesis method of fragment condensation is described in U.S. Patent No. 3,972,859

(3. August 1976) dargestellt. Andere Synthesen sind in der US-PS 3 842 067 (15. Oktober 1974) und US-PS 3 862 925 (28. Januar 1975) dargestellt.(August 3, 1976). Other syntheses are shown in U.S. Patent 3,842,067 (October 15, 1974) and U.S. Patent 3,862,925 (January 28, 1975).

Bei derartigen chemischen Synthesen ist es üblich, die labilen Seitenkettengruppen verschiedener Aminosäurereste mit geeigneten Schutzgruppen zu schützen, wodurch eine chemische Reaktion an dieser Stelle verhindert wird, bis die Gruppe schließlich entfernt wird. Üblich ist auch der Schutz einer alpha-Aminogruppe an einer Aminosäure oder einem Fragment, während die gesamte Struktureinheit an der Carboxygruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe, um die · nachfolgende Reaktion an diesem Ort stattfinden zu lassen. Dementsprechend ist es üblich, daß als Stufe bei der Synthese eine Zwischenverbindung entsteht, die jeden der Aminosäurereste, angeordnet in seiner gewünschten Sequenz in der Peptidkette aufweist, mit Seitenketten-Schutzgruppen, die mit den entsprechenden Resten verbunden sind.In such chemical syntheses, it is common practice to protect the labile side chain groups of various amino acid residues with appropriate protecting groups, thereby preventing a chemical reaction at that site until the group is finally removed. Also common is the protection of an alpha-amino group on an amino acid or a fragment, while the entire structural unit reacts at the carboxy group, followed by the selective removal of the alpha-amino protecting group to allow the subsequent reaction to occur at that location. Accordingly, it is common that as a step in the synthesis, there arises an intermediate compound having each of the amino acid residues arranged in its desired sequence in the peptide chain with side-chain protecting groups attached to the corresponding residues.

Ebenso im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung sind Zwischenprodukte der Formel:Also within the scope of the present invention are intermediates of the formula:

X'-R₁(XoderX²J-R₂-R₃(X³)-Ala-R_B-R₆(X²)-R₇(X⁴)-R₈(X⁴oderX⁵)-R₉(X⁴l-r?,o(X²)-R„(X^eoderX⁷J-R₁₂(X⁶oder " .X'-R ₁ (X or X ² JR ₂ -R ₃ (X ³ ) -Ala-R _B -R ₆ (X ² ) -R ₇ (X ⁴ ) -R ₈ (X ⁴ or X ⁵ ) -R ₉ (X ⁴ lr?, O (X ² ) -R "(X ^e or X ⁷ JR ₁₂ (X ⁶ or".

X⁷)-R₁₃-Leu-R₁₅-GIn(X⁵)-Leu-R₁₈(X²)-R₁₉(X⁴)-R₂₀(X⁶ oder X⁷J-R₂₁(X⁶ oder X⁷J-LeU-LeU-GIn(X⁵J-GIu(X³J-R₂₆-R₂₇(X⁸J-R₂₈(X⁴ oder X⁵)-Ar₉(X⁶J₇-X⁵,X ⁷ ) -R ₁₃ -Leu-R ₁₅ -GIn (X ⁵ ) -Leu-R ₁₈ (X ² ) -R ₁₉ (X ⁴ ) -R ₂₀ (X ⁶ or X ⁷ JR ₂₁ (X ⁶ or X ⁷ J-LeU-LeU-GIn (X ⁵ J-Glu (X ³ JR ₂₆ -R ₂₇ (X ⁸ JR ₂₈ (X ⁴ or X ⁵ ) -Ar ₉ (X ⁶ J ₇ -X ⁵ ,

worin X¹ entweder Wasserstoff oder eine a-Amino-Schutzgruppe ist. Die a-Amino-Schutzgruppe, die als Xl bezeichnet werden können, sind jene, die aus der Stufensynthese von Polypeptiden bereits gut bekannt sind. Zu diesen Klassen von a-Amino-Schutzgruppen, die als X¹ angesehen werden können, gehören (1) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Z, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (2) aliphatische Urethanschutzgruppen wie t-Butyloxycarbonyl (BOC), Diisopropylmethyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; und (3) Cycloalkyl-Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl. Die bevorzugte a-Amino-Schutzgruppe ist BOC, gerade wenn ein N^aMe-substituierter Rest in der 1 -Stellung eingesetzt ist.wherein X ^{1 is} either hydrogen or an a-amino protecting group. The a-amino protecting group, which may be referred to as XI, are those already well known from the step synthesis of polypeptides. Among these classes of a-amino protecting groups which may be considered X ¹ include (1) urethane-type aromatic protecting groups such as fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), benzyloxycarbonyl (Z) and substituted Z such as p-chlorobenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, p-bromobenzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl; (2) aliphatic urethane protecting groups such as t-butyloxycarbonyl (BOC), diisopropylmethyloxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, ethoxycarbonyl, allyloxycarbonyl; and (3) urethane type cycloalkyl protecting groups such as cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl and cyclohexyloxycarbonyl. The preferred a-amino protecting group is BOC, especially when a N ^a Me-substituted radical is used in the 1-position.

X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Imidazolstickstoff von His, wie Tos.X is hydrogen or a protecting group for the imidazole nitrogen of His, such as Tos.

X² kann eine geeignete Schutzgruppe für die phenolische Hydroxygruppe von Tyr sein, wie Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, TrityJ, BzI, CBZ, 4Br-CBZ und 2,6-Dichlorbenzyl (DCB). Die bevorzugte Schutzgruppe ist 2,6-Dichlorbenzyl (DCB).X ² may be a suitable protecting group for the phenolic hydroxy group of Tyr, such as tetrahydropyranyl, tert -butyl, trityl, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ and 2,6-dichlorobenzyl (DCB). The preferred protecting group is 2,6-dichlorobenzyl (DCB).

X² kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß in dieser Position am Aminosäurerest keine Seitenkettenschutzgruppe vorhanden ist.X ² may be hydrogen, meaning that there is no side chain protecting group at this position on the amino acid residue.

X³ ist Wasserstoff oder eine geeignete esterbildende Schutzgruppe für die Carboxygruppe von Asp oder GIu, wie Benzyl (OBzI), 2,6-Dichlorbenzyl, Methyl und Ethyl.X ³ is hydrogen or a suitable ester-forming protecting group for the carboxy group of Asp or Glu, such as benzyl (OBzI), 2,6-dichlorobenzyl, methyl and ethyl.

X⁴ kann eine geeignete Schutzgruppe für die Hydroxylgruppen von Thr oder Ser sein, wie Acetyl, Benzoyl, ter.-Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, BzI, 2,6-Dichlorbenzyl und CBZ. Die bevorzugte Schutzgruppe ist BzI. X⁴ kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß in dieser Position an der Hydroxylgruppe keine Schutzgruppe vorhanden ist.X ⁴ may be a suitable protecting group for the hydroxyl groups of Thr or Ser, such as acetyl, benzoyl, tert-butyl, trityl, tetrahydropyranyl, BzI, 2,6-dichlorobenzyl and CBZ. The preferred protecting group is BzI. X ⁴ may be hydrogen, which means that there is no protecting group at this position on the hydroxyl group.

X⁵ ist Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Asn oder GIn. Vorzugsweise ist es Xanthyl (Xan).X ⁵ is hydrogen or a suitable protecting group for the side chain amino group of Asn or GIn. Preferably, it is xanthyl (xan).

X⁶ ist eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arg, wie Nitro, Tos., CBZ, Adamantyloxycarbonyl und BOC, oder es ist Wasserstoff.X ⁶ is a suitable protecting group for the guanidino group of Arg, such as nitro, Tos., CBZ, adamantyloxycarbonyl and BOC, or it is hydrogen.

X⁷ ist Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Lys oder Orn. Beispiele für geeignete Seitenkettenamino-Schutzgruppen sind 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (2-CI-Z), Tos, t-Amyloxycarbonyl und BOC.X ⁷ is hydrogen or a suitable protecting group for the side chain amino group of Lys or Orn. Examples of suitable side chain amino protecting groups are 2-chlorobenzyloxycarbonyl (2-CI-Z), Tos, t-amyloxycarbonyl and BOC.

X⁸ ist Wasserstoff oder eine geeignete Seitenkettenschutzgruppe wie oben generell spezifiziert.X ⁸ is hydrogen or a suitable side chain protecting group as specified above generally.

Met kann gegebenenfalls durch Sauerstoff geschützt werden, bleibt jedoch vorzugsweise ungeschützt.Met may optionally be protected by oxygen, but preferably remains unprotected.

Die Auswahl einer Seitenkettenamino-Schutzgruppe ist nicht kritisch, mit der Ausnahme, daß im allgemeinen eine solche gewählt wird, die nicht während der Entschützung der a-Aminogruppen bei der Synthese entfernt wird.Selection of a sidechain amino-protecting group is not critical except that one is generally chosen which is not removed during deprotection of the alpha-amino groups in the synthesis.

Allerdings ist für einige Aminosäuren, z. B. für His, ein Schutz nicht allgemein erforderlich, nachdem die Kupplung beendet ist, und die Schutzgruppen können die gleichen sein.However, for some amino acids, eg. For example, for His, protection may not be generally required after the coupling is complete, and the protecting groups may be the same.

X⁹ ist eine geeignete Schutzgruppe für die C-terminale Carboxygruppe oder ist eine Ankerbindung, die in der Festphasensynthese für die Bindung zu einem festen Harzträger verwendet wird, oder ist des-X⁹, wobei in einem solchen Fall der Arg-Rest am C-Terminus amidiert ist. Wenn ein solcher fester Harzträger verwendet wird, der im weitesten Sinn als Schutzgruppe anzusehen ist, wird ein entsprechender ausgewählt, wie er aus dem Stand derTechnik bekannt ist, z. B. -O-CH₂-Harzträger, -NH-Benzydrylamin(BHA)-Harzträger oder -NH-Paramethylbenzhydrylamin (MBHA)-Harzträger. Wenn ein unsubstituiertes Amid am C-Terminus hergestellt werden soll, ist der Einsatz von BHA- oder MBHA-Harz bevorzugt, da die Spaltung direkt zum Amid führt.X ⁹ is a suitable protecting group for the C-terminal carboxy group or is an anchor bond used in solid-phase synthesis for bonding to a solid resin support, or is -X ⁹ , in which case the Arg residue is at the C-terminal carboxy group. Terminus is amidated. When such a solid resin support is used, which in the broadest sense is to be considered a protective group, a corresponding one is selected, as known from the prior art, for. For example, -O-CH ₂ resin support, -NH-benzydrylamine (BHA) resin support or -NH-paramethylbenzhydrylamine (MBHA) resin support. If an unsubstituted amide is to be prepared at the C-terminus, the use of BHA or MBHA resin is preferred because the cleavage leads directly to the amide.

In der Formel für das Zwischenprodukt ist zumindest eine der X-Gruppen eine Schutzgruppe oder X⁹ schließt den Harzträger mit ein.In the formula for the intermediate, at least one of the X groups is a protecting group or X ⁹ includes the resin carrier.

Somit betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Peptids durchThus, the invention also relates to a process for the preparation of a desired peptide by

(a) Bilden eines Peptid-Zwischenproduktes mit zumindest einer Schutzgruppe und der Formel (II)(a) forming a peptide intermediate having at least one protective group and the formula (II)

X¹-R₁(X oder X²)-R₂-R₃(X³)-Aia-R₅-R₆(X²J-R₇(X⁴J-R₈(X⁴ oder X⁵)-R₃(X⁴)-R₁₀(X²)-R„(X⁶ oder X⁷J-R₁₂(X⁶ oder X⁷)-R,3-Leu-R₁₅-Gln(X⁵)-Leu-R₁₈(X²)-R₁₉(X⁴)-R₂₀(X⁶ oder X⁷)-R₂₁(X⁶ oder X⁷)-Leu-Leu-Gln(X⁵)-Glu(X³)-R₂₆-R₂₇(X⁸J-R₂₈(X⁴ oderX⁵)-Arg(X⁶)-X⁹ X ¹ -R ₁ (X or X ² ) -R ₂ -R ₃ (X ³ ) -Aia -R ₅ -R ₆ (X ² JR ₇ (X ⁴ JR ₈ (X ⁴ or X ⁵ ) -R ₃ ( X ⁴ ) -R ₁₀ (X ² ) -R "(X ⁶ or X ⁷ JR ₁₂ (X ⁶ or X ⁷ ) -R, 3-Leu-R ₁₅ -Gln (X ⁵ ) -Leu-R ₁₈ (X ² ) -R ₁₉ (X ⁴ ) -R ₂₀ (X ⁶ or X ⁷ ) -R ₂₁ (X ⁶ or X ⁷ ) -Leu-Leu-Gln (X ⁵ ) -Glu (X ³ ) -R ₂₆ -R ₂₇ (X ⁸ JR ₂₈ (X ⁴ or X ⁵ ) -Arg (X ⁶ ) -X ⁹

worin X, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷ undwherein X, X ¹ , X ² , X ³ , X ⁴ , X ⁵ , X ⁶ , X ⁷ and

X⁸ entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe darstellen und X⁹ ist entweder eine Schutzgruppe oder eine Ankerverbindung zu dem Harzträger oder des-X⁹;X ^{8 is} either hydrogen or a protecting group and X ⁹ is either a protecting group or an anchor compound to the resin support or the -X ⁹ ;

(b) Abspalten der Schutzgruppe oder -gruppen oder der Ankerbindung von dem Peptid der Formel (II); und(b) cleaving the protecting group or groups or the anchor bond from the peptide of formula (II); and

(c) gewünschtenfalls Umwandeln eines erhaltenen Peptids in dessen nichttoxisches Salz.(c) if desired, converting an obtained peptide into its non-toxic salt.

Bei der Auswahl einer speziellen Seitenkettenschutzgruppe zum Einsatz in der Peptidsynthese gibt es folgende allgemeine Regeln: (a) die Schutzgruppe behält ihre schützenden Eigenschaften und wird unter Kupplungsbedingungen nicht abgespalten; (b) die Schutzgruppe sollte dem Reagens gegenüber stabil sein und ist, mit Ausnahme von X_3n, vorzugsweiss unter den Reaktionsbedingungen stabil, die für die Entfernung der a-Aminoschutzgruppe bei jedem Syntheseschritt ausgewählt wurden, und (c) die Seitenkettenschutzgruppe muß entfernbar sein nach Abschluß der Synthese mit der gewünschten Aminosäuresequenz, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die die Peptidkette nicht in unerwünschter Weise beeinträchtigt.The following general rules apply to the selection of a particular side chain protecting group for use in peptide synthesis: (a) the protecting group retains its protective properties and is not cleaved under coupling conditions; (b) the protecting group should be stable to the reagent and, with the exception of X _3n , is preferably stable under the reaction conditions selected for the removal of the α-amino protecting group at each step in the synthesis, and (c) the side chain protecting group must be removable Completion of the synthesis with the desired amino acid sequence, under reaction conditions that does not affect the peptide chain in an undesirable manner.

Verbindungen dieser Erfindung können auch über die rekombinante DNA-Methodik hergestellt werden. Dabei wird eine Nucleotidsequenz, die für das gewünschte Peptid codiert, unter Verwendung von nunmehr Routineverfahren für derartige Synthesen hergestellt. Zu diesen Methoden gehört allgemein die Herstellung von Oligonucleotiden, die sowohl für die Fragmente der gewünschten Codierungssequenz als auch für deren komplementäre Sequenzen codieren. Die Oligonucleotide sind dazu bestimmt, ein Fragment der Codierungsseq'uenz mit zwei Fragmenten der komplementären Sequenz zu überlappen und umgekehrt. Die Oligonucleotide sind gepaart und miteinander verbunden und produzieren letzten Endes die gewünschte Gensequenz. Die Sequenz wird in einen klonierenden Vektor an einem Ort insertiert, der es gestattet, das Peptidprodukt, für das sie codiert zu exprimieren. Ein geeigneter Klonierungsvektor enthält wenigstens einen Teil einer Expressionssteuerungssequenz eines Gens. Eine typische Expressionssteuerungssequenz kann mit den Begriffen von fünf Elementen beschrieben werden. In der Reihenfolge, in der sie im Gen auftreten, sind dies die folgenden Elemente:Compounds of this invention can also be made via the recombinant DNA methodology. A nucleotide sequence encoding the desired peptide is thereby prepared using now routine procedures for such syntheses. These methods generally include the preparation of oligonucleotides encoding both the fragments of the desired coding sequence and their complementary sequences. The oligonucleotides are designed to overlap one fragment of the coding sequence with two fragments of the complementary sequence, and vice versa. The oligonucleotides are paired and linked together and ultimately produce the desired gene sequence. The sequence is inserted into a cloning vector at a location that allows expression of the peptide product for which it is encoded. A suitable cloning vector contains at least part of an expression control sequence of a gene. A typical expression control sequence can be described with the terms of five elements. In the order in which they occur in the gene, these are the following elements:

(a) die Promotor-Region;(a) the promoter region;

(b) die 5'-untrans!atierte Region;(b) the 5'-untranslated region;

(c) die Proteincodierungssequenz; ,(c) the protein coding sequence; .

(d) die 3'-untranslatierte Region und(d) the 3'-untranslated region and

(e) die Endstelle der Transkription.(e) the terminus of transcription.

Die Funktion jedes dieser Elemente in Gensystemen ist festgelegt. Die Promotor-Region vermittelt die Initiierung der Produktion von Boten-RNA (mRNA) (Transkription). Der Promotor kann (1) frei von äußerer Steuerung sein (konstitutiv), (2) unter Steuerung durch einen Repressor stehen, einer Substanz, die bei Vorhandensein die Genfunktion unterdrückt, oder (3) unter Steuerung einer auslösenden Verbindung (Inducer) stehen, einer Substanz, die erforderlich ist, die Genfunktion zu induzieren. Ein äußeres Membranlipoprotein (Ipp)-Gen von E. coli ist beispielsweise frei von äußerer Steuerung und wird daher als „konstitutiv" bezeichnet.The function of each of these elements in gene systems is defined. The promoter region mediates the initiation of the production of messenger RNA (mRNA) (transcription). The promoter may be (1) free from external control (constitutive), (2) under the control of a repressor, a substance which suppresses gene function when present, or (3) is under the control of a triggering compound (inducer) Substance required to induce gene function. For example, an outer membrane lipoprotein (lpp) gene of E. coli is free of external control and is therefore termed "constitutive."

Am oder nahe dem Promotor angeordnet ist die „Transkriptionsinitiierungsstelle", ein Punkt, an dem RNA-Polymerase die Transkription von mRNA initiiert. Ist die Transkription erst einmal initiiert, wird mRNA- produziert. Die Struktur der erhaltenen mRNA wird durch die DNA-Sequenzen der obigen Genelemente (b) bis (d) bestimmt.Arranged at or near the promoter is the "transcription initiation site", a point at which RNA polymerase initiates transcription of mRNA, once transcription is initiated, mRNA is produced The structure of the mRNA obtained is expressed by the DNA sequences of the mRNA above gene elements (b) to (d) determined.

Die erhaltene mRNA trägt eine Sequenz, die in ein Proteinprodukt translatierbar ist. Die translatierbare Sequenz ist in Abwärtsrichtung von der 5'-untranslatierten Region angeordnet und in Aufwärtsrichtung von der 3'-untranslatierten Region. Die Translation wird vermittelt durch Binden der Ribosome an eine Sequenz in der mRNA-5'-untranslatierten Region, die als Ribosombindungsstelle bezeichnet wird und wird am Translations-Startcodon (AUG) initiiert, das als das erste Codon der Produktgensequenz auftritt und ebenso für die Aminosäure Methionin (Met) codiert. Die Translation ist'an einem oder mehreren Stopcodons (termination codons) beendet, die am Ende der Translationsregion auftreten.The resulting mRNA carries a sequence that is translatable into a protein product. The translatable sequence is located downstream from the 5 'untranslated region and upwardly from the 3' untranslated region. Translation is mediated by binding of the ribosomes to a sequence in the mRNA 5 'untranslated region, termed the ribosome binding site, and is initiated at the translation start codon (AUG), which appears as the first codon of the product gene sequence and also for the amino acid Methionine (Met) coded. Translation is terminated at one or more termination codons that appear at the end of the translation region.

Mit Hilfe der rekombinanten DNA-Techniken wurde es möglich, Klonierungsvektoren herzustellen, die für die Produktion ausgewählter fremder (exogener) Proteine nützlich sind, durch Insertieren in derartige Vektoren einer Expressionssteuerungssequenz, d. i. eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression struktureller Gene mit der Produktion exogenen Proteins, wenn es operativ mit jenen Genen verbunden ist, steuert und reguliert.By means of recombinant DNA techniques, it has become possible to produce cloning vectors useful for the production of selected foreign (exogenous) proteins by inserting into such vectors an expression control sequence, i. i. a sequence of nucleotides that directs and regulates the expression of structural genes by the production of exogenous protein when operatively linked to those genes.

Im Kontext mit dem vorgenannten umfaßt der Begriff „Expressionssteuerungssequenz" Elemente von (a), (b), (d) und (e).In the context of the foregoing, the term "expression control sequence" includes elements of (a), (b), (d) and (e).

Die rekombinante DNA-Methodik kann eingesetzt werden, um erfindungsgemäße Verbindungen entweder als ein Teil eines größeren „Hybrid"moleküls zu exprimieren oder durch direkte Expression. Bei der direkten Expressionsweise wird der Klonierungsvektor so ausgewählt, daß das Expressionsprodukt vollständig aus dem gewünschten Produkt besteht, dem ein Methioninrest (Met) vorangeht, der sich aus der Anwesenheit des notwendigen Startcodons ergibt. Der überflüssige Met-Rest kann durch Behandlung des Produktes mit Cyanbromid oder mit Phenylisothiocyanat entfernt werden, gefolgt von einer starken Säure wie Trifluoressigsäure.The recombinant DNA methodology can be used to express compounds of the invention either as part of a larger "hybrid" molecule or by direct expression. In the direct mode of expression, the cloning vector is selected so that the expression product consists entirely of the desired product, preceded by a methionine residue (Met) resulting from the presence of the necessary start codon The excess Met residue can be removed by treating the product with cyanogen bromide or with phenyl isothiocyanate, followed by a strong acid such as trifluoroacetic acid.

Bei der Hybridmolekülexpressionsweise wird eine DNA-Sequenz, die für das gewünschte Produkt codiert, in die Expressionssteuerungssequenz eines klonierenden Vektors an einem Punkt insertiert, so daß das exprimierte Produkt ein Hybridprotein umfaßt. Unter dem hier benutzten Begriff „Hybridprotein" wird ein rekombinantes DNA-Produkt verstanden, das ein Fremdprotein enthält, im allgemeinen ein ganzes oder ein Teil des natürlichen (endogenen) Proteins, das durch die Expressionssteuerungssequenz (beispielsweise Lipoprotein im Lipoproteingen) hergestellt wird, an die das gewünschte Protein angefügt ist.In the hybrid-molecular expression mode, a DNA sequence encoding the desired product is inserted into the expression control sequence of a cloning vector at a point such that the expressed product comprises a hybrid protein. By the term "hybrid protein" as used herein is meant a recombinant DNA product containing a foreign protein, generally all or part of the natural (endogenous) protein produced by the expression control sequence (for example, lipoprotein in lipoprotein gene) the desired protein is added.

Das korrekt bestimmte Hybridprotein, das mittels rekombinanter DNA-Methodik hergestellt wurde, enthält eine Schnittstelle an der Verbindung des endogenen Proteinteiles mit dem gewünschten Produkt. Die Schnittstelle gestattet die Erzeugung des reifen Produktes durch chemische oder enzymatische Behandlung des Hybridproteinproduktes. Im höchsten Maße nützliche, selektive Schnittstellen bestehen aus einer DNA-Sequenz, die für eine Aminosäure codiert oder für eine Sequenz von Aminosäuren codiert oder für eine Sequenz von Aminosäuren die chemisch oder enzymatisch an ihrem C-Terminal geschnitten (bzw. gespalten) werden können.The correctly determined hybrid protein prepared by recombinant DNA methodology has an interface at the junction of the endogenous protein portion with the desired product. The interface allows the production of the mature product by chemical or enzymatic treatment of the hybrid protein product. Highly useful selective interfaces consist of a DNA sequence that encodes an amino acid or encodes a sequence of amino acids or a sequence of amino acids that can be cleaved (or cleaved) chemically or enzymatically at its C-terminal.

Beispiele chemischer Agenzien zum Schneiden von Proteinen sind Cyanbromid, BNPS-skatol', Hydroxylamin und ähnliche Produkte.Examples of chemical agents for cutting proteins are cyanogen bromide, BNPS-skatol ', hydroxylamine and similar products.

Cyanbromid schneidet die Proteine am C-Terminus eines Methioninrestes. Daher ist die selektive Schnittstelle an einem Methioninrest selbst.Cyanogen bromide cuts the proteins at the C-terminus of a methionine residue. Therefore, the selective site is on a methionine residue itself.

Hydroxylamin schneidet am C-Terminus vom Rest-Asn-Q, worin Q GIu, Leu oder AIa ist.Hydroxylamine cleaves at the C-terminus from the residue Asn-Q, where Q is Glu, Leu or Ala.

B NPS-skatol schneidet am C-Terminus eines Tryptophanrestes. Für das Schneiden nützliche enzymatische Agenzien sind Beispiele:B NPS-skatol cleaves at the C-terminus of a tryptophan residue. Enzymatic agents useful for cutting are examples:

Trypsin, Papain, Pepsin, Plasmin, Thrombin, Enterokinase und ähnliche Produkte. Jedes bewirkt einen Schnitt an einer besonderen Aminosäuresequenz, die es wiedererkennt.Trypsin, papain, pepsin, plasmin, thrombin, enterokinase and similar products. Each effects a cut on a particular amino acid sequence that recognizes it.

Ein Enzym der Wahl ist Enterokinase. Eine bevorzugte Schnittstelle ist daher jene, die Enterokinase erkennt, nämlich eine DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz -(Asp)„-Lys- codiert, wobei η eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist.An enzyme of choice is enterokinase. A preferred cleavage site is therefore that which recognizes enterokinase, a DNA sequence coding for the amino acid sequence - (Asp) "- Lys, where η is an integer from 2 to 4.

Die bevorzugteste selektive Schnittstelle ist ein Methioninrest, da die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise Methionin nicht enthalten. Dieser Rest, gebunden an das N-Terminal des gewünschten Produktes, wird leicht durch die bekannten Verfahren unter Verwendung von Cyanbromid geschnitten, um das gewünschte reife Produkt zu erzeugen.The most preferred selective site is a methionine residue since the compounds of the invention preferably do not contain methionine. This residue, attached to the N-terminal of the desired product, is readily cut by the known methods using cyanogen bromide to produce the desired mature product.

Gewisse eukaryotische Zellen, z. B. Hefe und Säugetierzellen, sind in der Lage, kleine Peptide durch Synthetisieren eines größeren Precursor-Moleküls herzustellen.'Diese Organismen enthalten hoch spezifische Enzyme, die in der Lage sind, die gewünschten Peptide von dessen Precursor an exakt definierten Schnittstellen abzutrennen. Zu den exaktesten definierten proteolytisch'en Arbeitsstellen gehören gepaarte basische Aminosäurereste. Ein anderes Beispiel derartiger Arbeitsstellen sind die Aminosäuren GIu-AIa oder Asp-Ala. Die meisten hypothalamischen Peptide werden ebenso wie einige Hypophysenhormone in dieser Art hergestellt. Andere Beispiele der Herstellung kleiner Peptide in eukaryotischen Organismen sind der Hefe-alpha-Faktor oder a-Faktor, der kleine Peptide gepaart mit Pheromonen darstellt.Certain eukaryotic cells, e.g. Yeast and mammalian cells are capable of producing small peptides by synthesizing a larger precursor molecule. These organisms contain highly specific enzymes capable of separating the desired peptides from its precursor at precisely defined interfaces. The most exact defined proteolytic sites include paired basic amino acid residues. Another example of such jobs are the amino acids Glu-Ala or Asp-Ala. Most hypothalamic peptides, as well as some pituitary hormones, are produced in this manner. Other examples of small peptide production in eukaryotic organisms are the yeast alpha factor or a factor, which is small peptides paired with pheromones.

Es sollte möglich sein, synthetische GRF-Analoge verschlüsselnde DNA-Sequenzen an den Precursorteil derartiger proteinverschlüsselnder Sequenzen (oft als Pre-Pro-Segment bezeichnet) anzufügen, unmittelbar benachbart zu und in abwärtiger Richtung von deren normalen proteolytischen Arbeitsstellen. Kulturen eukaryotischer Zellen, die Plasmidelemente tragen, die eine derartige Expressionseinheit enthalten, sollten in der Lage sein, das gewünschte Precursor-Peptidmolekül mit Hilfe des normalen Mechanismus der Genexpression von Wirtszellen zu erzeugen. Darüber hinaus sollten die normalen Zellprozesse für die präzise Entfernung des gewünschten Produktes aus dem Precursormolekül sorgen.It should be possible to add synthetic GRF analogue encoding DNA sequences to the precursor portion of such protein encoding sequences (often referred to as the pre-pro segment), immediately adjacent and in the downward direction of their normal proteolytic sites. Cultures of eukaryotic cells carrying plasmid elements containing such an expression unit should be able to produce the desired precursor peptide molecule by the normal mechanism of host cell gene expression. In addition, normal cell processes should provide for the precise removal of the desired product from the precursor molecule.

Bei der Konstruktion nützlicher Klonierungsvektoren sind eine Reihe von Elementen erforderlich. Zwei dieser Elemente sind für alle nützlichen Klonierungsvektoren üblich. Erstens muß der Vektor eines DNA-Segment aufweisen, das einen funktionellen Ursprung der Replikation enthält (Replicon). Plasmide und Phagen-DNA enthalten bei ihrer starken Natürlichkeit Replicone, die eine Replication in einer Wirtszelle bewirken.Construction of useful cloning vectors requires a number of elements. Two of these elements are common to all useful cloning vectors. First, the vector must have a DNA segment that contains a functional origin of replication (replicon). In their strong naturalness, plasmids and phage DNA contain replicons that cause replication in a host cell.

Zweitens muß der Vektor ein DNA-Segment aufweisen, das einer transformierbaren Wirtszelle eine Eigenschaft verleiht, die für die Auswahl transformierter Zellen aus nichttransformierten Zellen nützlich ist. Beliebige einer Vielzahl von Eigenschaften können für Auswahlzwecke verwendet werden. Eine der üblicherweise am meisten eingesetzten Eigenschaften ist die antibiotische Resistenz, z. B. Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz, insbesondere bei der Transformation von E. coli. Ebenfalls üblicherweise eingesetzt werden die Komplementierung auxotropher Mutanten durch Plasmiderzeugte Kopien des Gens vom Wildtyp, das in der Lage ist, derartige Unzulänglichkeiten zu heilen.Second, the vector must have a DNA segment that confers to a transformable host cell a property that is useful for selecting transformed cells from untransformed cells. Any of a variety of properties may be used for selection purposes. One of the most commonly used properties is antibiotic resistance, e.g. As tetracycline resistance or ampicillin resistance, especially in the transformation of E. coli. Also commonly used are the complementation of auxotrophic mutants by plasmid-generated copies of the wild type gene capable of curing such deficiencies.

Die beiden vorgenannten Elemente sind im allgemeinen in leicht erhältlichen und bestimmten Klonierungsvektoren vorhanden. Beispiele geeigneter Klonierungsvektoren sind bakterielle Plasmide, wie Plasmide von E. coli, einschließlich pBR 322, pMB 9, Co1E1, pCR1; Plasmide vieler anderer Wirte, einschließlich RP4; Phagen-DNAs wie Lambda und ähnliches. Die meisten, wenn nicht alle der oben gekennzeichneten Vektoren weisen die vorher beschriebenen beiden Elemente schon auf.The two aforementioned elements are generally present in readily available and specific cloning vectors. Examples of suitable cloning vectors are bacterial plasmids, such as E. coli plasmids, including pBR 322, pMB 9, Co1E1, pCR1; Plasmids of many other hosts, including RP4; Phage DNAs such as lambda and the like. Most, if not all, of the vectors identified above already have the previously described two elements.

Ein drittes Element ist die Expressionssteuerungssequenz. Beliebige einer Vielzahl derartiger Steuerungssequenzen können eingesetzt werden, einschließlich zum Beispiel jene des Lipoproteingens, des ß-Galactosidasegens, des Tryptophangens, des ß-Lactamasegens, des Phagen Lambda und ähnliche.A third element is the expression control sequence. Any of a variety of such control sequences may be employed, including, for example, those of the lipoprotein gene, the β-galactosidase gene, the tryptophan gene, the β-lactamase gene, the phage lambda, and the like.

Bei der Herstellung eines geeigneten Klonierungsvektors durch Insertion der ausgewählten Expressionssteuerungssequenz wird mit Routinemethoden gearbeitet. Es existieren innerhalb des Klonierungsvektors zahlreiche Stellen, an denen Schnitte vorgenommen werden können bei Einsatz einer für diese Stelle spezifischen Restriktionsendonukiease. Für die Insertion der Expressionssteuerungssequenz können beliebige dieser Stellen ausgewählt werden. Als ein Beispiel existieren in dem gut bekannten und beschriebenen Plasmid pBR322 verschiedene geeignete Restriktionsstellen, von denen beliebige als Insertionsstellen benutzt werden können. Eine Pstl-Stelle ist innerhalb des Gens für ß-Lactamase angeordnet. Andere Stellen außerhalb eines speziellen Codierungsbereiches sind EcoRI und Pvull. Diese und andere Stellen sind durch die Fachwelt gut bestimmt worden. Wenn man sich diese oder andere Stellen zunutze macht, kann die Insertion einer Expressionssteuerungssequenz oder dessen wesentlichen Teiles bei der Herstellung von erfindungsgemäß definierten Vektoren leicht verwirklicht werden. Ein viertes Element ist natürlich die für das gewünschte Produkt codierende DNA-Sequenz. Wie vorher bereits festgestellt, wird diese DNA-Sequenz synthetisch unter Verwendung der bekannten Phosphotriester-Methode oder anderen wohlbekannten Methoden konstruiert.In preparing a suitable cloning vector by insertion of the selected expression control sequence, routine methods are used. There are numerous sites within the cloning vector where sections can be made using a restriction endonuclease specific for this site. For the insertion of the expression control sequence, any of these sites can be selected. As an example, in the well-known and described plasmid pBR322, there are various suitable restriction sites, any of which can be used as insertion sites. A PstI site is located within the gene for β-lactamase. Other locations outside of a particular coding area are EcoRI and Pvull. These and other passages have been well defined by the art community. By taking advantage of these or other sites, insertion of an expression control sequence or its essential part in the production of vectors defined according to the invention can be easily accomplished. A fourth element is, of course, the DNA sequence encoding the desired product. As previously stated, this DNA sequence is synthetically constructed using the known phosphotriester method or other well-known methods.

Geeignete Klonierungsvektoren können bei einem großen Bereich von Wirtsorganismen verwendet werden, z. B. gramnegative prokaryotische Organismen wie Escherichia coli, Serratia, Pseudomonas und ähnliche; grampositive prokaryotische Organismen wie Bacillus, Streptomyces und ähnliche; und eukaryotische Organismen wie Saccharomyces und ähnliche. Wenn der Wirtsorganismus ein gramnegativer prokaryotischer Organismus ist, ist E. coli bevorzugt, beispielsweise ein E. coli Κ-12-Stamm wie RV308. Unter Einsatz der bekannten Methode werden die entsprechend präparierten Klonierungsvektoren verwendet, um die geeigneten Wirtsorganismen zu transformieren, werden in derartigen Organismen amplifiziert, und das exogene Proteinprodukt wird bei Standardfermentierungsbedingungen exprimiert. Das exogene Proteinprodukt wird durch Routineverfahren aus der erhaltenen Fermentationsbrühe isoliert.Suitable cloning vectors can be used in a wide range of host organisms, e.g. Gram-negative prokaryotic organisms such as Escherichia coli, Serratia, Pseudomonas and the like; Gram-positive prokaryotic organisms such as Bacillus, Streptomyces and the like; and eukaryotic organisms such as Saccharomyces and the like. When the host organism is a gram-negative prokaryotic organism, E. coli is preferred, for example, an E. coli Κ-12 strain such as RV308. Using the known method, the appropriately prepared cloning vectors are used to transform the appropriate host organisms, amplified in such organisms, and the exogenous protein product is expressed at standard fermentation conditions. The exogenous protein product is isolated by routine methods from the resulting fermentation broth.

Zu einem typischen Verfahrensablauf für die Produktisolierung eines eine Met-Schnittstelle enthaltenden Precursors gehört die Lyophilisierung der das Produkt enthaltenden Zellen. Zu einem Liter 70%iger (V/V) Ameisensäure wurden 10 g lyophilisierte Fermentationsfeststoffe gegeben. Nach Auflösen (etwa 60 Minuten) wurde die Lösung in einer Cyanbromidkonzentration auf 0,1 M eingestellt durch Zugabe von 10,6 g Reagens. Der quantitative Peptidschnitt zum gewünschten Amino-Ternninal-Produkt war in etwa 8 Stunden bei 23⁰C vollständig. Die Ameisensäure wurde durch Eindampfen unter Vakuum entfernt und die geschnittenen Fermentationsfeststoffe wurden lyophilisiert. Die Feststoffe wurden mit 10 g/l in 10%iger (V/V) Essigsäure gelöst und bis zu 5% des Säulenvolumens auf eine G-50 Superfein-Sephadexsäule (2,6 cm χ 100 cm) mit einer Fließrate von 5 cm/Stunde, 4°C, gegeben. Die Reinigung bis zur Homogenität wurde durch Umkehrphase auf einer 0,46 cm χ 25 cm Zorbax-C₈-Säule erreicht unter Einsatz eines linearen Acetonitrilgradienten in 0,1 M Ammoniumphosphat, pH 7,2. Das gewünschte Produkt wurde auf Sephadex G-25 in 0,01 M Ammoniumhydrogencarbonat entsalzt, pH 8,5, und lyophilisiert.A typical procedure for the product isolation of a precursor containing a Met interface involves the lyophilization of the cells containing the product. To a liter of 70% (v / v) formic acid was added 10 g of lyophilized fermentation solids. After dissolution (about 60 minutes), the solution was adjusted to 0.1 M in cyanogen bromide concentration by adding 10.6 g of reagent. The quantitative peptide cut to the desired amino-terninal product was complete in about 8 hours at 23 ⁰ C. The formic acid was removed by evaporation under vacuum and the cut fermentation solids were lyophilized. The solids were dissolved at 10 g / L in 10% (v / v) acetic acid and up to 5% of the column volume on a G-50 super fine Sephadex column (2.6 cm χ 100 cm) with a flow rate of 5 cm / Hour, 4 ° C, given. Purification to homogeneity was achieved by reverse phase on a 0.46 cm χ 25 cm Zorbax C ₈ column using a linear gradient of acetonitrile in 0.1 M ammonium phosphate, pH 7.2. The desired product was desalted on Sephadex G-25 in 0.01 M ammonium bicarbonate, pH 8.5, and lyophilized.

Wenn Peptide nicht unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt werden, so werden sie vorzugsweise mittels Festphasensynthese hergestellt, wie dies allgemein durch Merrifield, 1. Am. Chem. Soc, 85, S. 2149 (1963) beschrieben wurde, obgleich andere äquivalente chemische Synthesen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, ebenso wie die vorgenannten verwendet werden können. Die Festphasensynthese beginnt am C-Terminal des Peptide durch Kupplung einer geschützten a-Aminosäure an ein geeignetes Harz. Ein derartiges Startmaterial kann durch Anknüpfen einer a-Amino-geschützten Aminosäure über eine Esterbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hadroxymethylharz hergestellt werden, oder durch eine Amidbindung an ein BHA-Harz oder MBHA-Harz. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist von Bodansky et al., Chem. Ind. (London), 38, 1597—98 (1966) beschrieben worden. Chlormethylierte Harze sind im Handel erhältlich. Die Herstellung eines solchen Harzes ist von Stewart et al. in „Festphasenpeptidsynthese" (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois 1984), Kapitel 1, S. 8-9 beschrieben. BHA- und MBHA-Harzträger sind im Handel erhältlich, werden jedoch allgemein nur dann verwendet, wenn das gewünschte Peptid, das synthetisiert werden soll, ein unsubstituiertes Amid am C-Terminal aufweist.When peptides are not prepared using recombinant DNA technology, they are preferably prepared by solid phase synthesis as generally described by Merrifield, I. Am. Chem. Soc., 85, p. 2149 (1963), although other equivalent chemical syntheses known in the art, as well as the foregoing, can be used. Solid phase synthesis begins at the C-terminal of the peptide by coupling a protected a-amino acid to a suitable resin. Such a starting material may be prepared by attaching an α-amino-protected amino acid through an ester bond to a chloromethylated resin or a hadroxymethyl resin, or through an amide bond to a BHA resin or MBHA resin. The preparation of the hydroxymethyl resin has been described by Bodansky et al., Chem. Ind. (London), 38, 1597-98 (1966). Chloromethylated resins are commercially available. The preparation of such a resin is described by Stewart et al. in "Solid Phase Peptide Synthesis" (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois 1984), Chapter 1, pp. 8-9. BHA and MBHA resin carriers are commercially available, but are generally used only when the desired peptide, the to be synthesized having an unsubstituted amide at the C-terminal.

Die C-terminale Aminosäure, d. i. Arg, geschützt durch BOC und durch Tos, kann erst an ein chlormethyliertes Harz gekuppelt werden oder an ein hier beschriebenes BHA- oder MBHA-Harz. Nach dem Kuppeln der BOC-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die a-Aminoschutzgruppe entfernt, wie z. B. mittels Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid oder durch TFA allein. Das Entschützen erfolgt bei einer Temperatur zwischen etwa O⁰C und Zimmertemperatur. Andere Standardreagenzien zum Abspalten, wie HCI in Dioxan, sowie andere Bedingungen für die Entfernung spezieller a-Aminogruppen können angewandt werden, wie in Schroder u. Lubke, „Die Peptide", 1, S. 72-75 (Academie Press 1965) beschrieben.The C-terminal amino acid, ie Arg, protected by BOC and by Tos, can first be coupled to a chloromethylated resin or to a BHA or MBHA resin described herein. After coupling of the BOC-protected amino acid to the resin support, the α-amino protecting group is removed, such as. Example by means of trifluoroacetic acid (TFA) in methylene chloride or by TFA alone. The deprotection takes place at a temperature between about O ⁰ C and room temperature. Other standard cleavage reagents, such as HCl in dioxane, as well as other conditions for the removal of specific α-amino groups can be used as described in Schroder et al. Lubke, "The Peptides", 1, pp. 72-75 (Academie Press 1965).

Nach der Entfernung der a-Aminoschutzgruppe werden die verbliebenen a-Amino- und Seitenketten-geschützten Aminosäuren schrittweise in gewünschter Folge gekuppelt, um die anfangs hier definierte Zwischenverbindung zu erhalten oder als Alternative jede Aminosäure getrennt in der Synthese zuzusetzen, wobei einige von ihnen vor der Zugabe zum Festphasenreaktionsgefäß an eine andere gekuppelt werden können. Die Auswahl eines entsprechenden Kupplungsreagens ist dem Fachmann geläufig. Insbesondere geeignet als Kupplungsreagens ist N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI).After removal of the a-amino protecting group, the remaining a-amino and side-chain protected amino acids are coupled stepwise in the desired sequence to obtain the intermediate compound initially defined herein or, alternatively, add each amino acid separately in the synthesis, with some of them added before synthesis Addition to the solid phase reaction vessel can be coupled to another. The selection of a corresponding coupling reagent is familiar to the person skilled in the art. Particularly suitable as coupling reagent is N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCCI).

Die bei der Festphasensynthese der Peptide verwendeten Aktivierungsr-eagentien sind in der Peptidchemie bekannt. Beispiele geeigneter Aktivierungsreagentien sind Carbodiimide wie Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-djmethyl-aminopropyl)carbodiimid.'Andere Aktivierungsreagentien und ihre Verwendung bei der Peptidkupplung sind von Schroder und Lubke, s. o. in Kapitel III und von Kapoor, I. Phar-Sci. 59, S. 1—27 (1970) beschrieben worden. Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in das Festphasenreaktionsgefäß mit etwa vierfachem oder größerem Überschuß eingebracht, und die Kupplung kann in einem Medium von Dimethylformamid (DMF): CH₂Cl₂(V-I) oder in DMF oder CH₂CI₂ allein durchgeführt werden. In Fällen, wo eine unvollständige Kupplung erfolgt, wurde die Kupplung vor der Entfernung der a-Aminoschutzgruppe wiederholt, bevor die nächste Aminosäure gekuppelt wurde. Der Erfolg der Kupplungsreaktion wird in jedem Stadium des Verfahrens bei manueller Durchführung vorzugsweise über die Ninhydrinreaktion beobachtet, wie von E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970) beschrieben. Die Kupplungsreaktionen können automatisch z. B. auf einem Beckman 990-Syntheseautomaten unter Verwendung eines Programmes, wie das, über das von Rivier et al. in Biopolymeres, 1978,17, S. 1927-1938 berichtet wurde, erfolgen.The activating reagents used in the solid phase synthesis of the peptides are known in peptide chemistry. Examples of suitable activating reagents are carbodiimides such as Ν, Ν'-diisopropylcarbodiimide and N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide.'Other activating reagents and their use in peptide coupling are described in Schroder and Lubke, supra in Chapter III and of Kapoor, I. Phar-Sci. 59, pp. 1-27 (1970). Each protected amino acid or amino acid sequence is introduced into the solid phase reaction vessel at about a four-fold or greater excess, and the coupling can be carried out in a medium of dimethylformamide (DMF): CH ₂ Cl ₂ (VI) or in DMF or CH ₂ Cl ₂ alone. In cases where incomplete coupling occurs, the coupling was repeated before the removal of the a-amino protecting group before the next amino acid was coupled. The success of the coupling reaction is observed at each stage of the procedure when carried out manually, preferably via the ninhydrin reaction as described by E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). The coupling reactions can automatically z. On a Beckman 990 synthesizer using a program such as that described by Rivier et al. in Biopolymeres, 1978, 17, pp. 1927-1938.

Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vervollständigt wurde, kann das Peptid-Zwischenprodukt vom Harzträger durch Behandlung mit einem Reagens, wie Flußsäure in flüssiger Form entfernt werden, wobei das Reagens nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch alle verbliebenen Seitenkettenschutzgruppen X, X², X³, X⁴, X^s, X⁶, X⁷ und X⁸ abspaltet, und ebenso die a-Aminoschutzgruppe X', falls eine verwendet wurde, wobei man das arhidierte Peptid erhält. Sollte Met in der Sequenz auftreten, wird die BOC-Schutzgruppe vorzugsweise zuerst entfernt unter Einsatz von Trifluoressigsäure (TFA)/Ethandiol vor dem Abspalten des Peptids vom Harz mit HF, um eine potentielle S-Alkylierung auszuschließen. Bei Verwendung von Flußsäure zum Abspalten werden Anisol und Methylethylsulfid als Spülmittel im Reaktionsgefäß eingesetzt. ' . After the desired amino acid sequence has been completed, the peptide intermediate can be removed from the resin support by treatment with a reagent such as hydrofluoric acid in liquid form, whereby the reagent not only cleaves the peptide from the resin, but also all remaining side chain protecting groups X, X ² , X. ³ , X ⁴ , X ^s , X ⁶ , X ⁷ and X ⁸ , and also the α-amino-protecting group X ', if one was used to obtain the arid peptide. Should Met appear in the sequence, the BOC protecting group is preferably first removed using trifluoroacetic acid (TFA) / ethanediol prior to cleaving the peptide from the resin with HF to preclude potential S-alkylation. When using hydrofluoric acid for splitting off anisole and methyl ethyl sulfide are used as a rinsing agent in the reaction vessel. '.

Ausführungsbeispieleembodiments

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below with reference to some examples.

Beispiel I stellt eine bevorzugte Synthesemethode eines bevorzugten amidierten Peptids über die Festphasentechnik dar. Die Synthese entsprechend anderer Peptide, die in der Länge unterschiedlich sind, kann in gleicher Weise erfolgen durch bloßes Hinzugeben oder Eliminieren der erforderlichen Anzahl Aminosäuren an einem Ende der Kette; allerdings wird gegenwärtig vermutet, daß biologisch aktive Analoge die angegebene Sequenz, der Äquivalente, vom N-Terminal zum Rest 27 aufweisen sollten.Example I represents a preferred method of synthesis of a preferred amidated peptide via the solid phase technique. The synthesis of other peptides that are different in length can be done in the same way by simply adding or eliminating the required number of amino acids at one end of the chain; however, it is currently believed that biologically active analogs should have the indicated sequence, the equivalents, from the N-terminal to the residue 27.

Beispiel IExample I

Die Synthese des Peptids [Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala³-¹⁵·'⁸·²³, Arg¹²·²¹, Leu'³-²⁶'²⁷]-hGRF (1-29)-NH₂ mit der Formel':The synthesis of the peptide [Ser ⁷ x ⁸ x ¹⁹ , Ala ³ - ¹⁵ x ' ⁸ x ²³ , Arg ¹² x ²¹ , Leu' ³ - ^{26 '27} ] -hGRF (1-29) -NH ₂ having the formula':

H-Tyr-Ala-Asp-Aia-lle-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-.Arg- Arg-Leu-Leu-Ala-GIn-Leu-AIa-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gin-GIu-Leu-Leu-AIa-Arg-NH₂ erfolgte schrittweise unter Verwendung eines Beckmann 990 Peptidsynthetisators auf einem MBHA-Harz mit einem Substitionsbereich von etwa 0,35 bis 0,5 mmol/g Harz. Die Kupplung von BOC-Arg (Tos) an das Harz erfolgte nach dem allgemeinen Verfahren der US-PS 4 292 313 (VaIe) unter Verwendung von KF in DMF bei etwa 60°C über 24 Stunden unter Rühren. Man erhielt eine Substitution von etwa 0,35 rnmol Arg pro Gramm des Harzes.H-Tyr-Ala-Asp-Aia-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-GIn-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gin Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-NH _{2 was} carried out stepwise using a Beckman 990 peptide synthesizer on an MBHA resin having a substitution range of about 0.35 to 0.5 mmol / g resin. The coupling of BOC-Arg (Tos) to the resin was carried out according to the general procedure of U.S. Patent 4,292,313 (VaIe) using KF in DMF at about 60 ° C for 24 hours with stirring. A substitution of about 0.35 nm of Arg per gram of the resin was obtained.

Nach der Entblockierung und Neutralisation wurde die Peptidkette Schritt für Schritt auf dem Harz aufgebaut. Das Entblockieren, das Neutralisieren und die Zugabe jeder Aminosäure erfolgte in genereller Übereinstimmung mit der Verfahrensweise, die im Detail von Rivier, J. in J. Armer. Chem. Soc, 96, 2986-2992 (1974) beschrieben wurde. Alle Lösungsmittel, die verwendet wurde, waren sorgfältig entgast durch Spülen mit einem Inertgas, ζ. B. Helium oder Stickstoff, um die Anwesenheit von Sauerstoff zu gewährleisten.After deblocking and neutralization, the peptide chain was built up step by step on the resin. The deblocking, neutralization and addition of each amino acid was done in general accordance with the procedure described in detail by Rivier, J. in J. Armer. Chem. Soc., 96, 2986-2992 (1974). All solvents used were carefully degassed by purging with an inert gas, ζ. As helium or nitrogen, to ensure the presence of oxygen.

Das Entblockieren erfolgte vorzugsweise in Übereinstimmung mit dem folgenden Ablaufschema AThe deblocking was preferably carried out in accordance with the following flowchart A.

Reagensreagent Ablaufschema AFlowchart A Mischzeit (Min.Mixing time (min. 1. 60% TFA/2 % Ethandithiol1. 60% TFA / 2% ethanedithiol 1010 2. 60% TFA/2 % Ethandithiol2. 60% TFA / 2% ethanedithiol 1515 Reagensreagent Mischzeit (Min.)Mixing time (min.) 3. IPA/1% Ethandithiol3. IPA / 1% ethanedithiol 0,50.5 4. Et₃N (10%) in CH₂CI₂ 4. Et ₃ N (10%) in CH ₂ Cl ₂ 0,50.5 5. MeCfH5. MeCfH 0,50.5 6. Et₃N (10%) in CH₂CI₂ 6. Et ₃ N (10%) in CH ₂ Cl ₂ 0,50.5 7. MeOH (zweimal)7. MeOH (twice) 0,50.5 8. CH₂CI₂ 8. CH ₂ Cl ₂ 0,50.5

Die Kupplungen erfolgten vorzugsweise wie im folgenden Ablaufschema B dargestelltThe couplings were preferably carried out as shown in the following flow chart B.

Ablaufschema BFlowchart B Mischzeit (MinMixing time (min Reagensreagent __ 9. DCCI9. DCCI 50-9050-90 10. BOC-Aminosäure10. BOC-amino acid 0,50.5 11. MeOH (zweimal)11. MeOH (twice) 0,50.5 12. CH₂CI₂ (zweimal)12. CH ₂ CI ₂ (twice) 15,015.0 13. Ac₂O (3M) InCH₂CI₂ 13. Ac ₂ O (3M) In CH ₂ Cl ₂ 0,50.5 14. CH₂CI₂ 14. CH ₂ Cl ₂ 0,50.5 15. MeOH15. MeOH 0,50.5 16. CH₂CI₂ (zweimal)16. CH ₂ CI ₂ (twice)

Zusammengefaßt: es wurden zwei mmol BOC-geschützter Aminosäure in Methylenchlorid pro Gramm Harz verwendet plus ein Äquivalent 1,0 molarer DCCI in Methylenchlorid über zwei Stunden. Wenn BOC-Arg/Tos) gekuppelt wurde, wurde ein Gemisch von 50%igem DMF und Methylenchlorid eingesetzt. Bzl-Ether wurde verwendet als Hydroxyseitenkettenschutzgruppe für Ser und Thr. Die Amidgruppe von Asn oder GIn wurde durch Xan geschützt, wenn mit der DCC-Kupplung gearbeitet wurde, was bevorzugt war. p-Nitrphenylester (ONp) kann auch verwendet werden, um das Carboxy-Ende von Asn oder GIn zu aktivieren, und beispielsweise kann BOC-Asn (ONp) über Nacht gekuppelt werden unter Einsatz eines Äquivalentes HOBt in einem 50% Gemisch von DMF und Methylen-chlorid, wobei in einem solchen Falle kein DCC hinzugegeben wurde.In summary, two millimoles of BOC-protected amino acid in methylene chloride were used per gram of resin plus one equivalent of 1.0 molar DCCI in methylene chloride over two hours. When BOC-Arg / Tos) was coupled, a mixture of 50% DMF and methylene chloride was used. Bzl ether was used as the hydroxy side chain protecting group for Ser and Thr. The amide group of Asn or GIn was protected by Xan when working with the DCC coupling, which was preferred. p-Nitrphenylester (ONp) can also be used to activate the carboxy terminus of Asn or GIn, and for example, BOC-Asn (ONp) can be coupled overnight using one equivalent of HOBt in a 50% mixture of DMF and methylene chloride, in which case no DCC was added.

2-Chlor-benzyloxycarbonyl (2CI-Z) wurde als Schutzgruppe für die Lys-Seitenkette verwendet. Tos wurde verwendet, die Guanidingruppe von Arg zu schützen und den Imidazolstickstoff von His. Die GIu- oder Asp-Seitenkettencarboxygruppe wurde durch OBzI geschützt. Die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr wurde mit 2,6-Dichlorbenzyl (DCB) geschützt. Am Ende der Synthese erhielt man die folgende Zusammensetzung: ;2-Chloro-benzyloxycarbonyl (2CI-Z) was used as a protecting group for the Lys side chain. Tos was used to protect the guanidine group from Arg and the imidazole nitrogen from His. The GIu or Asp side chain carboxy group was protected by OBzI. The phenolic hydroxyl group of Tyr was protected with 2,6-dichlorobenzyl (DCB). At the end of the synthesis, the following composition was obtained:

BOC-Tyr(X)-Ala-Asp(X³)-Äia-lle-Phe-Ser(X⁴)-Ser(X⁴)-Ala-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-Arg(X⁶)-Leu-Leu-Ala-Gln(X^s)-Leu-Ala-Ser(X⁴)-Arg(X⁶)-Arg(X⁶)-Leu-Leu-Gln(X⁵)-Glu(X³)-Leu-Leu-Ala-Arg(X⁶)-X⁹, worin X ist Tos, X² ist DCB, X³ ist OBzI, X⁵ ist Xan, X⁶ ist Tos und X⁹ ist -NH-Harzträger und X⁴ ist BzI. .BOC-Tyr (X) -Ala-Asp (X ³ ) -alkyl-Phe-Ser (X ⁴ ) -Ser (X ⁴ ) -Ala-Tyr (X ² ) -Arg (X ⁶ ) -Arg (X ⁶⁾ -Leu-Leu-Ala-Gln (X ^s) -Leu-Ala-Ser (X ⁴⁾ -Arg (X ⁶⁾ -Arg (X ⁶⁾ -Leu-Leu-Gln (X ⁵⁾ -Glu (X ³ ) -Leu-Leu-Ala-Arg (X ⁶ ) -X ⁹ wherein X is Tos, X ² is DCB, X ³ is OBzI, X ⁵ is Xan, X ⁶ is Tos and X ⁹ is -NH resin support and X ⁴ is BzI. ,

Xan kann teilweise oder vollständig durch die TFA-Behandlung entfernt worden sein, die zur Deblockierung der a-Aminoschutzgruppe erforderlich war. .Xane may have been partially or completely removed by the TFA treatment required to deprotect the α-amino protecting group. ,

Um das geschützte Peptidharz abzuspalten und zu entschützen, wurde es mit 1,5 ml Anisol, 0,5 ml Methylethylsulfid und 15 ml Flußsäure (HF) pro Gramm Peptidharz bei -20°C über eine halbe Stunde und bei 0°C über eine halbe Stunde behandelt. Nach Entfernung von HF unter Hochvakuum wurde der Harz-Peptidrest nacheinander mit trockenem Diethylether und Chloroform gewaschen und das Peptid dann mit entgaster 2N wäßrigen Essigsäure extrahiert und vom Harz durch Filtration abgetrennt. Das abgespaltene und entschützte Peptid wurde dann in 0,5%iger Essigsäure aufgelöst und einer Reinigung unterworfen, wozu auch eine Sephadex G-50 Feingelb-Filtration gehörte.To cleave and deprotect the protected peptide-resin, it was incubated with 1.5 ml of anisole, 0.5 ml of methyl ethyl sulfide and 15 ml of hydrofluoric acid (HF) per gram of peptide resin at -20 ° C for half an hour and at 0 ° C over one half Hour treated. After removal of HF under high vacuum, the resin-peptide residue was washed successively with dry diethyl ether and chloroform, and the peptide was then extracted with degassed 2N aqueous acetic acid and separated from the resin by filtration. The cleaved and deprotected peptide was then dissolved in 0.5% acetic acid and subjected to purification, which included a Sephadex G-50 Feingelb filtration.

Das Peptid wurde dann weiter gereinigt durch präparative oder halbpräparative HPLC, wie von Rivier et al. in „Peptide: Struktur und biologische Funktion", (1979), S. 125-128 und von Marki et al. in J. Am. Chem. Soc, 103, 3178 (1981) beschrieben. Von Waters Assogiates ausgerüstete prep LC-500 Hülsen wurden mit 15-20 μ C₁₈ - Silicagel von Vydac (300 A) gefüllt. Ein CH₃CN-Gradient in TEAP wurde mittels eines Niederdruck-Eldex-Gadientenherstellers erzeugt, wie von Rivier, J., in J. Liq. Chromatography 1, 343-367 (1978) beschrieben. Die chromatografischen Fraktionen wurden sorgfältig durch HPLC beobachtet, und es wurden nur die Fraktionen gesammelt, die im wesentlichen rein waren. Das Entsalzen der gereinigten Fraktionen, die unabhängig auf ihre Reinheit geprüft wurden, erreichte man durch Verwendung eines CH₃CN-Gradienten in 0,1 % TFA. Der Mittelschnitt wurde dann lyophilisiert, um das gewünschte Peptid zu erhalten, dessen Reinheit größer als 98% sein kann.The peptide was then further purified by preparative or semi-preparative HPLC as described by Rivier et al. in "Peptide: Structure and Biological Function", (1979), pp. 125-128, and by Marki et al., J. Am. Chem Soc, 103, 3178 (1981). prep LC-500 equipped by Waters Assogiates Tubes were filled with Vydac (300A) 15-20 μC ₁₈ silica gel A CH ₃ CN gradient in TEAP was generated by a low pressure Eldex Gadient manufacturer as described by Rivier, J. in J. Liq. Chromatography 1, 343-367 (1978) The chromatographic fractions were carefully monitored by HPLC and only the fractions which were substantially pure were collected and desalting of the purified fractions independently tested for purity was achieved Using a CH ₃ CN gradient in 0.1% TFA The mid-cut was then lyophilized to obtain the desired peptide whose purity may be greater than 98%.

Beispiel 11Example 11

Die Synthese eines Peptids mit der gleichen Sequenz, jedoch in Form der freien Säure, d. i. [Ser⁷·⁸¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹, _Leui3,26,27]__hGRp (1_29)-OH mit der Formel:Synthesis of a peptide having the same sequence, but in the form of the free acid, di [Ser ⁷ x ⁸¹⁹ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x ²¹ , _Leu i 3, 26, 27] _ _hGR p (1_29) -OH with the formula:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg

Arg-Leu-Leu-Ala-Gin-Leu-AIa-Ser-A^rg-A^rg-Leu-Leu-Gin-GIu-Leu-Leu-Ala-Arg-OH erfolgt schrittweise unterArg-Leu-Leu-Ala-Gin-Leu-Ala-Ser-Ag-Ag-Leu-Leu-Gin-Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-OH takes place gradually

Verwendung eines Beckman 990-p Peptidsynthetisators auf einem chlormethylierten Harz mit einem Substitutionsbereich von etwa 0,35 bis 0,5 mmol/g Harz. Die Kupplung von BOC-Arg(Tos) an das Harz erfolgte durch das allgemeine Verfahren, das von Monhan et al. in Biopolymers 12 (1973) S. 2513-2519 beschrieben wurde, unter Verwendung von Methylenchlorid als Lösungsmittel für zwei Stunden unter Rühren plus ein Äquivalent von 2M DCCI in Methylenchlorid, was zu einer Substitution von etwa 0,35 mmol Arg pro Gramm Harz führt. Der restliche Ablauf der Synthese erfolgte wie im Beispiel I einschließlich der Abspaltung, des Entschützens und der Reinigung.Use of a Beckman 990-p peptide synthesizer on a chloromethylated resin having a substitution range of about 0.35 to 0.5 mmol / g resin. The coupling of BOC-Arg (Tos) to the resin was accomplished by the general procedure described by Monhan et al. in Biopolymers 12 (1973) pp. 2513-2519, using methylene chloride as a solvent for two hours with stirring plus one equivalent of 2M DCCI in methylene chloride, resulting in a substitution of about 0.35 mmol Arg per gram of resin. The remainder of the synthesis was carried out as in Example I, including cleavage, deprotection and purification.

Das Peptid wurde nach TLC und HPLC als im wesentlichen rein befunden.The peptide was found to be essentially pure by TLC and HPLC.

Beispiel 111Example 111

Die Synthese des gleichen Peptids, das in Beispiel Il synthetisiert wurde, wurde mittels rekombinanter DNA-Technologie durchgeführt.The synthesis of the same peptide synthesized in Example II was carried out by recombinant DNA technology.

Das 1,7 Kb EcoRI-Fragment, das das alpha-Faktor strukturelle Gen verschlüsselt, wie von Kurjan und Herskowitz beschrieben (Cell 30: 933-943, Okt. 1982), wurde in pB R322 subkloniert, so daß sich das alpha-Faktor strukturelle Gen in gleicher Orientierung befand wie das Tetracycli-Resistenzgen. Dieses Plasmid wurde mit Ball abgebaut und wieder ringgeschlossen, das erhaltene Plasmid enthielt den alpha-Faktor Promoter, die pre-pro-Peptid-codierende Sequenz und einen Teil des 13 Aminosäure-reifen alpha-Faktorpeptids. Dieses Plasmid wurde weiter modifiziert durch Insertieren eines BamHI-Linkers in die einzige Pvull-stelle dieses Vektors, wodurch eine Stelle für die Insertierung der GRF-Analogen verschlüsselnden Sequenz gebildet wurde.The 1.7 Kb EcoRI fragment encoding the alpha-factor structural gene as described by Kurjan and Herskowitz (Cell 30: 933-943, Oct. 1982) was subcloned into pB R322 so that the alpha factor structural gene in the same orientation as the tetracycline resistance gene. This plasmid was ball digested and re-annealed, the resulting plasmid containing the alpha-factor promoter, the pre-pro-peptide coding sequence, and a portion of the 13 amino acid mature alpha-factor peptide. This plasmid was further modified by inserting a BamHI linker into the unique Pvull site of this vector, thereby forming a site for insertion of the GRF analogue-encoding sequence.

Die folgende Nucleotidsequenz (sinngemäßer Strang) wurde für das in Beispiel Il beschriebene GRF-Analoge ausgewählt:The following nucleotide sequence (analogous strand) was selected for the GRF analog described in Example II:

TAT GCT GAC GCT ATT TTC TCC TCC GCC TAT AGA AGA CTT CTT GCT CAG CTT GCC TCC AGA AGA CTC CTC CAA GAA CTT CTT GCT AGG TAG.TAT GCT GAC GCT ATT TTC TCC TCC GCC TAT AGA AGA CTT CTT GCT CAG CTT GCC TCC AGA AGA CTC CTC CAA GAA CTT CTT GCT AGG DAY.

Dazu gehört der TAG-Terminalcode an ihrem 3'-Ende. Diese DNA-Sequenz zusammen mit deren gegensinnigen Strang wurde nach Verfahren des Standes der Technik synthetisiert. Um diese Sequenz mit dem Expressionsvektor kompatibel zu machen, wurde die folgende Sequenz, die für einen Teil des alpha-Faktorpeptids und Arbeitsstellen codiert, zum 5'-Ende des sinngemäßen Stranges des GRF-Analogen gegeben: CCAACCAATGTACAAAAGG.This includes the TAG terminal code at its 3 'end. This DNA sequence, along with its reverse strand, was synthesized according to prior art methods. To make this sequence compatible with the expression vector, the following sequence, encoding part of the alpha-factor peptide and sites, was added to the 5 'end of the analogous strand of the GRF analog: CCAACCAATGTACAAAAGG.

Der gegensinnige Strang besteht aus dem genauen Komplement zu sowohl diesem Oligo- als auch dem GRF-Analogen; er enthält jedoch einen BamHI-Überhang an seinem 5'-Ende.The opposing strand consists of the exact complement to both this oligonucleotide and the GRF analog; however, it contains a BamHI overhang at its 5 'end.

Der wie oben beschrieben hergestellte Vektor wurde dann mit BamHI und Ball geschnitten, und das synthetische Gen wurde insertiert, wodurch ein Vektor mit den folgenden Merkmalen entstand. Er enthält den alpha-Faktor Promoter und die pre-pro-Sequenz, ebenso wie eine alpha-Faktor-peptidverschlüsselnde Sequenz. Dieser peptidverschlüsselnden Sequenz folgt die Sequenz für Lys-Arg. die die proteolytische Abspaltung des GRF-Analogen vom alpha-Faktorpeptid signalisiert. Das GRF-Analoge, das das Translationsstop enthält, ist nach der Lys-Arg-Sequenz angeordnet.The vector prepared as described above was then cut with BamHI and Ball, and the synthetic gene was inserted, resulting in a vector having the following characteristics. It contains the alpha-factor promoter and the pre-pro sequence, as well as an alpha-factor peptide-encoding sequence. This peptide-encoding sequence follows the sequence for Lys-Arg. which signals the proteolytic cleavage of the GRF analogue from the alpha-factor peptide. The GRF analog containing the translation stop is located after the Lys-Arg sequence.

Die Expressionseinheit des GRF-Analogen wurde präzise aus diesem Vektor mittels Abbau mit BamHI und BgIII herausgeschnitten, und das Fragment wurde aus einem 6%igen Acrylamidgel durch Elektroeluierung isoliert und. phenolextrahiert und ethanolgefallt. Annähernd 20 ng dieses Fragments wurden unter Standardbedingungen ligiert an 6 ng eines entphosphorylierten BamHI-Abbaus eines geeigneten Hefezubringervektors, vorzugsweise einem der auf pBR322 basierte, in den hefespezifizierte Sequenzen isertiert worden waren, z. B. der Expressionsvektor TRP209, der detailliert in der US-Patentanmeldung 747 152 vom 20. Juni 1985 (Thill et al.) beschrieben wird, auf deren Offenbarung hier Bezug genommen wird. Dieses Produkt wurde dann dazu verwendet, den E. coli Stamm MC1061 zur Ampicillinresistenz zu transformieren.The expression unit of the GRF analogue was precisely excised from this vector by digestion with BamHI and BglII, and the fragment was isolated from a 6% acrylamide gel by electroelution and. phenol extracted and ethanol precipitated. Approximately 20 ng of this fragment was ligated under standard conditions to 6 ng of dephosphorylated BamHI digestion of a suitable yeast delivery vector, preferably one based on pBR322, into yeast-labeled sequences, e.g. , The expression vector TRP209 described in detail in U.S. Patent Application 747,152, June 20, 1985 (Thill et al.), The disclosure of which is incorporated herein by reference. This product was then used to transform E. coli strain MC1061 for ampicillin resistance.

Die Transformanten wurden durch Xbal-Abbau von Minilysaten analysiert. Jene mit der korrekten Orientierung, d. i. dem 3'-Ende des Gens als nächstes zum Transkriptionsterminator, wurden durch Identifizierung diagnostischer Restriktionsfragmente im Verhältnis zu Standards mit bekannter Molekularmasse ausgewählt. Der erhaltene Hefeexpressionsvektor trägt das Wildtyp TRP1-Geri für die Selektion in Hefe un den Replikationsursprung vom endogenen Hefeplasmid^-Ring. Er wurde dazu verwendet, einen Tryptophan-erfordernden Saccharomyces-Stamm, wie GG100-14D (ATCC 20762) zur Prototrophie zu transformieren. Darüber hinaus trägt er die Expressionskassette, die den vorher beschriebenen alpha-Faktor Promoter, die pre-pro-Region, das alpha-Faktorpeptid, Arbeitsstellen, das GRF-Analoge und den alpha-Faktor-Transkriptionsterminator enthält. Positive Transformanten wurden mit Hilfe von Standardtechniken erzeugt und wuchsen in synthetischen Medien unter Tryptophanmangel ansatzweise oder in kontinuierlicher Kultur. Immunoreaktive GRF-Analoge wurden im Wachstumsmedium über RIA ermittelt. Die Analyse zeigte, daß das 29-Aminosäurepeptid mit freier Säure am C-Terminal produziert worden war.The transformants were analyzed by XbaI degradation of minilysates. Those with the correct orientation, d. i. the 3 'end of the gene next to the transcription terminator were selected by identifying diagnostic restriction fragments relative to standards of known molecular mass. The yeast expression vector obtained carries the wild type TRP1 Geri for selection in yeast and the replication origin of the endogenous yeast plasmid ^ ring. It was used to transform a tryptophan-requiring strain of Saccharomyces, such as GG100-14D (ATCC 20762), for prototrophy. In addition, it carries the expression cassette containing the previously described alpha-factor promoter, pre-pro region, alpha-factor peptide, sites, GRF analog and alpha-factor transcription terminator. Positive transformants were generated by standard techniques and grew in synthetic media under tryptophan deficiency, batchwise or in continuous culture. Immunoreactive GRF analogs were detected in the growth medium via RIA. The analysis showed that the 29-amino acid peptide was produced at the C-terminal with free acid.

Beispiel IVExample IV

Die Festphasensynthese der folgenden hGRF-Analogen wird nach Verfahren ausgeführt, die allgemein in den Beispielen 1 und Il beschrieben wird:Solid phase synthesis of the following hGRF analogs is carried out according to methods generally described in Examples 1 and II:

[His¹, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·'⁵·¹⁸·²⁸, Arg'²·²¹,[His ¹ , Ser ⁷ × ⁸ × ¹⁹ , Ala ⁹ × ' ⁵ × ¹⁸ × ²⁸ , Arg' ² × ²¹ ,

Leu¹³-²⁶-²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁷·⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,Leu ^{13 to 26} - ^27] -hGRF (1-29) -NH _2; [His ¹ , Ser ⁷ x ⁸ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x ²¹ ,

Leu¹³²⁶Aia²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁸·¹⁹, Ala³·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,Leu ¹³²⁶ Aia ²⁷ ] -hGRF (1-29) -NH ₂ ; [His ¹ , Ser ⁸ x ¹⁹ , Ala ³ x ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x ²¹ ,

LeU¹³^-²⁷I-HGRF(I-29)-NH₂; [Ser⁷·¹⁹, Gin⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,LeU ¹³ ^ - ²⁷ I-HGRF (I-29) -NH ₂ ; [Ser ⁷ x ¹⁹ , Gin ⁸ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x ²¹ ,

Leu¹³-²⁶·²⁷] -hGRF(1 -29)- NH₂; [Phe¹, Leu⁵-¹³-²⁶·²⁷, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala¹⁵·¹⁸·²⁸,Leu ^{13 to 26} · ^27] -hGRF (1 -29) - _NH2; [Phe ¹ , Leu ⁵ - ¹³ - ²⁶ x ²⁷ , Ser ⁷ x ⁸ x ¹⁹ , Ala ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ ,

Arg¹²-²¹]-hGRF(1-29)-NH₂; [Ser⁷·⁸·¹⁹-²⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸, Phe¹⁰, Arg¹²·²¹,Arg ^12-21] -hGRF (1-29) -NH _2; [Ser ⁷ x ⁸ x ¹⁹ - ^28, Ala ⁹ x ¹⁵ x ^18, Phe ^10, Arg ¹² · ²¹

[His¹, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Om¹²,[His ¹ , Ser ⁷ x ⁸ x ¹⁹ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Om ¹² ,

Arg¹²·²¹, Leu¹³-²⁷, Val²⁶]-hGRF(1-29)-OH; [Leu⁵·¹³·²⁶, Ser⁷·¹⁹, Ala⁹·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,Arg ¹² · ^21, Leu ^{13 to 27,} Val ^26] -hGRF (1-29) -OH; [Leu ⁵ x ¹³ x ²⁶ , Ser ⁷ x ¹⁹ , Ala ⁹ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x ²¹ ,

Nle²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁷·¹⁹, ThH*, Ala⁹-¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg²¹,Nle ²⁷ ] -hGRF (1-29) -NH ₂ ; [His ¹ , Ser ⁷ x ¹⁹ , ThH *, Ala ⁹ - ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ²¹ ,

Leu¹³-²⁶-²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁷·⁸-¹⁹, Ala⁹·¹⁵·²⁸, Arg¹²·²¹,Leu ^{13 to 26} - ^27] -hGRF (1-29) -NH _2; [His ^1, Ser ⁷ · ^8-19, Ala ⁹ · ¹⁵ · ^28, Arg ¹² · ²¹

Leu^iW7]-hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, SER⁷-⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹, He¹³ Leu ^iW7 ] -hGRF (1-29) -NH ₂ ; [His ¹ , SER ⁷ - ⁸ x ¹⁹ , Ala ⁹ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x ²¹ , He ¹³

Leu²⁶'²⁷]-hGRF(1-29)-NH,; [His¹, Tyr⁶, Ser⁷·⁸-¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸-²⁸, Arg¹², ^_ Phe¹³, Leu²⁶]-hGRF(1-29)-0H;Leu ^{26 '27} ] -hGRF (1-29) -NH ,; [His ^1, Tyr ^6, Ser ⁷ · ^8-19, Ala ⁹ · ¹⁵ · ¹⁸ - ^28, Arg ^12, ^ _ Phe ^13, Leu ^26] -hGRF (1-29) -0H;

[D-Asp², Ser™¹⁹, AIa⁹^²⁸, Arg¹²-²¹,[D-Asp ^2, Ser ™ ^19, Ala ²⁸ ^ ^9, Arg ^{12 to 21,}

Leu¹³-²⁶, Nle²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [D-Phe¹, Ser⁷·⁸, AIa⁹-¹⁵-²⁸, Arg¹²-²¹,Leu ^{13 to 26,} Nle ^27] -hGRF (1-29) -NH _2; [D-Phe ¹ , Ser ⁷ x ⁸ , Ala ⁹ - ¹⁵ - ²⁸ , Arg ¹² - ²¹ ,

Leu¹³·²⁶, Nva²⁷]^hGRF(1-29)-NH₂; [D-His¹, D-Asp³, Ser⁷·¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Argi2_r Leui3,26_{( N}le27, Orn2i]-hGRF(1-29)-NH₂; [Na Me-D-Tyr¹, Ser⁷.8,19, Ala⁹'¹⁸.²⁸,Orn¹¹, Argiz.21, Leuis.26, He27]-hGRF(1-29)-NH₂;Leu ¹³ · ^26, Nva ^27] ^ hGRF (1-29) -NH _2; [D-His ¹ , D-Asp ³ , Ser ⁷ x ¹⁹ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Argi 2 _r Leui 3,26 _(N le27, Orn 2i] -h GRF (1-29) -NH ₂ ; [Na Me .-D-Tyr ^1, Ser ⁷ .8,19, Ala ^{9 '18 28,} Orn ^11, Argiz.21, Leuis.26, HE27] -hGRF (1-29) -NH _2;

Leu26,27]_hGRF(1-29)-NH₂; [His¹, Ser⁷-⁸, AIa⁹-¹⁵-²⁸, Arg¹²,Leu26,27] _hGRF (1-29) -NH ₂ ; [His ¹ , Ser ⁷ - ⁸ , Ala ⁹ - ¹⁵ - ²⁸ , Arg ¹² ,

Leu¹³·²⁶-²⁷, Orn²⁰-²¹]-hGRF(-29)-NH₂; [Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸-²⁸, Leu¹⁰·¹³, Arg¹²·²¹,Leu ¹³ · ²⁶ - ^27, Orn ²⁰ - ^21] -hGRF (-29) _-NH2; [Ser ⁷ x ⁸ x ¹⁹ Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ - ^28, Leu ¹⁰ · ^13, Arg ¹² · ²¹

Phe²⁶, Glu²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂;Phe ²⁶ , Glu ²⁷ ] -hGRF (1-29) -NH ₂ ;

[CMe-Tyr¹, Ser⁷·⁸.·¹⁹, Ala³·'⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,[CMe-Tyr ¹ , Ser ⁷ x ^8, x ¹⁹ , Ala ³ x ⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x ²¹ ,

Leu¹³·²⁶, Orn²⁰, Asp²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [Leu¹·¹³, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁸·²⁸, Arg¹²·²¹,Leu ¹³ · ^26, Orn ^20, Asp ^27] -hGRF (1-29) -NH _2; [Leu ¹ x ¹³ , Ser ⁷ x ⁸ x ¹⁹ , Ala ⁹ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x ²¹ ,

He^2M7]-hGRF(1-29)-OH; [N^aMe-Met', Ser⁷·¹⁹, Thr⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Lys¹¹,He ^2M7 ] -hGRF (1-29) -OH; [N ^a Me-Met ', Ser ⁷ x ¹⁹ , Thr ⁸ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Lys ¹¹ ,

Arg¹²·²¹, Leu'ww'l-hGRFil-aai-NHj; [Ser⁷·⁸, Ala⁹·¹⁵·¹⁸, Arg¹²·²¹, -Arg ¹² x ²¹ , Leu'ww'l-hGRFil-aai-NHj; [Ser ⁷ x ⁸ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ , Arg ¹² x ²¹ , -

Leu¹³·²⁶·²⁷, Asn²⁸] -hGRF( 1 -29)-NH₂; [N³Me-HiS¹, Ser⁷·⁸·¹⁹, Phe¹⁰, Ala¹⁵·¹⁸·²⁸,Leu ¹³ · ²⁶ · ²⁷ , Asn ²⁸ ] -hGRF (1 -29) -NH ₂ ; [N ³ Me-HiS ¹ , Ser ⁷ x ⁸ x ¹⁹ , Phe ¹⁰ , Ala ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ ,

Orn¹²·²¹, Leu¹³·²⁶, Lys²⁰, Gln²⁷]-hGRF(1-29)-NH₂; [C³Me-HiS¹, Ser⁷·¹⁹, Gin⁸, Ala⁹·¹⁵·¹³·²⁸, Orn¹¹,Orn ¹² x ²¹ , Leu ¹³ x ²⁶ , Lys ²⁰ , Gln ²⁷ ] -hGRF (1-29) -NH ₂ ; [C ³ Me-HiS ¹ , Ser ⁷ x ¹⁹ , Gin ⁸ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹³ x ²⁸ , Orn ¹¹ ,

Arg¹²·²¹, Leu¹³·²⁶, TrP²⁷J-HGRF(I^g)-OH; [His¹, Ser⁷·⁸·¹⁹, Ala⁹·¹⁵·¹⁸·²⁸, Arg¹²·Arg ¹² x ²¹ , Leu ¹³ x ²⁶ , TrP ²⁷ J-HGRF (I ^ g) -OH; [His ¹ , Ser ⁷ x ⁸ x ¹⁹ , Ala ⁹ x ¹⁵ x ¹⁸ x ²⁸ , Arg ¹² x

Leu¹³·²⁶, Lys²⁰, Tyr²⁷]-HGRF(I^)-N H₂;Leu ¹³ x ²⁶ , Lys ²⁰ , Tyr ²⁷ ] -HGRF (I ^) - NH ₂ ;

Von diesen Analogen wurde bestätigt, daß sie nach TLC und HPLC im wesentlichen rein waren.These analogs were confirmed to be substantially pure after TLC and HPLC.

Von diesen synthetischen Peptiden wurde gefunden, daß sie - durch Vergleich mit synthetischen hGRF(1-40)-OH - etwa die gleiche und oftmals größere Wirksamkeiten hinsichtlich der GH-Sekretion zeigten. Als ein Testbeispiel für die Wirksamkeit des synthetischen Peptids von Beispiel I, die Freisetzung von Wachstumshormonen zu beschleunigen, wurden in vitro Assays unter Verwendung von synthetischer hGRF(1-40)-OH als Standard im Nebeneinander-Vergleich mit äquimolaren Konzentrationen von verschiedenen anderen synthetisierten Analogen und Fragmenten durchgeführt. Es wurden Kulturen verwendet, die Zellen von Rattenhypophysen enthielten, die vier Tage vor dem Test entfernt worden waren. Kulturen, die als optimal für die Sekretion von Wachstumshormon betrachtet wurden, wurden für den Vergleichstest eingesetzt, der ganz allgemein von VaIe et al. in Endocrindogy, 91, 562-572 (1972) beschrieben wurde und detaillierter von VaIe et al. in Endocrindogy, 112, 1553-1555 (1983). Die zu testende Substanz wurde vier Stunden inkubiert, und Aliquote des Kulturmediums wurden entfernt und behandelt, um ihren entsprechenden Gehalt an immunoreaktiver GH(ir GH) über eine charakteristische Immunoassay zu messen. Die Ergebnisse dieses Vergleichstests unter Verwendung äquimolarer Konzentrationen zeigen, daß die Peptide der Beispiele I und Il eine Wirksamkeit aufwiesen, die der des hpGRF(1—4O)-OH Standards äquivalent ist. Derartige synthetische hpGRF-Analoge sollten für Anwendungen am Menschen nützlich sein, bei denen ein Arzt die GH-Produktion anheben will, und sie sollten natürlicher hpGRF vorzuziehen sein. Die Festphasensynthese dieser Analoge ist leichter als die Synthese des natürlichen Moleküls, wegen der kürzeren Länge des hpGRF-Analogpeptids. Darüber hinaus kann die geordnetere Struktur, die in den Analogen gefunden wurde, zu stabileren Peptiden führen, wodurch deren Reinigung leichter wird. Die Stimulierung der GH-Sekretion durch derartige Analoge ist bei Patienten von Interesse, die völligen oder relativen GH-Mangel aufweisen, hervorgerufen durch Unterproduktion endogener GRF. Darüber hinaus ist zu vermuten, daß eine steigende GH-Sekretion und deren davon abhängiges steigendes Wachstum bei Menschen oder Tieren mit normalen GH-Spiegeln erreicht werden kann. Weiterhin sollte die Verabreichung den Körperfettgehalt ändern und andere GH-abhängige metabolische, immunologische und Entwicklungsprozesse modifizieren. Beispielsweise können diese Analoge als Mittel zur Stimulierung anabolischer Prozesse beim Menschen unter Begleitumständen nützlich sein, wie siez. B. bei Verbrennungen eintreten. Als ein anderes Beispiel können diese Analoge warmblütigen Nutztieren verabreicht werden, wie Hühnern, Truthühnern, Schweinen, Ziegen, Rindern und Schafen, und sie können in der Aquokultur zur Aufzucht von Fischen und anderen kaltblütigen Seelebewesen, z. B. Seeschildkröten und Aalen sowie Amphibien verabreicht werden, um das Wachstum zu beschleunigen und das Verhältnis von Protein zu Fett zu steigern, was durch Verfütterung wirksamer Mengen der Peptide erreicht wird.These synthetic peptides were found to show approximately the same and often greater efficiencies in GH secretion by comparison with synthetic hGRF (1-40) -OH. As a test of the effectiveness of the synthetic peptide of Example I to accelerate growth hormone release, in vitro assays were performed using synthetic hGRF (1-40) -OH as a standard in juxtaposition with equimolar concentrations of various other synthesized analogues and fragments performed. Cultures containing rat pituitary cells removed four days before the test were used. Cultures considered to be optimal for growth hormone secretion were used for the comparison test, which is generally described by VaIe et al. in Endocrindogy, 91, 562-572 (1972) and described in more detail by VaIe et al. in Endocrindogy, 112, 1553-1555 (1983). The substance to be tested was incubated for four hours, and aliquots of the culture medium were removed and treated to measure their respective levels of immunoreactive GH (irGH) via a characteristic immunoassay. The results of this comparative assay using equimolar concentrations indicate that the peptides of Examples I and II had efficacy equivalent to that of the hpGRF (1-4O) -OH standard. Such synthetic hpGRF analogs should be useful for human applications where a physician wants to increase GH production, and they should be preferable to natural hpGRF. The solid-phase synthesis of these analogs is easier than the synthesis of the natural molecule because of the shorter length of the hpGRF analog peptide. In addition, the more ordered structure found in the analogs can lead to more stable peptides, making their purification easier. Stimulation of GH secretion by such analogs is of interest to patients having complete or relative GH deficiency caused by underproduction of endogenous GRF. In addition, it can be assumed that increasing GH secretion and its dependent increasing growth in humans or animals can be achieved with normal GH levels. Furthermore, administration should alter body fat content and modify other GH-dependent metabolic, immunological and developmental processes. For example, these analogs may be useful as agents for stimulating anabolic processes in humans under circumstances such as. B. occur during burns. As another example, these analogs can be administered to warm-blooded farm animals, such as chickens, turkeys, swine, goats, cattle and sheep, and can be used in aquaculture for rearing fish and other cold-blooded animals, e.g. Sea turtles and eels, as well as amphibians, to accelerate growth and increase the protein to fat ratio, which is achieved by feeding effective amounts of the peptides.

Für die Verabreichung am Menschen sollten diese synthetischen Peptide eine Reinheit von wenigstens etwa 93% und vorzugsweise von wenigstens 98% haben. Die Reinheit für die Zweckadieser Anwendung bezieht sich auf das ausgewählte Peptid und macht den festgestellten (Masse-)Prozentsatz aller vorhandenen Peptide und Peptidfragmente aus. Für die Verabreichung derartiger synthetischer Peptide an Nutz- und andere Tiere, um deren Wachstum zu beschleunigen und den Fettgehalt zu reduzieren, kann eine Reinheit von weniger als 5% oder noch von 0,01 % annehmbar sein.For human administration, these synthetic peptides should have a purity of at least about 93%, and preferably at least 98%. The purity for the purpose of this application refers to the peptide selected and accounts for the detected (mass) percentage of all the existing peptides and peptide fragments. For the administration of such synthetic peptides to commercial and other animals to accelerate their growth and reduce fat content, a purity of less than 5% or even 0.01% may be acceptable.

Diese synthetischen Peptide oder deren riichttoxische Salze, kombiniert mit einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Träger zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung können an Lebewesen, einschließlich Menschen verabreicht werden, entweder intravenös, subkutan!, inframuskulär, perkutan z. B. intranasal oder eben oral. Die Verabreichung kann durch einen Arzt erfolgen, um die Freisetzung von GH zu stimulieren, in den Fällen, wo ein Patient eine solche therapeutische Behandlung benötigt. Die erforderliche Dosis hängt von den besonderen zu behandelnden Bedingungen ab, von der Schwierigkeit des Zustandes und von der Dauer der gewünschten Behandlung.These synthetic peptides or their toxic salts, combined with a pharmaceutically or veterinarily acceptable carrier for the preparation of a pharmaceutical composition, can be administered to animals, including humans, either intravenously, subcutaneously, inframuscularly, percutaneously, e.g. B. intranasal or even oral. The administration may be by a physician to stimulate the release of GH in cases where a patient needs such therapeutic treatment. The required dose depends on the particular conditions to be treated, on the severity of the condition and on the duration of the desired treatment.

Derartige Peptide werden oft in Form von nichttoxischen Salzen verabreicht, wie Säureadditionssalze oder Metallkomplexe, z. B. mit Zink, Eisen oder ähnlichem (die als Salze für die Zwecke dieser Anmeldung angesehen werden). Beispiele für derartige Säureadditionssalze sind das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat und ähnliche. Wenn der aktive Bestandteil oral in Tablettenform zu verabreichen ist, kann die Tablette ein Bindemittel enthalten, wie Tragant, Maisstärke oder Gelatine; ein Verteilungsmittel wie Alginsäure; und ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat. Falls die Verabreichung in flüssiger Form wünschenswert ist, kann ein Süßungs- und/oder Geschmacksstoff verwendet.werden. Die intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Salzlösung, Phosphatpufferlösungen oder ähnlichem erfolgen.Such peptides are often administered in the form of non-toxic salts, such as acid addition salts or metal complexes, e.g. With zinc, iron or the like (which are considered as salts for the purposes of this application). Examples of such acid addition salts are the hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, maleate, acetate, citrate, benzoate, succinate, malate, ascorbate, tartrate and the like. When the active ingredient is to be administered orally in tablet form, the tablet may contain a binder such as tragacanth, corn starch or gelatin; a distribution agent such as alginic acid; and a lubricant such as magnesium stearate. If administration in liquid form is desirable, a sweetening and / or flavoring agent may be used. Intravenous administration may be in isotonic saline, phosphate buffer solutions or the like.

Die Peptide sollten beim Menschen unter ärztlicher Aufsicht verabreicht werden, und pharmazeutische Zusammensetzungen werden üblicherweise das Peptid in Verbindung mit einem konventionellen festen oder flüssigen, pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff enthalten. Üblicherweise wird die parenterale Dosis zwischen etwa 100 Nanogramm bis etwa 50 Mikrogramm Peptid pro Kilogramm Körpermasse des zu Behandelnden liegen.The peptides should be administered to humans under medical supervision, and pharmaceutical compositions will usually contain the peptide in conjunction with a conventional solid or liquid, pharmaceutically acceptable carrier. Typically, the parenteral dose will be between about 100 nanograms to about 50 micrograms of peptide per kilogram body mass of the subject to be treated.

Obgleich die Erfindung im Hinblick auf ihre bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, insbesondere Beispiel I und II, die die beste, den Erfindern gegenwärtig bekannte Art darstellten, sollte klar sein, daß zahlreiche Änderungen und Modifikationen für den auf dem Fachgebiet tätigen Fachmann naheliegend sind, ohne vom Schutzbereich der Erfindung, wie sie in den folgenden Ansprüchen dargelegt ist, abzuweichen. Beispielsweise können Modifikationen in der Peptidkette, insbesondere Weglassen eines oder zweier Reste erfolgen, beginnend am C-Terminal des Peptids, in Übereinstimmung mit bisher bekannten experimentellen Praktiken, um zu Peptiden zu gelangen, die sehr wesentliche Teile der biologischen Potenz des Peptids aufweisen. Solche Peptide sind als innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung liegend anzusehen.Although the invention has been described in terms of its preferred embodiments, in particular Example I and II, which represent the best mode presently known to the inventors, it should be understood that numerous changes and modifications will be apparent to those skilled in the art without departing from The scope of the invention as set forth in the following claims, depart. For example, modifications in the peptide chain, especially omission of one or two residues, starting at the C-terminal of the peptide, in accordance with previously known experimental practices, can result in the production of peptides having very substantial parts of the peptide's biological potency. Such peptides are to be considered to be within the scope of the invention.

Darüber hinaus können am C-Terminal Zusätze angefügt werden und /oder allgemein äquivalente Reste können für natürlich auftretende Reste substituiert werden, wie das. in der Peptidchemie allgemein üblich ist, um beispielsweise andere Analoge mit erhöhter Resistenz gegen Proteolyse herzustellen, und auch um wenigstens einen wesentlichen Teil der Wirksamkeit des beanspruchten Polypeptide zu erhalten, ohne dabei vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, wie das im Beispiel IV erläutert wurde. Desgleichen können bekannte Substitutionen im Carboxylrest am C-Terminal, z. B. ein niederes Alkylamid, ebenfalls zu äquivalenten Molekülen führen.In addition, additions may be made to the C-terminal and / or generally equivalent residues may be substituted for naturally occurring residues, such as is common in peptide chemistry to produce, for example, other analogues having increased resistance to proteolysis, and also at least one to obtain substantial part of the efficacy of the claimed polypeptides, without departing from the scope of the invention, as explained in Example IV. Similarly, known substitutions in the carboxyl group at the C-terminal, z. As a lower alkyl amide, also lead to equivalent molecules.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel (I)1. Process for the preparation of a peptide of the formula (I) R₁-R₂-R₃-AIa-R₅-R₆-R₇-R₈-R₁O-RiI-R₁₂-R₁₃-LeU-R₁₅-GIn-LeU-R₁₈-R₁₉-R₂O-R₂I-LeU-LeU-QJ^_G|_U_R₂₆_R₂₇_R_?S—Arg— Y worin RiistTyoD-Tyr.Met/Phe.D-Phe^ei^His oder D-His das entweder eine C^aMe- oder N³Me-Substitution aufweist oder unsubstituiert ist; worin R₂ gleich AIa oder D-AIa ist;R ₁ -R ₂ -R ₃ -Al-R ₅ -R ₆ -R ₇ -R ₈ -R ₁ O -RiI-R ₁₂ -R ₁₃ -LeU-R ₁₅ -GIn-LeU-R ₁₈ -R ₁₉ - R ₂ OR ₂ I-LeU-LeU-QJ ^ _G | _U _R ₂₆ _R ₂₇ _R _{? S} -Arg- Y wherein RiistTyoD-Tyr.Met / Phe.D-Phe ^ ei ^ His or D-His has either a C ^a Me or N ³ Me substitution or is unsubstituted; wherein R ₂ is Ala or D-Ala; R₃ ist Asp oder D-Asp; R₅ ist He oder Leu; R₆ ist Phe oder Tyr; R₇ ist Ser oder Thr; R₈ ist Ser, Asn, Thr oder Gin; R₉ ist AIa oder Ser; R₁₀ ist Tyr, Phe oder Leu; R_n ist Arg, Om oder Lys; R₁₂ ist Arg, Orn oder Lys; R₁₃ ist He, Leu, Phe oder VaI; R₁₅ ist GIy oder Ala; R₁₈ ist AIa oder Ser; R₁₉JSt Ser oder Ala; R₂₀ ist Arg, Om oder Lys; R₂₁ ist Arg, Om oder Lys; R₂₆ ist Leu, lie, VaI oder Phe, R₂₇ ist Nie, Nva oder eine natürliche Aminosäure; R₂₈ ist AIa, Leu, Asn, GIn oder Ser; und Y ist OH oder NH₂; mit der Maßgabe, daß wenigstens vier der folgenden Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, Rn, Ri₂, R13, Ri₅, Ri₈, R₁₉, R₂₀, R₂i und R₂₆ verschieden von den Resten sind, die in der entsprechenden Position natürlicher hGRF auftreten, gekennzeichnet durch entweder (A) die SchritteR ₃ is Asp or D-Asp; R ₅ is He or Leu; R ₆ is Phe or Tyr; R ₇ is Ser or Thr; R ₈ is Ser, Asn, Thr or Gin; R ₉ is Ala or Ser; R ₁₀ is Tyr, Phe or Leu; R _n is Arg, Om or Lys; R ₁₂ is Arg, Orn or Lys; R ₁₃ is He, Leu, Phe or VaI; R ₁₅ is Gly or Ala; R ₁₈ is Ala or Ser; R ₁₉ JSt Ser or Ala; R ₂₀ is Arg, Om or Lys; R ₂₁ is Arg, Om or Lys; R ₂₆ is Leu, lie, VaI or Phe, R ₂₇ is Never, Nva or a natural amino acid; R ₂₈ is Ala, Leu, Asn, GIn or Ser; and Y is OH or NH ₂ ; with the proviso that at least four of the following radicals R ₅ , R ₆ , R ₇ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ , Rn, Ri ₂ , R 13, Ri ₅ , Ri ₈ , R ₁₉ , R ₂₀ , R ₂ i and R _{26 are} different from the residues occurring in the corresponding position of natural hGRF, characterized by either (A) the steps (a) Bilden eines Peptidzwischenprcduktes mit wenigstens einer Schutzgruppe und der Formel (II) X'-R,(X oder X²)-R₂-R₃(X³)-Ala-R₅-R₆(X²)-R₇(X⁴)-R₈(X⁴ oder X⁵)-R₉(X⁴)-R,o(X²)-Rii(X⁶ oder X⁷)-R₁₂(X⁶ oder X⁷)-R,₃-Leu-R₁₅-Gln(X⁵)-Leu-R₁₈(X²)-R₁₉(X⁴)-R₂₀(X⁶ oder X⁷)-R₂₁(X⁶ oder X⁷)-Leu-Leu-Gln(X⁵)-Glu(X³)-R₂₆-R₂₇(X⁸)-R₂₈(X⁴ oder X⁵)-Arg(X⁶)-X⁹, worin X, X¹, X², X³, X⁴, X^s, X⁶, X⁷ und X⁸ jeweils entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe darstellen und X⁹ ist entweder eine Schutzgruppe oder eine Ankerbindung zum Harzträger oder des -X⁹;(a) forming a peptide intermediate having at least one protective group and the formula (II) X'-R, (X or X ² ) -R ₂ -R ₃ (X ³ ) -Ala-R ₅ -R ₆ (X ² ) - R ₇ (X ⁴ ) -R ₈ (X ⁴ or X ⁵ ) -R ₉ (X ⁴ ) -R, o (X ² ) -Rii (X ⁶ or X ⁷ ) -R ₁₂ (X ⁶ or X ⁷ ) -R, ₃ -Leu-R ₁₅ -Gln (X ⁵ ) -Leu-R ₁₈ (X ² ) -R ₁₉ (X ⁴ ) -R ₂₀ (X ⁶ or X ⁷ ) -R ₂₁ (X ⁶ or X ⁷ ) -Leu-Leu-Gln (X ⁵ ) -Glu (X ³ ) -R ₂₆ -R ₂₇ (X ⁸ ) -R ₂₈ (X ⁴ or X ⁵ ) -Arg (X ⁶ ) -X ⁹ , wherein X, X ¹ , X ² , X ³ , X ⁴ , X ^s , X ⁶ , X ⁷ and X ^{8 are} each either hydrogen or a protecting group and X ⁹ is either a protecting group or an anchor bond to the resin support or -X ⁹ ; (b) Abspalten der Schutzgruppe oder -gruppen oder der Ankerbindung von dem Peptid der Formel (II); und(b) cleaving the protecting group or groups or the anchor bond from the peptide of formula (II); and (c) gewünschtenfalls Umwandeln eines erhaltenen Peptids in ein nichttoxisches Salz davon; oder (B) die Schritte zum Erhalten einer DNA-Kette, die ein Peptid der Formel (I) verschlüsselt, Insertieren der DNA-Kette in einen Klonierungsvektor in genauer Beziehung zu DNA-Sequenzen, die die Expression des verschlüsselten Peptids starten, Transformieren eines Organismus oder einer Zellinie mit dem Klonierungsvektor, der die insertierte DNA-Kette enthält, Kultivieren des transformierten Organismus oder der Zellinie und Erhalten des dadurch produzierten Peptids.(c) if desired, converting an obtained peptide to a non-toxic salt thereof; or (B) the steps of obtaining a DNA chain which encodes a peptide of formula (I), inserting the DNA chain into a cloning vector in exact relationship to DNA sequences which start the expression of the encoded peptide, transforming an organism or a cell line with the cloning vector containing the inserted DNA chain, culturing the transformed organism or cell line, and obtaining the peptide produced thereby. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Kette durch schrittweise Konstruktion des Oligonucleotids mit überlappenden Komplementärsequenzen synthetisiert wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the DNA chain is synthesized by stepwise construction of the oligonucleotide with overlapping complementary sequences. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein prokaryotischer ist.3. The method according to claim 1, characterized in that the organism is a prokaryotic. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus oder die Zellinie ein(e) eukaryotische ist.4. The method according to claim 1, characterized in that the organism or the cell line is a (e) eukaryotic. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X¹ Wasserstoff oder eine a-Amino-Schutzgruppe ist; X² ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr; X³ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Carboxygruppe von Asp oder GIu; X⁴ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Ser oder Thr; X⁵ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Seitenkettenamidogruppe von Asn oder Gin; X⁶ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arg; X⁷ ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Seitenkettenaminogruppe von Lys oder Orn; X⁸ ist Wasserstoff oder eine geeignete Seitenkettenschutzgruppe; X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Imidazolstickstoff von His; und X⁹ ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus OH, Amide, -O-CH₂-Harzträger und -NH-Harzträger.5. The method according to claim 1, characterized in that X ^{1 is} hydrogen or an a-amino protecting group; X ² is hydrogen or a protecting group for the phenolic hydroxyl group of Tyr; X ³ is hydrogen or a protecting group for the carboxy group of Asp or Glu; X ⁴ is hydrogen or a protecting group for the alcoholic hydroxyl group of Ser or Thr; X ⁵ is hydrogen or a protecting group for the side chain amido group of Asn or Gin; X ⁶ is hydrogen or a protecting group for the guanidino group of Arg; X ⁷ is hydrogen or a protecting group for the side chain amino group of Lys or Orn; X ⁸ is hydrogen or a suitable side chain protecting group; X is hydrogen or a protecting group for the imidazole nitrogen of His; and X ⁹ is selected from the group consisting of OH, amides, -O-CH ₂ resin carrier and -NH resin carrier. 6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Peptid die Formel aufweist H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu- 6. The method according to claim 1, characterized in that the peptide has the formula H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gln- Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu -Leu-Gln-Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-OH und worin X¹ gleich BOC ist, X² ist 2,6-Dichlorbenzyl, X³ ist OBzI, X⁴ ist BzI, X⁵ ist Xan, X⁶ ist Tos und X^s ist -O-CHj-Harzträger.-Leu-Gln-Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-OH and wherein X ¹ is BOC, X ² is 2,6-dichlorobenzyl, X ³ is OBzI, X ⁴ is BzI, X ⁵ is Xan, X ⁶ Tos is and X ^s is -O-CHj resin carrier. 7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Formel (I) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr- Arg-7. The method according to claim 1, characterized in that the formula (I) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg ,,-Arg-Leu-Leu-Ala-GIn-Leu-AIa-Ser-Arg-Leu-Leu-Gin-GIu-Leu-Leu-AIa-Arg-N H₂ ist, worin X¹ gleich BOC ist, X² ist 2,6-Dichlorbenzyl, X³ ist OBzI, X⁴ ist BzI, X^B ist Xan, X⁶ ist Tos und X⁹ ist -NH₂-Harzträger.,, - Arg-Leu-Leu-Ala-Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Gin-Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-N H ₂ wherein X ¹ is equal to BOC, X ² is 2,6-dichlorobenzyl, X ³ is OBzI, X ⁴ is BzI, X ^B is Xan, X ⁶ is Tos and X ⁹ is -NH ₂ resin carrier.