CZ300805B6 - Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy - Google Patents

Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy Download PDF

Info

Publication number
CZ300805B6
CZ300805B6 CZ20070054A CZ200754A CZ300805B6 CZ 300805 B6 CZ300805 B6 CZ 300805B6 CZ 20070054 A CZ20070054 A CZ 20070054A CZ 200754 A CZ200754 A CZ 200754A CZ 300805 B6 CZ300805 B6 CZ 300805B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cells
layers
group
layer
tissue
Prior art date
Application number
CZ20070054A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ200754A3 (cs
Inventor
Lesný@Petr
Syková@Eva
Michálek@Jirí
Prádný@Martin
Jirsák@Oldrich
Martinová@Lenka
Original Assignee
Ústav experimentální medicíny AV CR
Ústav makromolekulární chemie AV CR
Technická univerzita v Liberci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav experimentální medicíny AV CR, Ústav makromolekulární chemie AV CR, Technická univerzita v Liberci filed Critical Ústav experimentální medicíny AV CR
Priority to CZ20070054A priority Critical patent/CZ300805B6/cs
Priority to PCT/CZ2008/000005 priority patent/WO2008089708A1/en
Publication of CZ200754A3 publication Critical patent/CZ200754A3/cs
Publication of CZ300805B6 publication Critical patent/CZ300805B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/0007—Electro-spinning
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/12—Nanosized materials, e.g. nanofibres, nanoparticles, nanowires, nanotubes; Nanostructured surfaces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev sestává alespon ze dvou nanovlákenných vrstev, porostlých na obou stranách souvisle živými bunkami, pricemž tyto vrstvy jsou vzájemne propojeny prorustáním bunek. Nanovlákenné vrstvy jsou netkané a jsou tvoreny syntetickými polymery nebo kopolymery monomeru vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, urethany, vinylalkohol a monomery odvozené od kyseliny mlécné a jejích derivátu, a zpusobu jeho prípravy.

Description

Biomateriál na bázi nanoviákenných vrstev a způsob jeho přípravy
Oblast techniky
Vynález se týká biomateriálu na bázi nanoviákenných vrstev a způsobu jeho přípravy.
Dosavadní stav techniky
Příprava různých forem pevných látek vyznačujících se přítomností pórů, respektive měrného povrchu odpovídajícího rozměrům strukturních jednotek systému v řádu několika nanometrů až stovek nanometrů je v současné době v popředí zájmu materiálového inženýrství. Prakticky všechny důležité vlastnosti takových systémů se odvozují právě od mimořádně velkého měrného i s povrchu. Zatímco porézní materiály na bázi polymerů a nanomateriály připravované cestou organizovaných nadmolekulámích struktur jsou dlouhodobě zevrubně studovány, vláknům o průměru řádově v desítkách až stovkách nanometrů se věnuje zvýšená pozornost teprve v posledních pěti letech. Z těchto vláken lze přitom vytvářet vlákenné vrstvy dobrých mechanických vlastností přímo v průběhu procesu zvláknění. Mechanické vlastnosti i morfologie jsou příznivě ovlivněny anizotropickým charakterem vlákenné vrstvy. Póry v takových vrstvách mají specifickou geometrii, díky níž jsou povrchy vláken dobře přístupné.
Nanovlákna jsou obecně popisována jako vlákna, jejichž průměr se pohybuje v submikronové oblasti, tedy v rozsahu do 1000 nm. Mají řadu výjimečných vlastností, jako je například velký měrný povrch vláken, velká pórovitost vlákenné vrstvy a malý průměr pórů. Z hlediska buněčných kultur se struktura nanoviákenných vrstev přibližuje struktuře extracelulámí matrix. Tomu odpovídají opakovaná pozorování vyšší adheze buněk k nanovláknům než k mikrovláknům nebo vrstvám identických polymerů [SchindlerM, Ahmedl, KamalJ, NurEKA, Grafe TH, Young Chung H, et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morpho30 genesis for celíš in culture. Biomaterials. 2005 Oct; 26(28): 5624-31.; Rho KS, Neony L, Lee G, Seo BM, Park YJ, Hong SD, et al. Electrospinning of collagen nanofibers: effects on the behavior of normál human keratinocytes and early-stage wound healing. Biomaterials. 2006 Mar; 27(8): 1452-61.; Min BM, Lee G, Kim SH, Nam YS, Lee TS, Park WH. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normál human keratinocytes and fibroblasts in vitro. Biomaterials. 2004 Mar-Apr; 25(7-8): 1 289-97].
Využití mikrovláken k vytvoření porézních trojrozměrných tkáňových náhrad obsahujících buňky je známo již od roku 1993; tato technologie sloužila nejprve k experimentální přípravě náhrad kloubních chrupavek [Robinson D, Efrat M, Mendes DG, Halperin N, Něvo Z. Implants compo40 sed of carbon fiber mesh and bone-marrow-derived, chondrocyte-enriched cultures for jo int surface reconstruction. Bull Hosp Jt Dis. 1993 Spring; 53(1): 75-82.], Toto využití mikrovláken je chráněno patentem [US 5 759 830, US 5 770 417]. Prostorová síť mikrovláken zde zajišťuje mechanickou pevnost materiálu, udržuje jeho trojrozměrný tvar a vzájemné prostorové uspořádání buněk. Tato metoda však není aplikovatelná na netkané nanovlákenné textilie, protože při dosažení porozity potřebné pro vmezeření buněk mezi vlákna (póry v řádech jednotek až desítek mikrometrů) by materiál vlastní vahou kolaboval.
Standardním postupem pro udržování kultur tkáňových i kmenových buněk je kultivace v monolayeru (růst v ploše); pro tuto kultivaci se využívá speciálně povrchově upravených materiálů, ke kterým buňky adherují (tkáňový plastik, sklo povrchově upravené lamininem, polylysinem, tkáňový plastik porostlý inaktivovanými fibroblasty apod.). Alternativní metody kultivace zahrnují kultivaci v suspenzi nebo v materiálech na bázi řídkých gelů, např. MatriGel®. Všechny popsané metody kultivace mají své nevýhody. Růst buněk v kultuře v monolayeru je podmíněn jejich adhezí k materiálu, na němž jsou kultivovány; médium má přístup pouze kapikální (od kultivačního povrchu odvrácené) vrstvy; vlastnosti buněk se mění po dosažení souvislé (konCZ 300805 B6 tluentní) vrstvy; látky produkované buňkami se uvolňují do média a nezůstávají v okolí buněk. Výhodou kultivace v monolayeru je - kromě toho, že jde o velmi dobře standardizovaný postup také možnost sledovat v mikroskopu jednotlivé buňky (obr. 1).
Při kultivaci buněk na vláknech, nebo v makroporézních materiálech, jejichž velikost pórů se pohybuje v řádu desítek mikrometrů, se buňky chovají podobně jako v monolayeru - porůstají rovné plochy materiálu (obr. 2).
Vrstvy z netkané nanovlákenné textilie připravené metodou elektrospinningu je možné využít ke ío kultivaci buněk v monolayeru podobně jako například tkáňový plastik; první experimenty s buněčnými kulturami na nanovlákenných textiliích byly publikovány v roce 2002 [Li WJ,
Laurencin CT, Caterson EJ, Tuan RS, Ko FK. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res. 2002 Jun 15; 60(4): 613-21.]. Systém pro kultivaci buněk na nanovlákenných vrstvách je chráněn patentem [US 6 790 455], Očekávané prospěšné využití nanovlákenných vrstev v biomedicíně vedlo k podání souhrnné patentové přihlášky [WO 2005/025630], ve které však použití nanovláken pro konstrukci tkáňových náhrad není zmiňováno.
Řada autorů se pokoušela o vytvoření trojrozměrné tkáňové náhrady s využitím nanovláken.
Patentováno bylo využití nanovlákenné vrstvy jako základu, na kterém jsou kultivovány buňky hladké svaloviny a na nich j sou poté vytvářeny další buněčné vrstvy oddělované biomateriálem (například na bází polymeru) [US 6 428 802]. Zveřejněna byla i možnost vytvoření tkáňové náhrady pomocí kultivace buněk na rovnoběžných vrstvách ze sítě nanovláken a podkladové vrstvy (nosiče, v originále substráte). Tyto vrstvy dále mohou být od sebe odděleny libovolným biomateriálem [WO 2005/047493], Ani zde však není popsán vznik homogenní tkáně vzájemným propojením vrstev obsahujících buňky.
Materiály na základě kopolymerů 2-hydroxyethylmethakrylátu (HEMA) již byly opakovaně připraveny. Tyto kopolymery jsou vysoce biokompatibilní a adheze buněk kjejich povrchům závisí na jejich elektrickém náboji [Lesný P, PradnyM, JendelovaP, Michalek J, VacikJ, Sykova E. Macroporous hydrogels based on 2-hydroxyethyl methacrylate. Part 4: Growth of rat bone marrow stromal cells in three-dimensional hydrogels with positive and negative surface charges and in polyelectrolyte complexes. Journal of materials science. 2006 Sep; 17(9): 82933.].
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev, jehož podstata spočívá v tom, že sestává alespoň ze dvou nanovlákenných vrstev, porostlých na obou stranách souvisle živými buňkami, přičemž tyto vrstvy jsou vzájemně propojeny prorůstáním buněk, přičemž nanovlákenné vrstvy jsou netkané a jsou tvořeny syntetickými polymery nebo kopolymery monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, urethany, vinylalkohol a monomery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů.
S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethylmethakrylát, 2ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakryIamid.
Znakem vynálezu je, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně. S výhodou jsou buňky vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, fibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
Schopnost polymeru formovat se do vláken, tedy zvlákňovat se, je ovlivněna řadou procesních a materiálových parametrů, jako je například intenzita elektrického pole, elektrická vodivost, viskozita, molární hmotnost, povrchové napětí, koncentrace polymeru, rozpouštědlo, dielektrické vlastnosti polymemího roztoku, hydrofílnost/hydrofobnost, polymerizaění stupeň a stupeň větve5 ní polymeru nebo uspořádání experimentu. Vlastnosti zvlákněného materiálu ovlivňuje nejen chemické složení polymeru, ale i parametry zvlákňování. Změnou uvedených parametrů lze ovlivnit nejen proces zvlákňování, ale v určitých mezích i strukturu výsledné vrstvy a jemnost vláken. Pro každý polymerní roztok zvlákňovaný metodou elektrostatického zvlákňování je však třeba zvlášť hledat optimální procesní a systémové parametry, protože nalezené parametry jsou to přenositelné jen ve velmi omezené míře.
Způsobem přípravy nanovláken syntetického polymeru nebo kopolymeru podle předloženého vynálezu může být metoda elektrostatického zvlákňování „Nanospider“, při které jsou vlákna formována účinkem elektrostatického pole z tenké vrstvy polymemího roztoku, vynášené brodí15 cím válečkem, který je zároveň kladnou elektrodou, a jsou ukládána na kolektor, který je zároveň protielektrodou [CZ 294274 (B6), WO 2005/024101],
Kontakt s molekulami extracelulámí matrix a adheze k nim jsou pro většinu buněk velmi důležité faktory, které podmiňují jejich adhezi a růst v organismu. Kultivace buněk ve dvojrozměrných kultivačních systémech neodráží přirozené prostředí v organismu. Struktura nanovlákenné vrstvy je přirovnávána ke struktuře bazální membrány.
Buňky výrazně adherují na nanovlákenné vrstvy podle předloženého vynálezu tvořené polymery s nanovlákennou strukturou, a to i tehdy, když nejeví afinitu k vlastním polymerům bez nano25 vlákenné struktury. Po naočkování buněk na vrstvu nanovláken dojde v době dnů až týdnů (v závislosti na koncentraci buněk) k tomu, že buňky vrstvu nanovláken hustě porostou a jejich výběžky vrostou i mezi vlákna. Je-li vrstva nanovláken dostatečně tenká (jednotky až desítky mikrometrů), přesahuje růst buněk až na opačnou stranu vrstvy; od tloušťky vrstvy cca 100 mikrometrů již buňky na druhou stranu vrstvy nepřesahují.
Předností buněčných kultur na nanovlákenných vrstvách je možnost oboustranného růstu buněk na nanovlákenné vrstvě. Buňky rostoucí na nanovlákenné vrstvě si současně zachovávají schopnost růstu v prostoru, která se projevuje tak, že při přiblížení dvou nanovlákenných vrstev, obsahujících buňky, k sobě dojde ke srůstu těchto vrstev.
Předmětem předloženého vynálezu je dále způsob přípravy biomateriálu podle předloženého vynálezu, sestávajícího alespoň ze dvou nanovlákenných vrstev navzájem propojených prorůstáním buněk, jehož podstata spočívá v tom, že se připraví syntetický polymer nebo kopolymer monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny meth40 akrylové, urethany, vinylalkohol a monomery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer se zvlákní metodou elektrostatického zvlákňování, následně se na metodou elektrostatického zvlákňování připravenou zvlákněnou vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur do dosažení souvislého (konfluentního) pokrytí nanovlákenné vrstvy, a poté se alespoň dvě vrstvy zvlákněného syntetického polymeru nebo kopolymeru, porostlé buňkami, manuálně nebo automaticky naskládají na sebe a tato soustava vrstev se zatíží tlakem 0,5 až 2 kPa a kultivuje se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur po dobu 1 až 4 týdnů.
Standardní podmínky pro pěstování tkáňových kultur zahrnují použití kombinace média vhodného pro daný typ buněk, fetálního telecího séra nebo jeho náhrady, antibiotik, případně růstových faktorů, a kultivace probíhá v inkubátorech při 37 °C a 5 % CO2, kultivační médium je měněno každé 2 až 3 dny.
S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethylmethakrylát, 2-ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.
Znakem způsobu podle vynálezu je, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně. S výhodou jsou buňky vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, fibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
io Celý postup podle vynálezu tedy spočívá v neoddělitelných procesech zahrnujících přípravu a charakterizaci polymeru, proces zvláknění, osídlení nanovláken vhodnou buněčnou kulturou, kultivaci buněk na vrstvě nanovláken a zformování výsledného materiálu do podoby vhodné k vybrané aplikaci v tkáňovém inženýrství nebo konvenčním léčebném procesu.
Biomedicinální aplikace
V oblasti biomedicinálních aplikací je nutné brát zřetel na kvalitu použitého materiálu z několika úhlů pohledu. První hledisko jsou výsledné užitné lyzikálně-chemické vlastnosti, jako jsou mechanické (pevnost, tvrdost, houževnatost, elasticita), botnací (rovnovážný obsah vody), trans20 portní (permeabilita), optické (index lomu) a povrchové (drsnost, smáčivost, kontaktní úhel) vlastnosti. Dalšími podstatnými hledisky jsou pak fyzikální a chemická struktura materiálu, které významně ovlivňuji biotoleranci materiálu v aplikacích v daném prostředí. Jedná se o požadovanou interakci materiálu s živou tkání, tedy buněčnou kulturou, dále o jeho chemickou stabilitu, respektive řízenou biodegradaci. Požadavky kladené na vlastnosti biomateriálů jsou často proti25 chůdné a je nutno hledat kompromis mezi nimi. Proto také pro řadu aplikací existuje pouze úzký výběr vhodných chemických struktur.
Dalším problémem bioaplikací jsou nutné dlouhodobé testy vlastních účinků a zejména možných nežádoucích účinků použitých látek. Ze všech uvedených důvodů rezultuje přirozená snaha testovat v nových aplikacích již zavedené a tedy dlouhodobě užívané vyzkoušené materiály, které mají dobrý předpoklad vyhovět v testech toxicity, respektive snášenlivosti. V oblasti hydrogelů je takovým materiálem síťovaný poly(2-hydroxyethylmethakrylát) a některé jeho kopolymery nebo poly(2-hydroxypropylmethakrylamid),
Biomateriál podle předloženého vynálezu může být použit jako trojrozměrná orgánová náhrada: seskládáním nanovlákenných vrstev porostlých buňkami a jejich rovnoměrným zatížením je možné vytvořit trojrozměrné implantáty. Vhodnou kombinací parametrů zatížení, tloušťka vrstvy, procento plochy porostlé buňkami, počet vrstev a typy buněk v jednotlivých vrstvách - můžeme dosáhnout i vzniku relativně komplexních tkání. Příklad: kombinací vrstev porostlých hepato40 cyty a vrstev s buňkami endotelu lze vytvořit tkáňovou náhradu s podobným zastoupením buněk, jaké je v jatemí tkáni.
Přehled obrázků
Obr. 1 znázorňuje lidské stromální buňky kostní dřeně rostoucí v monotayeru na plastiku pro tkáňové kultury. Černá úsečka znázorňuje měřítko = 100 pm.
Obr. 2 znázorňuje lidské chondrocyty (šipka) rostoucí na povrchu polylaktidového vlákna o tloušťce 50 mikrometrů. Čemá úsečka znázorňuje měřítko = 50 pm.
Obr. 3 ukazuje schéma přístroje pro elektrospinning. Použité vztahové značky: 1 - kovový válec, kladná elektroda, 2 - zvlákňovaná vrstva polymemího roztoku, 3 - rezervoár polymemího roztoku, 4 - textilní substrát (podpůrný materiál), 5 - směr vzniku nanovláken, 6 - záporná uzemněná elektroda, 7 - odsávání vzduchu a par.
Obr. 4 ukazuje strukturu nanovlákenné vrstvy zobrazenou elektronovým mikroskopem AQUASEM.
Obr. 5 znázorňuje růst lidských chondrocytů obarvených pomocí imunofluorescence CFDA-SE (karboxyfluorescein diacetát, sukcinimidyl ester) na vrstvě nanovláken; (A) z horní strany jsou viditelné celé buňky (šipka), (B) ze spodní strany jsou viditelné pouze jejich výběžky. Bílá úsečka znázorňuje měřítko = 100 pm.
ío Obr. 6 znázorňuje vznik tkáně v nanovlákenném implantátu připraveného stočením nanovláken do ruličky v míše laboratorního potkana a jejím vložením v podélné ose míchy (A,C,E,G,I) nebo kolmo na podélnou osu míchy (B,D,F,H,J,K,L).
A,B - přehledné barvení hematoxylinem-eosinem, obdélníky označují výřezy s vysokou a s níz15 kou denzitou buněk které jsou dále zobrazeny ve větším měřítku. Měřítko = 500pm.
C,D - detaily vrůstání tkáně s vysokou denzitou buněk, barvení hematoxylinem-eosinem. Měřítko = ΙΟΟμητ.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu (25,5 g) s 2-ethoxyethylmethakiyIátem (60 g) byl připraven oxidačně redukční radikálovou polymerací monomerů účinkem persíranu amonného (0,5 g) a pyrosiřičitanu sodného (0,5 g) ve vodné - ethanolickém roztoku (380 g ethanolu, 170 g vody) při 23 °C po dobu 7 dnů. Poté byl vzniklý kopolymer vysrážen do vody (3 1), vysušen a rozpuštěn v ethanolu na koncentraci 16,6 %. Molámí hmotnost kopolymem byla 6,78 . 10s g/mol, vnitřní viskozita 27,1.
Příklad 2
Polymer 2-ethoxyethylmethakrylátu (85,5 g) byl připraven oxidačně redukční radikálovou polymerací monomeru účinkem persíranu amonného (0,5 g) a pyrosiřičitanu sodného (0,5 g) ve vodné - ethanolickém roztoku (380 g ethanolu, 170 g vody) při 23 °C po dobu 7 dnů. Poté byl vzniklý polymer vysrážen do vody (3 1), vysušen a rozpuštěn v absolutním ethanolu na koncent40 raci 16,1 % . Molámí hmotnost kopolymem byla 6,78 . 10s g/mol, vnitrní viskozita 26,9.
Příklad 3
Poly(2-hydroxypropylmethakrylamid) byl připraven srážecí polymerací 10 g monomeru účinkem 0,1 g azobis(isobutyronitrilu) při 60 °C po dobu 8 h. V 40 g acetonu, následným promytím polymeru acetonem a vysušením. Molámí hmotnost polymeru byla 8,2.10s.
Příklad 4
Roztok kopolymem podle příkladu 1 byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Schéma přístroje je znázorněno na obr. 3 a podrobně bylo popsáno již dříve [CZ 294274 (B6), WO 2005/024101].
Zvláknění probíhalo při napětí 25 kV.
Příklad 5
Polyuretan o molámí hmotnosti 2000 (lineární polykarbonátový diol a alifatický isophorondiizo5 kyanát) (Larithane LSI086 od firmy Novotex, Itálie) byl zvlákněn z 15% hmotn. roztoku dimethylformamidu s 1 % hmotn. tetraethylamoniumbromidu (vztaženo na polyuretan) metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.
io
Příklad 6
Polyvinylalkohol se stupněm hydrolýzy 80±8 % (Sloviol R - Chemické závody Nováky, Slovensko) byl zvlákněn z 12 % hmotn. vodného roztoku spolu s glyoxalem 3 % hmotn.) a kyselinou trihydrogenfosforeěnou (4,5 % hmotn.) metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.
Následně byla vlákenná vrstva zahřáta na 140 °C po dobu 3 minut, při čemž došlo kzesítění a tím stabilizaci vláken proti rozpouštění ve vodě.
Příklad 7
Kopolymer kyseliny mléčné a glykolové - (typ 7525DL HIGH IV od firmy Lakeshore Biomate25 rials Birmingham, AL) byl zvlákněn z 15% hmotn. roztoku v dichlormethanu a acetonu (4:1) metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.
Příklad 8
16,6% ethanolický roztok polymeru podle příkladu 1, jehož vodivost byla upravena přídavkem nasyceného roztoku chloridu sodného na 260 pS/cm, byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider.
Povrchové napětí polymemího roztoku bylo 27,07 mN/m, napětí při zvláknění 30 kV. Vzniklá nanovlákenná struktura je dokumentována na obr. 4 (fotografie z mikroskopu AQUASEM ve velkém zvětšení).
Příklad 9
16,1% vodně - ethanolický roztok (66,3 % ethanolu) polymeru podle příkladu 2, jehož vodivost byla upravena přídavkem nasyceného roztoku chloridu sodného na 260 pS/cm, byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Povrchové napětí polymemího roztoku bylo 26,9 mN/m, napětí při zvláknění 34 kV.
Příklad 10
16,8% vodný roztok polymeru podle příkladu 3, jehož vodivost byla upravena (přídavkem nasyceného roztoku chloridu sodného na 270 pS/cm, byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Povrchové napětí polymemího roztoku bylo 26,2 mN/m, napětí při zvláknění 31 kV.
Příklad 11
Vrstva nanovláken podle příkladů 1 a 4 o ploše 5 mm2 a tloušťce 50 pm byla na jednu hodinu ponořena do suspenze chondrocytů, označených plazmatickým barvivém CFDA, o koncentraci 1 χ 106 buněk/ml a kultivována po dobu 2 dní ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium DMEM/F12 1:1, 10% FCS, penicilin+streptomycin, inkubátor s 5 % CO2, 37 °C). Po uplynutí této doby byla vrstva nanovláken hustě porostlá zobou stran chondrocyty. Na obr. 5 je ukázán růst buněk z horní (A) a ze spodní (B) strany nanovlákenné vrstvy.
Příklad 12
Na vrstvu nanovláken o ploše 5 mm2 a tloušťce 50 pm připravenou podle příkladů 1 a 4 byly vysety potkaní buňky olfaktorické glie (OEG); vrstva byla stočena do roličky o tloušťce 1,5 mm a délce 1 mm a vložena do míchy laboratorního potkana. Po uplynutí 2 týdnů buňky pojivové tkáně a cévy masivně prorostly do implantované nanovlákenné roličky. V okolní tkáni nedošlo k zánětlivé infiltraci. Z proximálního i distálního okolí implantátu (roličky) prorůstala u implantátů, jejichž osa byla totožná s osou míchy, í vlákna nervových buněk; u implantátů, které byly kolmé na osu míchy vlákna nervových buněk prorůstala jen minimálně (obr. 6).
Příklad 13
Na vrstvu nanovláken připravenou podle příkladů 1 a 4 o ploše 5 mm2 a tloušťce 50 pm byly vysety potkaní stromální buňky kostní dřeně v koncentraci 1 x 104/cm3. Buňky byly obarveny phalloidinem (červeně) a jádra dobarvena DAP1 (modře). Za sedm dní porostly obě buněčné kultury (srovnatelně navzájem) nanovlákennou vrstvou srovnatelně jako při růstu na standardním polystyrenu upraveném pro růst tkáňových kultur (obr. 7).
Příklad 14
Pět jednotlivých vrstev nanovláken připravených podle příkladu l a 4 o ploše 5 mm2 a tloušťce
50 pm bylo ponořeno na 1 h do suspenze lidských chondrocytů o koncentraci 1 xlO6 buněk/ml a kultivováno po dobu 2 dní ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium DMEM/F12 1:1, 10% FCS, penicilín + streptomycin; inkubátor 5 % CO2 a 37 °C) tak, aby chondrocyty porostly obě strany každé vrstvy netkané nanovlákenné textilie. Vrstvy byly poté naskládány na sebe, rovnoměrně zatíženy (1 kPa) a kultivovány po následující tři týdny opět za stejných standardních podmínek jako předchozí kultivace. Po této době v materiálu vznikla řídká mezenchymální tkáň prorostlá všemi vrstvami nanovláken (obr. 8).
Příklad 15
Pět jednotlivých vrstev nanovláken připravených podle příkladů 1 a 4 o ploše 5 mm2 a tloušťce 50 pm bylo ponořeno na 1 h do suspenze lidských stromální buněk kostní dřeně o koncentraci 1 x I06 buněk/ml a kultivováno po dobu 2 dní ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium DMEM/F12 1:1, 10% FCS, penicilin + streptomycin; inkubátor 5% CO2 a 37 °C) tak, aby buňky porostly obě strany každé vrstvy netkané nanovlákenné textilie. Vrstvy byly poté naskládány na sebe, rovnoměrně zatíženy (1 kPa) a kultivovány po následující dva týdny za stejných standardních podmínek jako předchozí kultivace. Po této době buňky propojily jednotlivé vrstvy nanovlákenné textilie (obr. 9).
Příklad 16
Na vrstvu nanovláken připravenou podle příkladů 1 a 4 o ploše 1 cm2 a tloušťce 50 pm byly vysety stromální buňky kostní dřeně a mezenchymální buňky derivované z tukové tkáně v kon5 centraci 1 x 103 / cm3. Po 3 dnech kultivace ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur buňky porostly celou vrstvu nanovláken; zobrazení v konfokálním mikroskopu po obarvení phalloidinem ukázalo, že buňky porůstají souvisle (konfluentné) vrstvu nanovláken (obr. 10A) a vysílají výběžky do vrstvy nanovláken (obr. 10B). V místech, kde byla nanovlákenná vrstva zvlněná, porůstaly buňky její povrch (obr. 10C); buňky rostly i na okraji nanovlái o kenné vrstvy, kde byla koncentrace buněk nej nižší (obr. 1 OD).
Příklad 17
Stejný experiment jako v příkladu 16 byl zopakován s vrstvou nanovláken připravenou podle příkladů 3 a 10 o ploše 1 cm2 a tloušťce 50 pm. 3D zobrazení v konfokálním mikroskopu po obarvení buněk phalloidinem prokázalo obdobný růst, jako v předchozím případě (obr. 10E), v místech na okrajích rostly na povrchu vrstvy izolované buňky (obr. 10F).
Příklad 18
Na vrstvách nanovláken připravených podle příkladů 2 a 9 (obr. 11 A) a 3 a 10 (obr.l IB) byly kultivovány za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur mezenchymální buňky derivované z tukové tkáně laboratorního potkana po dobu 4 dnů. Poté byly buňky obarvené phalloidinem. Buňky porostly konfluentné vrstvu nanovláken.
Příklad 19 jednotlivých vrstev nanovláken připravených podle příkladů 1 a 4 o ploše 10 mm2 a tloušťce 50 pm bylo ponořeno na 1 h do suspenze lidských chondrocytů o koncentraci 1 x 106 buněk/ml a kultivováno po dobu 2 dní ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium DMEM/F12 1:1, 10% FCS, penicilín + streptomycin; inkubátor 5 % CO2 a 37 °C tak, aby chondrocyty porostly obě strany každé vrstvy netkané nanovlákenné textilie. Vrstvy byly poté naskládány na sebe, nerovnoměrně zatíženy( 0 až 2 kPa) a kultivovány po následující tři týdny opět za stejných standardních podmínek jako předchozí kultivace.
Po této době v části materiálu, která byla zatížena vyšším tlakem než 0,5 kPa, vznikla řídká mezenchymální tkáň prorostlá všemi vrstvami nanovláken a došlo k ukládání extracelulámí matrix (obr. 12A); v nezatížené Části materiálu nedošlo k propojení vrstev (obr. 12B).

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev, vyznačený tím, že sestává alespoň ze dvou nanovlákenných vrstev, porostlých na obou stranách souvisle živými buňkami, přičemž tyto vrstvy jsou vzájemně propojeny prorůstáním buněk, přičemž nanovlákenné vrstvy jsou netkané a jsou tvořeny syntetickými polymeiy nebo kopolymery monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakiylové, urethany, vinylalkohol i o a monomery odvozené od kyseliny mléčné a jej ích derivátů.
  2. 2. Biomateriál podle nároku 1, vyznačený tím, že monomery jsou vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethylmethakrylát, 2-ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.
  3. 3. Biomateriál podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
    20
  4. 4. Biomateriál podle nároku 3, vyznačený tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, fibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
  5. 5. Způsob přípravy biomateriálu podle nároku 1, vyznačený tím, že se připraví synte25 tický polymer nebo kopolymer monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakiylové, amidy kyseliny methakiylové, urethany, vinylalkohol a monomeiy odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer se zvlákní metodou elektrostatického zvlákňování, následně se na metodou elektrostatického zvlákňování připravenou zvlákněnou vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují
    30 se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur do dosažení souvislého pokrytí nanovlákenné vrstvy buňkami, a poté se alespoň dvě vrstvy zvlákněného syntetického polymeru nebo kopolymeru, porostlé buňkami, manuálně nebo automaticky naskládají na sebe a tato soustava vrstev se zatíží tlakem 0,5 až 2 kPa a kultivuje se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur po dobu 1 až 4 týdnů.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že monomery jsou vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethylmethakrylát, 2-ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.
    40
  7. 7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačený tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahmu45 jící chondrocyty, fibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
CZ20070054A 2007-01-23 2007-01-23 Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy CZ300805B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20070054A CZ300805B6 (cs) 2007-01-23 2007-01-23 Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy
PCT/CZ2008/000005 WO2008089708A1 (en) 2007-01-23 2008-01-09 Biomaterial based on nanofibrillar layers and method of preparation thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20070054A CZ300805B6 (cs) 2007-01-23 2007-01-23 Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200754A3 CZ200754A3 (cs) 2008-10-29
CZ300805B6 true CZ300805B6 (cs) 2009-08-12

Family

ID=39431239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20070054A CZ300805B6 (cs) 2007-01-23 2007-01-23 Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ300805B6 (cs)
WO (1) WO2008089708A1 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2530189A1 (en) 2011-06-01 2012-12-05 Technicka Univerzita V Liberci Method of production of functional nanofiber layer and device for carrying out the method

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2775833C (en) 2009-09-30 2018-01-16 Thiomatrix Forschungs-Und Beratungs Gmbh Mucoadhesive polymers having vitamine b partial structures
GB201202138D0 (en) * 2012-02-07 2012-03-21 Electrospinning Company The Ltd Multi-well plate

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5770417A (en) * 1986-11-20 1998-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Children's Medical Center Corporation Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
US6428802B1 (en) * 1999-12-29 2002-08-06 Children's Medical Center Corp. Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate
US20030054035A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Benjamin Chu Cell storage and delivery system
WO2005047493A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 Michigan State University Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1804844A4 (en) * 2004-09-29 2012-02-29 Univ Singapore COMPOSITE, PROCESS FOR ITS MANUFACTURE AND ITS APPLICATIONS
WO2006068809A2 (en) * 2004-12-03 2006-06-29 New Jersey Institute Of Technology Substrate recognition by differentiable human mesenchymal stem cells
AU2006220565A1 (en) * 2005-03-07 2006-09-14 Georgia Tech Research Corporation Nanofilament scaffold for tissue regeneration
US8048446B2 (en) * 2005-05-10 2011-11-01 Drexel University Electrospun blends of natural and synthetic polymer fibers as tissue engineering scaffolds

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5770417A (en) * 1986-11-20 1998-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Children's Medical Center Corporation Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
US6428802B1 (en) * 1999-12-29 2002-08-06 Children's Medical Center Corp. Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate
US20030054035A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Benjamin Chu Cell storage and delivery system
WO2005047493A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 Michigan State University Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2530189A1 (en) 2011-06-01 2012-12-05 Technicka Univerzita V Liberci Method of production of functional nanofiber layer and device for carrying out the method

Also Published As

Publication number Publication date
CZ200754A3 (cs) 2008-10-29
WO2008089708A1 (en) 2008-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Cell infiltration and vascularization in porous nanoyarn scaffolds prepared by dynamic liquid electrospinning
Xing et al. Porous biocompatible three-dimensional scaffolds of cellulose microfiber/gelatin composites for cell culture
Chen et al. A three-dimensional dual-layer nano/microfibrous structure of electrospun chitosan/poly (d, l-lactide) membrane for the improvement of cytocompatibility
Shabani et al. Improved infiltration of stem cells on electrospun nanofibers
Khanam et al. Electrospun linear polyethyleneimine scaffolds for cell growth
CN101253259A (zh) 聚合物涂覆的纳米原纤结构和用于细胞维持和分化的方法
US20100136649A1 (en) Encapsulation of Cells in Biologic Compatible Scaffolds by Coacervation of Charged Polymers
Masaeli et al. Does the tissue engineering architecture of poly (3‐hydroxybutyrate) scaffold affects cell–material interactions?
Kim et al. 3D tissue formation by stacking detachable cell sheets formed on nanofiber mesh
Rajasekaran et al. Role of nanofibers on MSCs fate: Influence of fiber morphologies, compositions and external stimuli
EP1937796A2 (en) Polymer coated nanofibrillar structures and methods for cell maintenance and differentiation
Pattanashetti et al. Development of multilayered nanofibrous scaffolds with PCL and PVA: NaAlg using electrospinning technique for bone tissue regeneration
Cui et al. Vascularization of LBL structured nanofibrous matrices with endothelial cells for tissue regeneration
Wang et al. Nanofibres and their influence on cells for tissue regeneration
WO2000047716A2 (en) Fibres for culturing eukaryotic cells
Wu et al. Development of dynamic liquid and conjugated electrospun poly (L-lactide-co-caprolactone)/collagen nanoyarns for regulating vascular smooth muscle cells growth
Li et al. Applying electrospun gelatin/poly (lactic acid-co-glycolic acid) bilayered nanofibers to fabrication of meniscal tissue engineering scaffold
Wang et al. Bacterial cellulose nanofiber reinforced poly (glycerol-sebacate) biomimetic matrix for 3D cell culture
Kwon et al. Electrospinning of microbial polyester for cell culture
Qiao et al. An ordered electrospun polycaprolactone–collagen–silk fibroin scaffold for hepatocyte culture
GHASEMI et al. Electrospun poly (epsilon-caprolactone) nanofiber mat as extracellular matrix
CZ300805B6 (cs) Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy
Wu et al. Bacterial cellulose nanofiber distribution on gelatin and silk fibroin scaffolds and the cell behavior
Zhu et al. A novel composite and suspended nanofibrous scaffold for skin tissue engineering
Karimi Alavije et al. Endothelial cells performance on 3D electrospun PVA/graphene nanocomposite tubular scaffolds

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180123