CN1979165B - α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学领域,涉及抗原表位多肽的筛选、免疫学检测方法的建立以及临床诊断试剂的制备及应用,尤其是涉及α-胞衬蛋白抗原表位多肽的筛选及α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物的设计组成,得到具有诊断意义的两条最佳α-胞衬蛋白抗原表位多肽对应的氨基酸序列,以及建立检测患者血清中α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的免疫学方法,以及将合成的两条最佳α-胞衬蛋白抗原表位多肽作为混合抗原在制备诊断干燥综合征的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域,涉及抗原表位多肽的筛选、免疫学检测方法的建立以及临床诊断试剂的制备及应用,尤其是涉及α-胞衬蛋白抗原表位多肽的筛选及α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物的设计组成,得到具有诊断意义的两条最佳α-胞衬蛋白抗原表位多肽对应的氨基酸序列,以及建立检测患者血清中α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的免疫学方法,以及将合成的两条最佳α-胞衬蛋白抗原表位多肽作为混合抗原在制备诊断干燥综合征的药物中的应用。
确切地说,本发明涉及一种采用现代生物信息学、免疫学技术筛选获得的人干燥综合征抗原蛋白新的表位多肽及其对应的氨基酸序列,该两条抗原表位多肽可以分别特异性的检测干燥综合征患者血清中的抗IgG、IgA抗体。本发明还涉及两条抗原表位多肽优化条件组合进行“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的免疫学方法。另外,本发明提供了该抗原表位多肽混合物在人干燥综合征临床诊断中的应用。
技术背景
干燥综合征(Syndrome,SS)是一种以口、眼干燥为主,并累及全身多个***和器官的全身性自身免疫病,分为原发性(pSS)和继发性干燥综合征(sSS)。流行病学调查发现,我国干燥综合征的患病率为0.77%,而在50岁以上人群中的患病率达5%,甚至明显高于糖尿病(0.67%)、风湿性心脏病(0.19%)及肺源性心脏病(0.47%)的患病率,总患病人数已逾800万。然而,在临床上,绝大部份(97%)的干燥综合征患者未得到及时的诊断和治疗,52%的患者被误诊为肺间质纤维化、免疫性肝炎及肾炎等,而未能得到正规的治疗或误治,甚至出现因误治出现的器官损害。本病为慢性全身性自身免疫病,未经正确治疗的患者多逐渐出现器官功能异常、衰竭,甚至死亡。淋巴瘤、骨髓瘤等恶性肿瘤在干燥综合征的发生率可高达正常人的40倍。目前,本病的早期诊断是困扰临床医师多年的最大问题。临床诊断主要靠症状、体征、唇腺活检及非特异的抗核抗体等指标。其中唇腺活检属创伤性检查,且敏感性差,大多数患者不能接受。而抗核抗体、SSA抗体、SSB抗体则特异性较差,敏感性也不理想。大部分患者在确诊时已属于中、晚期,往往病情严重,并有多个脏器受损或并发症,治疗上已十分困难。
Hayashi等于1997年发现了一种针对干燥综合征患者唾液腺导管上皮细胞的器官特异性抗原,进一步通过鉴定氨基酸残基确定该抗原为人类骨架蛋白α-胞衬蛋白,首次提出这种120KD的抗原与干燥综合征有关(Haneji N,Nakamura T,Yakiok K et al,Identification of α-Fodrin as a candidate autoantigen in primarysyndrome.Science,1997,276(25):604-606.)。近几年来,国外学者及本发明人继续对干燥综合征相关的α-胞衬蛋白抗体进行研究,关于该抗体与干燥综合征的发病机制及诊断相关研究及存在问题集中在以下方面:
(1)α-胞衬蛋白抗体的阳性率:由于α-胞衬蛋白抗原对干燥综合征患者较特异,可应用其纯化抗原,或细胞裂解的α-胞衬蛋白产物来检测患者血清中的抗体。但目前的研究结果不尽一致。Hayashi研究小组应用α-胞衬蛋白融合蛋白—JS-1,利用Western blot方法,检测原发性干燥综合征43例,继发性干燥综合征8例,***性红斑狼疮(SLE)21例,类风湿关节炎(RA)14例,正常对照15例。结果显示,α-胞衬蛋白抗体的阳性率在原发性干燥综合征患者中为95.35%,继发性干燥综合征患者为50%,而在RA,SLE及正常人群中未检测到α-胞衬蛋白抗体(Janicke RU,Ng P,Sprengart ML,Porter AG,Caspase-3 is required for alpha-Fodrin cleavage but dispensable for cleavage of other deathsubstrates in apoptosis.J Biol Chem,1998,273(25):15540-5.)。然而,Masataka等的研究发现,α-胞衬蛋白抗体在干燥综合征患者的阳性率仅为50%(42/82),敏感性为52%,特异性为96%(Masataka K,Tetsuroh O,Yoko O,Junichi D,and Yutaka K,Autoantibodies tothe Amino-Terminal Fragment of β-Fodrin expressed in Glandular Epithelial Cells in Patientswith Sjogren’s syndrome.The Journal of Immunology,2001,167:5449-5456)。
(2)对儿童干燥综合征的检测:Maeno等应用Western blot法检测15例干燥综合征患儿血清中的α-胞衬蛋白抗体,15例患儿血清α-胞衬蛋白抗体均阳性,而正常儿童均为阴性(Haneji.N,Nakamura.T,Takio.K,et al,Identification of alpha-Fodrin antibodiex inSjogren’s syndrome in children.J Rheumatol,2001,28:860.)。由此可见,α-胞衬蛋白在成人原发性干燥综合征发病机制中的作用可能在儿童干燥综合征中有相同的意义,但其确切机制尚需要进一步研究明确。
(3)α-胞衬蛋白的IgA和IgG抗体亚型:一般认为,干燥综合征患者体内异常的免疫球蛋白多是IgG亚型。Witte等首先分别用IgA和IgG抗体检测原发性干燥综合征(85例),继发于SLE的干燥综合征(15例)和继发于RA的干燥综合征(7例)患者血清中的α-胞衬蛋白抗体。结果显示,64%的原发性干燥综合征,47%继发于SLE的干燥综合征和86%继发于RA的干燥综合征患者的IgA抗体阳性。在对照组中,健康献血者(1/160),SLE(1/50),RA(2/12)中IgA抗体阳性。以同样的方法测量IgG抗体阳性率相对较低,在原发性干燥综合征,继发SLE的干燥综合征和继发RA的干燥综合征中的阳性率分别为55%,40%和43%。健康献血者,SLE,RA中IgG抗体阳性率分别为3/160,1/50和5/12。因此,对IgA抗体和IgG抗体进行比较,IgA的阳性率和特异性更高,并且对继发性干燥综合征更为特异(Witte T,Matthias T,Arnett FC,Deter HH,etal,IgA and IgG autoantibodies against alpha-fodrin as markers for Sjogren′s syndrome.JRheumatol,2000,27(11):2617-20.)。随后,分别有许多关于α-胞衬蛋白的IgA和IgG抗体亚型在干燥综合症检测中的研究,多数认为α-胞衬蛋白的IgA和IgG抗体亚型与干燥综合症相关,是很好的诊断抗体,但结果不尽相同,主要与检测抗原材料来源相关(WitteT,Matthias T,Oppermann M,et al,Prevalence of antibodies against alpha-fodrin in Sjogren′ssyndrome:comparison of 2sets of classification criteria.J Rheumatol,2003,30(10):2157-9.Ruffatti A,Ostuni P,Grypiotis P,et al,Sensitivity and specificity for primary Sjogren′ssyndrome of IgA and IgG anti-alpha-fodrrin antibodies detected by ELISA.J Rheumatol,2004,31(3):504-7.Kahaly GJ,Bang H,Berg W,et al,Alpha-fodrin as a putative autoantigen inGraves′ophthalmopathy.Clin Exp Immunol,2005,140(1):166-72.Turkcapar N,Olmez U,Tutkak H,et al,The importance of alpha-fodrin antibodies in the diagnosis of Sjogren′ssyndrome.Rheumatol Int,2006,26(4):354-9.Yavuz S,Toker E,Bicakcigil M,et al,Comparative analysis of autoantibodies against a-fodrin in serum,tear fluid,and saliva frompatients with Sjogren′s syndrome.J Rheumatol,2006,33(7):1289-92.)。
(4)α-胞衬蛋白抗原表位多肽的研究:以上研究以表达纯化的蛋白进行抗体检测,检测结果会受纯化蛋白的性质和稳定性的限制,从而对α-胞衬蛋白在抗体检测中的真实价值和稳定结果影响很大。本发明人及Shiari R等人运用表达重叠蛋白片段及免疫分析筛选得到了一些干燥综合征相关的α-胞衬蛋白抗原表位多肽(或蛋白片断),其敏感性、特异性相比抗核抗体、SSA抗、SSB抗体均有所提高,结果也很稳定,但最终因筛选方法中运用原核表达重叠重组蛋白结合免疫检测分析,与抗原表位多肽的独立检测价值还是不符合,加上国外许多研究中病例样本小等,该抗体检测在干燥综合征诊断中的特异性、敏感性仍不尽如人意,更重要的是针对更为有意义的IgA抗体检测还没有对应的表位多肽的研究(何菁,李晶,栗占国,陈巧林.抗α-胞衬蛋白多肽抗体在干燥综合征诊断中的意义,中华风湿病学杂志,2003,7(10):600-603.He Jing,Chen Qiaolin,Li Zhanguo,Antibodies to α-fodrin-derived peptide in Sjogren’s Syndrome.Annals of Rheumatic Diseases,2006,65(4):549-550.陈巧林,朴海燕,何菁,李晶,栗占国.干燥综合征抗原α-胞衬蛋白抗原表位的筛选与鉴定,中国免疫学杂志,2005,11(21):864~872.Shiari R,Kobayashi I,Toita N,et al,Epitope mapping of anti-alpha-fodrin autoantibody in juvenile Sjogren′ssyndrome:difference in major epitopes between primary and secondary cases.J Rheumatol,2006,33(7):1395-400.Fox RI,Konttinen Yj,Fisher A,Use of Muscarinic Agonists in theTreatment of Sjogren’s syndrome.Clin Immunol.2001,101(3):249-263.)。
综上所述,目前已知的干燥综合征诊断抗原(蛋白或多肽)中,尚缺乏一种针对人干燥综合征特异性高,而阳性率也高的标志物;缺乏特异性的诊断方法也是问题的核心。在干燥综合症相关抗原——α-胞衬蛋白领域进行了包括血清抗体检测及抗原表位多肽筛选的探索研究,但仍有多个方面的问题尚待澄清及解决,如:高特异性、强敏感性α-胞衬蛋白IgG、IgA型抗体检测用的抗原表位多肽尚缺乏深入研究;尚缺乏针对α-胞衬蛋白IgG/IgA型抗体同时检测用的方法。因此,筛选及鉴定新的α-胞衬蛋白相关抗原表位多肽,寻找一种敏感性高、特异性强而临床又易于检测的抗体,建立更好的诊断方法,对干燥综合征的临床诊断具有重要而迫切的意义。
发明内容
针对前述研究现状及干燥综合征临床诊断需求,本发明的第一个目的在于提供新的α-胞衬蛋白抗原表位多肽(包括其衍生物),以及其对应的氨基酸序列。所述的两条α-胞衬蛋白抗原表位多肽(包括其衍生物)可以分别特异性地检测干燥综合征患者血清中的抗α-胞衬蛋白多肽IgG、IgA抗体,两条α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物用于检测IgG/IgA总抗体的结果显示在干燥综合征患者(原发、继发)血清中的阳性率高,而其他对照疾病(类风湿关节炎、***性红斑狼疮)及正常人群血清中阳性率很低,完全符合临床诊断的需要。因而所述的两条α-胞衬蛋白抗原表位多肽(包括其衍生物)混合物可以被提供作为人干燥综合征临床诊断用混合抗原。
本发明的第二个目的在于提供所述的两条α-胞衬蛋白抗原表位多肽及其衍生物的筛选方法。本发明采用生物信息学方法结合免疫检测分析方法,筛选获得可作为人干燥综合征混合抗原的α-胞衬蛋白抗原表位多肽及其衍生物。
本发明的第三个目的在于提供一种将含有所述α-胞衬蛋白抗原表位多肽或其衍生物作为混合抗原用于检测干燥综合征患者血清抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的方法,即“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法。本发明对两条抗原表位多肽的最佳混合比例及所述的免疫学检测方法的各种条件均进行了优化,并得到实验验证。
本发明的第四个目的在于提供所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物在制备用于诊断干燥综合征的药物中的应用。该应用是基于所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物测定抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在干燥综合征诊断中的价值评定结果。本发明所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物可以用于制备干燥综合征的临床诊断试剂盒。
根据本发明的第一个目的,本发明提供了α-胞衬蛋白抗原表位多肽,包括:
(a)、由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的多肽;
(b)、在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有能与抗α-胞衬蛋白多肽IgG抗体反应的抗原表位活性的由(a)衍生的多肽;
(c)、由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽;
(d)、在(c)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有能与抗α-胞衬蛋白多肽IgA抗体反应的抗原表位活性的由(c)衍生的多肽。
SEQ ID NO.1
NH3-Gln-Asp-Leu-Glu-His-Val-Glu-Val-Leu-Gln-COOH
SEQ ID NO.2
NH3-Arg-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Lys-COOH
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示多肽均为α-胞衬蛋白序列中的部分氨基酸残基。
根据本发明的第二个目的,本发明人选取人α-胞衬蛋白ORF中1-1680核酸序列对应的氨基酸序列为对象,通过采用Standard,Karplus,Emini,Amphiphi,Pellequer等5种国际关于抗原表位预测的方法(Odorico M,Pellequer JL,BEPITOPE:predicting thelocation of continuous epitopes and patterns in proteins.J Mol Recognit.2003,Jan-Feb;16(1):20-22.),预测分析主要包括与蛋白抗原性相关的二级结构、可及性、亲水性、β-转角、信号肽切割位点、穿膜螺旋、N-糖基化位点等,通过分析抗原趋势指数,初步确定了上述560aa长度的α-胞衬蛋白的抗原决定簇氨基酸残基的分布。进一步通过合成多肽及免疫学检测分析,得到了两条各自对应检测抗体敏感性和特异性均很高的抗原表位多肽,一条可以很好检测患者血清中的抗α-胞衬蛋白多肽IgG型抗体,一条可以很好检测患者血清中的抗α-胞衬蛋白多肽IgA型抗体。同时,经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有能与抗α-胞衬蛋白多肽IgG、IgA抗体反应的抗原表位活性的由这两条多肽序列衍生而来的一系列多肽,也显示很好的抗原抗体结合反应,该两条多肽及其对应的系列衍生物(多肽)即为本发明所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽。该发明中的α-胞衬蛋白抗原表位多肽单独均可以很好检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG或IgA型抗体,其混合物则可以很好的检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体。迄今为止,国内外尚无关于α-胞衬蛋白此两条抗原表位多肽(包括筛选到的两条抗原表位多肽及对应的衍生多肽)序列的抗原性、该抗原表位多肽混合物检测血清中对应IgG/IgA总抗体的方法及其作为混合抗原在干燥综合征诊断中意义等的研究。
本发明所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽可以用本领域人员所熟知的方法得到,例如:固相合成法等。
上述所选取的人α-胞衬蛋白ORF中1-1680nt基因序列来源于NCBI(>gi|4507190|ref|NM_003127.1|[4507190]spectrin,alpha,non-erythrocytic 1(alpha-fodrin)(SPTAN1),mRNA[Homo sapiens])。
根据发明的第三个目的,本发明建立了含有所述α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物(SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2)作为混合抗原用于检测干燥综合征患者血清抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的方法(“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法)。
酶联免疫吸附法(ELISA)检测产品大致可以分为三种:“单特异性ELISA”试剂盒(包被有单特异性抗原)可提供对一种抗体的定量体外检测;“抗体谱ELISA”试剂盒可在一条微孔板上对多种不同抗体分别进行半定量体外检测;“混合ELISA”试剂盒的固相包被有混合抗原,可半定量检测多种抗体。本发明中所用的拓宽了范围的“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法具体指:运用混合抗原,同时对不同亚型抗体进行检测,而且本发明运用的是同一个微孔中进行不同亚型抗体的检测。
“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测中,首先最重要的是包被抗原(混合物)之间的混合比例,本发明人通过多次摸索,选择SEQ ID NO.1序列合成多肽与SEQID NO.2序列合成多肽的不同配比浓度进行优化实验:1∶2,6∶7,9∶14,5∶7,11∶14,6∶7,13∶14。最终确定最佳混合比例为11∶14,以此混合比例混合α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2),包被在固相的聚苯乙烯微孔板上,然后加入阳性干燥综合征患者血清,最终加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG/IgA两种抗体的混合物(等比例),反应最佳。
其次,由于抗原抗体反应需要必须的结合条件(pH值、离子浓度和等电点等),尤其是在“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测中,对混合抗原与各抗体反应的条件更为精密,本发明人在实验初始阶段,发现混合抗原与不同抗体抗体反应总和比单独反应时相加后要弱很多,后期经过一系列pH值及反应离子浓度(包括:pH6.01×PBS、pH6.51×PBS、pH7.01×PBS、pH7.51×PBS、pH8.01×PBS、pH8.51×PBS、pH9.01×PBS、pH9.51×PBS等)的调整后,确定了稳定的最佳包被缓冲液(pH8.01×PBS);另外包被抗原的浓度过高和过低都会影响ELISA检测的特异性和敏感性,尤其在临床患者血清抗体滴度不平衡的情况下,选择抗原多肽的最佳包被浓度是ELISA检测的关键要素。对此本发明发明人进行了相应的实验,将所述α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQID NO.1及SEQ ID NO.2)按11∶14比例混合后经多次不同范围的浓度梯度稀释后进行反应,具体浓度梯度稀释试验中,总的包被量分别为:1ng、10ng、100ng、1000ng;10ng、40ng、60ng、80ng、100ng;60ng、65ng、70ng、75ng、80ng。最终确定了检测多肽(SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2多肽混合物)的最佳包被量(70ng),以此包被量进行血清抗体检测,效果最好;再有,关于对血清中抗原抗体非特异性反应的阻止问题,也是任何临床ELISA检测试剂能得到很好应用的另一关键因素。本发明发明人通过所在研究小组以往的经验,分别采用1%OVA/PBS、1%BCA/PBS、1%脱脂奶粉/PBS及封闭用正常用兔血清等,最终通过临床血清样本检测反应背景比对,确定运用业内统一的封闭用正常兔血清经特定处理后作为反应中封闭液(称为:BNRS)(具体程序为:将封闭用正常兔血清先62℃灭活20分钟,然后在25ml灭活过的封闭用正常兔血清中加入0.3275g Tris、0.21915g NaCl,再用HCl调至pH8.0),这样可以使得抗α-胞衬蛋白多肽抗体检测的背景(非特异性结合)降到最低。
通过以上条件优化,本发明人将含有所述α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2)通过最佳混合比例(11∶14),按特定浓度(总量为70ng),包被在固相的聚苯乙烯微孔板上,利用处理好的封闭用正常兔血清进行封闭,然后加入干燥综合征患者血清,最终加入HRP标记的抗人IgG/IgA抗体混合物(等比例),合并以上优化条件外,其他环节与常规混合ELISA相同。本发明经过优化建立的拓宽范围了的“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法可以很好的检测临床干燥综合征患者血清的抗IgG/IgA总抗体,实验结果显示,该方法得到的干燥综合征患者血清抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的敏感性好、特异性强,完全符合疾病临床诊断的要求。
与现有技术相比,本发明所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽测定抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在干燥综合征诊断中的价值评定有着非常明显的优势,详述如下:
目前,国内外虽然已经针对α-胞衬蛋白的IgA和IgG抗体亚型的检测展开了大量研究,但以表达纯化的蛋白进行抗体检测,结果会受纯化蛋白的性质和批次稳定性的限制,从而对α-胞衬蛋白在抗体检测中的真实作用和结果分析影响很大。对抗原表位多肽(或片断)的研究,迎合了临床产品的需要,提高了检测的稳定性,但以往研究最终因筛选方法中运用原核表达重叠重组蛋白结合免疫检测分析,局限了抗原表位多肽的独立检测价值,加上国外许多研究中病例样本小等,该抗体在干燥综合征诊断中的特异性、敏感性不尽如人意,而且还没有IgA抗体检测对应的表位多肽的相关研究。
基于以上研究现状,本发明人采用Standard,Karplus,Emini,Amphiphi,Pellequer等5种国际关于抗原表位预测的方法,分析了560aa长度的α-胞衬蛋白的抗原决定簇,进一步通过合成多肽及免疫检测,得到了两条各自对应检测抗体敏感性和特异性均很高的抗原多肽,一条可以很好检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG型抗体,一条可以检测抗α-胞衬蛋白多肽IgA型抗体。本发明人将该两条多肽作为检测混合抗原,用上述建立好的“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测干燥综合征、类风湿关节炎、***性红斑狼疮及正常人血清中的抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体。本发明研究共检测干燥综合征患者182例,***性红斑狼疮患者113例,类风湿关节炎患者136例,正常人212例。结果发现该多肽混合物检测到的干燥综合征的抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体具有较高的敏感性和特异性,可以达到通过血清学的方法诊断干燥综合征的目的,为干燥综合征的临床诊断提供客观的实验室依据。
根据本发明的第四个目的,本发明还提供了所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物在制备用于诊断干燥综合征的药物中的应用。
根据上述关于α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物测定抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在干燥综合征诊断中的价值评定结果、α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物测定抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体初步免疫学方法(“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法)以及干燥综合征临床诊断试剂盒的要求,本发明人制备了α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体临床诊断用试剂盒。具体采用的是混合直接固相酶联免疫吸附分析多种抗体法(“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法),用于检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体;所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2)按上述条件混合被包被于微孔板上并经封闭,可拆分的微孔板(1×8)共12板条,可以完成96人份的检测。
本试剂盒经过3个不同的反应阶段并形成混合复合物,最后产生酶联颜色反应,颜色的深浅与样品中抗体的浓度成一定的比例关系。步骤1:样品,标准品和质控血清加入微孔板的反应孔内(孔内已包被了上述的混合抗原并完成封闭),任何存在的抗体结合在微孔内表面,30分钟孵育后洗涤除去非反应成分。步骤2:加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗人IgG及HRP标记山羊抗人IgA等比例抗体混合物,30分钟孵育后洗涤除去未结合的多余的酶标抗体。步骤3:加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(简称TMB)底物,15分钟孵育后试剂颜色变成蓝色,加入终止液(含1mol/L HCl)终止反应,试剂颜色变成黄色。
颜色的深浅与样品中IgG/IgA总抗体的浓度成一定比例关系。样品的IgG/IgA总抗体含量可根据其OD值由标准曲线推断出来。在酶标仪或分光光度计中读取结果。450nm作为初始波长,600至650nm(优选为620nm)作为参考波长。
附图说明
图1为560aa长度的α-胞衬蛋白抗原表位抗原趋势指数分析结果图。横坐标表示α-胞衬蛋白氨基酸序列的位置,纵坐标表示抗原趋势指数的大小,>1.012者为可能的抗原表位,而且抗原趋势指数越大,抗原表位的可能性越大。该方法准确性为75%。
图2为混合直接固相酶联免疫吸附分析多种抗体法(“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法)检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体原理示意图。图中,用混合抗原(α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物)包被微孔板,制成固相载体,并完成封闭。加患者(干燥综合征及疾病对照组等)血清到板孔中,其所含的抗体(抗α-胞衬蛋白多肽IgG、IgA抗体)特异性地与固相载体中存在的抗原结合,形成混合免疫复合物。除去多余物质后,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG和IgA抗体混合物,使之与上述免疫复合物反应。洗板,除去多余的结合物,加入底物(TMB)。该反应产生有颜色产物,颜色强度与特异性抗体含量成正比。
图3为本发明所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物建立的“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法的检测程序示意图。
图4显示α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在不同疾病的阳性率。由图可见抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在原发性和继发性干燥综合征中的阳性率明显高于SLE、RA及正常对照(P均<0.01)。
图5显示自身抗体在干燥综合征患者血清样本中检测的敏感性和特异性。在干燥综合征患者中,抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的敏感性和特异性明显高于SSA、SSB抗核抗体(P均<0.01)及抗α-胞衬蛋白多肽IgG抗体,敏感性比抗α-胞衬蛋白多肽IgA抗体单独检测也有很大提高,但特异性比其稍低。综合而言,抗α-胞衬蛋白多肽总抗体在干燥综合征血清学诊断中具重要价值。
具体实施方式
本发明所用术语:
α-胞衬蛋白抗原表位多肽:是指具有SEQ ID NO.1序列QDLEHVEVLQ(即NH3-Gln-Asp-Leu-Glu-His-Val-Glu-Val-Leu-Gln-COOH)的多肽,以及具有SEQ ID NO.2序列RDLASVQALLRK(即NH3-Arg-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Lys-COOH)的多肽或将上述两条多肽的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有能与抗α-胞衬蛋白多肽IgG、IgA抗体反应的抗原表位活性的衍生而来的多肽。
α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物:是指将具有SEQ ID NO.1共同序列的多肽或上述的对应衍生多肽与具有SEQ ID NO.2共同序列的多肽或上述的对应衍生多肽进行优化比例混合后形成的混合物。
实施例1α-胞衬蛋白抗原表位多肽的筛选及鉴定
前述的研究工作已经证明,利用基因工程的方法纯化出的α-胞衬蛋白融合蛋白能够特异性的结合干燥综合征患者血清中的抗α-胞衬蛋白抗体(IgA或IgG),然后通过特定的方法可以将其检出(Cheney R,Hirokawa N,Levine J,Willard M,Intracellular movementof Fodrin.Cell Motil,1983,3(5-6):649-55.Haneji,N.,Nakamura T,Takio K,et al,Identification of α-Fodrin as a candidate autoantigen in primary Sjogren’s Syndrome.Science,1997,276:604-7.Watanabc T,Tsuchida T,Kanda N,et al,Anti-α-Fodrin antibodies inSjogren’s Syndrome and lupus erythematosus.Arch Dermatol,1999,135:535-539.Witte T,Matthias T,Arnett C F,et al,IgA and IgG autoantibodies against α-Fodrin as marker forSjogren’s Syndrome.J Rheumatol,2000,27:2617-20.)。本发明的实验中,发明人选取α-胞衬蛋白ORF中1-1680核酸序列对应的氨基酸序列为对象,采用Standard,Karplus,Emini,Amphiphi,Pellequer等5种国际关于抗原表位预测的标准方法,全面分析了上述560aa长度的α-胞衬蛋白的抗原决定簇,按抗原趋势指数排列,结果见图1,根据结果合成了共计23条多肽。选取的560aa长度的α-胞衬蛋白对应序列及合成的23条多肽氨基酸序列分别为:
选取的α-胞衬蛋白ORF中1-1680核酸序列对应的560aa序列为(从NH3端到COOH端排序):
MDPSGVKVLETAEDIQERRQQVLDRYHRFKELSTLRRQKLEDSYRFQFFQRDAEELE
KWIQEKLQIASDENYKDPTNLQGKLQKHQAFEAEVQANSGAIVKLDETGNLMISEGH
FASETIRTRLMELHRQWELLLEKMREKGIKLLQAQKLVQYLRECEDVMDWINDKEAI
VTSEELGQDLEHVEVLQKKFEEFQTDMAAHEERVNEVNQFAAKLIQEQHPEEELIKT
KQDEVNAAWQRLKGLALQRQGKLFGAAEVQRFNRDVDETISWIKEKEQLMASDDF
GRDLASVQALLRKHEGLERDLAALEDKVKALCAEADRLQQSHPLSATQIQVKREELI
TNWEQIRTLAAERHARLNDSYRLQRFLADFRDLTSWVTEMKALINADELASDVAGAE
ALLDRHQEHKGEIDAHEDSFKSADESGQALLAAGHYASDEVREKLTVLSEERAALLE
LWELRRQQYEQCMDLQLFYRDTEQVDNWMSKQEAFLLNEDLGDSLDSVEALLKKH
EDFEKSLSAQEEKITALDEFATKLIQNNHYAMEDVATRRDALLSRRNALHE
合成的23条多肽序列为(均为从NH3端到COOH端排序):
SGVKVLE RRQQVLDR IQEKLQI LQGKLQKHQAFEAEV SGAIVKL
RQWELLL GIKLLQAQKLVQYLRECED KEAIVTS QDLEHVEVLQ
NQFAAKLIQE RLKGLALQRQ KLFGAAEV RDLASVQALIRK
ERDLAALEDKVKALCAE RLQQSHPLSATQIQVKR YRLQRFLAD
LASDVAGAEALLDR GQALLAAGH VREKLTVLS RAALLEL
QYEQCMDLQLFY QEAFLLN LGDFLDSVEALLKK
将上述23条合成的α-胞衬蛋白多肽分别采用单特异性ELISA方法检测临床10例α-胞衬蛋白IgG抗体检测阳性的干燥综合征确诊患者血清抗体和10例α-胞衬蛋白IgA抗体检测阳性的干燥综合征确诊患者血清抗体。
具体步骤是:23条合成的α-胞衬蛋白多肽分别用包被缓冲液(1×PBS,pH8.0)稀释至0.5μg/ml,包被酶标板(100μl/孔),37℃温育4小时。以0.1%PBS-Tween洗板5次,每孔加入封闭用正常兔血清缓冲液(BNRS)(用前经过处理,见前述)150μl,4℃孵育过夜,洗板5次。抗α-胞衬蛋白阳性SS患者血清标本(包括IgG阳性10例,IgA阳性10例)各以PBS稀释50倍后分别加入(100μl/孔),37℃孵育30min。洗板5次后分别对应加入PBS 1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG、IgA二抗(SantaCruz产品),37℃孵育30min。洗板5次后加入TMB显色液显色15min,加入1mol/L的HCL终止后测定标本在450nm处的吸收值(A值)。每板同时设空白对照、阳性对照及阴性对照(均来自德国BL公司alpha-Fodrin抗体IgG、IgA单独定量ELISA检测试剂盒)。采用反应OD值的平均值,比较23条合成多肽与SS患者血清IgG、IgA的反应强弱,得到的最强反应的多肽认定为SS(干燥综合征)相关抗体最佳检测抗原——α-胞衬蛋白抗原表位多肽。
通过以上免疫检测分析,得到了两条反应最强的抗原表位多肽:第9条,QDLEHVEVLQ(NH3-Gln-Asp-Leu-Glu-His-Val-Glu-Val-Leu-Gln-COOH),可以很好检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG型抗体,在23条合成多肽中与干燥综合征阳性血清IgG抗体反应最强,OD平均值为:0.68;第13条,RDLASVQALLRK(NH3-Arg-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Gln-Ala-Leu-Leu-Arg-Lys-COOH),可以检测抗α-胞衬蛋白多肽IgA型抗体,在23条合成多肽中与干燥综合征阳性血清IgA抗体反应最强,OD平均值为:0.75。结果见表1。
表1 23条α-胞衬蛋白合成多肽的序列及单特异性ELISA检测结果
No | 起点 | 氨基酸序列 | 终点 | IgG反应OD平均值 | IgA反应OD平均值 |
1 | 4 | SGVKVLE | 10 | 0.11 | 0.09 |
2 | 18 | RRQQVLDR | 25 | 0.14 | 0.18 |
3 | 60 | IQEKLQI | 66 | 0.08 | 0.06 |
4 | 78 | LQGKLQKHQAFEAEV | 92 | 0.25 | 0.16 |
5 | 96 | SGAIVKL | 102 | 0.09 | 0.07 |
6 | 129 | RQWELLL | 135 | 0.10 | 0.07 |
7 | 142 | GIKLLQAQKLVQYLRECED | 160 | 0.34 | 0.12 |
8 | 168 | KEAIVTS | 174 | 0.12 | 0.09 |
9 | 179 | QDLEHVEVLQ | 188 | 0.68 | 0.14 |
10 | 209 | NQFAAKLIQE | 218 | 0.21 | 0.31 |
11 | 239 | RLKGLALQRQ | 248 | 0.31 | 0.38 |
12 | 250 | KLFGAAEV | 257 | 0.24 | 0.21 |
13 | 285 | RDLASVQALLRK | 296 | 0.23 | 0.75 |
14 | 301 | ERDLAALEDKVKALCAE | 317 | 0.28 | 0.54 |
15 | 320 | RLQQSHPLSATQIQVKR | 336 | 0.44 | 0.15 |
16 | 361 | YRLQRFLAD | 369 | 0.17 | 0.22 |
17 | 389 | LASDVAGAEALLDR | 402 | 0.36 | 0.14 |
18 | 424 | GQALLAAGH | 432 | 0.23 | 0.11 |
19 | 438 | VREKLTVLS | 446 | 0.12 | 0.13 |
20 | 449 | RAALLEL | 455 | 0.07 | 0.07 |
21 | 462 | QYEQCMDLQLFY | 473 | 0.14 | 0.36 |
22 | 486 | QEAFLLN | 492 | 0.06 | 0.10 |
23 | 495 | LGDFLDSVEALLKK | 508 | 0.31 | 0.26 |
分别将第9条多肽和第13条多肽标记为SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2,为了分析上述筛选得到的SEQ ID NO.1多肽及SEQ ID NO.2多肽抗原性的普遍稳定性,对SEQ IDNO.1及SEQ ID NO.2序列分别经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸但保证能与抗α-胞衬蛋白多肽IgG、IgA抗体反应的抗原表位活性的由此衍生出一系列多肽,重新合成对应的该系列多肽,利用以上免疫检测方法进行检测,发现分别可以很好检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG抗体、IgA抗体,分别显示与干燥综合征阳性血清IgG、IgA抗体很好的反应,OD平均值结果见表2及表3。
表2 10条α-胞衬蛋白SEQ ID NO.1多肽衍生物的序列及其单特异性ELISA检测结果
No | 氨基酸序列 | IgG反应OD平均值 |
1 | GQDLEHVEVLQ | 0.65 |
2 | QDLEHVEVLQK | 0.57 |
3 | ELGQDLEHVEVLQ | 0.63 |
4 | QDLEHVEVLQKKF | 0.65 |
5 | ELGQDLEHVEVLQKKF | 0.79 |
6 | QDLEPVEVLQ | 0.56 |
7 | QDLEPVEVLP | 0.53 |
8 | QDLEHVEVL | 0.54 |
9 | DLEHVEVLQ | 0.51 |
10 | DLEHVEVL | 0.45 |
上表中,序号为1-5的序列是在SEQ ID NO.1序列的首末端分别添加不同数量氨基酸(用下划线标出)的序列;序号为6和7的序列是在SEQ ID NO.1序列取代1个或多个氨基酸的序列(用下划线标出);序号为8-10的序列是在SEQ ID NO.1序列首末端缺失1个或多个氨基酸的序列。
表3 10条α-胞衬蛋白SEQ ID NO.2多肽衍生物的序列及单特异性ELISA检测结果
No | 氨基酸序列 | IgA反应OD平均值 |
1 | GRDLASVQALLRK | 0.72 |
2 | RDLASVQALLRKH | 0.67 |
3 | DFGRDLASVQALLRK | 0.72 |
4 | RDLASVQALLRKHEG | 0.65 |
5 | DFGRDLASVQALLRKHEG | 0.82 |
6 | RDLASVPALLRK | 0.64 |
7 | RDLASVPALLRP | 0.61 |
8 | RDLASVQALLR | 0.67 |
9 | DLASVQALLRK | 0.61 |
10 | DLASVQALLR | 0.60 |
上表中,序号为1-5的序列是在SEQ ID NO.2序列的首末端添加不同数量氨基酸(用下划线标出)的序列;序号为6和7的序列是在SEQ ID NO.2序列取代1个或多个氨基酸的序列(用下划线标出);序号为8-10的序列是在SEQ ID NO.2序列首末端缺失1个或多个氨基酸的序列。
本发明的试验中发明人利用的是Flechsler等报道的固相合成法(Anderson EC,et al,Proc,Natl.Acad.USA 1998,95:7574-79.)合成了这两条共22个氨基酸的α-胞衬蛋白多肽(SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2)及其对应的多肽衍生物。迄今为止,国内外尚无关于该多肽序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及其对应的多肽衍生物)的抗原性、该抗原表位多肽混合物检测血清中对应IgG/IgA总抗体的方法及其作为混合抗原在干燥综合征诊断中意义的研究。
实施例2α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物的混合浓度设计
为了满足“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测的需要,本发明中根据α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2)分别作为单独检测抗原,采用单特异性ELISA方法分别检测临床10例α-胞衬蛋白IgG抗体检测阳性及10例α-胞衬蛋白IgA抗体检测阳性的干燥综合征确诊患者血清抗体的结果。以这两条多肽作为混合抗原,调整两条多肽的不同配比浓度,对这20例临床确诊干燥综合征患者血清IgG/IgA总抗体进行“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测。通过初步摸索比较结果,进一步选择SEQ ID NO.1合成多肽与SEQ ID NO.2合成多肽的不同配比浓度(1∶2,6∶7,9∶14,5∶7,11∶14,6∶7,13∶14)进行最终确定实验。
“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测具体步骤是:首先选择上述筛选到的两条α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2),分别以上述不同配比浓度比例混合,每组混合多肽用包被缓冲液(1×PBS,pH8.0,此为之前试验摸索结果,具体见实施例3)稀释至0.7μg/ml,包被酶标板(100μl/孔),37℃温育4小时。以0.1%PBS-Tween洗板5次,每孔加入封闭用正常兔血清缓冲液(BNRS)(用前经过处理,包被量及封闭液均为试验摸索结果,具体见实施例3及前述)150μl,4℃孵育过夜,洗板5次。前面实验用的20例抗α-胞衬蛋白阳性SS患者血清标本(包括IgG阳性10例,IgA阳性10例)分别以1×PBS稀释50倍后加入各包被孔中(100μl/孔),37℃孵育30min。洗板5次后分组加入1×PBS 1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgA二抗(均为Santa Cruz产品)混合物(等比例,200μl/孔),37℃孵育30min。洗板后加入TMB显色液显色15min,加入1mol/L的HCL终止后测定标本在450nm处的A值。每板同时设空白对照、阳性对照及阴性对照(均来自德国BL公司alpha-Fodrin抗体IgG、IgA单独定量ELISA检测试剂盒)。采用待测标本A值>正常标本均数+2×标准差为阳性域值,分析两条合成多肽混合物与SS患者血清IgG/IgA的反应情况。
分析“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测结果并与前面单特异性ELISA检测的结果进行比较,选择最佳的配比浓度。要求得到的两条多肽最佳混合比例满足要求:以此浓度比例混合两条多肽作为混合抗原,检测干燥综合征患者血清IgG/IgA总抗体具有背景低及阳性反应强。结果见表4:
表4SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2不同比例混合多肽抗体反应的OD平均值
本发明的实验中最终通过优化条件,确定了这两条多肽(SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2)进行“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的最佳混合配比为11∶14,通过该最佳配比混合在一起进行检测α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体用的抗原(多肽)混合物物称为α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物。
本发明中的实验研究表明:上述α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物具有很好的识别干燥综合征患者血清中的IgG/IgA总特异性抗体的作用,对干燥综合征的诊断具有重要意义。
实施例3α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物对患者血清中抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的检测及其价值评定
本发明实验中针对合成多肽的氨基酸特性及混合抗原与抗体反应的情况,经过一系列pH值及反应离子浓度的调整后,我们确定了以pH8.0的自配1×PBS为包被缓冲液;同时也针对包被的多肽混合物混合比例及最佳浓度进行了相应的实验,将该α-胞衬蛋白多肽SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2分别按不同比例进行混合后进行反应,结果显示,用以上pH8.0的自配1×PBS包被缓冲液将两条抗原多肽按11∶14比例混合稀释为0.7μg/ml,每孔加入100μl,37℃温育4小时后,进行血清抗体检测,效果最好;另外,关于对非特异性反应的阻止问题,通过发明人以往的实验经验,首次运用业内统一的封闭用正常兔血清经特定处理后作为封闭液,使得抗α-胞衬蛋白多肽抗体检测的特异性能达到最佳。具体操作如下:
封闭:每孔加经处理的封闭用正常兔血清缓冲液(BNRS)150μl,4℃温育过夜。
BNRS的配制:正常兔血清25ml(先62℃灭活20分钟),再加入0.3275g Tris,0.21915g NaCl,最后用HCl调pH至8.0。
本研究利用上述的SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2多肽采用上述经过优化而建立好的酶联免疫吸附法(“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法)对干燥综合征(SS)、类风湿关节炎(RA)、***性红斑狼疮(SLE)患者及正常人血清中的抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体进行检测,以评价该多肽抗体在各种疾病中的分布。
具体步骤是:首先选择上述筛选到的α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQ ID NO.1及SEQID NO.2)合成干粉,按11∶14比例称量混合后用包被缓冲液(上述自制1×PBS缓冲液,pH8.0)稀释至0.7μg/ml,包被酶标板(100μl/孔),37℃温育4小时。以0.1%PBS-Tween洗板5次,每孔加入经过处理的封闭用兔血清缓冲液(BNRS)(用前经过处理,见上述)150μl,4℃孵育过夜,洗板5次。患者血清标本(包括干燥综合征患者、***性红斑狼疮患者、类风湿关节炎患者及正常人)以pH7.2PBS稀释50倍后分别加入包被孔中(100μl/孔),37℃孵育30min。洗板5次后分组加入pH7.2PBS 1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗及辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgA二抗混合物(均为Santa Cruz产品,等比例混合,200μl/孔),37℃孵育30min。洗板后加入TMB显色液显色15min,加入1mol/L的HCL终止后测定标本在450nm处的A值。每板同时设空白对照、阳性对照及阴性对照(均来自德国BL公司alpha-Fodrin抗体IgG、IgA单独定量ELISA检测试剂盒)。采用待测标本A值>正常标本均数+2×标准差为阳性域值,分析α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2)混合物与SS患者及对照组血清IgG/IgA总抗体的反应情况。
“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测原理示意图见图2。
本发明研究共检测干燥综合征患者182例,***性红斑狼疮患者113例,类风湿关节炎患者136例,正常人212例。
1.检测程序概要:如图3所示,多肽混合稀释后进行包被,70ng/孔,37℃温育4小时,洗涤,加入封闭用正常兔血清缓冲液(BNRS)150μl,4℃过夜,洗涤。样品稀释液1∶50稀释临床病人血清,将稀释的样本,和立即可用的对照血清,分别加到微量孔内(100μl),在湿盒中孵育30分钟/37℃。再洗涤,加入已稀释的酶标记IgG/IgA等比例混合溶液200μl,在湿盒中再孵育30分钟/37℃,洗涤,加入底物溶液100μl,在湿盒中再孵育15分钟/37℃,加入终止液(100μl),在450nm处读数。
2.检测过程
2.1将检测所需数目的微孔条放到微孔板(已包被好多肽SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2混合物,并已经封闭完成)框上并准备好一张草签。
2.2在微量孔内分别加入100μl的已稀释样本或立即可用的对照血清。留一个孔为底物空白使用,例如:
2.3将样品于湿盒内37℃(±1℃)孵育30min(±5min)。
2.4孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔(使用自动洗板机或手工洗板):
-吸去或甩去洗液
-每孔内加入300μl洗液
-吸去或甩去洗液
-重复洗涤过程4次(共5次!)
-将微孔板翻转过来在纸巾上拍打,使微孔中不再含有液体
2.5加入酶标记抗体。
于适当孔内(底物空白除外)加入200μl IgG酶标记抗体及IgA酶标记抗体等比例混合物
2.6湿盒内37℃(±1℃)孵育30min(±1min)。
2.7孵育后,以洗液清洗板孔(洗涤见上)
2.8加入底物
于每孔内加入100μl底物溶液(包括底物空白孔)
2.9湿盒内37℃(±1℃)孵育15min(±1min)。
2.10终止反应
每孔内加入100μl终止液,轻微振荡微孔板以混合溶液。
2.11读取消光度
以底物空白为空白对照液,60min内读取450nm的OD值,参考波长范围为620nm-690nm(例如650nm)。
本实施例主要通过以下几个方面阐明本发明α-胞衬蛋白抗原表位多肽(SEQ IDNO.1及SEQ ID NO.2)在干燥综合征患者诊断中的意义:
1、α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体阳性率在干燥综合征、类风湿关节炎、***性红斑狼疮及正常人之间的比较。
本发明的研究实验中,发明人用“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法检测了α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在干燥综合征、类风湿关节炎、***性红斑狼疮及正常人血清检测中的阳性率(表5,图4)。应用统计学比较各组数据,结果显示,α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在原发和继发性干燥综合征患者血清检测中的阳性率显著高于类风湿关节炎、***性红斑狼疮和正常人,p值均<0.01。原发和继发性干燥综合征的α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体的阳性率相近,无统计学差异。
表5.α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在不同疾病的阳性率
*包括SLE继发SS患者13例,RA继发SS者19例,皮肌炎继发SS、未分化***病继发SS患者各2例。
2、抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在干燥综合征、***性红斑狼疮、类风湿关节炎及正常人血清滴度的比较。
由表6可见α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在干燥综合征的平均滴度明显高于RA、SLE患者及正常人。
表6.SS、SLE、RA及正常人抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体滴度的比较
3、抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体与其它自身抗体在干燥综合征的敏感性和特异性的比较。
表7,图5显示了抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体、α-胞衬蛋白多肽IgG、α-胞衬蛋白多肽IgA、SSA抗体、SSB抗体及ANA(抗核抗体)在干燥综合征中的敏感性和特异性。其中单特异性ELISA法检测抗α-胞衬蛋白IgG或IgA抗体:相应检测试剂盒及方法由德国BL公司提供;欧蒙斑点法检测抗SSA、SSB抗体:相应检测试剂盒及方法由德国欧蒙医学实验诊断有限公司提供;间接免疫荧光法检测抗核抗体(ANA):相应检测试剂盒及方法由德国欧蒙医学实验诊断有限公司提供。本发明实验结果显示抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体特异性和敏感性均明显高于SSB抗体、SSA抗体、ANA和α-胞衬蛋白多肽IgG,比α-胞衬蛋白多肽IgA单特异性抗体敏感性明显提高、但特异性稍低。因此,结合敏感性和特异性,抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体在诊断中的意义优于其他自身抗体。
表7自身抗体在干燥综合征的敏感性和特异性
实施例3α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物作为混合抗原在制备临床干燥综合征诊断试剂盒中的应用
本发明人建立优化的“混合ELISA”结合“抗体谱ELISA”法,将所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物包被于微孔板上,制备了α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体临床诊断用试剂盒,用于检测抗α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体,共可以完成96人份的检测。具体内容如下:
1.试剂盒组成材料
包被了高度纯化α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物可拆分的微孔板(1×8)12板条1块;α-胞衬蛋白多肽IgG及IgA标准品:0/6.3/12.5/25/50/100U/ml各1瓶,每瓶1.5ml;
质控血清(含IgG、IgA和阴性质控)各1瓶,1.5ml;
浓缩的样品缓冲液1瓶,20ml;
HRP过氧化物酶标记山羊抗人IgG 1瓶,15ml;
HRP过氧化物酶标记山羊抗人IgA 1瓶,15ml;
TMB底物1瓶,15ml;
终止液(含1M HCl)1瓶,15ml;
浓缩洗涤缓冲液1瓶,20ml
2.技术参数
(1)样本:血清
(2)样本量:每次实验100μl未稀释样本
(3)总孵育:室温下(18-28℃)30min
(4)质控范围:0-100U/ml
(5)灵敏度:1U/ml
(6)储存:2-8℃
(7)有效期:生产后9个月或标明有效期
(8)包装规格:96人份
3.试剂盒性能
(1)特异性高度纯化的α-胞衬蛋白多肽混合物被包被于微孔板上,制备的α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物试剂盒仅用于特异性检测的IgG/IgA总抗体。
(2)校正α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体检测***无国际标准校正。
4.免疫分析程序
(1)样品收集,处理和保存
使用血清样本检测α-胞衬蛋白多肽IgG/IgA总抗体,血清用样品稀释缓冲液以1∶50的比例稀释(20μl样本+1ml缓冲液),病人无须禁食,也不用特别的准备,静脉穿刺,取血采样,形成凝结后离心吸取上清。
样品如果不直接使用,2-8℃下可保存5天或-20℃下可保存6个月,将其分为小部分避免反复冷冻。
胆红素和溶血素对结果无影响。
(2)试剂的准备/储存
除样品缓冲液和洗涤缓冲液外,全部试剂均为即用型液体;开盖后试剂2-8℃下可至少保存30天或标签上的有效期。
实验中不用的板条立即放回带干燥剂的包装中,2-8℃下密封保存,以免变质。
洗涤缓冲液的准备:蒸馏水50倍稀释后装到1000ml容器。稀释后的缓冲液可在2-8℃下至少保存30天或标签上的有效期。
稀释缓冲液的准备:蒸馏水5倍稀释后装到100ml容器。稀释后的缓冲液可在2-8℃下至少保存30天或标签上的有效期。
(3)技术要点
质控血清或样本必须每次作为未知分析,以检测实验的可靠性。
加样和样本处理:使用带一次性吸头的微量加样器取样;直接加入微孔底部。为避免交叉污染,每次更换吸头取样。对怀疑高浓度的病人样本应进一步稀释,并在结果计算时调整。
(4)试验过程
不同批号不要混用。全部试剂和样本使用前恢复到室温。
所有病人样本用样品稀释缓冲液以1∶50的比例稀释(20□1样本+1ml缓冲液),混合均匀。标准品和质控血清为即用型,不必稀释。
根据样品数量加上标准品和质控决定所需的板条,每个样品,标准品和质控都应做双份。使用的试验方案:
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A | 标1 | 标1 | 样1 | 样1 | ||
B | 标2 | 标2 | 样2 | 样2 | ||
C | 标3 | 标3 | 样3 | 样3 | ||
D | 标4 | 标4 | 样4 | 样4 | ||
E | 标5 | 标5 | 样5 | 样5 | ||
F | 标6 | 标6 | … | …. | ||
G | 阳 | 阳 | ||||
H | 阴 | 阴 |
每孔加入100ul血清稀释液、标准品和质控血清,室温下孵育1小时(18-28℃);倒空微孔板,每孔用300ul洗涤缓冲液冲洗3次;每孔加入100ul酶标液,室温下孵育60分钟;倒空微孔板,每孔用300ul洗涤缓冲液冲洗3次;每孔加入100ul底物TMB,室温下黑暗中孵育10分钟;每孔加入100ul的终止液,静止5分钟;停止反应后30分钟内,测定结果,450nm作为初始波长,620nm(可以用600至690nm)作为参考波长。
(5)结果分析
以吸光度和标准品浓度作标准曲线(直线、半对数或对数坐标纸)。
由标准曲线可直接确定血清的抗体浓度。
(6)实验参数
精度:
灵敏度:1U/ml
对应:在稀释实验中,高抗体浓度的样本用样本缓冲液稀释并检测。结果在全部测试范围内成线性关系。
SEQUENCE LISTING(序列表)
<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120>α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物及其应用
<130>
<141>2006-11-22
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Gln Asp Leu Glu His Val Glu Val Leu Gln
1 5 10
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Arg Asp Leu Ala Ser Val Gln Ala Leu Leu Arg Lys
1 5 10
Claims (3)
1.a-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物,其特征在于,包括
(a)、由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的多肽;
(b)、在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与抗α-胞衬蛋白多肽IgG抗体反应的抗原表位活性的由(a)衍生的多肽;
(c)、由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽;
(d)、在(c)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与抗α-胞衬蛋白多肽IgA抗体反应的抗原表位活性的由(c)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的α-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
A)选取人α-胞衬蛋白ORF中1-1680核酸序列对应的氨基酸序列为对象,通过采用Standard,Karplus,Emini,Amphiphi,Pellequer五种国际上关于抗原表位预测的方法,预测分析主要包括与蛋白抗原性相关的二级结构、可及性、亲水性、信号肽切割位点、穿膜螺旋、N-糖基化位点,通过分析抗原趋势指数,初步确定了560aa长度的α-胞衬蛋白的抗原决定簇氨基酸残基的分布;
B)进一步通过合成多肽及免疫学检测分析,得到如权利要求1中(a)与(c)所述的两条各自对应检测抗体敏感性和特异性均很高的抗原表位多肽。
3.含有如权利要求1所述的a-胞衬蛋白抗原表位多肽混合物的诊断干燥综合征的试剂盒。
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