CN1934259B - 具有改良的生长特性的植物以及制备所述植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过在植物中引入和表达编码S3a蛋白的核酸而改良植物的生长特性的方法。本发明还涉及其中引入了编码S3a蛋白的核酸的转基因植物，该植物相对于对应的野生型植物具有改良的生长特性。本发明还涉及可用于本发明方法的构建体。

Description

具有改良的生长特性的植物以及制备所述植物的方法

本发明一般地涉及分子生物学领域，并且涉及一种改良植物生长特性的方法。更具体地说，本发明涉及通过在植物中引入和表达编码小亚基核糖体蛋白(S3a)的核酸而改良植物生长特性尤其是产率的方法。本发明还涉及其中引入了S3a编码核酸的植物，该植物相对于对应的野生型植物具有改良的生长特性。

不断增长的世界人口和可用于农业的可耕地的不断减少的供给，激起农业研究向提高农业的效率发展。农作物和园艺改良的传统手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这样的选育技术具有若干缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传组分的植物，这并非总是产生自亲本植物传递过来的期望性状。分子生物学的发展已经允许人类修饰动物和植物的种质。植物的遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)，随后需要把该遗传物质导入到植物中。这种技术能够提供具有多种改良的经济学、农艺学或园艺性状的作物或植物。一种具有特殊经济利益的性状是产率。产率通常定义为作物产生的可衡量经济价值。这可以从数量和/或质量方面定义。产率直接取决于几个因素，例如，器官的数量和大小，植物结构(例如，分枝的数量)，种子产量等等。根的发育、营养吸收和应激耐受性也是确定产率的重要因素。可以通过优化上述因素之一来提高作物产率。

20世纪70年代早期，蔗糖梯度分析浮现了核糖体装配途径的轮廓。这些研究鉴定了3种主要的前核糖体颗粒。早期的90S颗粒(‘S’是沉积速率)随后被加工成66S和43S的前核糖体，它们分别为成熟的60S和40S亚基的前体。60S亚基经加工后由25S、5.8S和5S的核糖体RNA组成。在成熟过程中，许多蛋白质将相互作用而产生最终的结构。40S亚基由18S核糖体RNA组成，而且在成熟复合物形成之前，同样有许多蛋白质相互作用。这两种亚基装配成大的复合物，其中40S小亚基结合mRNA和tRNAs，而大亚基催化肽键形成。核糖体质量的大约2/3由RNA组成，而1/3由蛋白质组成。蛋白质依其所属的核糖体亚基命名：小亚基(S1至S31)和大亚基(L1至L44)。多数蛋白质与通常来自不同结构域的多个RNA元件相互作用，以构成并稳定rRNA三级结构。尽管解码和肽移位的关键活性是基于RNA的过程，但蛋白质在可能已经进化为蛋白质合成过程流水线的功能方面起着积极的作用。除了它们典型的核糖体作用，许多核糖体蛋白还具有非核糖体作用，如DNA修复。

S3a(cyc07)在1991年首次克隆。它编码40S的核糖体蛋白(小亚基)，与v-fos转化效应因子(由人和大鼠的fte-1基因编码)、TNF-α诱导的小鼠TU-11基因同源，且类似于酵母PLC1和PLC2。哺乳动物fte-1、植物cyc-07和酵母PLC2都已表明是细胞周期调控的，而且在核糖体水平上参与蛋白质的合成。

改良植物的各种生长特性的能力，将在诸如作物增强、植物育种、观赏植物的生产、树木栽培学、园艺学、林学、用于生物反应器的藻类的生产(用于物质如药物、抗体或疫苗的生物工艺学生产，或是有机废物的生物转化)等领域及其它这样的领域中具有许多应用。

现已发现，在植物中引入和表达编码小亚基核糖体蛋白(S3a)的核酸，产生了相对于对应的野生型植物而言具有改良的生长特性的植物。因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种用于改良植物的生长特性的方法，包括在植物中引入和表达编码S3a的核酸。

最好地，通过实施本发明的方法，产生具有多种改良的生长特性的植物，尤其是增加的产率，特别是种子产率。

如文中所定义的术语“增加的产率”分别用来指相对于对应的野生型植物，在如下的一个或多个方面的增加：(i)植物一个或多个部分增加的生物量(重量)，特别是地上(可收获)部分，增加的根生物量或增加的任何其它的可收获部分的生物量，(ii)增加的种子产率，其可能源于增加的种子生物量(种子重量)，可能是每株植物种子重量的增加或个别种子基础上的增加，并且所述种子重量的增加可能是因改变的种子大小所致，如种子长度和/或种子宽度和/或种子面积；(iii)增加的(饱满)种子数量；(iv)增加的种子大小，这可能也影响种子的组成；(v)增加的种子体积，这也可能影响种子的组成；(vi)增加的收获指数，其可以表达为可收获部分如种子的产率占总生物量的比率；和(vii)增加的千籽粒重(TKW)，是从计数的饱满种子的数量和它们的总重量推断的。增加的TKW可能源于增加的种子大小和/或种子重量。

根据本发明的一个优选实施方案，产率的增加涵盖如上文(ii)至(vii)中任何一项或多项所定义的种子水平上的产率增加。

以谷物为例，产率增加可表现为下列一个或多个方面：每公顷或每英亩植株数的增加，每株植物穗的增加，行数、每行种仁数、粒重、千籽粒重、穗长度/直径的增加，等等。以稻为例，产率增加可表现为下列一个或多个方面的增加：每公顷或每英亩植株数，每株植物的花序数，每个花序上的小穗数，每个花序上的花数，种子饱满率的增加、千籽粒重的增加，等等。产率的增加可能还导致改变的结构，或可能作为改变的结构的结果发生。

根据本发明的一个优选的特点，实施本发明的方法产生了具有增加的产率的植物，其分别表现为相对于对照植物的如下至少一个方面：增加的TKW，增加的(饱满)种子数，增加种子重量和增加的收获指数。因此，根据本发明，提供了一种用于增加植物产率的方法，该方法包括在植物中引入和表达编码S3a多肽的核酸。

因为根据本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于处于其生活周期的相应阶段的对应野生型植物的生长速率而言，这些植物很可能显示出增加的生长速率(在它们至少部分的生活周期期间)。增加的生长速率可能是植物的一个或多个部分(包括种子)特异性的，或可能是基本上整个植株的。具有增加的生长速率的植物甚至可能显示出早期开花。生长速率的增加可能发生在植物生活周期的一个或多个阶段，或基本上在整个植物生活周期期间。植物生活周期早期增加的生长速率可能反映增强的生长力。生长速率的增加可能改变植物的收获周期，使得植物能够比可能的情形更晚播种和/或更早收获。如果生长速率充分增加，可能允许播种相同植物物种的更多种子(例如播种和收获稻类植物，接着播种和收获更多的稻类植物，所有这些都在一个传统的生长期内)。类似地，如果生长速率充分增加，可能允许播种不同植物物种的更多种子(例如播种和收获稻类植物，接着，例如，播种和任选地收获大豆、马铃薯或任何其它合适的植物)。就有些植物来说，从同一根茎收获增加的次数也是可能的。改变植物的收获周期可能导致每英亩年生物量产量的增加(由于(比方说在一年里)任何特定植物生长和收获的次数增加)。生长速率的增加还可能允许在比它们的野生型对应物更广的地理区栽培转基因植物，因为种植作物的地区限制常常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定的。如果缩短收获周期，可以避免这些不利条件。生长速率可通过从生长曲线绘图生长实验获得各种参数来确定，这些参数可以是：T-Mid(植株达到其最大大小的50％所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小的90％所需的时间)，等等。

实施本发明的方法产生具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了一种用于增加植物的生长速率的方法，该方法包括在植物中引入和表达编码S3a多肽的核酸。生长速率的增加这里例示为分别相对于对照植物/对应的野生型植物而言，TKW增加、(饱满)种子数增加的种子重量增加以及收获指数增加。

与对照植物相比，在植物处于非应激状态下或植物接触多种应激时发生产率和/或生长速率的增加。植物一般通过更为缓慢地生长来应答所接触的应激。在严重的应激下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，中度应激在文中定义为植物接触的任何不会导致植物完全停止生长的应激。由于耕作方法(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物植物常常不会遭遇到严重的应激。因此，中度应激诱导的受损生长常常是农业不期望的特点。中度应激是植物可能接触的典型应激。这些应激可能是植物接触的日常生物的和/或非生物(环境)应激。典型的非生物或环境应激包括由反常的热或冷/冷冻温度引起的温度应激；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量水分)。非生物应激也可能是化学品引起的。生物应激一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些应激。

最好可在任何植物中改变上述的生长特性。

如文中所用的术语“植物”包含整个植物，植物的祖先和后代，以及植物的部分，包括种子，枝条，茎，叶，根(包括块茎)，以及组织和器官，其中上述的每一种都包含目的基因。术语“植物”还包含胚，分生组织区域，配子体，孢子体，花粉与小孢子，同样其中上述的每一种也都含有目的基因。

尤其可用于本发明方法的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或饲料豆科植物，观赏植物，粮食作物，选自如下物种的乔木或灌木：金合欢属物种(Acaciaspp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、七叶树属物种(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、须芒草属物种(Andropogon spp.)、落花生属物种(Arachis spp.)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragaluscicer、Baikiaea plurijuga、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属物种(Calliandra spp.)、大叶茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、决明属物种(Cassia spp.)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜属物种(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、Colophospermum mopane、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、柏木属物种(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属物种(Cymbopogon spp.)、Cyntheadealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、粗糙蚌贝蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆属物种(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、画眉草属物种(Eragrestis spp.)、刺桐属物种(Erythrina spp.)、桉属物种(Eucalyptus spp.)、Eucleaschimperi、Eulalia villosa、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、费约果(Feijoasellowiana)、草莓属物种(Fragaria spp.)、千斤拔属物种(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium th unbergii、银杏(Ginkgo biloba)、Glycinejavanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属物种(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄芪属物种(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小连翘(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属物种(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属物种(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、罗顿豆(Lotonus bainesii)、百脉根属物种(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、苹果属物种(Malusspp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、粉芭蕉(Musa sapientum)、烟草属物种(Nicotianumspp.)、驴食豆属物种(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryzaspp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属物种(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬茄属物种(Petunia spp.)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠属物种(Photiniaspp.)、白云杉(Picea glauca)、松属物种(Pinus spp.)、豌豆(Pisumsativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、柳属物种(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitysverticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属物种(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodium distichum)、***黄背草(Themeda triandra)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、小麦属物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属物种(Vacciniumspp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zeamays)、苋属植物、朝鲜蓟、芦笋、椰菜、孢子甘蓝、卷心菜、canola、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝绿叶植物、亚麻、无头甘蓝、小扁豆、油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶叶和藻类，等等。根据本发明的一个优选实施方案，植物是作物如大豆，向日葵，芸苔，紫花苜蓿，油菜籽，棉花，番茄，马铃薯或烟草。  更进一步优选地，植物是单子叶植物，如甘蔗。  更优选地，植物是谷类，如稻，玉米，小麦，大麦，粟，黑麦，高粱或燕麦。

术语S3a是本领域熟知的。下表1中给出的S3a的可选择名称来自Naora和Naora(Immunology and Cell Biology(1999)77，197-205)。

表1：S3a的同系物和命名

名称	物种	鉴定标准	参考文献
				RPS3a	人类	核糖体蛋白	Metspalu等，1992
nbl	人类	在Namalwa Burkitt淋巴瘤细胞中丰富表达	Naora等，1995
				RPS3a	猫	在猫白血病病毒诱导的淋巴瘤中丰富表达	Starkey和Levy，1995
fte-1	大鼠	在回复子v-fos转化的成纤维细胞中被破坏	Kho和Zarbl，1992
				U-11	小鼠	由TNF-a诱导表达	Gordon等，1992
13T	小鼠	大鼠杂交细胞  在转化的杂合体中丰富表达	Lecomte等，1997
				KRP-A	海兔	在神经细胞中丰富表达	Auclair等，1994
C3	蚊子	在卵巢中优先表达	Zurita等，1997
				RPS3a	果蝇	与弱势表型相关的突变	van Beest等，1998
cyc07	高等植物	S期特异性表达	Ito等，1991
				MFT1	酵母	削弱蛋白质输入到线粒体中的突变	Garrett等，1991

通过将查询序列(优选蛋白质序列)与已知的S3a蛋白序列进行比对，可以很容易地鉴定S3a(例如参见图1和2所示的序列比对)。例如，可使用VNTI AlignX序列多重比对程序(InforMax，Bethesda，MD)，采用空位开放罚分为10、空位延伸罚分为0.05的缺省设置，对查询序列(与已知的S3a序列)进行比对。因为S3a序列是高度保守的，通过把查询序列的任何保守区域与已知S3a序列的那些区域进行比较，本领域普通技术人员能很容易地鉴定其它的S3a序列。这些高度保守的区域在图2中以3个框区图解说明。因此，具有相应的保守区域的查询序列将鉴定为S3a。还已表明S3a与真核起始因子eIF-2和eIF-3结合(Westermann等(FEBSLetters Vol.97，No.1(1979年1月))。

如文中所用的术语“S3a”用于指蛋白质，当其用于序列比对时[例如图1或2所示的比对]，是与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域。文中提及的S3a编码核酸是指编码这样的蛋白质的核酸，当其用于序列比对时[例如图1或2所示的比对]，是与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域。如上定义的S3a和S3a编码核酸在本发明的方法中是有用的。

待导入到植物中的核酸可以是如上定义的任何S3a编码序列。核酸优选如SEQ ID NO：1所示。待导入到植物中的核酸优选与组成型启动子有效连接以在植物中过表达。组成型启动子优选是GOS2启动子，更优选来自稻的GOS2启动子。显然，本发明的应用不局限于SEQ ID NO：1所示的S3a，当由GOS2启动子驱动时，本发明的应用也不局限于S3a基因/核酸的表达。

根据本发明的一个优选方面，考虑增强的或增加的S3a核酸的表达。本领域已经充分报道了获得增强的或增加的基因或基因产物表达的方法，例如，其包括由强启动子驱动的过表达，转录增强子或翻译增强子的使用。

编码S3a的核酸可以来源于任何来源。编码S3a的核酸/基因可以分离自微生物来源，如细菌、酵母或真菌，或分离自植物、藻类或动物(包括人)来源。可通过深思熟虑的人为操作，对处于组合物和/或基因组环境中的核酸的天然形式进行修饰。核酸优选是同源核酸，即获自植物的核酸可以是来自其将被导入其中的相同的植物物种，也可以是来自不同的植物物种。核酸可以分离自双子叶种类，优选来自十字花科，还优选分离自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。更优选地，分离自拟南芥的S3a如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：1所示的序列描述了来自拟南芥的S3a，SEQ ID NO：2是相应的氨基酸序列。最好地，本发明的应用不局限于使用如SEQ ID NO：1所示的来自拟南芥的S3a。也可使用如上文定义的任何S3a或S3a编码序列来实施本发明的方法。

用于实施本发明方法的S3a或S3a编码核酸可以是：

(i)S3a编码核酸的部分，优选如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸的部分；

(ii)能与S3a编码核酸杂交的序列，优选能与如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸杂交的序列；

(iii)S3a编码核酸的可选择剪接变体，优选如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸的可选择剪接变体；

(iv)S3a编码核酸的等位变体，优选如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸的等位变体；和

(v)S3a蛋白/氨基酸的同系物和衍生物，优选如SEQ ID NO：2所示的S3a蛋白的同系物和衍生物。

上述的部分、杂交序列、剪接变体和等位变体、同系物和衍生物是落入如上文所定义的S3a或S3a编码核酸的定义范围内的那些，即，在蛋白质的情况下，与已知S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域；而在核酸的情况下，编码与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域。

对本领域普通技术人员来说显而易见的是，使用全长的S3a DNA序列，对于实施本发明的方法并非是必要的。本发明的方法最好使用例如SEQ ID NO：1所示的编码S3a的DNA/核酸的部分。部分指来源于原始的(较大)DNA分子或由其制备的一段DNA。例如，可使用本领域熟知的技术，通过对SEQ ID NO：1的核酸序列进行一个或多个缺失来制备所述部分。适合用于实施本发明方法的部分是编码S3a蛋白的那些部分，该S3a蛋白与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域。

因此根据本发明，提供了一种用于改良植物的生长特性的方法，包括在植物中引入和表达S3a编码核酸的部分，优选如SEQ ID NO：1所示的核酸的部分。

还可用于实施发明方法的是能与S3a编码核酸杂交的核酸，优选能与如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸序列杂交的核酸。这样的杂交序列是编码S3a蛋白的那些序列，该S3a蛋白序列与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域。

如本文所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可完全发生在溶液中，即两互补的核酸都处于溶液中。依赖这种方法的分子生物学工具包括聚合酶链式反应(PCR；以及基于此的所有方法)、扣除杂交、随机引物延伸、S1核酸酶作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNA差异显示和DNA测序。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖凝胶珠子或任何其它树脂上。依赖这种方法的分子生物学工具包括poly(A+)mRNA的分离。此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。依赖这种方法的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、集落杂交、噬菌斑杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其它二级结构。杂交的严谨性受诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。杂交优选在严谨条件下进行。严谨条件为(1)采用低离子强度和高温度进行洗涤，例如，0.5M磷酸钠缓冲液pH 7.2，溶于7％SDS的1mM EDTA pH 8.0，温度为65℃或55℃，或者(2)在杂交期间使用变性剂如甲酰胺，例如，50％(体积/体积)甲酰胺加0.1％牛血清蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.05M磷酸钠缓冲液pH 6.5加0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠，温度为42℃。具体的实例包括使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75 NaCl，0.075 M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhard’s液，超声处理的鲑精DNA(50nm/ml)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，温度为55℃，并于55℃在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。本领域的技术人员能够很容易地确定并适当地改变严谨条件，以获得清楚和可检测的杂交信号。

因此根据本发明，提供了一种用于改良植物的生长特性的方法，包括在植物中引入和表达优选在严谨条件下能与S3a编码核酸序列[优选与如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸]杂交的序列。

S3a编码核酸的可选择剪接变体，优选如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸的可选择变体，也可用于实施本发明的方法。适合用于实施本发明方法的剪接变体是编码S3a蛋白的那些剪接变体，该S3a蛋白与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域。如本文所用的术语“可选择的剪接变体”涵盖这样的核酸序列变体，即其中选定的内含子和/或外显子已经切除、置换或添加。这样的变体是其中蛋白质的生物学活性保持未受影响的那些变体，其可以通过选择性地保留蛋白质的功能片段来获得。这样的剪接变体可以是天然发现的或可以是人造的。用于制备这样的剪接变体的方法是本领域熟知的。

因此，本发明还提供了一种用于改良植物的生长特性的方法，包括在植物中引入和表达S3a编码核酸的可选择剪接变体，优选如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸的可选择剪接变体。

S3a编码核酸的等位变体，优选如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸的等位变体，也可用于实施本发明的方法。适合用于实施本发明方法的等位变体是编码S3a蛋白的那些等位变体，该S3a蛋白与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域。

等位变体天然存在，且囊括在本发明的方法之内的是这些天然等位基因的用途。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)，以及小的***/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物体的天然存在的多态菌株中，SNP和INDEL构成了最大的一类序列变体。

因此，本发明还提供了一种用于改良植物的生长特性的方法，包括在植物中引入和表达S3a编码核酸的等位变体，优选如SEQ ID NO：1所示的S3a编码核酸的等位变体。

此外，本发明的方法最好也可以使用S3a如SEQ ID NO：2所示的S3a的同系物、衍生物或活性片段。使用本领域技术人员熟知的常规技术，可以很容易地确定编码S3a的同系物或衍生物的核酸。

蛋白质的“同系物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或***、且与其所衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。为了产生这样的同系物，蛋白质的氨基酸可以被具有相似性能(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打断α-螺旋结构或β-片层结构的趋势)的其它氨基酸所取代。保守置换表是本领域熟知的(例如参见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。

可用于本发明方法的同系物与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有优选度依次递增的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。而且，适合用于实施本发明方法的同系物是与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域的那些同系物。

术语“同系物”还涵盖两种特殊形式的同源性，其包括直向同源(orthologous)序列和共生同源(paralogous)序列，它们涵盖了用于描述基因遗传关系的进化概念。术语“共生同源”涉及某物种基因组内的基因复制，产生共生同源基因。术语“直向同源”涉及不同生物体中因遗传关系所致的同源基因。

例如，单子叶植物物种中的直向同源物可以通过实施所谓的交互blast搜索很容易地找到。这可以通过第一次blast完成，包括在任何序列数据库如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公众可用的NCBI数据库中，对所讨论的序列(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)进行blast。如果寻找的是稻的直向同源物，所讨论的序列将与例如来自NCBI上可用的Oryza sativa Nipponbare稻的28，469的全长cDNA克隆进行blast。当从核苷酸开始时可使用BLASTn，或当从蛋白质开始时可使用TBLASTX，并使用标准缺省值(期望值10，比对值50)。blast的结果可以进行过滤。然后再将过滤结果或未过滤结果的全长序列与所讨论的序列(SEQ IDNO：1或2)进行反向blast(第二次blast)。然后对第一次和第二次blast的结果进行比较。在大家族的情况下，使用ClustalW，接着使用相邻连接树以帮助观察聚类(clustering)。

同系物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即，其中氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，而将一个不同的残基***到它的位置上。氨基酸取代一般是单残基的，但是取决于对多肽构成的功能限制可以是成串的；***通常是大约1到10个氨基酸残基，缺失为大约1到20个残基。优选地，氨基酸取代包括保守氨基酸取代。

同系物还可以是蛋白质的“***变体”，即，其中一个或多个氨基酸残基被引入到蛋白质中的预定位点。***可包括氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内***。通常，氨基酸序列内的***将小于氨基或羧基末端融合，约为1到10个残基的数量级。氨基或羧基末端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂合***的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG

表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。

蛋白质“缺失变体”形式的同系物的特征在于从蛋白质除去一个或多个氨基酸。

使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以很容易地制备蛋白质的氨基酸变体。对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、***或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生取代突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其它定点诱变方案。

“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与S3a蛋白天然存在形式的氨基酸序列相比，例如，如SEQ ID NO：2所示，其可以包括天然和非天然存在氨基酸残基的取代、缺失或添加。蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，其可以包括改变的、糖基化的、酰化的天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。与其衍生自的氨基酸序列相比，衍生物还可包括一个或多个非氨基酸取代基，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报告分子或其它配体，如结合以便于其检测的报道分子，以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言的非天然存在的氨基酸残基。

搜索和鉴定S3a同系物的方法是本领域技术人员熟知的。对用于比较的序列进行比对的方法是本领域熟知的，这类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443-453，1970)的算法来实现两个全序列的比对，其最大化匹配的数目，并最小化空位数目。BLAST算法计算序列同一性百分比，并对两个序列之间相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(the National Centre for Biotechnology Information)可公众获得。可以通过取全长蛋白质序列，使用VNTI AlignX序列多重对比程序对它们进行序列比对(InforMax，Bethesda，MD)，并使用空位开放罚分为10和空位延伸为0.05的设置默认值，来鉴定适合用于本发明方法的同系物，即，与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的那些同系物。例如参见图1。

因此，本发明还提供了一种用于改良植物的生长特性的方法，包括在植物中引入和表达编码如SEQ ID NO：2所示的S3a的同系物或衍生物的核酸，该同系物、衍生物或活性片段与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有优选度依次递增的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性，而且把该同系物或衍生物与已知的S3a蛋白序列比对且包含与图2序列比对中所示的框区相应的保守区域。

本发明还提供了遗传构建体和载体，以便于引入和/或表达可用于本发明方法的核苷酸序列。

因此，本发明提供了一种基因构建体，其包含：

(i)S3a编码核酸，优选如SEQ ID NO：1所示；

(ii)能驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地

(iii)转录终止序列。

可用于本发明方法的构建体可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建。基因构建体可***到载体中，该载体可以是商购的，适于转化到植物中，并适于在转化的细胞中表达目的基因。

植物用包含目的序列(即如上文所定义的S3a编码核酸)的基因构建体转化。目的序列与一个或多个控制序列(至少与一个启动子)有效地连接。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中都可以互换使用，且应当取其广义，是指能对与它们连接的序列的表达起作用的调控核酸序列。上述术语涵盖来源于经典真核生物基因组基因(包括精确转录起始所需的TATA盒，带或不带CCAAT盒序列)以及根据发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调控元件(即，上游激活序列、增强子和沉默子)的转录调控序列。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在这种情况下，它可能包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能够、在细胞、组织或器官中表达，激活或增强这种表达。如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，以便启动子序列能启动目的基因的转录。

最好地，任何类型的启动子都可用于驱动S3a编码核酸的表达。

优选地，编码S3a的核酸有效地与组成型启动子连接。如文中所定义的术语“组成型”指该启动子在不止一种组织或器官中优势表达，而且在植物生活周期的任何阶段都优势表达。优选地，组成型启动子在整株植物中优势表达。优选地，组成型启动子是来自稻的GOS2启动子。

适合用于本发明方法的其它组成型启动子的例子列于下表A。

表A：用于实施本发明的组成型启动子的实例

基因来源	表达模式	参考文献
			肌动蛋白	组成型	MeElroy等，Plant Cell，2：163-171，1990

CAMV 35S	组成型	Odell等，Nature，313：810-812，1985
			CaMV 19S	组成型	Nilsson等，Physiol.Plant.100：456-462，1997
GOS2	组成型	de Pater等，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992
			遍在蛋白质	组成型	Christensen等，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992
稻亲环蛋白	组成型	Buchholz等，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994
			玉米H3组蛋白	组成型	Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
肌动蛋白2	组成型	An等，Plant J.10(1)；107-121，1996

任选地，一个或多个终止子序列也可用于被引入到植物中的构建体中。术语“终止子”涵盖控制序列，其是位于转录单元末端的DNA序列，传递3’加工和初级转录物聚腺苷酸化以及转录终止的信号。另外的调控元件也可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员知晓适合用于实施本发明的终止子与增强子。这样的序列是已知的，或本领域技术人员可以很容易地获得。

本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制原点序列。一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为染色体外遗传元件(例如，质粒或粘粒分子)维持的情况。优选的复制原点包括但不局限于：f1-ori和colE1。

遗传构建体任选地可包含选择标记基因。如本文所用，术语“选择标记基因”包括赋予表达该基因的细胞表型以便于鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的任何基因。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的新陈代谢性状或允许视觉选择。选择标记基因的实例包括能赋予抗生素抗性(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或使潮霉素磷酸化的hpt)、除草剂抗性(例如提供对Basta的抗性的bar；提供对草甘膦的抗性的aroA或gox)的基因，或提供新陈代谢性状的基因(如允许植物利用甘露糖作为唯一碳源的manA)。视觉标记基因导致形成颜色(例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、发光(如荧光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。

本发明还涵盖可通过本发明的方法获得的植物。本发明因此提供了可通过本发明的方法获得的植物，该植物中引入和表达了如上文所定义的编码S3a蛋白的核酸。

本发明还提供了一种生产具有改良的生长特性的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达S3a编码核酸，优选如SEQ ID NO：1所示的核酸。

更具体地说，本发明提供了一种生产具有改良的生长特性的转基因植物的方法，该方法包括：

(i)向植物或植物细胞中引入S3a编码核酸，优选如SEQ ID NO：1所示的核酸；

(ii)在促进再生和使植物生长成熟的条件下培养植物细胞。

核酸可以直接引入到植物细胞或植物本身(包括引入到植物的组织、器官或任何其它部分)之中。根据本发明的一个优选的特征，核酸优选通过转化被引入到植物中。

如本文所提及的术语“转化”涵盖把外源多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不管转移的方法如何。能够随后无性繁殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用本发明的遗传构建体进行转化，并从其再生完整植物。选择的特定组织将视可用于且最适于转化的特定物种的无性繁殖体系而改变。例示性的靶组织包括叶圆盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋生的芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地被引入到宿主细胞中，并可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择地，它可以整合到宿主基因组中。所得的转化植物细胞然后可用于以本领域技术人员所知的方法再生为转化植物。

植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，任何转化方法都可用于引入目的基因到合适的祖代细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、能增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪颗粒轰击、使用病毒或花粉进行转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA涂层颗粒轰击(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。表达S3a的转基因稻植物优选使用任何用于稻转化的熟知方法，通过土壤农杆菌(Agrobacterium)介导的转化产生，例如在任何以下文献中描述的方法：公开的欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入文中作为参考。至于谷物转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)：745-50)或Frame等(Plant Physiol.2002 May；129(1)：13-22)中所述，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入文中作为参考。

通常在转化以后，选择植物细胞或细胞群中与目的基因共转移的植物可表达基因所编码的一个或多个标记，接着将转化的材料再生成完整植株。

DNA转移和再生之后，可评价推断转化植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组结构，例如使用Southern分析。可选择地或另外地，新引入DNA的表达水平可使用Northern和/或Western分析进行监控，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。

产生的转化植物可通过各种方法进行繁殖，如通过无性繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花授精以产生纯合的第二代(或T2)转化株，而T2植物可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。

产生的转化生物体可以是各种形式的。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有的细胞都被转化以含有表达盒)；转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，转化的根茎被嫁接到未转化的接穗中)。

本发明显然延及由文中描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及囊括由任何上述的方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的要求是该后代显示与由本发明的方法在亲代中产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本发明还包括含有分离的S3a编码核酸的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明还延及植物的可收获部分，如但不局限于种子、叶、果实、花、茎培养物、根茎、块茎和鳞茎。

也可实施本发明的方法而不需向植物中引入编码S3a的核酸。这可通过引入遗传修饰来实现(优选在S3a编码基因的基因座中)。如文中所定义的基因的基因座是指基因组区域，其包括目的基因以及10KB编码区的上游或下游。

例如，遗传修饰可以通过以下的任何一种(或多种)方法引入：TDNA激活、TILLING、定点诱变、同源重组、直接进化，或如上文所述的，通过在植物(细胞)中引入和表达S3a编码核酸。

T-DNA激活标签(Hayashi等Science(1992)1350-1353)包括T-DNA的***，其通常在目的基因的基因组区域或基因编码区的上游或下游10KB处中含有如此构造的启动子(也可能是翻译增强子或内含子)，从而该启动子能指导靶基因的表达。一般地，破坏靶基因天然启动子对其的表达调控，而使该基因处于新引入的启动子的控制之下。启动子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通过土壤农杆菌感染随机***到植物基因组中，并导致靠近该***的T-DNA的基因过量表达。由于接近引入的启动子的基因过量表达，所得的转基因植物显示出显性表型。待引入的启动子可以是能指导基因在所需的生物体[在本案为植物]中表达的任何启动子。例如，组成型、组织偏好的、细胞类型偏好的以及诱导型启动子都适合用于T-DNA激活。

也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部突变技术)，把遗传修饰引入到编码S3a的核酸/基因的基因座中。这是一种诱变技术，可用于产生和/或鉴定、并最终分离能显示S3a生物学活性的S3a编码核酸的诱变变体。TILLING还能够选择携带这类突变变体的植物。这些突变变体甚至可表现出比该基因的天然形式所表现的更高的S3a活性。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei和Koncz，1992；Feldmann等，1994；Lightner和Caspar，1998)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链；(e)DHPLC，其中库中异源双链的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum Nat Biotechnol.2000 Apr；18(4)：455-7，由Stemple 2004(TILLING-a high-throughput harvest for functionalgenomics.Nat Rev Genet.2004年2月；5(2)：145-50.)综述)。

可利用定点诱变产生S3a编码核酸的变体或其部分。若干方法可用来实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley编http://www.4ulr.com/products/currentprotocols /index.html)。

直接进化也可用于产生S3a编码核酸的变体。这包括重复的DNA改组，接着进行合适的筛选和/或选择以产生S3a编码核酸的变体(Castle等，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

T-DNA激活、TILLING、定点诱变和直接进化是能产生新的等位基因和SYT变体的技术的实例。

同源重组能够在基因组的规定选择位置处引入选定的核酸。同源重组是生物学中通常使用的标准技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓physcomitrella。用于在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中描述(Offringa等Extrachromosomal homologous recombination and genetargeting in plant cellsafter Agrobacterium-mediated transformation.1990EMBO J.1990年10月；9(10)：3077-84)，而且在禾谷类作物例如稻中描述(Terada R，Urawa H，Inagaki Y，Tsugane K，Iida S.Efficient gene targetingby homologous recombination in rice.Nat Biotechnol.2002.Iida和Terada：A tale of two integrations，transgene and T-DNA：gene targeting byhomologous recombination in rice.Curr Opin Biotechnol.2004年4月；15(2)：132-8)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定义的S3a编码核酸)不需靶向到S3a编码基因的基因座中，但是可以被引入到高表达的区域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替换内源基因，或附加地引入到内源基因中。

本发明还包括编码S3a的核酸的用途和S3a多肽的用途。

一种这样的用途当然涉及如上文所定义的S3a在改良植物的生长特性，特别是用于提高产率，尤其是种子产率的用途。种子产率可包括下列一个或多个方面：增加的(饱满)种子数、增加的种子重量、增加的收获指数和增加的TKW等等。S3a编码核酸可以如SEQ ID NO：1所示，S3a蛋白可以是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸。

如上文所定义的编码S3a的核酸以及S3a多肽在育种方案中也大有用途。S3a编码核酸可以如SEQ ID NO：1所示，或S3a可以是如SEQID NO：2所示的氨基酸。例如，S3a编码核酸或其部分可以位于染色体(或其部分)上，优选与一种或多种相关的家族成员连接在一起。在这种育种方案的一个实例中，鉴定可能与能够调节植物中编码S3a蛋白的核酸表达的基因遗传连锁的DNA标记，该基因可以是编码S3a蛋白本身的基因，或者是可直接或间接地影响编码S3a蛋白的基因的表达和/或S3a蛋白本身的活性的任何其它基因。然后这种DNA标记可用于育种方案，以选择具有改良的生长特性的植物。

S3a的等位变体也可用于常规的育种方案，如在标记辅助的育种中。这样的育种方案有时需要通过植物的诱变处理，在植物中引入等位基因变异。一种合适的诱变方法是EMS诱变。然后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。接着是筛选步骤，用于选择所讨论序列的优良等位变体，其在植物中产生改良的生长特性。一般通过监控含有所讨论序列的不同等位变体(例如，SEQ ID NO：1的不同等位变体)的植物的生长特性来进行筛选。监控生长特性可以在温室或野外进行。此外任选的步骤包括使植物与另一种植物杂交，其中鉴定优良的等位变体。例如，这可用于产生组合的目的表型特征。

S3a编码核酸还可用作探针，以对基因进行遗传和物理作图，这些基因是与之连锁的性状的一部分和标志。这些信息可用于植物育种，以开发具有所需表型的种系。S3a编码核酸的这种应用，仅仅需要长度为至少15个核苷酸的核酸序列。S3a编码核酸可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Maniatis)可使用S3a编码核酸进行探测。然后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)对所得的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，该核酸可用于探测Southern印迹，该Southern印迹含有代表亲本和明确的遗传杂交后代的一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA。记录到DNA多态性的分离，并用于计算S3a编码核酸在前面使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

植物基因来源的探针的制备和在遗传作图中的用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。众多出版物描述过使用上面所述的方法或其变通形式对特定的cDNA克隆进行遗传作图。例如，F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系及其它的个体组可用于作图。这类方法是本领域技术人员熟知的。

核酸探针也可用于物理作图(即，把序列置于物理图上；参见Hoheisel等：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346页，以及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。虽然目前的FISH作图方法偏向于使用大的克隆(几个到几百KB；参见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏度的提高允许使用较短的探针进行FISH作图。

许多用于遗传和物理作图的各种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸实施。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic AcidRes.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和制备引物对，以用于扩增反应或引物延伸反应。这类引物的设计是本领域技术人员所熟知的。在采用基于PCR遗传作图的方法中，可能有必要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲代之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。

编码S3a的核酸和S3a多肽也可用作生长调节剂。S3a编码核酸可以是如SEQ ID NO：1所示的核酸，而S3a蛋白/多肽可以是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸。由于这些S3a可用于改良植物的生长特性，S3a也是有用的生长调节剂，如除草剂或生长刺激物。本发明因此提供了一种组合物，其包含S3a或编码S3a的核酸，连同合适的载体、稀释剂或赋形剂，用作生长调节剂。

本发明的方法产生具有改良的生长特性的植物，如以上所述。这些改良的生长特性也可与其它经济学上有利的性状结合，如其它增产性状、对各种应激的耐受性、修饰各种结构特征和/或生化和/或生理学特征的性状。

附图说明

本发明现在将参考以下附图进行描述，其中：

图1显示了使用VNTI AlignX序列多重比对程序(InforMax，Bethesda，MD)进行的S3a蛋白序列的比对，其中使用空位开放罚分为10和空位延伸为0.05的缺省设置。黑色背景上以白色表示的残基是相同的；灰色背景上以白色表示的残基是保守的或类似残基区，如VNTI选项所定义的那样。

图2显示了来自Lyamouri(Gene 294(2002)147-156)等的序列比对，其显示了来自不同物种的S3a蛋白中的高度保守：智人(H.sapiens)(Hs)，褐家鼠(M.musculus)(Mm)，红鳍东方鲀(T.rubripes)(Tr)，非洲爪蟾(X.laevis)(Xl)，黑腹果蝇(D.melanogaster)(Dm)，黑果蝇(D.virilis)(Dv)，秀丽隐杆线虫(C.elegans)(Ce)，酿酒酵母(S.cerevisiae)(Sc)，拟南芥(A.thaliana)(At)，稻(O.sativa)(Os)和H.holobium(Hh)。黑色阴影表示相同的氨基酸，而浅灰表示保守的氨基酸置换。空位由破折号表示。最高度保守的区域是方框内的。

图3显示了二元载体，用于在稻中表达处于稻GOS2启动子控制下(内参PRO0129)的拟南芥cyc07推定的S-期特异性40S S3a核糖体蛋白基因(内参CDS0730)。

图4详述了用于进行本发明方法的序列。

实施例

本发明现在将参考以下实施例进行描述，其仅仅是为了例证说明。

DNA操作：除非另有说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，3rd Edition Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等第1卷和第2卷(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protoeols中描述的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。

实施例1：基因克隆

使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，PCR扩增拟南芥S3a(S-期特异性40S cyc07)。对从幼苗提取的RNA进行反转录以后，把cDNA克隆到pCMV Sport 6.0中。基因库的平均***大小为1.5kb，而且克隆的原始数为1.59×10⁷cfu。原始滴度确定为9.6×10⁵cfu/ml，而且在第一轮扩增以后变成6×10¹¹cfu/ml。质粒提取以后，200ng的模板用于50μl PCR混合物。如下引物用于PCR扩增：引物prm02255(正义，起始密码子为黑体，AttB1位点为斜体：5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTGTCGGGAAGAA 3’)和prm02256(反向，互补，终止密码子为黑体，AttB2位点为斜体：5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAGCTCCGATGATTTCT3’)，其包括用于Gateway重组的AttB位点。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在标准条件下进行PCR。扩增到789bp的PCR片段，而且同样使用标准方法进行纯化。然后进行Gateway方法的第一步，即BP反应，在此期间，PCR片段在体内与pDONR201质粒重组，根据Gateway术语，以产生“entry克隆”p2782。质粒pDONR201购自Invitrogen，作为Gateway

technology的一部分。

实施例2：载体构建

entry克隆p2782接着与p0640进行LR反应，p0640是用于稻转化的目的载体。该载体包含位于T-DNA边界内的以下部分作为功能性元件：植物选择标记；植物筛选标记；旨在与已克隆到entry克隆中的目的序列进行体内重组的LR的Gateway表达盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(PRO0129)位于该Gateway表达盒的上游。LR重组步骤之后，得到的如图3所示的表达载体被转化到土壤农杆菌中，其随后被转化到稻植株中。使转化的稻植株生长，然后检验实施例3中所述的参数。

实施例3：评估和结果

产生了大约15到20个独立的T0稻转化株。一代转化株从组织培养室转移到温室中生长，并收获T1种子。6个事件得以保留，其中T1后代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。对于这些事件中的每一个，通过监控视觉标记的表达，选择了大约10个包含转基因的T1幼苗(异型和同型接合子)，和大约10个缺乏转基因的T1幼苗(无效接合子)。有些T1事件在T2代中使用与T1代相同的评价方法进行进一步予以评估。

统计学分析：F-测验

两因子的ANOVA(可变性分析)用作统计模型，用于植物表型特征的综合评价。对用本发明的基因转化的所有事件的所有植株的所有测量参数进行F测验。进行F测验以检查基因对所有转化事件的作用，并检验基因的总效应，亦称之为整体基因效应。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F测验的5％概率水平。显著的F测验值显示基因效应，意味着不仅仅是基因的存在或位置引起表型的差异。

3.1种子相关的参数测量

收获成熟的初级穗，装袋，进行条型码标记，然后在烘箱于37℃干燥3天。然后对穗脱粒，收集所有的种子并计数。使用鼓气装置，把饱满的谷壳从空谷壳中分离开。丢弃空谷壳，并对保留的部份再次计数。饱满的谷壳在分析天平上称重。该方法产生如下所述的种子相关参数组。

下面的结果表显示了用于T1评估、T2评估的F测验的p值，以及用于联合的T1和T2评估的F测验的p值。当对相同的事件已经进行了两个实验时，可以考虑联合分析。这可用于检查对两个实验的作用的一致性，并增加结论的可信度。所用的方法是混合模型法，其考虑数据的多级结构(也即实验-事件-分离子)。P值通过比较似然比检验与卡方分布获得。每一个表都提供了每代的转基因与对应的无效接合子之间的％差异。

3.1.1饱满的种子数

通过计数分离步骤之后保留的饱满谷壳的数目确定饱满的种子数。如下表1所示，用于联合的T1和T2评估的F测验的p值是显著的(p值为0.0071)，这表明植物中构建体的存在对转基因植物的饱满种子数具有显著影响。

表1

饱满的种子数
				％差异	P值
T1	22	0.354
			T2	15	0.1829
联合的		0.0071

3.1.2每个植株的种子总产率

通过对从植株收获的全部饱满的谷壳进行称重，来测定种子总产率。如下表2所示，用于联合的T1和T2评价的F测验的p值是显著的(p值为0.0016)，这表明植物中构建体的存在对转基因植物的种子总重量具有显著影响。

表2

种子总重量
				％差异	P值
T1	29	0.0266
			T2	20	0.1037
联合的		0.0016

3.1.3植物的收获指数

本发明中的收获指数定义为种子总产率与地上面积(mm²)之间的比率，再乘以系数10⁶。如下表3所示，用于联合的(以及分别的)T1和T2评价的F测验的p值是显著的(p值为0.0005)，这表明植物中构建体的存在对转基因植物的收获指数具有显著影响。

表3

收获指数
				％差异	P值
T1	15	0.0358
			T2	14	0.0365
联合的		0.0005

3.1.4千籽粒重(TKW)

从计数的饱满种子数以及它们的总重量来推断该参数。如下表4所示，用于联合的T1和T2评估的F测验的p值是显著的(p值为0.0405)，这表明植物中构建体的存在对转基因植物的TKW具有显著影响。

表4

千籽粒重
				％差异	P值
T1	3	0.3353
			T2	2	0.1257
联合的		0.0405

Claims (17)

1.一种相对于相应野生型单子叶植物增加单子叶植物的种子产率的方法，包括在单子叶植物中引入和表达编码小亚基核糖体蛋白S3a多肽的核酸，其中所述编码S3a的核酸为编码来源于拟南芥的S3a多肽的核酸。

2.权利要求1的方法，其中所述S3a多肽如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1的方法，其中所述编码S3a的核酸为由SEQ ID NO：1代表的核酸。

4.权利要求1的方法，其中所述增加的种子产率选自(i)增加的种子生物量；(ii)增加的饱满种子数；(iii)增加的种子大小；(iv)增加的种子体积；(v)增加的收获指数；和(vi)增加的千籽粒重，其中所述收获指数表达为可收获部分种子的产量占总生物量的比率，其中所述千籽粒重从计数的饱满种子的数量和它们的总重量推算。

5.权利要求1的方法，其中所述编码S3a的核酸序列在植物中过表达。

6.权利要求1的方法，其中所述编码S3a的核酸的表达由组成型启动子驱动。

7.权利要求6的方法，其中所述组成型启动子为GOS2启动子。

8.用于相对于相应野生型单子叶植物增加单子叶植物种子产率的方法，包括在单子叶植物中在编码植物S3a多肽的基因的基因座中引入增强来自拟南芥的S3a多肽的表达的遗传修饰。

9.通过权利要求1至8中任一项的方法获得的单子叶植物的细胞或部分，其非植物的繁殖体。

10.用于生产相对于相应的野生型单子叶植物具有增加的种子产率的转基因单子叶植物的方法，该方法包括：

(iii)把编码拟南芥S3a的核酸引入到单子叶植物或植物细胞中；

(iv)在促进再生和使植物生长成熟的条件下培养植物细胞。

11.具有增加的种子产率的转基因单子叶植物的细胞或部分，特征在于在所述植物细胞或植物部分中引入和表达了编码拟南芥S3a蛋白的核酸序列，其中所述植物细胞或植物部分非植物的繁殖体。

12.权利要求9或11的转基因植物细胞或部分，其中所述单子叶植物是甘蔗。

13.权利要求12的转基因植物细胞或部分，其中所述单子叶植物是选自稻、玉米、小麦、大麦、高粱、甘蔗、粟、和大麦的禾谷类植物。

14.权利要求9或11中任一项的非植物繁殖体的植物部分，其为可收获部分。

15.来源于拟南芥的S3a或编码拟南芥S3a的核酸在相对于相应的野生型单子叶植物提高单子叶植物种子产率中的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述种子产率包括如下一项或多项：(i)增加的饱满种子数、(ii)增加的种子重量、(iii)增加的收获指数、和(iv)增加的千籽粒重，其中所述收获指数表达为可收获部分种子的产率占总生物量的比率，其中所述千籽粒重从计数的饱满种子的数量和它们的总重量推算。

17.权利要求15或16的用途，其中所述S3a编码核酸如SEQ ID NO：1所示，而其中所述S3a是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

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