CN1872344A - 人异体间质干细胞（携带治疗基因）的基因治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人异体间质干细胞(MSCs携带治疗基因)的基因治疗方法。用人异体间质干细胞作基因治疗的靶细胞和载体，通过基因转染技术，将治疗的目的基因导入间质干细胞内，使间质干细胞自身或分化后的后代细胞表达治疗基因的产物，达到基因治疗的目的。人异体间质干细胞(携带治疗基因)的基因治疗方法可以是单基因实施方案，也可以是多基因综合治疗，称之为“间质干细胞(携带治疗基因)的多基因综合治疗方法”。

Description

人异体间质干细胞(携带治疗基因)的基因治疗方法

本发明用美国希望基因治疗有限公司和上海凯铱威机电有限公司的资金进行，因此，以上两家在本发明中拥有一些权利。

发明领域：

本发明属于干细胞基因工程和基因治疗领域，具体涉及人异体间质干细胞(携带治疗基因)作为基因治疗的靶细胞和载体，对人类的遗传性疾病和后天获得性疾病进行基因治疗，治愈人类的各种难治性疾病。

背景技术：

干细胞技术

自从1998年科学家发现干细胞的多分化潜能后，干细胞的研究与应用在美国的《科学》杂志的1999年世界十大科学成果中名列榜首，2000年再度入选世界十大科技进展。科学家们发现，“取自人胚胎，胎盘，脐血或骨髓的干细胞可培育不同的人体细胞，组织或器官。这有望成为移植器官新的材料来源和细胞治疗的基础。”除此之外，人体的干细胞有许多种类，由于它们的组织来源不同和自身生物学特性不一样，许多实验室和临床治疗组，用它们来做基因治疗的靶细胞，让它们携带治疗基因在人体的病变器官进行治疗性的目的基因表达。实验研究已证实有非常重要的临床治疗意义。这将有望在21世纪人们利用干细胞这一生物学特性，结合基因治疗方法，攻克人类某些重大疾病，如癌症，心脑血管疾病，老年性疾病，内分泌和自身免疫性疾病等。

随着生命科学的迅猛发展，相关学科的相互交叉渗透，使得干细胞的基因工程学方面有了突破性进展，特别是干细胞的分离，纯化，培养扩增，性能研究，诱导分化等取得长足的进步。干细胞是具有自我更新，高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，干细胞可通过细胞***维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而构成机体的各种复杂的组织器官。随着干细胞基因工程和技术的发展，以及干细胞自身具有的特性，人们能在体外大规模扩增某些干细胞，有望利用干细胞来治疗人类各种疾病，特别是基因治疗浪潮掀起，给干细胞基因工程带来了前所未有的发展势头。尤其是来自骨髓和脐带或胎盘的间质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是中胚层来源的具有多向分化潜能的干细胞，主要存在于全身***和器官间质中，以骨髓组织中含量最丰富，胎儿脐血亦可分离得到。间质干细胞具有向骨细胞，软骨细胞，肌腱细胞，肌细胞，神经细胞，脂肪细胞和造血支持***等分化的能力。同所有的干细胞一样，骨髓间质干细胞也具有自我更新能力和多向分化潜能，它虽然仅占骨髓单核细胞的0.001％-0.01％，却有惊人的增殖能力和强大的自我更新能力，间质干细胞还具有以下的特点和优势：1.能在体外大批量扩增培养，传代至40-50代或扩增109以上仍保持不分化的特性和不丢失其多向分化潜能；2.外源基因易于植入并整合到间质干细胞的基因组中稳定表达而不影响干细胞特性；3.外源基因的表达具有组织特异体，受所定位微环境的作用；4.间质干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，异体注射免疫源性很弱，不发生异体排斥反应；5.间质干细胞具有自我更新能力，治疗基因导入间质干细胞后如果能长期表达，病人可终生受益；6.间质干细胞具有向各系分化的能力，只要少数间质干细胞转染目的基因后，由其分化而成的细胞便可随着血液循环分布到全身各部位，利于其携带的外源治疗基因能更大限度地发挥治疗作用；7.间质干细胞无论在骨髓内还是在循环或组织中，治疗基因表达产物都能通过血液循环而达到靶器官，也能通过血脑屏障进入脑循环；8.当机体损伤或病变时，病变局部会诱发出信号，间质干细胞会循着信号到达病变部位，释放细胞因子和细胞生长因子或表达治疗基因的产物，对局部病变起到治疗和保护作用。由于这些优势和特点，使用间质干细胞作为靶细胞和载体，为人类多种疾病的基因治疗带来新的希望。

基因治疗

21世纪是生命科学的世纪，基因治疗的兴起和人类基因组计划的全面实施已有力地说明了这一点。2000年6月26日获得了人类基因组计划的“工作框架图”。2003年4月14日人类基因组序列绘制成功，成为人类基因组计划的一个重要里程碑。基因组计划的成功为基因治疗奠定了坚实的基础。基因治疗的基本原理来源于人类对自身遗传机制的了解，基因作为机体内的遗传的基本单位，不仅可以决定人们的相貌，高矮，肤色，而且它的异常变化将会不可避免的导致各种疾病。某些缺陷的基因可能会遗传给他们的后代(血友病，高血压，糖尿病等)，而有些则不能遗传。基因治疗的最早提出是针对单基因缺陷的遗传病，目的在于用一个正常的基因来代替或置换缺陷的基因或者补救缺陷基因。

1990年美国国立卫生院(NIH)的Blase RM和Anderson WF用ADA(腺苷酸脱氨酶)基因治愈了一位ADA基因缺陷导致严重免疫缺损(SCID)的4岁女孩，我国1991年由复旦大学生命科学院薛京伦教授领导的课题组，用基因治疗方法对两例XIII对凝血因子缺失的患者进行基因治疗，取得可喜的成绩，使世界各国都掀起研究基因治疗的热潮。至今，基因治疗的研究内容也从单基因的遗传病扩大到多基因的肿瘤，艾滋病，心血管病，神经***疾病，自身免疫性疾病和内分泌和老年性疾病。

载体技术

基因治疗方案大部分都包括相辅相成的三个部分：治疗基因或其它核酸(如RNA分子或合成的寡核苷酸)选择；可携带治疗基因进入靶细胞的载体；治疗基因在靶细胞，靶组织中的表达调控。如何将精心挑选的治疗基因导入体内，穿过细胞膜，进入细胞核获得表达。这是基因治疗成败的关键。无论是体内还是体外途径的基因转移都需要一种安全，无毒，高效表达的工具来携带外源基因进入细胞内。这种工具被称之为载体(Vector)。理想的载体应具有以下条件：易获得高滴度的纯品；可以稳定，高效的重组体内非增殖状态的细胞；可以长期稳定地表达外源基因而不会引起细胞毒性、感染或免疫应答；能特异地识别靶组织和在靶细胞内表达外源基因，包括药理学和生理学上的调控基因。至今，还没有一种载体***适用于所有的基因治疗方案。目前，已经建立了多种基因转染方法，其中包括化学的，物理的，以及生物学的方法(如电穿孔，脂质体和基因枪，病毒载体和非病毒载体，病毒载体有腺病毒载体和腺相关病毒载体及其它病毒载体)。本发明选择腺相关病毒作为间质干细胞的转染体。腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)是一个缺陷的非致病性的单链DNA病毒，其复制需要辅助病毒的共感染，没感染时，野生型AAV优先整合到19q 13.3处潜伏存在，直到被辅助病毒“拯救”出来。AAV进行位点特异性的整合需要基因末端的反向重复序列(Inverted Terminal Repeat，ITR)与非结构蛋白Rep78和Rep68共同存在。AAV适用于基因治疗的特性包括：没有证明对人体有致病性；广泛的宿主和组织范围，可稳定地整合入细胞内并稳定的表达外源基因，在实验猴子中已观察rAAV表达持续5年；由于ITR的存在，***基因引起突变的危险性低；由于缺乏病毒基因，因而不会引起机体对载体的免疫应答，所以用rAAV载体与间质干细胞进行转染，将有效的治疗基因转染间质干细胞，间质干细胞作为基因治疗的靶细胞，携带目的基因到达靶组织发挥治疗作用。如果用DNA质粒或RNA分子来转染干细胞，需要提高转染率。

发明内容

本发明采用干细胞基因工程技术和基因治疗方法，结合动物细胞大规模培养工程技术，将治疗基因导入大规模培养的人异体间质干细胞中，使人异体间质干细胞(携带治疗基因)作为基因治疗的靶细胞载体，对人类的遗传性疾病和后天获得性疾病进行基因治疗，彻底治愈人类的各种难治性疾病。

间质干细胞(携带基因治疗)基因治疗的意义

基于间质干细胞的更新增殖能力，基因转染的间质干细胞基因治疗与传统的基因治疗相比有明显的优势。基因转染的间质干细胞基因治疗包括以下几个靶标：1.转染间质干细胞的潜能——以间质干细胞为靶标，间质干细胞的某些生物学特性可因为转入新的基因而发生改变。成人组织中分离出的间质干细胞可能会因为机体年龄的问题，遗传性或后天获得性疾病等原因而使其重建受损组织或治疗效果受到影响，导入转录基因或相关的酶基因进行转染是一种有效的途径来维持，增强或抑制干细胞增殖分化的能力。2.改善器官的性能——以间质干细胞的子代细胞为靶标，导入间质干细胞的基因可随着干细胞的分化传给子代细胞，由于基因转染的间质干细胞重建了某一组织后使***的基因在这一组织中持续表达一生。如对具有遗传缺陷的组织，特别是造血***的遗传性缺陷，或心血管疾病，糖尿病等，可通过基因转染的间质干细胞进行治疗。3.加快组织重建——利用间质干细胞的增殖和分化能力重建受损细胞，如用间质干细胞和造血干细胞重建骨髓造血***，间质干细胞在骨和软骨受损处重建，亦可以通过转染治疗基因随着受损或病变处诱发的信号，到达病变部位和受损区，释放，表达转录治疗基因，对病变和受损部位进行治疗。此外，机体自身修复过程可由于组织严重的损伤，疾病或老年化问题而难以实现。基因转染的间质干细胞以促进有丝***，对负调节因子进行抑制或影响特定基因的原位表达等方式加快被延迟的组织重建过程。间质干细胞基因治疗的意义除了上述外，最重要意义是间质干细胞能被转染和导入广泛具有治疗的基因，作为靶细胞携带这些治疗基因，执行对各种人类疾病(如癌症，心血管病，神经***疾病，自身免疫性疾病，内分泌和老年性疾病等)的全方位的基因治疗，克服目前基因治疗所遇到的种种难题。基于间质干细胞的治疗是癌症研究中一个重要的领域，研究者正在设计更多的方法，以实现将原于干细胞的特殊细胞锁定到特定癌细胞上，从而直接将可破坏或修饰癌细胞的药物送到癌细胞。这一方面，更多是直接将治疗基因转染间质干细胞，以间质干细胞作为靶细胞将按照间质干细胞自身生物学的特征，一方面将治疗基因在局部及病变组织释放表达起到治疗作用，另一方面，间质干细胞自身的分化潜能和增殖能力，其子代的细胞会不断地表达治疗基因，起到长效的治疗作用。

某些疾病是由于多基因平衡失调所至，因此，在治疗上采用单一基因的方法不能起到很好的治疗效果。用间质干细胞作为基因转染的载体，可分别转染多种治疗基因，用同一载体，转染不同治疗基因，同时治疗病患，会起到十分满意的效果，如癌症的病患就可以采用这一方法，笔者已在另一申请的专利《癌症的多基因综合治疗》中提到了关于单一基因治疗和多基因的综合治疗疗效的比较。多基因的综合治疗比单一基因的治疗的效果明显增强。在该专利中笔者使用rAAV作载体，同时用三组治疗基因，实施综合性基因治疗。这一方法的理论基础是在于癌症的发病机制是多基因的平衡失调所至，肿瘤的发生过程中的癌基因的得能，抑制癌基因的失能，加上癌症转移基因的得能和癌症转移抑制基因失能的综合因素失调，导致癌变，最后演变成癌症的发生，如果治疗无效，最终导致癌细胞的转移，耗尽机能生命体能而死亡。因此，利用间质干细胞作为对癌症治疗的靶细胞时，可实施多基因综合治疗方案，同时分别转染经精心挑选的基因，组成综合治疗的相关药物，对癌症实施多方位的综合基因治疗。组合搭配的治疗基因可以从这几方面着手：1.增强机体免疫功能基因；2.直接杀死癌细胞基因；3.抑制癌症转移的基因；4.反义核苷；5.增强机体抗癌药物的耐药性基因和细胞因子基因。经过精心科学的选择，组合成最有效的治疗方案。对艾滋病的治疗亦可以采用多基因的综合治疗，将有效杀死HIV病毒的基因和增强机体免疫能力的基因组合，分别转染间质干细胞，从几个方面实施对HIV的患者进行基因综合治疗。除上述外，其它由于多基因平衡失调所致疾病，也可以用基因综合治疗的方案。

人异体间质干细胞(携带治疗基因)产品的制备工艺

异体的种子间质干细胞进行工作库的放大培养，然后按一定的细胞数目接种在反应器(发酵罐)或转瓶中进行悬浮或贴壁培养。培养介质中除增殖***的细胞因子和细胞生长因子外，促分化的细胞因子和细胞生长因子一律不用。产品制备过程：1.间质干细胞的发酵罐或转瓶大规模培养；2.质粒DNA、核酸、RNA分子或rAAV的转染(其它病毒载体或非病毒载体进行转染)；3.细胞的收集和纯化；4.安全性检测后包装储存。(发酵罐大规模培养详细过程见如下)

取1.5×10⁵/mL量的工作库种子间质干细胞接种于50L的特殊发酵罐中，接种前培养基的pH值用二氧化碳来校正，发酵罐预热至37℃时开始接种，培养介质是无血清或血清培养基，发酵罐的搅拌速度约100-300r/min，不得大于350r/min，搅拌叶轮的切片应光滑平整，不能有锋尖的叶面，避免搅拌时损伤培养细胞，搅拌的目的是保持细胞均匀呈悬浮状态生长，细胞的培养过程中的氧气，二氧化碳，pH值，葡萄糖浓度及氨浓度等参数的变化，随时调整和补充介质。每天观察细胞生长状态及检测生长密度。当细胞长到80％的罐内培养密度时，开始进行治疗基因的转染，治疗基因可以是质粒DNA、核酸、RNA分子，转染过程相对简单(主要加氯化钙或其它物质增加细胞膜的通透性，质粒DNA易于吸收入细胞内)，但转染率比较低。用病毒载体的过程相对复杂，特别是腺相关病毒载体，至少要2-3天的共转染过程才能比较完全地转染进入间质干细胞内，在2-3天的转染过程中，发酵罐的搅拌速度和次数应严格按照预定的程序进行，保持每小时轻微的搅拌次数，让细胞能立即转染，使细胞不会贴壁生长，一旦完成转染过程后，阳性比率达到90％以上时，及时收集细胞。常规细胞收集方法是利用反应器(发酵罐)中的滤膜排放***，将发酵罐内培养液放去80％左右，大约20L的培养液，或用过滤的方法滤去培养液，留下5L的细胞混合液，在洗脱液洗脱下，将收集到的细胞混合液和洗脱液一起经过离心收集沉淀的细胞层，所有收集，测试安全性生物特性后，进行分瓶罐装，再存入液氮中(逐步降温后)保存，保证产品始终保持最佳的生物活性。以上的生产工艺已日益完善，特别是发酵罐技术已有突破性进展，使干细胞的大规模培养变成现实。

Claims (8)

1.人异体间质干细胞包括：骨髓间质干细胞或胎盘，脐血及其它组织的间质干细胞，经过放大扩增(大规模)培养，采用基因(质粒DNA、RNA分子或病毒载体和非病毒载体所携带的治疗基因)转染技术将治疗基因导入间质干细胞中，间质干细胞作为基因治疗的靶细胞和载体，让治疗基因通过自身分化表达或子代细胞的表达，对患者实施有目的的基因治疗。

2.人异体间质干细胞(携带治疗基因)，是已导入了质粒DNA、RNA分子、和病毒载体(rAV，rAAV或其它病毒)或非病毒载体。在治疗过程中间质干细胞扮演了双重载体的角色，它即携带了病毒的载体(已重组治疗基因)，且自身也作为载体转运治疗基因。

3.权利要求人异体间质干细胞(携带治疗基因)的基因治疗方法，可实施单一基因治疗，也可以实施多基因综合治疗(特别是针对癌症等多基因失调病变的基因治疗)。多基因综合治疗是指用同一种间质干细胞转染不同的治疗基因。

4.权利要求人异体间质干细胞所携带的治疗基因，是指对人类疾病(包括各种类型的癌症，心脑血管疾病，神经***疾病，内分泌和自身免疫性疾病，血液***疾病，遗传性疾病)有治疗作用的基因。

5.权利要求所述的人异体间质干细胞(携带治疗基因)作为治疗基因的转染载体，取已培养至第5-8代以下的细胞做种子细胞，做起始培养(10代以下的间质干细胞生长最旺盛，活性最佳)。

6.权利要求人异体间质干细胞(携带治疗基因)的基因治疗方法，基因治疗药物的包装是保护剂加上异体间质干细胞(携带治疗基因)以水剂的形式保存在-180℃的液氮中，降温过程中以每分钟降低1-2度为宜(包括出厂临床使用前均应在-180℃低温条件中，以确保该产品的生物活性)。

7.权利要求人异体间质干细胞(携带治疗基因)的基因治疗方法，病人的给药途径：静脉、动脉注射，局部注射，肌肉注射，脏器内注射，瘤体内注射(如果不是肺部疾病，尽量避开静脉注射，减少干细胞在肺部的凋亡)。

8.权利要求人异体间质干细胞(携带治疗基因)的基因治疗方法的受试者为人。