CN1787739B - ***处理*** - Google Patents

***处理*** Download PDF

Info

Publication number
CN1787739B
CN1787739B CN038174847A CN03817484A CN1787739B CN 1787739 B CN1787739 B CN 1787739B CN 038174847 A CN038174847 A CN 038174847A CN 03817484 A CN03817484 A CN 03817484A CN 1787739 B CN1787739 B CN 1787739B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
seminal fluid
temperature
separated
hatched
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN038174847A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1787739A (zh
Inventor
阿利森·C·林赛
约翰·L·申克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
XY LLC
Original Assignee
XY LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by XY LLC filed Critical XY LLC
Publication of CN1787739A publication Critical patent/CN1787739A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1787739B publication Critical patent/CN1787739B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0612—Germ cells sorting of gametes, e.g. according to sex or motility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/52—Sperm; Prostate; Seminal fluid; Leydig cells of testes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及***或***的处理***，该***可维持或增强***在收集、处理、储存、运输、分离或授精等各个过程中的生物学、化学、物理、生理或功能特性。

Description

***处理*** 
技术领域
本发明涉及***或***(sperm cell)的处理***，该***可维持或增强***在收集、处理、储存、运输、分离或授精等各个过程中的生物学、化学、物理、生理或功能特性。 
背景技术
随着***分离方法的发展，***被安全可靠地将分离为富含X染色体和富含Y染色体的群体，由此导致在许多种家畜中实现了有效的性别预选。如本文及多项专利申请所公开，可以将含有X染色体的***与含有Y染色体的***分离开来，所述专利申请有例如国际专利申请PCT/US99/17165、PCT/US98/27909、PCT/US01/45237、PCT/01/18879、PCT/US01/15150和PCT/US01/02304，以及美国专利申请09/582,809和09/015,454，在此以参考的方式将其引入本文。这些将含有X染色体的***与含有Y染色体的***分离开来的实例并不意味着将本***处理***发明限制于使用流式细胞分选装置或流式分选方法的***处理技术，而是意在以之作为用以理解本发明的背景，来说明使***彼此分离的各种方法，以及说明收集、处理、分离、运输、使用或储存***的方式。 
对于基于***的某一特定性质而分离成亚群的***，其显著问题是运动力降低、存活力降低或生育力下降。此问题的一个方面是，在将***分离成亚群之前处理及运输***的传统方法通常是在约5℃下实施，或是在***的膜脂已从液相转化成凝胶态的温度下实施。***的膜脂从液相转化成凝胶态可以改变***的化学、物理、生理或功能性质，导致***生育力下降，或使***死亡。此问题的另一个方面是，***的膜脂从液相转化成凝胶态的温度可因作为***来源的哺乳动物的不同而不同。这样，对于特定的哺乳动物来说，为了防止***的膜脂从液相转化成凝 胶态而维持的温度必须在进行后续的收集、处理、运输及分离过程前确定下来。此问题的另一个方面是，传统上认为，为了在后续的处理、运输或分离过程中保持***的存活力和生育力，应该降低所收集的***的温度，这与本发明中所收集***的孵育或维持温度相背离，在本发明中所述温度大大高于已有常规应用的温度。 
将***分离成亚群的常规方法所具有的另一显著问题是，***所暴露的染色剂浓度可能对于取自特定哺乳动物的***来说太高了。例如，马***暴露于Hoechst 33342染色剂的浓度为染色牛***的常规所用浓度时，其可能表现出生育力基本丧失。 
将***分离成亚群的常规方法所具有的另一显著问题是，***在诸如Hoechst 33342等染色剂中孵育的时间对于特定哺乳动物来说太长了。例如，在Hoechst 33342中孵育1小时的马***可能表现出运动力或生育力基本丧失。 
常规处理***方法的另一显著问题是，用某些组合物来稀释(extension)***，在这些组合物中，***表现出运动力或生育力基本丧失。 
尽管已经改善了各种各样的***分离装置及方法，但是对于在收集、处理、运输、分离、使用或储存过程中保持***存活力来说仍存在显著问题。 
发明内容
因此，本发明的主要目的是提供用于收集、处理、运输、储存或分离***或***的装置或方法以保持***存活力。 
本发明的另一主要目的是提供收集、处理、运输、储存或分离***或***的装置或方法以保持或增强***存活力，所述***或***取自各种哺乳动物，包括但不限于马科动物、牛科动物、猫科动物、ovids、犬科动物、水牛、牛、麋鹿或猪；或取自哺乳动物的珍贵、濒临灭绝或稀有个体；或取自动物学标本。 
本发明的另一重要目的是提供处理和运输取自马科哺乳动物的*** 的装置或方法。 
本发明的另一重要目的是提供分离***的装置或方法，该装置或方法可在整个流式分选过程中使哺乳动物的***保持更高的存活力。 
本发明的另一重要目的是提供使***保持更高存活力的装置或方法，这些***用于如上所述不同种哺乳动物的人工授精，甚或用于与这些人工授精方法中常用或典型使用的***数量相比***数降低或减少的人工授精，而无论在这些方法中***是否分离成富含X染色体或富含Y染色体的***。 
本发明的另一重要目的是提供包括以下步骤的方法，所述步骤为在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育***。 
本发明的另一重要目的是提供在流式分选***前运输公马***的装置或方法。 
本发明包括以下技术方案： 
1、一种分离***的方法，该方法包括： 
a.从哺乳动物中的雄性动物获取***，该***含有大量***； 
b.在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***； 
c.测定所述大量***的***性质； 
d.基于所述***性质分离所述***；及 
e.收集分离的***。 
2、上述1所述的分离***的方法，其中在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括以下步骤：将所述***在不高于***膜脂转化成凝胶态的温度孵育。 
3、上述1所述的分离***的方法，其中在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括以下步骤：在使所述***膜脂维持于所述液相的温度孵育所述***。 
4、上述1所述的分离***的方法，其中在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，在约5℃至约25℃之间的温度孵育所述***。 
5、上述1所述的分离***的方法，其中所述温度选自约5℃、约6℃、 约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃。 
6、上述1所述的分离***的方法，其中所述哺乳动物选自牛、马、羊、猪、犬、猫、鹿、麋鹿或海洋动物。 
7、上述1所述的分离***的方法，其中所述哺乳动物包括牛，并且其中在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，将所述***于约17℃至约19℃之间的温度孵育。 
8、上述1所述的分离***的方法，其中所述哺乳动物包括牛，并且其中所述在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，将所述***于约17℃的温度孵育。 
9、上述1所述的分离***的方法，其中所述哺乳动物包括马，并且其中所述在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，将所述***于约15℃的温度孵育。 
10、上述1所述的分离***的方法，其中在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，将所述***在所述不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育约1小时至约18小时。 
11、上述1所述的分离***的方法，所述方法还包括以下步骤：在进行所述在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤过程中，将所述***从初始地点运输到第二地点。 
12、上述1所述的分离***的方法，所述方法还包括以下步骤：在所述在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤之前，向所述***加入抗菌药。 
13、上述1所述的分离***的方法，其中所述测定所述***中的大量***的***性质的步骤包括，测定所述***的性别特征。 
14、上述1所述的分离***的方法，其中所述基于所述***性质分离所述***的步骤包括，基于所述性别特征分离所述***。 
15、上述1所述的分离***的方法，该方法还包括以下步骤：用选自KMT或INRA96的稀释剂稀释***。 
16、上述1所述的分离***的方法，该方法还包括以下步骤：通过除去一部分***浆而浓缩所述***。 
17、上述1所述的分离***的方法，该方法还包括对所述***进行染色的步骤。 
18、上述17所述的分离***的方法，其中所述对所述***进行染色的步骤包括，对所述***内含有的DNA进行染色。 
19、上述18所述的分离***的方法，其中所述对所述***内含有的DNA进行染色的步骤包括，用Hoechst 33342染色剂对所述***内的DNA进行染色。 
20、上述19所述的分离***的方法，其中所述用Hoechst 33342染色剂对所述***内的所述DNA进行染色的步骤包括，将所述***与Hoechst 33342一起孵育约30分钟至约1小时。 
21、上述1所述的分离***的方法，其中所述基于所述***性质分离所述***的步骤包括，用选自流式细胞计数仪或细胞分选仪的仪器分离所述***。 
22、一种人工授精样品，该人工授精样品包括： 
a.人工授精装置； 
b.***稀释剂；及 
c.含有大量***的***，其来自于哺乳动物中的雄性动物，在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***1小时至18小时，其中基于性别特征分离所述的大量***，并且其中一部分所述分离后***被置于所述***稀释剂中，以及其中这部分置于所述***稀释剂中的所述分离后***容纳于所述人工授精装置中。 
23、上述22所述的人工授精样品，其中所述***稀释剂包含蛋黄稀释剂。 
24、上述22所述的人工授精样品，其中所述***稀释剂包含蛋黄-TRIS稀释剂。 
25、上述22所述的人工授精样品，其中所述***稀释剂包含基本等体积的所述蛋黄-TRIS稀释剂和蛋黄-TRIS稀释剂/12％甘油。 
26、上述23-25所述的人工授精样品，其中所述***稀释剂的体积为约0.1毫升至约2.0毫升。 
27、上述22所述的人工授精样品，其中所述人工授精装置包括人工授精管。 
28、上述22所述的人工授精样品，其中所述置于所述***稀释剂中的这部分所述分离后***包含1×105个分离后***至约25×106个分离后***。 
29、上述28所述的人工授精样品，其中容纳于所述人工授精装置中的、置于所述***稀释剂中的这部分所述分离***是冷冻的。 
30、上述29所述的人工授精样品，其中容纳于所述人工授精装置中的、冷冻于所述***稀释剂中的这部分所述分离后***是解冻的。 
31、一种生产人工授精样品的方法，该方法包括下列步骤： 
a.从哺乳动物中的雄性动物获取***，该***含有大量***； 
b.在不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***； 
c.测定所述大量***的性别特征； 
d.基于所述性别特征分离所述大量***；及 
e.建立包含分离后***的人工授精样品，所述分离后***具有使所述哺乳动物中的雌性动物体内的至少一个***受精的能力。 
32、给哺乳动物授精的方法，该方法包括下列步骤： 
a.从哺乳动物中的雄性动物获取***，该***含有大量***； 
b.将所述***在不高于***膜脂转化成凝胶态的温度孵育； 
c.测定所述大量***的性别特征； 
d.基于所述性别特征分离所述大量***； 
e.建立包含分离后***的人工授精样品，所述分离后***具有使所述哺乳动物的雌性动物体内的至少一个***受精的能力； 
f.将所述人工授精样品的一部分导入所述哺乳动物的雌性动物体内；及 
g.在所述哺乳动物的所述雌性动物体内使至少一个***受精。 
33、一种产生哺乳动物后代的方法，该方法包括下列步骤： 
a.从哺乳动物中的雄性动物获取***，该***含有大量***； 
b.将所述***在不高于***膜脂转化成凝胶态的温度孵育； 
c.测定所述大量***的性别特征； 
d.基于所述性别特征分离所述大量***； 
e.建立包含分离后***的人工授精样品，所述分离后***具有使所述哺乳动物的雌性动物体内的至少一个***受精的能力； 
f.将所述人工授精样品的一部分导入所述哺乳动物的雌性动物体内； 
g.在所述哺乳动物的所述雌性动物体内使至少一个***受精；及 
h.产生哺乳动物后代。 
附图说明
图1提供的图表显示，随染色剂浓度升高，***的总运动力及前进运动力下降，死亡***百分比(死亡％)增多，流式细胞计数技术将含有X染色体的***与含有Y染色体的***分辨开来的能力上升。 
图2提供的图表显示，与新鲜***样品和于室温储存一段时间如于室温储存18小时的***样品相比，在KMT中稀释的***保持更强的运动力。 
图3提供的图表显示，在更高pH下染色***可以降低染色后***样品中***的死亡百分比，并增加了用流式细胞计数分析法评价时的分辨率。 
图4提供的图表显示，将染色孵育时间从传统的60分钟减少到约30分钟的孵育时间可以提高染色后***样品中***的运动力，降低***的死亡百分比，并在流式分选染色***时提高将含有X染色体的***与含有Y染色体的***分离开来的分辨率。 
图5提供的图表显示，加入诸如咖啡因等刺激剂可以提高***的运动力。 
图6提供的图表显示使用NaH2PO4所制备的改良KMT时***的总运动力和前进运动力。 
图7提供的图表显示，无论***是否暴露于诸如咖啡因之类的刺激 剂，使用NaH2PO4所制备的改良KMT可以提高***的总运动力和前进运动力。 
图8提供的图表显示，在储存、处理、转移或运输时，可对取自哺乳动物中雄性动物的***的温度加以调节，以提高总运动力和前进运动力。 
图9提供的图表显示，在进行染色步骤前的转移、储存或处理时，可对***的温度加以调节，以提高***、经刺激的***或用咖啡因刺激的***的总运动力和前进运动力。 
图10提供的图表显示，在进行染色步骤前的转移、储存或处理时，可对***的温度加以调节，以提高染色步骤后的***、经刺激的***或用咖啡因刺激的***的总运动力和前进运动力。 
图11提供的图表显示，可通过于15℃储存或运输***，以使染色后***样品中的***死亡百分比下降。 
图12提供的图表显示，当***染色时的浓度约为100M/mL时，与浓度为200M/mL相比，能保持更多存活的***而不会降低流式细胞计数的分辨率。 
图13提供的图表显示，随着染色剂浓度的升高，存活的***较少而分辨率提高。 
图14提供的图表显示，可以大大缩短染色时间，而不会降低用流式细胞计数法进行评价时的含有X染色体的***类群与含有Y染色体的***类群间的分辨率。 
具体实施方式
本发明涉及***或***的处理***，该***可维持或增强***在采集、处理、储存、运输、分离或授精等各个过程中的生物学、化学、物理、生理或功能特性。 
实施例1 
从三匹具有合格生育力的公马收集***，在基于台氏液(Tyrode’s based)的脱脂乳-葡萄糖稀释剂中稀释到约25×106个***/mL，并在约5℃或约15℃下储存18小时。储存后，将***离心以除去***浆而将***浓缩，用Hoechst 33342(Hoechst)染色，采用SX 
Figure G200380017484701D00091
***分选仪根据DNA含量将其分选成含有X染色体的类群和含有Y染色体的类群。 
在所有授精过程中使用在体积为300μl中含有约20×106个流式分选后的***的最终剂量。使年龄为2～12岁的35匹母马的发情期同步。当母马的优势卵泡直径不小于35mm时施用人绒毛膜***(hCG，3000IU，iv(静脉注射)； 
Figure G200380017484701D00092
Intervet，Millsboro，DE，US)，并在施用hCG后约30小时进行授精。授精时，将母马分配到以下3个处理组之中的一个：1)***被储存于15℃，使用内镜录像技术进行授精；2)***被储存于5℃，也使用内镜录像技术授精；3)***被储存于5℃，使用直肠引导技术授精。 
在即将授精前给母马注射安定剂布托啡诺(4mg，iv； Ft.Dodge Co.，Fort Dodge，IA，US)和地托咪定(6mg，iv； Pfizer，Lees summit，MO，US)。每日评价母马的***情况，结果中只计入授精后48小时内***的母马。***后12至14天内超声波扫描测定妊娠。于***后第16天给母马施用***素F2α，并在随后两个周期内使用。 
如表1所示，用储存于15℃的分选的***进行子宫镜授精的母马其妊娠率约为72％，***储存于5℃则妊娠率约为55％。当用储存、分选的***授精时，与子宫镜授精(55％)相比，采用直肠引导技术授精时(38％)，妊娠的母马更少(P＝0.12)。 
表1.储存于5℃或15℃的流式分选***进行子宫镜授精或直肠引导授精后的妊娠率 
a，b同一栏内具有不同上标的值具有显著性差异(P＜0.05)。 
与分选前储存于5℃相比，用分选前储存于15℃的分选***授精后有更多的母马受孕。与分选前于5℃储存18小时相比，分选前于15℃储存18小时的所有公马***的生育力也与上述结果一致。 
采用以标准方法(5℃，12至72小时)运输的1×109个公马***授精后，预期的妊娠率为65％。本研究中所获得的妊娠率(72％)是很高的，与采用储存18小时、用常规技术流式分选的***所获得的妊娠率(35％)相比，它具有巨大进步。本研究中的生育力的提高可反映出进行流式细胞计数前的***处理的作用。若不是在实施本发明的两天中所有被授***马的妊娠率非常低，本研究中的妊娠率甚至会更高。 
子宫镜授精所得的妊娠率比子宫深部授精的妊娠率高。这与Rigby等所报道的结果相反，他们采用经过运输的***进行内镜录像授精与直肠引导授精，得到了相近的妊娠率。但是，他们的结果确实表明子宫镜授精具有12％的优势。与他们的研究相反，本试验使用流式分选的***，众所周知这样的***处于获能前的状态。总之，用储存18小时的流式分选***进行子宫镜授精获得了极好的妊娠率。 
对于全部三只公马，与保持在5℃相比，当***保持在15℃时，获得更高的妊娠率。用储存于15℃的***进行子宫镜授精比用储存于5℃的***进行直肠引导授精获得了更高的妊娠率。 
同样，本***处理***发明可包括：从哺乳动物中的雄性动物获取***；在给哺乳动物的雌性动物进行人工授精前，将所述取自哺乳动物中雄性动物的***维持于选自5℃至25℃的温度，从而使该哺乳动物中的雌性动物获得更高的妊娠率。对于马科动物尤其是所公开的马科动物来说，根据本发明，为了提高妊娠率，获自雄性马科动物的***的温度可维持于约10℃和约20℃之间，具体的说是约为15℃。参见下面涉及马科动物的应用的实施例。另外参见下面的实施例8，其显示了本发明的应用，其中取自雄性麋鹿的***在给雌性麋鹿授精前保持于约20℃。 
本***处理***发明还可包括，将取自哺乳动物的雄性动物的*** 维持在本发明的温度来进行运输。此类运输可具有短于一个小时的有限持续时间，或具有约1小时至约72小时之间的更长的持续时间，或如上所述可持续约18小时。 
本发明还可包括将如上所述取自哺乳动物中雄性动物的***染色的步骤，所述***已被维持于使此类哺乳动物的雌性动物产生最高妊娠率的温度。 
本发明还可包括哺乳动物的雌性动物的子宫镜人工授精或直肠引导的人工授精。具体地说，正如本文所引用的文献所述，在马科哺乳动物的子宫镜人工授精中，采用经过性别预选而分选的***，这种***可依据本发明进行处理，并且与通常用于给特定哺乳动物的雌性动物授精的***数量相比，还可包括更低数量的***，所述哺乳动物包括但不限于马科动物。 
实施例2 
分别在如表2所列四种经过运输的稀释剂中将来自8匹公马的***稀释到约25×106个***/mL。在模拟运输18小时的过程中，样品维持于环境温度(20℃～24℃)，而稀释于INRA96的***则储存于15℃。储存之后，将样品于600×g离心10分钟，并将沉淀稀释到400×106个***/mL。19℃～24℃孵育1小时后稀释到200×106个***/mL，***用224μM的Hoechst 33342于34℃染色1小时，然后用KMT稀释到100×106个***/mL。为了模拟分选条件，将***用不含BSA的HBGM-3稀释到700,000个***/mL，并且在环境温度下静置1.5小时，然后于850×g离心20分钟。如表2所示，评价四种化学环境中的运动力。 
表2.储存于四种不同运输介质中的样品中能动的***的百分比 
Figure G200380017484701D00111
a，b同一栏内无共同上标的值具有差异(P＜0.05)，Tukey检验。 
从表2所列数据可看出，KMT和INRA96在特定的***处理过程中保持了更高的运动力。 
本***处理***发明还可包括将取自哺乳动物的雄性动物的***在KMT中稀释的步骤，尤其是对于取自马科哺乳动物中雄性动物的***来说，KMT可以显著增强***的运动力。 
本***处理***发明还可包括将取自哺乳动物的雄性动物的***在INRA96中稀释的步骤，尤其是对于取自马科哺乳动物雄性动物的***来说，INRA96可以显著增强***的运动力。 
实施例3 
将8匹公马射出的***用KMT稀释到25×106个***/mL，将其分成40ml的等分，于5℃、10℃、15℃、20℃和25℃放置18小时。然后将样品按实施例2中的方法进行类似处理。评价有及没有2mM咖啡因作为刺激剂时的运动力。利用碘化丙啶染色进行死亡百分比的流式细胞计数评价。 
表3.在不同温度(℃)下18小时后能动***的百分比(无刺激/有刺激) 
Figure G200380017484701D00122
a，b，c同一栏内无共同上标的值具有差异(P＜0.05) 
如表3所示，就5℃、10℃或15℃的储存或运输温度来说，使用KMT可以缩小运动力的差异。 
同样，本***处理***发明还可包括将取自哺乳动物中雄性动物的***在所述浓度的KMT中稀释或保存的步骤，该步骤在用Hoechst染色剂对这些***染色之前及对这些***进行流式分选之前进行。 
实施例4 
首先评价3匹公马射出的***中的***的体积、浓度和运动力。***的余下部分用具有浓度为0％额外的***浆或10％***浆的KMT或EZMixin稀释到下列***/染色剂浓度：50×106个***/mL、2.6μl Hoechst；50×106个***/mL、3.9μl Hoechst；150×106个***/mL、7.8μl Hoechst；或450×106个***/mL、23.4μl Hoechst，然后立即处理或于室温储存18小时后进行处理。然后对染色的***样品用流式细胞计数分析评价分辨率和死亡百分比，进一步取20μl各染色***样品用140μl的EZ Mixin或KMT稀释。 
现主要参考图1，可以看出，随着染色剂浓度的升高，***尤其是马***的总运动力和前进运动力下降、***的死亡百分比升高、流式细胞计数技术将含有X染色体的***与含有Y染色体的***分开来的分辨率升高。 
本***处理***发明可包含一定范围的染色剂浓度，与取自特定种的***的常规技术中所用染色剂浓度范围或其他已公开的染色剂浓度范围相比，这些浓度使染色***的总运动力或前进运动力增强、使流式分选中含有X染色体的***与含有Y染色体的***分开来的分辨率增强或使死亡***百分比下降。尤其是对于本发明在马科动物方面的应用来说，所述浓度范围可介于约50×106个***/mL、2.6μl Hoechst和50×106个***/mL、3.9μl Hoechst之间，该浓度范围可使染色***的总运动力或前进运动力增强、使流式分选中含有X染色体的***与含有Y染色体的***分开来的分辨率增强或使死亡***百分比下降。染色剂浓度可介 于150×106个***/mL、7.8μl Hoechst和约450×106个***/mL、23.4μl Hoechst之间，尽管此时结果稍差。 
现主要参考图2，可以看出，对于新鲜***样品和于室温储存了一段时间(如于室温储存18小时)的***样品来说，稀释于KMT中的***保持了更好的运动力。 
本发明还可包括使用KMT作为稀释剂以增强以下类型的***的总运动力或前进运动力：新鲜***；储存了一段时间如18小时或更久的***；或是从初始地点转移或运输到第二地点或更多地点的***，所述的初始地点为例如从雄性哺乳动物获得***的地点，所述第二地点或更多地点为对从雄性哺乳动物处所获得***进行进一步处理的地点，所述处理为如***计数、分离含有X染色体的***与含有Y染色体的***，或制备含有***的产品，该制备过程包括但不限于制造用于人工授精的***(不论是否经过分选)管；或转移或运输到第二或更多地点，在所述第二或更多地点给哺乳动物的雌性动物进行授精、***体外授精等。 
实施例5 
首先评价3匹公马射出的***中的***的体积、浓度和运动力。各自***的余下部分用KMT稀释到25×106***/mL，然后于室温储存18小时。将储存的***于600g离心10分钟使之成为沉淀。将沉淀中的***重悬于含有Hoechst的KMT中以生成400×106个***/mL、12.4μlHoechst的***样品，调节到pH 7.1或pH 7.9，然后于34℃孵育30分钟或60分钟。将染色的***样品用以下稀释剂稀释：含1.5μl/mL 5％红色食用色素的1mL KMT；含2.0μl/mL 5％红色食用色素的1mL KMT；含2.5μl/mL 5％红色食用色素的1mL KMT或含3.0μl/mL 2％红色食用色素的1mL KMT。然后用流式细胞计数分析法评价死亡百分率和分辨率，将处理后的样品进一步在以下稀释剂中稀释以评价运动力：140μl KMT∶20μl***；140μl KMT+2mM咖啡因∶20μl***；或140μl KMT+2.5mM丙酮酸钠∶20μl***。 
表4.公马的影响 
  Gunsmoke   Rowdy   Sylekt
  死亡百分比(％)   15.5   16   17.13
  分辨率   5.81   4.5   5.88
  Gunsmoke   Rowdy   Sylekt
  运动力0小时   55   68.44   59.69
  前进运动力0小时   43.13   68.44   56.25
  运动力3小时-无   63.13   65.94   67.19
  运动力3小时-咖啡因   66.25   67.5   69.38
  运动力3小时-丙酮酸盐   62.19   67.19   65.94
  前进运动力3小时-无   55.94   65.94   63.75
  前进运动力3小时-咖啡因   63.13   67.5   69.06
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   56.56   67.19   63.13
表5.染色剂pH的影响 
  7.1   7.9
  死亡百分比(％)   17.25   15.17
  分辨率   5.58   5.21
  7.1   7.9
  运动力0小时   62.08   60
  前进运动力0小时   55.83   56.04
  运动力3小时-无   66.25   64.58
  运动力3小时-咖啡因   68.54   66.88
  运动力3小时-丙酮酸盐   65.83   64.38
  前进运动力3小时-无   62.29   61.46
  前进运动力3小时-咖啡因   67.5   65.63
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   63.13   61.46
表6.食物着色的影响 
  1.5   2   2.5  3
  死亡百分比(％)   16   16.33   16.17   16.33
  分辨率   5.33   5.25   5.5   5.5
  1.5   2   2.5   3
  运动力0小时   60.42   62.08   62.5   59.17
  前进运动力0小时   55.83   56.67   57.08   54.17
  运动力3小时-无   64.58   65.42   66.25   65.42
  运动力3小时-咖啡因   66.67   68.33   68.75   67.08
  运动力3小时-丙酮酸盐   64.58   65   65.83   65
  前进运动力3小时-无   61.67   61.67   62.92   61.25
  前进运动力3小时-咖啡因   65.42   67.5   67.92   65.42
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   62.08   60.83   64.58   61.67
表7.染色时间的影响(只有12个样品) 
  30分钟   60分钟
  死亡百分比(％)   14.83   16.17
  分辨率   4.92   5.5
  30分钟   60分钟
  运动力0小时   66.25   62.5
  前进运动力0小时   62.08   57.08
  运动力3小时-无   65.83   66.25
  运动力3小时-咖啡因   66.67   68.75
  运动力3小时-丙酮酸盐   64.58   65.83
  前进运动力3小时-无   62.08   62.92
  前进运动力3小时-咖啡因   65   67.92
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   60.42   64.58
表8.pH和染色时间 
  7.1   7.9
  30分钟   60分钟   30分钟   60分钟
  死亡百分比(％)   15.67   17   14   15.33
  分辨率   4.83   5.83   5   5.17
  7.1   7.9
  30分钟   60分钟   30分钟   60分钟
  运动力0小时   65.83   62.5   66.67   62.5
  前进运动力0小时   61.67   55.83   62.5   58.33
  运动力3小时-无   65.83   68.33   65.83   64.17
  运动力3小时-咖啡因   66.67   70   66.67   67.5
  运动力3小时-丙酮酸盐   64.17   67.5   65   64.17
  前进运动力3小时-无   63.33   64.17   60.83   61.67
  前进运动力3小时-咖啡因   65   70   65   65.83
  前进运动力3小时-丙酮酸盐   60.83   66.67   60   62.5
表9.运动力刺激剂 
  无   咖啡因   丙酮酸盐
 运动力3小时   65.42   67.71   65.1
 前进运动力3小时   61.88   66.56   62.29
现主要参考图3，可以获知，用流式细胞计数分析法进行评价，在更高的pH下对***染色可以减少的死亡***百分比。 
现主要参考图4，可以获知，将染色***的孵育时间从常规的60分钟降到30分钟可以降低死亡***的百分比，并可提高流式细胞计数时将含有X染色体的***与含有Y染色体的***分开来的分辨率。 
现主要参考图5，可以获知，加入刺激剂如浓度约为2mM的咖啡因可以刺激***的运动力，尤其是在刺激应激的马科动物***时特别有效。 
同样，本发明还可包括调节溶液的pH的步骤，在所述溶液中用荧光染料对取自哺乳动物的雄性动物的***进行染色，所述荧光染料例如Hoechst。染色溶液的pH可升至介于约pH 7.2和约pH 8.0之间，以选择特定***样品所需的pH，或在特定类型的染色***样品中使死亡百分比减少或最小的pH。具体地说，对于取自公马的***来说，染色溶液的 pH可以升至介于约pH 7.5至约pH 8.0之间，具体地说可以为pH 7.9，以减少染色的马科动物***样品中***的死亡百分比。 
本发明还可包括缩短***在染色溶液中孵育的时间的步骤，以减少染色***样品中的死亡百分比，或提高运动力，或在流式分选或其他基于DNA含量的分离时提高将含有X染色体的染色***与含有Y染色体的染色***分开来的分辨率。根据本发明不同的应用，***在染色溶液中暴露、孵育或悬浮的时间可以明显缩短。所述时间可比通常所用时间缩短10％、20％、30％、40％、50％，或更多；或可缩短到使***因荧光染料染色所致的死亡数量减少而在流式分选时分辨率未有明显下降；或可缩短到流式分选时分辨率提高而染色样品中的死亡***百分比无明显上升。例如，马科动物***样品在Hoechst(如上所述)染色溶液中孵育的时间可以介于约25分钟与约50分钟，具体的说可以是30分钟，以获得更好的流式分选分辨率或减少死亡***百分比。可以确定时间的实际缩短量，以在最接近的染色时间内使***群中的运动力、死亡***百分比和流式分选的分辨率之间保持所需的平衡。 
本发明还可包括在***样品中加入刺激剂的步骤。刺激剂可以是咖啡因，或是与咖啡咽类似的刺激剂，或是提高***运动力或其他***功能或性质的刺激剂，无论这些功能或性质是物理性的还是生理学的。刺激剂可以在***暴露于处理步骤之前或之后加入，所述处理步骤如储存、运输、稀释、流式分选、授精等等。具体地说，可以使用浓度介于约1mM至约5mM之间的咖啡因，具体地，就马科动物***来说可使用浓度为2mM的咖啡因。 
实施例6 
首先评价10匹公马射出的***的体积、***浓度和运动力。将各自***的余下部分在用Na2H2PO4KMT制备的KMT或用Na2H2PO4制备的KMT(改良的KMT)中稀释到25×106个***/mL，并于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃储存18小时。将处理后***的100μl等分液用100μl KMT或100μlKMT+4mM咖啡因稀释，然后测定***的运动力。各样品中处理后***的余 下部分于600g离心10分钟。吸出上清液，至约0.75mL，然后将沉淀的***重悬于该体积中。离心后取20μl各样品并用520μl KMT或520μlKMT+2mM咖啡因稀释，然后评价处理后***的运动力。 
将各处理组的200×106个***/mL，12.4μl Hoechst等分液调节到pH 7.1，于34℃孵育60分钟。染色的***样品用含1.5μl/mL 5％红色食用色素的1mL KMT稀释。然后通过在175μl染色***(100×106个***/mL)中加入3ml KMT或3ml改良的KMT及22ml 5mM HBGM-3制备高度稀释的样品。 
然后用流式细胞计数分析法测定处理后***样品的死亡百分比和分辨率，进一步将处理样品稀释于140μl KMT∶20μl***；或140μl KMT+2mM咖啡因∶20μl***中测定运动力。 
表10.公马的影响 
 运输后 (Pship)  离心后 (Pcent)   染色后  (Pstain)   高度稀释  (Hdil)   死亡百分比  (％dead)   分辨率  (resolution)
  A  63.3  52.5   44.5   47.5   22.8   5.7
  B  54.5  50.8   32.3   31.8   41.1   8.2
  C  68.8  62.8   55.6   44.1   21.4   6.2
  D  64.7  58.4   46.6   48.4   26.1   7.3
  E  65.3  57.8   48.8   45.5   21.6   5.2
  G  58.8  58   36.8   37   30.7   7
  H  58  51.5   48.5   46.5   25.2   8
  I  58  50   41.8   41.8   17.9   6.8
表11稀释剂的影响 
  运输后   离心后   染色后   高度稀释   死亡百分比   分辨率
 KMT   60.7   52.8   42.8   40.9   26.6   6.8
 改良的KMT   61.6   57.1   45.2   44.4   25.5   6.8
表12.运输温度的影响 
  运输后   离心后   染色后   高度稀释   死亡百分比   分辨率
  5   62.5   56.1   48.8   45   27.9   6.9
  10   62   58   47.5   44.7   26.4   6.8
  15   64.7   56.3   44.5   44.8   23.1   6.7
  20   59.2   53.6   42.2   41.4   23.3   6.6
  25   55.8   49.4   34.6   35.4   31.4   7.2
表13.运输后的运动力 
  总运动力  (Total)   前进运动力  (Prog.)   刺激剂  (Stim.)   T  Stim.Prog
  5   62.5   59.2   62.5   61.4
  10   62   58.9   63.3   61.9
  15   64.7   62.7   64.2   62.7
  20   59.2   59.1   62.3   61.1
  25   55.8   55   59   57.9
表14.离心后的运动力 
  总运动力   前进运动力   刺激剂   T      Stim.Prog
  5   56.1   55.6   56.3   55.2
  10   58   56.3   56.4   54.4
  15   56.3   56.1   53.6   52.2
  20   53.6   52.8   56.4   55.6
  25   49.4   48.5   52.7   51.9
表15.染色后的运动力 
  总运动力   前进运动力   Stim.，T   Stim.，   前进运动力
  5   48.8   48.6   49.1   49.1
  10   47.5   47.2   52   51.9
  15   44.5   44.5   51.4   51.3
  20   42.2   42.2   48.1   47.5
  25   34.6   34   42.7   42.7
表16.高度稀释后的运动力 
  总运动力   前进运动力   刺激剂   刺激剂，前进运动力百分比   (T Stim.，Prog)
  5   45   45   49.5   49.5
  10   44.7   44.1   49.5   48.9
  15   44.8   44.8   51.1   51.1
  20   41.4   40.5   46.9   46.9
  25   35.4   36.9   44.4   43.3
表17.死亡百分比和分辨率 
  死亡百分比   分辨率
  5   27.9   6.9
  10   26.4   6.8
  15   23.1   6.7
  20   23.3   6.6
  25   31.4   7.2
表18.KMT和改良的KMT，运输后的运动力 
  KMT  改良的KMT
  5   62.8  62.2
  10   61.9  62.2
  15   63.4  65.9
  20   57.8  60.6
  25   56.3  55.4
表19.KMT和改良的KMT，高度稀释中的运动力 
  KMT  改良的KMT
  5   42.8  47.2
  10   44.4  45
  15   43.1  46.6
  20   40  42.8
  25   31.7  39.2
表20.KMT和改良的KMT，死亡百分比 
  KMT  改良的KMT
  5   27.5  28.4
  10   26.4  26.5
  15   23.3  23
  20   23  23.6
  25   36.8  26
现主要参考图6，***的总运动力和前进运动力显示使用由NaH2PO4制备的改良的KMT的结果。 
现主要参考图7，可以获知，经过处理步骤(如用于流式分选的染色及稀释***)后，使用由NaH2PO4制备的改良的KMT时，无论***是否暴露于诸如咖啡因的刺激剂中，***的总运动力和前进运动力可能并不提高。 
现主要参考图8，可以获知，可以调节储存、处理、转移或运输取自哺乳动物的雄性动物的***的温度，以提高总运动力和前进运动力。 对于一些来自某些种哺乳动物的***来说，于约15℃储存、处理、转移或运输可以保持***或经刺激***的总运动力或前进运动力处于最高水平。 
现参考图9，可以获知，如上所述在进行染色过程之前可以对转移、储存或处理***的温度加以调节以提高***、经刺激***或用咖啡因刺激的***的总运动力或前进运动力。就本发明的某些实施方案来说，包括那些处理马科动物***的方案，介于约5℃至约20℃之间的储存、转移或运输温度可以提高***的总运动力和前进运动力。另外，对于根据本发明处理的经刺激***来说，包括那些本发明中用咖啡因刺激马科动物***的实施方案在内，介于约5℃至约20℃之间的处理、储存、转移或运输温度也可以提高总运动力和前进运动力。具体地说，本发明用于处理经刺激马科动物***的实施方案包括介于约10℃至约15℃之间的用于处理、储存或转移经刺激的马科动物***的温度。 
现参考图10，可以获知，如上所述在进行染色过程之前可以对转移、储存或处理***的温度加以调节，以提高在染色过程后***、经刺激的***或用咖啡因刺激的***的总运动力或前进运动力。就本发明的某些实施方案来说，包括那些处理马科动物***的方案，介于约5℃至约20℃之间的储存、转移或运输温度可以提高***的总运动力和前进运动力。另外，对于根据本发明处理的经刺激***来说，包括那些本发明中用咖啡因刺激马科动物***的实施方案在内，介于约5℃至约20℃之间的处理、储存、转移或运输温度也可以提高总运动力和前进运动力。具体地说，本发明用于处理经刺激的马科动物***的实施方案包括介于约10℃至约15℃之间的用于处理、储存或转移经刺激的马科动物***的温度。 
现参考图11，可以获知，通过将***于15℃储存或运输，可以降低在如上所述染色之后的***死亡百分比。 
实施例7 
首先评价12匹公马射出的***的体积、***浓度和运动力。将各***的余下部分于KMT中稀释到25×106个***/mL，并于15℃储存18小时。 将处理后***100μl等分液用100μl KMT+4mM咖啡因稀释，然后测定储存后的运动力。将各样品中处理后***的余下部分于600g离心10分钟。吸出上清液，至约1.50mL，然后将沉淀的***重悬于该体积中。将处理后***稀释至400×106个***/mL，并将各等分液转移到染色试管中以进行下列处理： 
1.200×106个***/mL，8.68μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
2.200×106个***/mL，10.54μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
3.200×106个***/mL，12.44μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
4.200×106个***/mL，8.68μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
5.200×106个***/mL，10.54μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
6.200×106个***/mL，12.44μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
7.100×106个***/mL，4.34μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
8.100×106个***/mL，5.27μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
9.100×106个***/mL，6.22μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育60分钟 
10.100×106个***/mL，4.34μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
11.100×106个***/mL，5.27μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
12.100×106个***/mL，6.22μl Hoechst pH 7.1，于34℃孵育30分钟 
将各染色***用含0.75μl/mL 5％红色食用色素的KMT稀释到75×106个***/mL。然后在234μl染色***样品(75×106个***/mL)中加入3ml KMT及22ml 5mM HBGM-3以制备高度稀释的样品。然后用流式细胞计数分析法评价各染色***样品的死亡百分比和分辨率，在KMT和KMT+2mM咖啡因中测定运动力。 
然后在234μl染色***样品(75×106个***/mL)中加入3ml KMT及22ml 5mM HBGM-3以制备高度稀释的样品，并于室温孵育约1.5小时。然后在KMT和KMT+4mM咖啡因中测定高度稀释的***样品的运动力。 
现主要参考图12，可以获知，当染色时***浓度为约100M/mL时，与200M/mL相比，***保持更好的存活力而未造成分辨率的丧失。 
本***处理***发明的某些实施方案还可包括将取自哺乳动物的雄性动物的***稀释到约75M/mL至200M/mL的步骤，以使***浓度下降、最小化，或使染色后样品中死亡百分比不会随***稀释程度进一步增加而降低。具体地说，对于本发明的某些实施方案来说，***的浓度可少于200M/mL，对于马科动物***来说可以约为100M/mL，以减少经上述染色过程后用流式细胞计数法评价的死亡百分比。 
现主要参考图13，可以获知，随着染色剂浓度的升高，存活的***更少，而分辨率升高。 
现主要参考图14，可以获知，可以大大缩短染色时间而不会造成用流式细胞计数法评价的含有X染色体的类群和含有Y染色体的类群之间分辨率下降。 
同样，本发明的实施方案还可包括以下步骤：降低上述染色过程中所用染色剂浓度，直至染色***样品中的死亡百分比不再进一步明显下降，还可包括以下步骤：降低所用染色剂浓度直至由含有X染色体***与含有Y染色体流式细胞的分辨率获得的分选***样品纯度低于60％；或低于必需或所需纯度百分比，如低于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％；或低于来自所述雄性哺乳动物的***所能达到的纯度；或低于以一定分选速度流式分选含有X 染色体类群及含有Y染色体类群之一或两者的纯度，所述分选速度不低于约500次分选/秒(sorts/sec)到约1000次分选/秒之间、约750次分选/秒到约1250次分选/秒之间、约1000次分选/秒到约1500次分选/秒之间、约1250次分选/秒到约1750次分选/秒之间、约1500次分选/秒到约2000次分选/秒之间、约1750次分选/秒到约2250次分选/秒之间、约2000次分选/秒到约2500次分选/秒之间、约2250次分选/秒到约2750次分选/秒之间、约2500次分选/秒到约3000次分选/秒之间、约2750次分选/秒到约3250次分选/秒之间、约3000次分选/秒到约3500次分选/秒之间、约3250次分选/秒到约3750次分选/秒之间、约3500次分选/秒到约4000次分选/秒之间、约3750次分选/秒到约4250次分选/秒之间、约4000次分选/秒到约4500次分选/秒之间、约4250次分选/秒到约4750次分选/秒之间、约4500次分选/秒到约5000次分选/秒之间。 
实施例8用经过性别分选的冷冻***给母麋鹿授精 
将科罗拉多州和明尼苏达州的年龄为3～6岁的母麋鹿，在9月份通过将孕酮CIDR(含有孕酮并缓慢释放的***栓)植入***12～14天以使它们发情期同步。移去CIDR后，给麋鹿肌肉内施用200IU的eCG，在60小时后使其同步授精。通过电刺激***从5岁大的公麋鹿收集新鲜的***，缓慢冷却4小时以上，直到约20℃，以纯***液运输到***分选试验室。将1.5ml等分液于15,000×g离心10秒，使***液浓缩到1×109个***/mL用于染色。将***于112μM Hoechst 33342中，在TALP液中的浓度为200×106个***/mL的条件下，于34℃孵育45分钟，然后稀释到100×106个***/mL用于分选。以含有X及Y染色体的***其DNA含量不同为基础分选***。含有X染色体的麋鹿***DNA含量比含有Y染色体的麋鹿***DNA含量多3.8％。使用 
Figure G200380017484701D00261
SX，以50psi操作，使用基于TRIS的鞘液，对***进行4小时以上的流式分选。发射功率为150mW的氩光的351及364波段激发了与DNA结合的Hoechst 33342染色剂。收集含有X染色体和含有Y染色体的***(通过对声波降解***等分液进行DNA重分析，验证其纯度约为92％)，将之以约4700个***/秒的速度收集到含2ml 20％蛋黄-TRIS稀释液的试管中。连续收集15ml的分选体积。对于每一性别，分选得到约110×106个***，冷却90分钟以上使之达到5℃。于5℃将等体积含甘油(12％)的稀释剂加到分选好的体积中。通过将含30ml的分选***等分液于4℃以850×g离心20分钟，进行浓缩。汇集***沉淀，调节到21.7×106个***/mL，并装到0.25ml的管内。每一管均含总量为5×106的***，将其在液氮气中冷冻。作为对照，同时将来自相同***液的总量为5×106个***象经过性别分选的***一样在0.25ml的管中冷冻。于37℃解冻30秒后，通过视觉估计，分别有65％和60％的***(对照和有性别)具有前进运动力。用常规的经颈***子宫体内沉积法，对三匹来自不同地方及不同饲养条件的母麋鹿进行授精。授精后40天，通过检测血液中妊娠特异性的蛋白B(Bio Tracking，Moscow，Idaho)来确定妊娠情况。位于一个地方的10匹母麋鹿授精时状态不好，用经过性别分选的或对照***均未能妊娠。其他地方的有性别***妊娠率(61％，11/18)与对照授精者(50％，3/6)类似。这些妊娠率(经过性别分选的和对照)是使用比正常麋鹿人工授精所用***更少的***所获得的。11只用经过性别分选的***得到的小仔中的9只(82％)为预期的性别。 
本发明还可包括根据本发明上述任意实施方案产生的哺乳动物；或可包括根据本发明各种实施方案产生的预定性别的哺乳动物，所述实施方案提供了***授精样品，这些样品含有富含X染色体***或富含Y染色体***的群体；或包括根据本发明任意实施方案产生的哺乳动物，在所述实施方案中含有比特定哺乳动物的授精常用***数量要少的***授精样品；或包括根据如上所述本发明而产生的麋鹿子代。 
正如可以很容易地从前文所理解一样，本发明的基本思想可用不同途径具体实施。本发明涉及***处理***，该***包括进行***处理的技术及装置。在此申请中，通过公开所述各种装置所得结果的一部分和固有使用步骤而公开了各种细胞处理技术。它们仅仅是利用预期的所述装置的自然结果。另外，尽管公开了一部分装置，但是应该理解，这些装置不仅完成了某些方法，它们也可以多种方式加以改变。重要的是应当理解，对于所有的前述内容，本公开包含了所有的上述方面。 
这份非临时申请中所包括的讨论的目的是提供基本的描述。读者应知道，具体的讨论可能并非明确地描述所有可能的实施方案，许多替代选择是隐含的。它可能没有充分地解释本发明的普遍性质，也可能没有明确地显示各个性质或件实际上如何代表大量不同功能或大量替代方案或等同元件。同样，这些也隐含地包括在本公开内容中。当以装置术语的角度描述本发明时，装置的每一元件隐含地执行一种功能。装置权利要求不仅可包括所述的装置，还可包括实现本发明的功能或每一元件执行的功能的方法或过程的权利要求。描述及术语均非意在限制权利要求的范围。 
而且，本发明及权利要求的每一不同元件还可以多种方式获得。本公开内容应理解为包括每一个这样的变化，不论它是任意装置实施方案、方法或过程实施方案的变更，还是甚至仅仅是其中任意元件的变更。特别是，应该理解，由于本公开内容涉及本发明的元件，每一元件的文字可以用等同的装置术语或方法术语来表达——甚至仅仅是其具有相同的功能或结果。应认为这些等同的、更广泛的甚至是更上位的术语包含于各元件或动作的描述中。当需要使本发明所包括的隐含的广泛范围明确时，这些术语可加以替换。仅举一个例子来说，应该理解的，是所有的动作均可以用执行该动作的装置或促使产生该动作的元件来表达。类似地，每一公开的物理元件应理解为包含了对所述物理元件执行的动作的公开。就此最后一方面来说，仅举一个例子，“流式分选仪”的公开内容应理解为包含了“流式分选”动作的公开内容，无论其是否明确讨论过；反过来说，当有“流式分选”动作的有效公开时，这样的公开内容应理解为包括了“流式分选仪”，甚至包括了“流式分选方式”的公开。这些变化及替代术语应理解为明确包括在说明书内。 
本专利申请中提及的任何法律、法令、规章或准则的条款，或此专利申请中提及的专利、出版物或其他参考文献均以参考的方式引入本文。另外，对于所用的每一术语，应当理解，除非其在本申请中的应用与通用词典中的解释不一致，否则应当认为，本文引入了通用词典中对各条术语的定义。在此以参考的方式引入例如Random House Webster’s UnabridgedDictionary(《兰登书屋韦氏大词典》)第二版的所有定义、替代术语和同 义词。 
因此，应理解为申请人至少要求如下：i)本文所公开和描述的各***处理装置；ii)所公开和描述的相关方法；iii)这些装置和方法的类似、等同甚至是隐含的变化；iv)完成公开和描述的所示功能的替代设计；v)完成每一所示功能的替代设计和方法，其为隐含的完成所公开和描述的功能的替代设计和方法；vi)作为分开的和独立的发明所示的每一性质、元件及步骤；vii)由所公开的不同***或组分改进的申请；viii)由此类***或元件所生成的终末产品；以及ix)基本在上文和参考任何所附实施例所描述的方法和装置，X)所公开元件的各种组合及排列，及xi)作为所述独立权利要求或概念中的每一从属的各潜在从属权利要求或概念，以及提供的所述的各项独立权利要求或概念。就这点上，应理解的是出于实际的原因及为了避免增加数以百计权利要求的可能性，申请人可最终仅提交具有最初的从属权利要求的权利要求。应当理解的是，应当达到有关发明创造的法规(new matter laws)所要求的支持程度，以便能够在一项独立权利要求或概念之下增加任何不同的从属权利要求或其他要素，作为任何其他独立权利要求或概念的从属权利要求或要素，上述法规包括但不限于《欧洲专利公约》第123(2)条款和美国专利法35 USC 132或其他此类法律。而且，如果使用或当使用表示转接关系的措词“包含”时，根据习惯上对权利要求的解释，使用该词是为了保持本文权利要求为“开放式”。因此，除非上下文需要，术语“包含”或诸如“包括“或“含有”等变化形式应理解为，它们意指包括所声明的要素或步骤或一组要素或步骤，而不排除任何其他的要素或步骤或一组要素或步骤。这样的术语应以其最广泛的形式来解释，以使申请人获得法律许可的最广泛的范围。 

Claims (17)

1.一种分离***的方法，该方法包括：
a.从非人类哺乳动物中的雄性动物获取***，该***含有大量***；
b.在10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***；
c.测定所述大量***的性别特征；
d.基于所述***的性别特征分离所述***；及
e.收集分离的***。
2.如权利要求1中所述分离***的方法，其中在10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括以下步骤：在使所述***膜脂维持于所述液相的温度孵育所述***。
3.如权利要求1中所述分离***的方法，其中所述温度选自10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃。
4.如权利要求1中所述分离***的方法，其中所述非人类哺乳动物选自牛、马、羊、猪、犬、猫、鹿、麋鹿或海洋动物。
5.如权利要求1中所述分离***的方法，其中所述非人类哺乳动物包括牛，并且其中在10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，将所述***于17℃至19℃之间的温度孵育。
6.如权利要求1中所述分离***的方法，其中所述非人类哺乳动物包括牛，并且其中所述在10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，将所述***于17℃的温度孵育。
7.如权利要求1中所述分离***的方法，其中所述非人类哺乳动物包括马，并且其中所述在10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，将所述***于15℃的温度孵育。
8.如权利要求1中所述分离***的方法，其中在10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤包括，将所述***在所述10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育1小时至18小时。
9.如权利要求1中所述分离***的方法，所述方法还包括以下步骤：在进行所述在10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤过程中，将所述***从初始地点运输到第二地点。
10.如权利要求1中所述分离***的方法，所述方法还包括以下步骤：在所述在10℃至20℃之间的不高于***膜脂从液相转化成凝胶态的温度孵育所述***的步骤之前，向所述***加入抗菌药。
11.如权利要求1中所述分离***的方法，该方法还包括以下步骤：用选自KMT或INRA96的稀释剂稀释***。
12.如权利要求1中所述分离***的方法，该方法还包括以下步骤：通过除去一部分***浆而浓缩所述***。
13.如权利要求1中所述分离***的方法，该方法还包括对所述***进行染色的步骤。
14.如权利要求13中所述分离***的方法，其中所述对所述***进行染色的步骤包括，对所述***内含有的DNA进行染色。
15.如权利要求14中所述分离***的方法，其中所述对所述***内含有的DNA进行染色的步骤包括，用Hoechst 33342染色剂对所述***内的DNA进行染色。
16.如权利要求15中所述分离***的方法，其中所述用Hoechst33342染色剂对所述***内的所述DNA进行染色的步骤包括，将所述***与Hoechst 33342一起孵育30分钟至1小时。
17.如权利要求1中所述分离***的方法，其中所述基于所述***性别特征分离所述***的步骤包括，用选自流式细胞计数仪或细胞分选仪的仪器分离所述***。
CN038174847A 2002-07-22 2003-07-22 ***处理*** Expired - Lifetime CN1787739B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40048602P 2002-07-22 2002-07-22
US60/400,486 2002-07-22
PCT/US2003/022906 WO2004009237A2 (en) 2002-07-22 2003-07-22 Sperm cell process system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1787739A CN1787739A (zh) 2006-06-14
CN1787739B true CN1787739B (zh) 2011-03-30

Family

ID=30771235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN038174847A Expired - Lifetime CN1787739B (zh) 2002-07-22 2003-07-22 ***处理***

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20060067916A1 (zh)
EP (2) EP1542529A4 (zh)
JP (2) JP2005533501A (zh)
CN (1) CN1787739B (zh)
AU (1) AU2003259205B2 (zh)
BR (2) BRPI0312843B1 (zh)
CA (1) CA2531176C (zh)
MX (1) MXPA05000865A (zh)
NZ (1) NZ538265A (zh)
WO (1) WO2004009237A2 (zh)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69830598T2 (de) 1997-01-31 2006-05-18 The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Limited Optische vorrichtung und methode
US6149867A (en) 1997-12-31 2000-11-21 Xy, Inc. Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm
US7208265B1 (en) 1999-11-24 2007-04-24 Xy, Inc. Method of cryopreserving selected sperm cells
EP2258172B1 (en) 2000-05-09 2017-04-19 Xy, Llc Flow cytometer for diffentiating x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations of spermatozoa
US7713687B2 (en) 2000-11-29 2010-05-11 Xy, Inc. System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations
BRPI0115791B1 (pt) 2000-11-29 2020-05-05 Colorado State Univ sistema para fertilização in vitro com espematozóides separados em populações portadoras de cromossoma x e cromossoma y
US8486618B2 (en) 2002-08-01 2013-07-16 Xy, Llc Heterogeneous inseminate system
EP1545203B1 (en) 2002-08-01 2016-10-19 Xy, Llc Low pressure sperm cell separation system
WO2004017041A2 (en) 2002-08-15 2004-02-26 Xy, Inc. High resolution flow cytometer
US7169548B2 (en) 2002-09-13 2007-01-30 Xy, Inc. Sperm cell processing and preservation systems
EP2305172B1 (en) 2003-03-28 2016-05-11 Inguran, LLC Apparatus and methods for providing sex-sorted animal sperm
CA2566749C (en) * 2003-05-15 2017-02-21 Xy, Inc. Efficient haploid cell sorting for flow cytometer systems
EP2151243B1 (en) 2004-03-29 2012-10-24 Inguran, LLC Sperm suspensions for sorting into X or Y chromosome-bearing enriched populations
CN101238369B (zh) 2004-03-29 2012-07-04 英格朗公司 调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物在***染色或分选方法中的用途
WO2006012597A2 (en) 2004-07-22 2006-02-02 Monsanto Technology Llc Process for enriching a population of sperm cells
CN101322489B (zh) * 2008-08-01 2011-11-30 内蒙古蒙牛繁育生物技术有限公司 一种鹿x/y***分离冷冻***及其生产方法和应用
CN101671651B (zh) * 2008-09-09 2013-05-29 上海交通大学医学院附属第九人民医院 ***的冷冻和解冻方法及***的冷冻和解冻装置
KR101005022B1 (ko) * 2009-05-22 2010-12-30 한국화학융합시험연구원 실험동물의 정액 채취 방법 및 이를 이용한 인공수정 방법
CN102812123A (zh) * 2010-04-01 2012-12-05 英格朗公司 减少经处理的***样品中的dna断裂的方法和***
EP2556146A4 (en) * 2010-04-01 2013-08-14 Inguran Llc METHOD AND SYSTEMS FOR REDUCING DNA FRAGMENTATION IN A PROCESSED SPERM PROBE
WO2013049631A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Inguran, Llc Sperm staining and sorting methods
EP3492603B1 (en) * 2012-10-05 2022-07-20 Inguran, LLC Methods of processing sperm for sex sorting
US10620213B2 (en) 2012-10-05 2020-04-14 Inguran, Llc High pressure sperm sorting and flow cytometer methods
CN104630137B (zh) * 2015-01-26 2017-10-20 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种猪icsi操作的方法
US9957548B2 (en) 2015-03-30 2018-05-01 General Electric Company Methods of capturing sperm nucleic acids
US10030241B2 (en) 2015-03-30 2018-07-24 General Electric Company Methods and kits for capturing sperm nucleic acids
CN105325401B (zh) * 2015-11-10 2017-12-12 天津市畜牧兽医研究所 一种猪鲜精保存长效稀释粉及制备方法与应用
CN106070184A (zh) * 2016-05-31 2016-11-09 山东鑫基牧业有限公司 一种猪***的冷冻和解冻方法
CN105850985A (zh) * 2016-05-31 2016-08-17 山东鑫基牧业有限公司 一种猪冷冻***稀释粉
MX2020005905A (es) * 2017-11-10 2020-10-22 Cytolutions Llc Sistemas de separación masiva de esperma sexado.

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5135759A (en) * 1989-05-10 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method to preselect the sex of offspring
US6071689A (en) * 1997-12-31 2000-06-06 Xy, Inc. System for improving yield of sexed embryos in mammals
CN1306805A (zh) * 2000-02-01 2001-08-08 杨承权 牛x、y***流动分离法
CN1306881A (zh) * 2000-02-01 2001-08-08 杨承权 马、驴x、y***流动分离法
CN1443519A (zh) * 2002-03-11 2003-09-24 刘凤鸣 一种动物***的性别分选方法

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US34782A (en) * 1862-03-25 Improvement in lamps
US1545498A (en) 1924-05-16 1925-07-14 Chemical Products Corp Method of cleaning steel and imparting rust-inhibitive properties thereto and solution therefor
US3788744A (en) * 1970-01-14 1974-01-29 Bio Physics Systems Inc Method and apparatus for photoanalysis
US3791384A (en) * 1971-07-15 1974-02-12 Schaumann H Artificial insemination of sows
US3791517A (en) * 1973-03-05 1974-02-12 Bio Physics Systems Inc Digital fluidic amplifier particle sorter
US4009260A (en) * 1973-04-19 1977-02-22 Schering Aktiengesellschaft Fractionation of sperm
US3944917A (en) * 1973-08-13 1976-03-16 Coulter Electronics, Inc. Electrical sensing circuitry for particle analyzing device
US4083957A (en) * 1974-07-26 1978-04-11 Lang John L Process for the alteration of the sex-ratio of mammals
US4006360A (en) * 1974-08-21 1977-02-01 Block Engineering, Inc. Method of discriminating between dyed particles and background fluorescence of the dye
US3976197A (en) * 1974-11-22 1976-08-24 Bhattacharya Bhairab C Thermal convection counter streaming sedimentation method and apparatus for controlling the sex of mammalian offspring
US4007087A (en) * 1975-10-17 1977-02-08 Gametrics Limited Sperm fractionation and storage
AU2154077A (en) * 1976-01-27 1978-07-27 Univ Edinburgh Control of sex ratio in mammalian offspring
JPS5319891A (en) * 1976-06-10 1978-02-23 Coulter Electronics Method and apparatus for folling drop formation and separation
US4191749A (en) * 1977-10-11 1980-03-04 Bryant Bernard J Method and material for increasing the percentage of mammalian offspring of either sex
US4189236A (en) * 1978-03-20 1980-02-19 Coulter Electronics, Inc. Ellipsoid-conic radiation collector and method
US4263508A (en) * 1979-04-20 1981-04-21 Research Corporation Pulse edge measurement for determining particle dimensional characteristics
US4367043A (en) * 1980-05-05 1983-01-04 Leland Stanford Junior University Method and means for delivering liquid samples to a sample scanning device
US4511661A (en) * 1982-03-19 1985-04-16 University Patents, Inc. ATCC HB8116 And its monoclonal anti-H-Y antibody, Hyclonalan
EP0112188B1 (en) * 1982-12-21 1987-06-16 Crosfield Electronics Limited Light beam-splitter
US4492436A (en) * 1983-01-03 1985-01-08 At&T Bell Laboratories Polarization independent beam splitter
US4585736A (en) * 1983-10-18 1986-04-29 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Flow cytometric measurement of total DNA and incorporated halodeoxyuridine
US4573796A (en) * 1984-01-06 1986-03-04 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Apparatus for eliminating background interference in fluorescence measurements
US4660971A (en) * 1984-05-03 1987-04-28 Becton, Dickinson And Company Optical features of flow cytometry apparatus
US4661913A (en) * 1984-09-11 1987-04-28 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for the detection and classification of articles using flow cytometry techniques
NO156917C (no) * 1985-07-16 1987-12-16 Harald B Steen Anordning for maaling av biologiske cellers lysspredning i vaeskestroemsfotometere.
US4989977A (en) * 1985-07-29 1991-02-05 Becton, Dickinson And Company Flow cytometry apparatus with improved light beam adjustment
US4999283A (en) * 1986-01-10 1991-03-12 University Of Kentucky Research Foundation Method for x and y spermatozoa separation
US4796788A (en) * 1987-08-26 1989-01-10 Liqui-Box Corporation Bag-in-box packaging and dispensing of substances which will not readily flow by gravity
US5712807A (en) * 1987-10-21 1998-01-27 Bangham; James Andrew Pulse analyzing method and apparatus
GB8726304D0 (en) * 1987-11-10 1987-12-16 Secr Defence Particle asymmetry analyser
US4988619A (en) * 1987-11-30 1991-01-29 United States Department Of Energy Flow cytometry apparatus
US5726009A (en) * 1989-03-20 1998-03-10 Anticancer, Inc. Native-state method and system for determining viability and proliferative capacity of tissues in vitro
US5275787A (en) * 1989-10-04 1994-01-04 Canon Kabushiki Kaisha Apparatus for separating or measuring particles to be examined in a sample fluid
EP0448931B1 (en) * 1990-01-26 1996-04-03 Canon Kabushiki Kaisha Method for measuring a specimen by the use of fluorescence light
US5492534A (en) * 1990-04-02 1996-02-20 Pharmetrix Corporation Controlled release portable pump
US5087295A (en) * 1990-06-13 1992-02-11 Becton Dickinson And Company Cleaning cycle for flow cytometers
US5204884A (en) * 1991-03-18 1993-04-20 University Of Rochester System for high-speed measurement and sorting of particles
US5488469A (en) * 1991-08-30 1996-01-30 Omron Corporation Cell analyzing apparatus
US5866344A (en) * 1991-11-15 1999-02-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody selection methods using cell surface expressed libraries
US5400179A (en) * 1992-02-18 1995-03-21 Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha Optical multilayer thin film and beam splitter
US5395588A (en) * 1992-12-14 1995-03-07 Becton Dickinson And Company Control of flow cytometer having vacuum fluidics
NO932088L (no) * 1993-06-08 1995-01-05 Oddbjoern Gjelsnes Anordning for anvendelse ved væskeströmscytometri
US5483469A (en) * 1993-08-02 1996-01-09 The Regents Of The University Of California Multiple sort flow cytometer
US5601234A (en) * 1994-08-01 1997-02-11 Abbott Laboratories Fluid nozzle and method of introducing a fluid
US5602039A (en) * 1994-10-14 1997-02-11 The University Of Washington Flow cytometer jet monitor system
US5602349A (en) * 1994-10-14 1997-02-11 The University Of Washington Sample introduction system for a flow cytometer
US6861265B1 (en) * 1994-10-14 2005-03-01 University Of Washington Flow cytometer droplet formation system
US5495719A (en) * 1994-11-14 1996-03-05 Gray, Jr.; Carl O. Method of preserving spermatozoa
JP3347495B2 (ja) * 1994-11-14 2002-11-20 シスメックス株式会社 粒子分析装置
US5608519A (en) * 1995-03-20 1997-03-04 Gourley; Paul L. Laser apparatus and method for microscopic and spectroscopic analysis and processing of biological cells
US5620842A (en) * 1995-03-29 1997-04-15 Becton Dickinson And Company Determination of the number of fluorescent molecules on calibration beads for flow cytometry
FR2734637B1 (fr) * 1995-05-24 1997-08-14 Abx Sa Dispositif d'inspection optique d'un fluide, notamment pour analyses hematologiques
US5726751A (en) * 1995-09-27 1998-03-10 University Of Washington Silicon microchannel optical flow cytometer
US5736330A (en) * 1995-10-11 1998-04-07 Luminex Corporation Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences
BR9600722A (pt) * 1996-02-14 1997-12-30 Jorge Antonio Rodrigues Claro Bomba de infusão para contidos em bolsas plásticas flexíveis
ATE357663T1 (de) * 1996-04-25 2007-04-15 Genicon Sciences Corp Teilchenförmiges markierungsmittel verwendendes analytassay
US6042249A (en) * 1996-07-30 2000-03-28 Bayer Corporation Illuminator optical assembly for an analytical instrument and methods of alignment and manufacture
US5883378A (en) * 1996-07-30 1999-03-16 Bayer Corporation Apparatus and methods for transmitting electrical signals indicative of optical interactions between a light beam and a flowing suspension of particles
US5745308A (en) * 1996-07-30 1998-04-28 Bayer Corporation Methods and apparatus for an optical illuminator assembly and its alignment
US5719667A (en) * 1996-07-30 1998-02-17 Bayer Corporation Apparatus for filtering a laser beam in an analytical instrument
US5872627A (en) * 1996-07-30 1999-02-16 Bayer Corporation Method and apparatus for detecting scattered light in an analytical instrument
US6221654B1 (en) * 1996-09-25 2001-04-24 California Institute Of Technology Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size
US6514722B2 (en) * 1997-03-27 2003-02-04 Oncosis Method and apparatus for selectively targeting specific cells within a cell population
US5874266A (en) * 1997-03-27 1999-02-23 Palsson; Bernhard O. Targeted system for removing tumor cells from cell populations
US5880474A (en) * 1997-08-29 1999-03-09 Becton Dickinson And Company Multi-illumination-source flow particle analyzer with inter-location emissions crosstalk cancelation
US6395305B1 (en) * 1997-09-22 2002-05-28 University Of Guelph Reduction of sperm sensitivity to chilling
EP1036371A4 (en) * 1997-11-19 2003-01-08 Univ Washington HIGH-THROUGHPUT OPTICAL SCANNER
US6207392B1 (en) * 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
WO1999031488A1 (en) * 1997-12-12 1999-06-24 Chemunex S.A. Digital flow cytometer
US6149867A (en) * 1997-12-31 2000-11-21 Xy, Inc. Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm
US6211477B1 (en) * 1998-02-26 2001-04-03 Becton Dickinson And Company Electrostatic deceleration system for flow cytometer
US6208411B1 (en) * 1998-09-28 2001-03-27 Kla-Tencor Corporation Massively parallel inspection and imaging system
US6707555B1 (en) * 1998-10-15 2004-03-16 Sysmex Corporation Optical information measuring apparatus
US6150119A (en) * 1999-01-19 2000-11-21 Caliper Technologies Corp. Optimized high-throughput analytical system
US6323632B1 (en) * 1999-08-13 2001-11-27 Coulter International Corp. Solid state RF oscillator-detector for flow cytometer
US6193647B1 (en) * 1999-04-08 2001-02-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Microfluidic embryo and/or oocyte handling device and method
FR2793495B1 (fr) * 1999-05-14 2001-08-10 Imv Technologies Dilueur pour la cryoconservation de spermatozoides de bovins
US6372506B1 (en) * 1999-07-02 2002-04-16 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for verifying drop delay in a flow cytometer
US7208265B1 (en) * 1999-11-24 2007-04-24 Xy, Inc. Method of cryopreserving selected sperm cells
US6700130B2 (en) * 2001-06-29 2004-03-02 Honeywell International Inc. Optical detection system for flow cytometry
US6503698B1 (en) * 2000-06-16 2003-01-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Cryopreservation of swine embryos
JP2004537712A (ja) * 2000-10-18 2004-12-16 バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド 多重細胞分析システム
US20040034879A1 (en) * 2000-11-09 2004-02-19 Steve Rothstein Mammalian sex selection using genetic modification
AU1980202A (en) * 2000-11-22 2002-06-03 Pharmacia Corporation Methods and apparatus for producing gender enriched sperm
US6849423B2 (en) * 2000-11-29 2005-02-01 Picoliter Inc Focused acoustics for detection and sorting of fluid volumes
US7713687B2 (en) * 2000-11-29 2010-05-11 Xy, Inc. System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations
US7029916B2 (en) * 2001-02-21 2006-04-18 Maxcyte, Inc. Apparatus and method for flow electroporation of biological samples
CA2440592C (en) * 2001-03-12 2012-05-15 The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon Oxidation-reduction sensitive green fluorescent protein variants
US6706163B2 (en) * 2001-03-21 2004-03-16 Michael Seul On-chip analysis of particles and fractionation of particle mixtures using light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
EP1245944B1 (en) * 2001-03-29 2007-02-14 Sysmex Corporation Flow cytometer
US20020148992A1 (en) * 2001-04-03 2002-10-17 Hayenga Jon W. Pneumatic valve interface for use in microfluidic structures
US20030048433A1 (en) * 2001-06-01 2003-03-13 Jean-Marie Desjonqueres Cytometer signal processing system and method
DE10151216A1 (de) * 2001-10-16 2003-04-24 Zeiss Carl Jena Gmbh Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen einer beleuchteten Probe
US6698627B2 (en) * 2002-02-19 2004-03-02 Valois S.A.S. Fluid dispenser
US6849394B2 (en) * 2002-02-21 2005-02-01 Minitube Of America Compositions comprising reproductive cell media and methods for using such compositions
US20050011582A1 (en) * 2003-06-06 2005-01-20 Haug Jeffrey S. Fluid delivery system for a flow cytometer
US7591064B2 (en) * 2005-07-20 2009-09-22 Hitachi Global Storage Technologies Netherlands B.V. Method of fabrication for tape medium read head with unitary formation of multiple elements
US7618770B2 (en) * 2005-07-29 2009-11-17 Xy, Inc. Methods and apparatus for reducing protein content in sperm cell extenders
EP2415640B1 (de) 2010-08-03 2013-02-13 SMR Patents S.à.r.l. Außenrückspiegel und Verfahren zu dessen Montage
US9917165B2 (en) 2015-05-15 2018-03-13 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Memory cell structure for improving erase speed

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5135759A (en) * 1989-05-10 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method to preselect the sex of offspring
US6071689A (en) * 1997-12-31 2000-06-06 Xy, Inc. System for improving yield of sexed embryos in mammals
CN1306805A (zh) * 2000-02-01 2001-08-08 杨承权 牛x、y***流动分离法
CN1306881A (zh) * 2000-02-01 2001-08-08 杨承权 马、驴x、y***流动分离法
CN1443519A (zh) * 2002-03-11 2003-09-24 刘凤鸣 一种动物***的性别分选方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张光勤，李建民.哺乳动物XY***分离技术的研究进展.河南农业大学学报36 2.2002,36(2),168-171.
张光勤,李建民.哺乳动物XY***分离技术的研究进展.河南农业大学学报36 2.2002,36(2),168-171. *
胡明信，吴学清.哺乳动物性别控制研究进展.中国兽医学报17 5.1997,17(5),517-520.
胡明信,吴学清.哺乳动物性别控制研究进展.中国兽医学报17 5.1997,17(5),517-520. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004009237A3 (en) 2004-04-22
US20060067916A1 (en) 2006-03-30
CN1787739A (zh) 2006-06-14
JP2011250793A (ja) 2011-12-15
EP2301333A1 (en) 2011-03-30
AU2003259205B2 (en) 2009-10-08
AU2003259205A1 (en) 2004-02-09
EP1542529A4 (en) 2006-08-09
EP1542529A2 (en) 2005-06-22
BR0312843A (pt) 2005-05-10
BRPI0312843B1 (pt) 2019-12-03
CA2531176A1 (en) 2004-01-29
NZ538265A (en) 2008-12-24
JP2005533501A (ja) 2005-11-10
MXPA05000865A (es) 2005-04-28
WO2004009237A2 (en) 2004-01-29
CA2531176C (en) 2018-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1787739B (zh) ***处理***
CN100581355C (zh) ***的保藏和处理***
CN100367849C (zh) 低温贮藏所选***的方法
CN102586179B (zh) 用于分选带有x或y染色体富集群的***悬浮液
US10563170B2 (en) Compositions and methods for improving the quality of processed sperm
US8251887B2 (en) Reproductive technology of low dose semen production and in vitro/in vitro fertilization in domestic animals
CN101498712A (zh) 以少量***对哺乳动物进行有性别选择的授精
Dorice et al. Effects of breed, age, body condition score, and nutritional status on follicular population, oocyte yield, and quality in three Cameroonian zebus cattle Bos indicus
US11364104B2 (en) Heterogeneous inseminate system
US8512224B2 (en) Method of producing an inseminate
Gaur et al. Sex sorted semen-methods, constraints and future perspective
Tsuchiya et al. Short-term preservation of mouse oocytes at 5 C
CN101014350A (zh) 用于授精的***悬浮液
Trung et al. A STUDY OF CRYOPRESERVATION OF PHUQUOC DOG SPERMS AFTER SEPARATED THROUGH BOVINE SERUM ALBUMIN MEDIUM COLUMN
BR132016001430E2 (pt) Composições e métodos para aprimorar a qualidade do esperma processado
Kristan et al. Fertilizing ability of gametes at different post-activation times and the sperm–oocyte ratio in the artificial reproduction of
AU2013202649A1 (en) Compositions and methods for improving the quality of processed sperm

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20110330

CX01 Expiry of patent term