CN1738648A - 小干扰rna基因治疗 - Google Patents
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Abstract
通过将编码基因特异性siRNA的慢病毒载体导入细胞中抑制细胞中的基因表达。编码对癌相关基因特异性的慢病毒载体导入癌细胞后抑制基因的表达,并导致细胞死亡。将编码HIV基因特异性的siRNA的慢病毒载体导入细胞后抑制HIV感染的细胞中的病毒复制。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求享有2003年1月17日提交的美国临时申请系列号60/440,987的优先权。
政府资助研究的声明
本发明是在国立卫生院授予的基金号为P50 HL59412的美国政府资助下进行的。美国政府对本发明享有一定的权利。
发明领域
本发明一般涉及生物学、肿瘤学和基因治疗领域。更具体地,本发明涉及使用编码小干扰RNA(siRNA)的慢病毒载体调节基因表达的方法。
发明背景
发现了双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默或RNA干扰(RNAi),并将之用作“敲除”线虫Caenorhabditis elegans中基因表达的遗传工具(P.Sharp,Genes &Development 13:139-141,1999)。后来发现这种基因沉默现象在许多真核细胞中都是高度保守的。长dsRNA向生物有机体细胞中的导入引发同源基因转录物的序列特异性降解。长dsRNA分子在称作Dicer的内源性核糖核酸酶的作用下代谢成小(如21-23个核苷酸(nt))干扰RNA(siRNA)(Grishok et al.,Science 287:2494-2497,2000和Zamoreet al.,Cell 101:25-33,2000)。siRNA分子与具有解螺旋酶活性和核酸内切酶活性的、称作RNA诱导的沉默复合体(RISC)的蛋白复合体相结合。解螺旋酶活性使RNA分子的双链解旋,使反义链与靶RNA分子结合(Zamore et al.,Cell 101:25-33,2000;Zamore,P.D.,Science 296:1265-1269,2002;和Vickers et al.,J Biol Chem.2003 Feb 28;278(9):7108-18)。核酸内切酶活性在反义链的结合部位水解靶RNA。因此,RNAi是一种反义作用机制,作为单链(ssRNA)RNA分子根据Watson-Crick碱基配对规则和靶RNA分子结合,并募集能够降解靶RNA的核糖核酸酶。
另一种转录后基因沉默方法是由抑制mRNA翻译的ssRNA物质:微小RNA或miRNA所介导的(Lee et al.,Cell 75,843-54(1993))。和siRNA一样,miRNA来源于RNA前体,其由核酸内切酶Dicer加工成21-25nt的序列,形成序列特异性基因沉默复合体。参见McManus & Sharp,Nat Rev Genet 3,737-47.(2002)。
在哺乳动物细胞中,长度超过30bp的dsRNA会由于干扰素α应答引发非特异性基因抑制。但是,转染两个3’端都突出两个核苷酸的21nt合成的双链siRNA可以逃逸干扰素应答,有效地行使序列特异性基因沉默功能。然而合成的siRNA的沉默效应是瞬时的。还使用包括T7聚合酶和哺乳动物pol II或pol III启动子的转录体系建立了表达siRNA的质粒DNA。Wang et al.,J Biol Chem 275,40174-9(2000);Yu et al.,Proc Natl Acad Sci USA 99,6047-52(2002).编码siRNA的质粒的基因沉默效率取决于DNA转染效率,对于许多细胞类型来说DNA转染效率低,尤其是对于体内研究。质粒DNA转染还导致瞬时siRNA表达。由于基因治疗应用可能需要有效的基因沉默,因此将需要能在较长时间内提供高水平siRNA表达的体系。
发明内容
本发明涉及使用编码siRNA的慢病毒载体调节细胞中基因表达的方法和组合物。为了调节(如降低)细胞中的基因表达,将编码对于待调节基因特异的siRNA的慢病毒载体导入细胞。一旦将慢病毒载体导入了细胞,即表达siRNA分子,促进互补RNA序列的降解,阻止这些序列所编码的基因表达。
在下述实验中,描述了编码用于降低哺乳动物细胞中特定基因表达的siRNA的慢病毒载体的一个实例。编码pol III启动子驱动的、对肿瘤特异性基因干细胞抗原-2(Sca-2)特异的siRNA的慢病毒载体有效地沉默鼠源肝细胞瘤细胞系中Sca-2表达,并诱导快速凋亡细胞死亡。
该***的一个明显优点是它能实现siRNA的稳定和长效表达。例如,在上述实验中,转导慢病毒siRNA载体后对Sca-2表达的抑制超过90%。此外,当载体含有反向取向的pol III-siRNA时,该沉默效应持续至少2个月。
下面所示的其他实验说明编码siRNA的慢病毒载体可以抑制细胞中的病毒复制。具体地,建立并测试了靶向1型HIV(HIV-1)基因组中多个高度保守区域的几个慢病毒siRNA载体。虽然载体***的辅助构建体中会存在一些siRNA靶向位点,使载体的产生受到抑制,但这些慢病毒siRNA载体的生成并不受到明显影响。当测试不同的HIV-1分子克隆时,靶向gag、pol、int和vpu基因的siRNA有效地抑制所有株系的复制。这些慢病毒siRNA载体还保护宿主细胞不受合胞体形成、巨噬细胞向性HIV-1诱导的细胞毒性的影响。并且用慢病毒siRNA转导长期慢性感染的人淋巴细胞系导致对HIV-1复制的稳定抑制。
因此,本发明的特征是包括编码小干扰RNA的核苷酸序列的慢病毒载体(如自我灭活载体)。慢病毒载体可以是包含在慢病毒毒粒中的载体。小干扰RNA可以对癌相关基因如Sca-2特异,或者对病毒(如HIV)中存在的基因如来自HIV-1的gag、pol、int或vpu特异。
载体可以包括以启动子和编码小干扰RNA的核苷酸序列为特征的序列盒。所述的序列盒可以相对于病毒载体基因组反向取向或正向取向。
另一方面,本发明的特征是包括将本发明的慢病毒载体(如包括编码小干扰RNA的核苷酸序列的慢病毒载体)导入细胞的步骤的方法。细胞可以是哺乳动物细胞,如人类细胞。细胞还可以是肿瘤细胞。
在本发明方法的一个变换方式中,小干扰RNA对癌相关基因特异,使向细胞中导入核酸的步骤引起基因表达下降和/或细胞死亡。
在本发明方法的另一个变换方式中,细胞感染病毒,小干扰RNA对病毒(如HIV)中存在的基因如来自HIV-1的gag、pol、int或vpu特异。在该变换方式中,向细胞中导入载体的步骤导致对细胞中病毒复制的抑制。
用于本发明方法的载体可以包括以启动子和编码小干扰RNA的核苷酸序列为特征的序列盒。序列盒可以相对于载体中的其他基因(即组成病毒基因组的基因)反义取向或正义取向。向细胞中导入载体的步骤导致编码小干扰RNA的核苷酸序列的表达持续超过3周。
除非指明,本文所用的所有技术术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员所达成共识的相同含义。分子生物学术语的共识性定义可以在Rieger et al.,Glossaryof Genetics:Classical and Molecular,5th edition,Springer-Verlag:New York,1991和Lewin,Genes VII,Oxford University Press:New York,1999中查到。病毒学术语的共识性定义可以在Granoff and Webster,Encyclopedia of Virology,2nd edition,AcademicPress:San Diego,CA,1999和Tidona and Darai,The Springer Index of Viruses,1st edition,Springer-Verlag:New York,2002中查到。微生物学术语的共识性定义可以在Singletonand Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,3rd edition,John Wiley& Sons:New York,2002中查到。
术语“基因”指编码特定蛋白质或在某些情况下编码功能性或结构RNA分子的核酸分子。
本文所用的“载体”指能够转运与之相连的另一核酸的核酸分子。本文所用的术语“慢病毒载体”指来自慢病毒(即具有其特有的核苷酸序列)的载体。
“小干扰RNA”或“siRNA”指介导信使RNA催化作用的长度通常约21-23个核苷酸的RNA。
当第一核酸序列与第二核酸序列功能相关时,第一核酸序列与第二核酸序列“可操作”连接。例如,如果启动子影响编码序列的转录或表达,将启动子可操作连接于编码序列。通常,可操作连接的核酸序列是邻接的,必要时将两个蛋白质编码区域连接在同一阅读框中。
虽然在本发明的实践和测试中可以使用与本文所述相似或等价的方法和材料,下面描述了合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的整体内容都通过引用并入。如有冲突,以包括定义的本说明书为准。下面讨论的具体实施方案仅是说明性的,不具有限制性。
附图说明
图1示意性说明慢病毒转导后慢病毒siRNA靶向Sca-2和对Sca-2表达的长期抑制。(A)lenti-siRNA载体***和病毒滴度。示出了nt 340-360之间的21-nt的Sca-2mRNA靶位点,和预测的编码U6启动子的siRNA茎环。(B)lenti-siRNA载体***。siRNA表达序列盒U6-Sca-2siRNA***到转导载体pTYF-EfnlacZ中,以正向取向或反向取向位于中央多聚嘌呤序列(cPPT)和EF1α启动子之间。通过用pTYF转导质粒、pHP和pHEF-VSVG质粒共转染293T细胞,产生病毒载体。
图2示意性说明HIV-1基因组结构、mRNA和siRNA靶序列列表。siRNA靶位点在虚线表示的病毒基因组上方示出,用箭头标出5’和3’剪接位点。根据HIV-1NL4-3的数字体系示出siRNA靶位点。
图3示意性说明慢病毒载体构建体和预测的siRNA结构。示出了gag-pol和VSV-G表达构建体及自我灭活型载体的特征。H1启动子-siRNA序列盒克隆到EF1a-nlacZ报道基因的上游。还示出了预测的茎环siRNA前体和2nd poli靶位点。
具体实施方式
本发明提供了使用编码siRNA的慢病毒载体调节细胞中基因表达的方法和组合物。在本文所述的实验中,编码siRNA的慢病毒载体用于降低哺乳动物细胞中特定基因的表达,抑制细胞中的HIV-1复制。
下述优选实施方案说明了这些组合物和方法的适用性。但是,从这些实施方案的描述,可以基于下面的描述进行和/或实施本发明的其他方面。
生物学方法
这些方法涉及本文所述的传统分子生物学技术。这些技术在本领域中是公知的,在方法学论著,如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001和Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel et al.,Greene Publishing andWiley-Interscience,New York,1992(with periodic updates)中作有详细描述。例如,核酸的化学合成方法在Beaucage and Carruthers,Tetra.Letts.22:1859-1862,1981和Matteucci et al.,J.Am.Chem.Soc.,103:3185,1981有所讨论。例如,核酸的化学合成还可以在商业化的自动寡核苷酸合成仪上进行。基因转移和基因治疗的传统方法在Gene Therapy:Principles and Applications,ed.T.Blackenstein,Springer Verlag,1999;Gene Therapy Protocols(Methods in Molecular Medicine),ed.P.D.Robbins,HumanaPress,1997和Retro-vectors for Human Gene Therapy,ed.C.P.Hodgson,Springer Verlag,1996中作有描述。
核酸和使用方法
本发明提供了包括慢病毒载体和编码siRNA的核苷酸序列的核酸。该核酸可以用来抑制细胞中靶基因的表达。核酸的慢病毒载体部分提供对病毒的产生和编码siRNA的核苷酸序列的表达所必需的序列。核酸的siRNA部分编码多核苷酸,其在细胞中表达时可以通过RNA干扰抑制靶基因的表达。可以使用适于本发明特定应用的任意慢病毒载体和编码siRNA的核苷酸。下面描述了几个实例。
慢病毒载体
公知有多种不同类型的慢病毒载体,包括天然存在的慢病毒,如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)等。参见美国专利No.6,207,455。由于基于HIV-1的许多有利的载体提供基因治疗用途,目前是优选的,但是也可以通过改变本文所述信息,使用来源于其他慢病毒的其他载体。
为了使HIV-1来源的载体安全有效地用于基因治疗用途,需要(1)通过重组而不干扰病毒效率,去除最大量的病毒序列,以避免野生型病毒的生成;和(2)***异源序列以增加载体效率。这种载体的一个实例从HIV-1前病毒DNA开始制备。例如,由于HIV-1Gag-Pol的有效合成需要LTR的tat活化和Rev-RRE相互作用,以介导mRNA的核输出,这些功能可以保留。另一方面,由于vif、vpr、vpu和nef的辅助基因功能对于病毒复制并非必需的,可以去除其中一个或多个。
本发明的慢病毒载体可以是假型化的,以克服有限的宿主细胞向性。例如,可以使用以水泡性口炎病毒G(VSV-G)病毒包膜蛋白假型化的慢病毒载体。此外,通过设计用于质粒生成的三质粒共转染策略,可以减小野生型重组的潜在危险性。这种三质粒设计包括编码gag-pol(必需病毒蛋白)的辅助构建体pHP、编码siRNA和病毒基因组并携带有外源基因序列盒(报道基因)的转导载体构建体pTYF-nlacZ和VSV-G包膜蛋白表达质粒(如pHEF-VSVG)。为了增加***中的载体滴度,还可以使用额外的真核表达质粒(例如反式激活因子质粒构建体,如pCEP4-tat)。
为了增加安全性,还可以使用SIN慢病毒载体。例如,可以通过灭活3’U3启动子和去除对于整合到宿主染色体重要的5’整合吸附位点之外的所有3’U3序列,制备SIN慢病毒载体。用来设计本发明载体的特别优选的构建体是图1所示的pTYF-nlacZ。
对于靶基因特异的siRNA
可以使用本发明的慢病毒siRNA载体来调节(例如沉默或抑制)细胞中合适基因(即靶基因)的表达。可以通过检测与不含慢病毒siRNA载体的对照相比的基因转录或翻译的下降,或通过检测基因表达产物(如多肽)活性的下降来评价对细胞中基因表达的调节。
在下述的一些实验中,使用编码对Sca-2基因特异的siRNA的慢病毒载体。在下述的其他实验中,使用编码对HIV-1基因特异的siRNA的慢病毒载体。但是,也可以使用慢病毒siRNA载体靶向其他基因进行调节(例如抑制或沉默)。要使用慢病毒siRNA载体靶向的基因包括但不局限于表达与不必要表型特征相关的基因。因此,可以靶向与癌症、类风湿性关节炎和病毒相关的基因。癌相关基因包括癌基因(如K-ras、c-myc、bcr/abl、c-myb、c-fms、c-fos和cerb-B)、生长因子基因(如编码表皮生长因子及其受体、成纤维细胞生长因子结合蛋白的基因)、基质金属蛋白酶基因(如编码MMP-9的基因)、粘附分子基因(如编码VLA-6整合素的基因)、肿瘤抑制因子基因(如bcl-2和bcl-X1)、血管生成基因和转移基因。例如,类风湿性关节炎相关基因包括编码基质溶素和肿瘤坏死因子的基因。病毒基因包括人***瘤病毒基因(例如和***相关的基因)、乙型肝炎和丙型肝炎基因、巨细胞病毒(CMV)基因(利于与视网膜炎相关的基因)。也可以靶向与这些或其他疾病相关的许多其他基因。
控制元件
本发明的慢病毒载体可以含有各种控制元件,如启动子调控区(例如控制诱导性或组成性、环境调节性或发育调节性、或者细胞特异性或组织特异性表达的调控区)、转录启动起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。
内源性慢病毒启动子可以用于许多应用,虽然经常优选使用异源启动子来增加***的外源核酸的表达。可以使用与所用的特定慢病毒载体相容的任意异源启动子。这些异源启动子的实例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、鼠白血病病毒LTR(MuLV LTR)、腺病毒主要早期启动子(Ad MLP)、腺病毒反向末端重复(ITR)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、诸如CMV即早启动子区的启动子(CMVIE)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、合成的启动子、杂合的启动子、其他polII和pol III及病毒启动子等。此外,也可以使用来自非病毒基因的序列,如鼠金属硫蛋白基因或金属硫蛋白II启动子。许多这种启动子序列都可以购自如Stratagene(SanDiego,Calif.)。可以使用的其他控制元件包括来自天然控制元件的元件,其调节编码β-肌动蛋白、α-胎蛋白、γ或β-珠蛋白、IL-2和β-干扰素的基因的转录。还可以使用包括延伸因子1(EF1)启动子、神经元特异性启动子和CMV增强子β肌动蛋白杂合启动子的其他控制元件。
在需要调控外源核酸的表达时,可以使用诱导性控制元件。例如,可以使用四环素诱导性表达***(Baron and Bujard Methods Enzymol.327:401-421,2000;Schonig et al.,NAR 30:el34,2002和Lamartina et al.,Hum.Gene Ther.13:199-210,2002)。含有嵌合四环素应答元件和pol III启动子的诱导性慢病毒siRNA载体是特别有用的。
诸如启动子的控制元件可以和编码siRNA的核酸可操作连接,以形成要***到慢病毒载体中的序列盒。这种序列盒可以以正向取向(与慢病毒序列方向相同)或反向取向(与慢病毒序列方向相反)***到慢病毒载体中。为了长期表达siRNA,优选反向取向。参见下面的实施例1。
容许的宿主细胞
在本发明中可以使用能转导慢病毒载体颗粒的任意细胞或细胞系。这些细胞的例子包括:Jurkat细胞(人T细胞系)、H9细胞(人T-淋巴样细胞系)、A3.01细胞(人T-淋巴样细胞系)、C3166细胞(人T-淋巴样细胞系)、COS-7细胞(非洲绿猴成纤维细胞细胞系)、人外周血淋巴细胞(PBL)、猴PBL、猫PELs、猫CD4+T细胞系、293细胞(人肾成纤维细胞细胞系)、293T细胞(人肾成纤维细胞细胞系)、哺乳动物外周血树突状细胞、哺乳动物肝细胞、人肥大细胞远祖细胞、哺乳动物巨噬细胞、哺乳动物肺泡树突状细胞、哺乳动物上皮朗氏细胞、哺乳动物巨核细胞、哺乳动物小胶质细胞、哺乳动物星形细胞、哺乳动物少突神经胶质细胞、哺乳动物CD8+细胞、哺乳动物视网膜细胞、哺乳动物肾上皮细胞、哺乳动物宫颈细胞、哺乳动物直肠黏膜细胞、哺乳动物滋养细胞、哺乳动物心肌细胞、人成神经细胞瘤细胞、哺乳动物CD4+细胞、哺乳动物造血干细胞、哺乳动物胶质细胞、成年哺乳动物神经干细胞、哺乳动物神经元、哺乳动物淋巴细胞和哺乳动物成纤维细胞。已经编写了可受HIV感染的CD4+和CD4-细胞类型的列表(参见Rosenburg and Fauci,Adv.Immunol.47:377-431,1989和Connor and Ho,1992,in AIDS:etiology,diagnosis,treatment,and prevention,3rd edition,Hellman and Rosenburg(eds)Lippincott,Philadelphia.还参见Vigna and Naldini,J.GeneMed.5:308-316,2000.
在本发明的组合物和方法中还可以使用假型化的慢病毒载体。例如,通过用编码表达在HIV颗粒表面上的VSV包膜糖蛋白的核酸转导用来包装载体的包装细胞系使HIV载体假型化。VSV感染***的和不***的CD34+细胞,表达VSV包膜蛋白的假型化载体有能力转导这些细胞。参见Naldini et al.,Science 272:263,1996和Akkinaet al.,J.Virol.70:2581,1996。
可以通过将慢病毒载体颗粒加入到细胞(如培养物中或原位)中并随后检查载体颗粒中是否表达一个或多个基因,来检查其他细胞的容许性。
将载体施用于培养物中的细胞
可以通过转导将慢病毒载体颗粒施用于培养物中的细胞。例如,可以用慢病毒载体转导细胞系,离心或不离心。用于下述实验的载体浓度在感染复数(MOI)为10-20变动。为了生成病毒,将容许慢病毒载体转导的细胞(如293T细胞)转染慢病毒转导质粒(如6-孔板中每孔0.8μg pTYF转导质粒)、提供gag和pol基因产物的辅助质粒(如6-孔板中每孔1.8μg pNHP)、编码包膜蛋白的辅助质粒(如6-孔板中每孔0.5μg pHEF-VSVG)、任选的编码反式激活蛋白的质粒(如6-孔板中每孔0.2μgpCEP4tat)以及对照质粒(如6-孔板中每孔0.2μg pHEFeGFP)。可以使用任意合适的细胞转染技术(如使用Superfect,Qiagen)使细胞转染这些质粒。转染后,将细胞洗涤并培养(fed)。然后收集、合并病毒。在本文所述实验中,5小时后将细胞洗涤并培养,将转染后24、36和48小时的病毒收集、合并在一起,然后浓缩并测定滴度,备用。制备和使用慢病毒载体的其他方案描述在Zhang and Zaiss,Methods Mol.Med.69:303-318,2002中。
将载体施用于宿主动物
本发明的慢病毒载体颗粒可以用在调节宿主动物基因表达的方法中。在该方法中,编码对于待调节(如抑制)基因特异的siRNA的慢病毒载体以siRNA能够表达的方式施用于动物。可以通过两种常用方法将慢病毒载体施用于宿主动物。在第一种方法中,用慢病毒载体颗粒体外转染不包含在动物体内的细胞(如从哺乳动物患者分离的细胞,如PBL;来自骨髓、胎儿肝脏或胎盘的造血细胞;纯化的造血干细胞如CD34+细胞),然后将细胞导入动物体内(如将转导的分离细胞重新输注到动物血流中)。在第二种方法中,通过静脉注射、腹腔注射或原位注射入靶组织将慢病毒颗粒直接导入动物体内。可以通过任意合适的方法将转导的细胞或慢病毒颗粒导入动物体内。例如,可以使用常规的注射器和针头将慢病毒载体颗粒悬液或转导的细胞悬液注射到动物中。根据所需的给药途径,注射可以是原位(即注射到特定组织或组织部位)、肌肉内、静脉内、腹腔内或通过其他非肠道途径。
例如,可以通过集合药团(bolus)注射或连续输注来进行经注射的载体或载体颗粒非肠道施用。用于注射的配方制剂可以以单位剂量形式存在,例如存在于安瓶或多剂量容器中,具有添加的防腐剂。组合物可以是诸如悬液、溶液或者油性或水性赋形剂中的乳液,可以含有配料剂(formulatory agent)如悬剂、稳定剂和/或分散剂。作为替代方案,载体或载体颗粒可以为粉末形式(如冻干的),在使用前用适当的赋形剂如无菌、无致热源的水配制(constitution)。
慢病毒载体或载体颗粒可以通过目前公知的合适技术经吸入递送到动物体内。例如,可以使用适当的推进剂,如二氯二氟甲烷、三氯三氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体,方便地将本发明的载体或载体颗粒通过加压包装或喷雾器以气雾方式施用。使用加压气体的情况下,可以通过提供一个阀门来确定剂量单位,以便按规定量施用。包含载体或载体颗粒与适当基料(如乳糖或淀粉)的粉末混合物的胶囊和软片(cartridge)(如明胶)可以用在吸入器(inhaller)或吸入器具(insufflator)中,将载体或载体颗粒递送到动物的呼吸道。
在本发明的某些应用中还可以采用其他的给药途径。例如,可以配制用于口服、经颊、经尿道、经***或直肠给药的载体或载体颗粒。
为了促进载体或载体颗粒向动物的递送,本发明的载体或载体颗粒可以与载体或赋形剂混合。可用的载体和赋形剂包括盐水(尤其是无菌、无致热源的盐水)、盐水缓冲液(例如柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、脲、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。对于将载体或载体颗粒递送到人类患者来说,USP级载体和赋形剂是特别优选的。配制这些配方的方法是公知的,例如可以在
Remington’s Pharmaceutical Sciences中查到。
除了前述配方,载体或载体颗粒还可以配制成储存制剂。可以通过包埋(例如皮下或肌肉包埋)或肌肉注射的方式施用这种长时间发挥作用的配方制剂。因此,例如,载体或载体可以与合适的多聚物或疏水物质(例如存在于可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制在一起,或者是少量可溶性衍生物的形式。
剂量
可以通过常规药学步骤,使用培养物中的细胞或实验动物测定LD50(使群体的50%致死的剂量)和ED50(对群体的50%治疗有效的量),来测定本发明中用于基因基因治疗的慢病毒载体的毒性和疗效。毒性和疗效之间的剂量比值是治疗指数,治疗指数可以表示为LD50和ED50之间的比值。虽然可以使用表现出毒副作用的剂量,但应注意设计将这类载体靶向到受影响组织部位的递送***,以便将对未感染细胞的潜在损伤降至最小,从而减小副作用。
从细胞培养物分析和动物研究获得的数据可以用于计算用于人类的剂量范围。这类载体的剂量优选位于循环浓度包括ED50的范围内,有或没有毒性。剂量可以在该范围内变动,取决于所用的剂型和所采用的给药途径。对于用在本发明方法中的任意载体而言,可以从细胞培养物分析初步估算治疗有效剂量。如培养物中测定一样,剂量可以用在动物模型中,以获得IC50(获得对症状的半数最大抑制作用的载体剂量)。这些信息可以用于更准确地确定人用剂量。
评价基因沉默
可以通过直接检测细胞或生物有机体中核酸的存在来评价慢病毒载体将外源核酸向宿主细胞或生物有机体的转移。可以通过本领域中公知的多种方法来实现这种检测。例如,可以通过Southern印迹法或利用特异性扩增与核酸相关的核苷酸序列的引物进行聚合酶链式反应(PCR)技术来检测外源核酸的存在。可以使用常规方法测定外源核酸的表达。例如,可以使用Northern印迹法或逆转录PCR(RT-PCR)对由外源核酸产生的mRNA进行检测并定量。
还可以通过测定酶活性或受体蛋白活性对外源核酸向RNA的表达进行检测。例如,可以将靶核酸表达的减少作为外源核酸生成效应RNA的标志,间接测定siRNA的活性。
实施例
实施例1-对SCA-2的抑制作用
慢病毒siRNA成功抑制了>90%的Sca-2表达,抑制作用超过3个月。
材料和方法
质粒的构建.从分离自鼠1MEA7R肝细胞瘤的基因组DNA中PCR扩增鼠U6 snRNA启动子。将PCR产物克隆到pBSKSII中的EcoR I和Hind III位点之间,产生pBS-U6。将下列两个引物:正义5’-TTT GCT CCT TCT GCA ACT TCA GTT CAAGAG ACT GAA GTT GCA GAA GGA GCT TTT TT-3’(SEQ ID NO:1)和反义5’-AGCTAA AAA AGC TCC TTC TGC AAC TTC AGT CTC TTG AAC TGA AGT TGC AGAAGG AG-3’(SEQ ID NO:2)退火,构建Sca-2siRNA编码序列,将下列两个引物:正义5’-TTT GAG AGA CCA CAT GGT CCT GTT CAA GAG ACA GGA CCA TGT GGTCTC TCT TTT T-3’(SEQ ID NO:3)和反义5’-AGC TAA AAA GAG AGA CCA CAT GGTCCT GTC TCT TGA ACA GGA CCA TGT GGT CTC T-3’(SEQ ID NO:4)退火,构建GFP siRNA编码序列,并克隆到pBS-U6的Bbs I和Hind III位点中,产生pBS-U6siRNA构建体。为便于慢病毒siRNA载体的构建,通过定点诱变和PCR将两个不同的Sfi I克隆位点(A和B)***到U6-siRNA的上游和下游,即构建成含有两个Sfi I(A/B)位点和1100bp填充序列的慢病毒SIN载体(pTYF-EFnlacZ),用于后续的U6-siRNA克隆。为了产生慢病毒siRNA载体,通过Sfi I消化,使U6-siRNA片段从pBS-U6siRNA释放,并***到pTYF-Sfi A/B或pTYF-Sfi B/A,以获得正向或反向siRNA***克隆。使用下列引物:引物1,5’-AAT CTA GAC CAC CAT GTC TGC CAC TTC CAA CATGAG-3’(SEQ ID NO:5);引物2,5’-GTG AAC AGC TAC TGC TGC CAA TCG TCGTTC TGC AAC TTC AGC GCA GCT G-3’(SEQ ID NO:6);和引物3,5’-AAG AAT TCTGGT CAG GGG CTC AGC TGC AG-3’(SEQ ID NO:7),采用基于PCR的定点诱变生成野生型Sca-2氨基酸同义突变体Mu-Sca-2,并将扩增的DNA克隆到pTYF-EFnlacZ中的Spe I和EcoR I位点之间。
慢病毒的生成、浓缩和滴度测定.通过DNA共转染产生慢病毒载体,通过离心机离心或过滤将病毒浓缩,如前所述。Chang and Zaiss.Methods for thepreparagtion and use of lentivirus vectors.In:Moran J,editor.Gene Therapy Protocols.2nd ed.Volume 2,Methods in Molecular Medicine.Totowa:Humana Press,Inc.:2001.p303-318.使用β-半乳糖苷酶分析法在TE671细胞上测定病毒滴度。
细胞培养、RNA转染和病毒转导.IMEA7R和BLN.CL2得自ATCC(Manassas,VA),培养在含10%FBS和100单位/ml青霉素-链霉素(Gibco BRL)的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM,Gibco BRL)中。293T细胞和TE671细胞培养在含10%FBS的DMEM中,并增殖较长时间,以建立所述的较贴壁表型。Sca-2siRNA双链体寡聚物:正义5’-GCT CCT TCT GCA ACT TCA GTT-3’(SEQ ID NO:8)和反义5’-CTG AAG TTG CAG AAG GAG CTT-3’(SEQ ID NO:9)由Dharmacon Research,Inc.化学合成。使用oligofectamine(Dharmacon Research,Inc.),根据生产商的指导将合成的双链RNA寡聚物转染到鼠源细胞中。对于慢病毒转导,1×105鼠源细胞在polybrene(8μg/ml,Sigma)的存在下转导MOI为10-20的不同lenti-U6-siRNA病毒载体。如前所述通过报道基因nlacZ分析测定转导效率。
细胞***和增殖分析.慢病毒转导后,将肿瘤细胞用胰酶处理,并悬浮于2mlDMEM中。取100μl的细胞样品,用台盼兰染色来测定细胞存活率和总数。将其余重新铺板继续培养。转导7天后每天进行细胞计数。通过羧基荧光素双乙酸琥珀酰酯染色(CFSE,Sigma)分析细胞***的相对速率。对于CFSE,将肿瘤细胞和DMEM中的5μM CFSE一起于室温下孵育10min。然后用培养基洗涤三次,除去过量的CSFE。接着将细胞培养在完全DMEM中,在3天期间通过FACSCalibur测定CFSE强度。
流式细胞术.对于表面蛋白分析,将细胞与荧光素偶联的大鼠抗小鼠Sca-2单克隆抗体(BD Bioscience)或与藻红蛋白偶联的仓鼠抗小鼠TNF-α受体1(Santa CruzBiotechnology)一起孵育,并使用FACSCalibur和CELLQUEST程序(BD Bioscience)进行分析。
Northern、Southern和Western分析.收获PolyA+RNA或总RNA和基因组DNA,并在琼脂糖凝胶上分离,以进行Southern和Northern分析。收获总蛋白质,通过12% NuPAGE bis-Tris凝胶电泳(Invitrogen)分离,并转移到硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell)上进行Western分析。将蛋白质印迹和兔多克隆抗caspase 8抗体(1∶1000)(Santa Cruz Biotechnology)、兔多克隆抗切割的caspase 3抗体(1∶1000)、兔多克隆抗PARP抗体(1∶1000)(Cell Signaling Technology)、小鼠单克隆抗TNFα-R1抗体(1∶1000)或小鼠多克隆抗α微管蛋白(tublin)抗体(1∶1000)(Santa CruzBiotechnology)一起孵育。用辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶2000)通过增强的化学发光显色caspase 3、PARP的信号。使用ImmunoPure Ultra-Sensitive ABC染色试剂盒(Pierce),根据生产商的指导用生物素偶联的二抗(1∶10,000)显色casepase 8、α-微管蛋白的信号。
凋亡诱导和分析.有或没有环己酰亚胺(5μg/ml)的条件下,将肿瘤细胞用不同浓度(0-10ng/ml)的TNFα处理,或用cisplatin(25μM)或紫外线照射(10mJ/cm2)处理,以诱导凋亡。对于早期凋亡分析,用ApopNexin Apoptosis Detection试剂盒(Serologicals Corporation),根据指导以FITC-Anenexin/Propidium iodide对细胞进行染色。通过FACSCalibur对染色的肿瘤细胞进行分析。对于肿瘤细胞DNA染色,使肿瘤细胞沉淀,重悬于50μl 3%的多聚甲醛的PBS溶液中,在室温下孵育10min,用PBS洗涤一次,并重悬于含32μg/ml二苯甲亚胺(Hoechst 33258,Sigma)的100μlPBS中。室温下孵育15分钟后,将细胞涂到显微载玻片上,使用荧光透镜和滤光片在倒置Axioskop Zeiss荧光显微镜(Zeiss,德国)下观察。通过包括染色质皱缩和核膜出泡的形态学变化对凋亡细胞进行评价。
统计学分析.根据SPSS统计程序(SPSS Inc.Chicago,IL)进行数据分析上的差异显著性。
结果
使用siRNA基因敲除方法的Sca-2下调.Sca-2经鉴定在癌细胞中超表达。为了研究Sca-2在肿瘤发生中的作用,用21-nt的合成siRNA靶向Sca-2mRNA。用21-ntsiRNA转染鼠肝细胞瘤细胞,通过使用特异性抗Sca-2抗体的FACS和Northern印迹法分析Sca-2蛋白和RNA。FACS和总RNA Northern印迹分析表明siRNA在转染3天后有效地下调了Sca-2表达。转染21-nt Sca-2siRNA的细胞在1-2天内经历快速细胞死亡。而在对照转染的细胞中没有观察到该现象。Sca-2抑制和肿瘤细胞死亡的效应在转染细胞中是瞬时的,在转染后10天Sca-2表达和细胞死亡恢复到正常水平。
慢病毒siRNA转导后对Sca-2表达的长期抑制.为了研究长期的Sca-2功能和siRNA效应,利用如图1A构建的合成siRNA发现靶向相同位点的慢病毒siRNA载体是有效的。将鼠源snU6启动子-siRNA序列盒相对于病毒基因组正向或反向取向***到慢病毒SIN载体中内部EF1α-nlacZ报道基因的5’端,如图1B所述和前面的研究所述,使用辅助质粒pNHP和pVSV-G生成慢病毒载体。Chang and Zaiss,Methods forthe preparation and use of lentivirus vectors.In:Morgan J.editor.Gene Therapy Protocols.2nd ed.Volume 2,Methods in Molecular Medicine.Totowa:Humana Press,Inc.;2001,p303-318和Zaiss et al.,J virol 2002;76:7209-7219.正向(lenti-Scai-F)和反向(lenti-Scai-R)siRNA慢病毒构建体与对照lenti-EFnlacZ相比都产生类似的载体滴度。
用两个慢病毒Sca-2siRNA载体之一或用对照慢病毒U6启动子载体(lenti-U6P)感染肝细胞瘤细胞。在转导后的不同时间,通过lacZ报道基因分析监测感染效率,通过FACS和Northern分析法分析Sca-2表达。结果表明慢病毒载体有效地感染了肝细胞瘤细胞(~100%),正向和反向慢病毒Sca-2siRNA载体都有效地抑制了Sca-2表达(~80-90%)。慢病毒siRNA载体的抑制作用稳定持续3周以上。与瞬时siRNA转染结果一致,转导后很快观察到了肿瘤细胞死亡。正向和反向慢病毒siRNA载体在短期的Sca-2抑制方面仅表现出微小差异。
使转导的肿瘤细胞连续增殖2个月,然后分析Sca-2表达。经FACS和RNA印迹法测定,Lenti-Scai-R载体保留有效的抑制作用(~90%),但是正向lenti-Scai-F载体逐渐丧失其抑制作用至~50-60%。抑制效率与nlacZ基因分析中观察到的转染效率密切相关。Southern分析表明抑制作用下降与携带转基因的细胞数目相关。类似地,构建的由不同pol-III启动子、人H1RNA启动子驱动、以正向取向和反向取向克隆的慢病毒siRNA载体也表现出高的抑制效率,反向siRNA构建体表现出长期稳定效应。
Sca-2抑制诱导的肿瘤细胞凋亡.为了获得纯系细胞群体,使用抗Sca-2抗体通过流式细胞术分选Sca-2阳性细胞。使分选的Sca-2+细胞再次转导Sca-2慢病毒siRNA载体,Sca-2表达得到了有效抑制(>90%)。通过在不同的时间点计***细胞数来分析Sca-2抑制对肿瘤细胞生长的影响。与对照细胞(lenti-U6P)相比,转导正向和反向慢病毒Sca-2siRNA载体(lenti-Scai F和R)的肿瘤细胞的生长速率显著下降。使用annexin/PI染色和FACS分析法来分析细胞的凋亡。结果表明Sca-2受抑制的肿瘤细胞大部分经历早期凋亡,证据是PI阴性和annexin阳性细胞群增加(39.88%)。经Hoechst染色表现出核皱缩和膜出泡的细胞形态学分析证实了该结果。使用包括CFSE活细胞染色和细胞周期PI染色的分析法,未检测到Sca-2抑制后细胞周期进程的差异。
Sca-2受抑制的肿瘤细胞对外来的凋亡信号敏感,对内在的凋亡信号不敏感.转导慢病毒Sca-2siRNA的肿瘤细胞在两周后逐渐从凋亡恢复,以Sca-2受抑制的状态继续增殖。由于对Sca-2的抑制诱导快速凋亡,研究了恢复的细胞是否对外来的和内在的凋亡信号的反应不同。肝细胞中常见的死亡受体介导的凋亡涉及TNFα/TNFα受体(TNFR)和Fas/FasL信号通路。肿瘤细胞在存在或不存在环己酰亚胺(CHX)的条件下用TNFα处理,用于分析外来(或死亡受体介导的)凋亡信号。
处理后6h和36h,通过Hoechst染料染色测定凋亡,根据形态学变化对凋亡细胞计数。结果表明肝细胞瘤细胞以剂量依赖性方式对TNFα诱导的细胞死亡作出应答,Sca-2表达受抑制的肿瘤细胞(Lenti-Scai-R)与对照相比对TNFα诱导的细胞死亡更敏感。为了证实这一发现,通过Western分析法分析了procaspase 8、caspase 3和多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP),所有这些都是TNFα受体1(TNFR1)介导的凋亡通路的关键组分。对这些蛋白质的动力学分析表明转导lenti-scai-R的肝细胞瘤细胞在24小时内表现出procaspase 8切割速率增加,切割的caspase 3和切割的核PARP产物积累,与TNFR1介导的凋亡增加相一致。还测试了Fas/FasL介导的凋亡,但是在Sca-2阳性和阴性肝细胞瘤细胞之间未发现差异。
通过使细胞接受来自UV照射或顺铂处理的DNA损伤信号,验证内在的凋亡通路。这些处理后在Sca-2阳性和阴性肝细胞瘤细胞之间未检测到显著差异。
突变Sca-2基因的慢病毒转导对下降的TNFα敏感性降低的恢复.为了证实转导lenti Sca-2siRNA载体的肿瘤细胞的表型确实是Sca-2抑制导致的,而非是其他的siRNA效应,设计了在Sca-2编码序列的siRNA靶位点中具有三个核苷酸变化、同时保留野生型氨基酸序列不变的Sca-2突变体。由于siRNA介导的mRNA降解是严格序列依赖性的,当将突变的Sca-2(muSca-2)导入转导有lenti-siRNA的肝细胞瘤细胞时,这些细胞中的Sca-2表达可以恢复。将muSca-2基因克隆到pTYF慢病毒载体(lenti-muSca-2)中,制备载体。用lenti-muSca-2或对照lenti-lacZ病毒(lenti-EFnlacZ)感染转导有Sca-2siRNA(lenti-Scai-R)的肝细胞瘤细胞,三天后,使用抗Sca-2抗体通过FACS分析转导细胞的Sca-2表达。结果表明lenti-muSca-2,并非lenti-lacZ有效地恢复siSca-2Td.细胞中Sca-2的表达。测试了这些细胞系对TNF-α的反应性。将细胞用不同浓度的TNF-α处理36h,并用Hoechst染料染色,进行凋亡分析。这些分析结果明显说明重构Sca-2表达的肿瘤细胞对TNF-α诱导的凋亡的敏感性下降。
Sca-2对TNFR1表面表达的调控
使用特异性的抗TNFR1抗体和FACS测定肿瘤细胞表面上的TNFR1表达。在转导lenti-Scai-R(Scai)或对照慢病毒GFP siRNA载体(GFPi)的肝细胞瘤细胞中,在慢病毒转导3或30天后分析表面TNFR1表达。结果表面在Scai转导细胞中,而非在GFPi转导细胞中TNFR1的表面表达明显增加。在Sca-2siRNA抑制后快速发生TNFR1表面表达的增加,并且30天后表达仍然高。为了看Sca-2的导入是否影响表面TNFR1的表达,使用lenti-muSca-2或lenti-EFnlacZ感染30DPI Scai转导的肝细胞瘤细胞,20天后分析表面TNFR1的表达。随着Sca-2表达得以营救,表面TNFR1表达下调至与对照组相当的水平。为了区别从头受体合成和TNFR1表面转运的增加,使用抗TNFR1抗体,通过Western印迹法分析了总细胞裂解物。总TNFR1在Sca-2受抑制的(lenti-Scai-R)肝细胞瘤细胞和对照肝细胞瘤细胞之间没有显著差异。
实施例2-对HIV-1的慢病毒siRNA抑制
使用携带靶向多个高度保守HIV-1序列的自我灭活的慢病毒绝缘子载体***研究了急性和慢性感染宿主细胞中siRNA对HIV感染的抑制作用。使用靶向不同HIV株的高度保守gag、pol、int和vpu序列的siRNA显示出对急性感染的接近100%的抑制作用。这些siRNA还有效抑制了慢性感染细胞和原代外周血单核细胞中的HIV-1复制。抑制机制涉及特异性病毒RNA降解,以及胞浆和核病毒RNA的沉默。
材料和方法
组织培养和HIV-1分子克隆.293T、TE671和GHOST hi5细胞培养在含10%FBS、1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM中,增殖以建立如前所述的较为贴壁的表型。Chang L-i,Zaiss A-K.Methods for the preparation and use of lentivirusvectors.In:Morgan J.ed.Gene Therapy Protocols.Vol.2.Methods in MolecularMedicine(ed 2nd).Totowa:Humana Press,Inc.;2001:303-318.原代外周血单核细胞(PBMC)使用Histopague(Sigma)通过密度梯度离心从健康供者的血沉棕黄层中制备。GHOSThi5来源于稳定转导CD4和CCR5的HOS细胞。CEM-A是CEM和PBMC的融合细胞克隆,带有贴壁表型,易于受HIV感染并形成合胞体。MOLT-3购自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland。慢性Molt-3-HIV-1NL4-3生成者(producer)通过用低MOI的HIV-1NL4-3产生,连续增殖至细胞从细胞病变恢复,变成长期HIV-1生成者。GHOST hi5、CEM-A和HIV-1分子克隆p89.6和p90CF402.1从AIDS Research and Reference Reagent Program,Division of AIDS,NIAID,NIH获得。HIV-1NL4-3、HIV-1NLAD8和HIV-2ROD分子克隆分别由M.Martin博士、E.Freed(NIH,USA)博士和K.Peden博士(FDA,USA)惠赠。CEM-A和MOLT-3-HIV-1NL4-3细胞培养在添加有10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640中,PBMC培养在添加有重组人IL-2(100u/ml)的上述RPMI培养基中。
siRNA质粒和慢病毒转导载体的构建.为了获得人H1启动子,使用5’引物:(5’至3’)CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC(SEQ ID NO:10)和3’引物:CCTCACCTCAGCCATTGAACTCAC(SEQ ID NO:11),从293细胞的基因组DNA扩增H1基因。然后使用扩增的H1序列和相同的5’引物与新的3’引物:-GCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC-(SEQ IDNO:12)扩增H1启动子,将扩增的DNA用EcoR I和Hind III消化,并克隆到pBSKSII中,产生pBS-H1。为了便于定向克隆,将两个不同的Sfi I克隆位点(A和B)***到Xba I和Hind III消化的、旁侧为H1启动子区的pBS-H1中,以产生pBS-H1-Sfi,其中所述pBS-H1通过使用下列4个引物:5’-CTAGAGGCCATTATGGCCG-3’(SEQID NO:13)、5’-AATTCG GCCATAATGGCCT-3’(SEQ ID NO:14)、5’-AGCTTGGCCGCCTCGGCC-3’(SEQ ID NO:15)和5’-TCGAGGCCGAGGCGGCCA-3’(SEQ ID NO:16)***旁侧为Xba I和Hind III克隆位点的两个接头而获得。通过将四个引物退火制备GFP siRNA构建体,通过将含茎环siRNA序列的两个引物和9-nt环序列-TTCAAGAGA-(SEQ ID NO:17)以及旁侧EcoR I和Hind III克隆位点退火来制备HIV-1siRNA构建体,然后克隆到pBS-H1-Sfi质粒中H1启动子的3’端。本研究中所用的siRNA引物如下所列:
GFPi-1:GATCCCCCATTCTCGGCCACAAGCTGTT(SEQ ID NO:18)
GFPi-2:TCTTGAACAGCTTGTGGCCGAGAATGGGG(SEQ ID NO:19)
GFPi-3:CAAGAGACAGCTTGTGGCCGAGAATGTTTTTGGAAA(SEQ IDNO:20)
GFPi-4:AGCTTTTCCAAAAACATTCTCGGCCACAAGCTGTC(SEQ ID NO:21)
U5i-1:GATC CCC GTAGTGTGTGCCCGTCTGT TTCA AGAGAACAGACGGGCACACACTAC TTTTT GGAAA(SEQ ID NO:22)
U5i-2:AGCTT TTCC AAAAA GTAGTGTGTGCCCGTCTGT TCT CTT GAAACAGACGGGCACACACTAC GGG(SEQ ID NO:23)
1st gagi-1:GATC CCC GAAATGATGACAGCATGTC TTCA AGAGAGACATGCTGTCATCATTTC TTTTT GGAAA(SEQ ID NO:24)
1st gagi-2:AGCTT TTCC AAAAA GAAATGATGACAGCATGTCTCT CTT GAAGACATGCTGTCATCATTTC GGG-(SEQ ID NO:25)
2nd gagi-1:GATCCCC TAGTAAGAATGTATAGCCC TTCAAGAGAGGGCTATACATTCTTACTA TTTTTGGAAA(SEQ ID NO:26)
2nd gagi-2:AGCTTTTCCAAAAA TAGTAAGAATGTATAGCCC TCTCTTGAAGGGCTATACATTCTTACTA GGG(SEQ ID NO:27)
1st poli-1:GATCCCC GCCAGGAATGGATGGCCCA TTCAAGAGATGGGCCATCCATTCCTGGC TTTTTGGAAA(SEQ ID NO:28)
1st poli-2:AGCTTTTCCAAAAA GCCAGGAATGGATGGCCCA TCTCTTGAATGGGCCATCCATTCCTGGC GGG(SEQ ID NO:29)
2nd poli-1:GATCCCC GGAATTGGAGGAAATGAAC TTCAAGAGAGTTCATTTCCTCCAATTCC TTTTTGGAAA(SEQ ID NO:30)
2nd poli-2:AGCTTTTCCAAAAA GGAATTGGAGGAAATGAAC TCTCTTGAAGTTCATTTCCTCCAATTCC GGG(SEQ ID NO:31)
1st inti-1:GATCCCC TTAGCAGGAAGATGGCCAG TTCAAGAGACTGGCCATCTTCCTGCTAA TTTTTGGAAA(SEQ ID NO:32)
1st inti-2:AGCTTTTCCAAAAA TTAGCAGGAAGATGGCCAG TCTCTTGAACTGGCCATCTTCCTGCTAA GGG(SEQ ID NO:33)
2nd inti-1:GATCCCC GGTGAAGGGGCAGTAGTAA TTCAAGAGATTACTACTGCCCCTTCACC TTTTTGGAAA(SEQ ID NO:34)
2nd inti-2:AGCTTTTCCAAAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATCTCTTGAATTACTACTGCCCCTTCACCGGG(SEQ ID NO:35)
1st vpui-1:GATC CCC GACAGTGGCAATGAGAGTGTTCAAGAGACACTCTCATTGCCACTGTC TTTTT GGAAA(SEQ ID NO:36)
1st vpui-2:AGCTT TTCCAAAAAGACAGTGGCAATGAGAGTG TCTCTTGAACACTCTCATTGCCACTGTC GGG(SEQ ID NO:37)
2nd vpui-1:GATCCCC GAGCAGAAGACAGTGGCAATTCAAGAGATTGCCACTGTCTTCTGCTC TTTTTGGAAA(SEQ ID NO:38)
2nd-vpui-2:AGCTTTTCCAAAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATCTCTTGAATTGCCACTGTCTTCTGCTCGGG(SEQ ID NO:39)
nefi-1:-GATC CCC GTAGTGTGATTGGATGGCC TTCAAGAGAGGCCATCCAATCACACTAC TTTTT GGAAA-(SEQ ID NO:40)
nefi-2:AGCTT TTCC AAAAAGTAGTGTGATTGGATGGCCTCTCTTGAAGGCCATCCAATCACACTACGGG(SEQ ID NO:41)
U3i-1:GATCCCCGGAGAGAACACCAGCTTGTTTCAAGAGAACAAGCTGGTGTTCTCTCCTTTTTGGAAA(SEQ ID NO:42)
U3i-2:AGCTT TTCCAAAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTCTCTTGAAACAAGCTGGTGTTCTCTCCGGG(SEQ ID NO:43)
使用含两个Sfi I(A/B)克隆位点和1100bp填充序列与鸡HS4绝缘子序列(cHS4)的慢病毒SIN-绝缘子载体(pTYF-EFnlacZcHS)来构建所有的慢病毒siRNA载体。通过Sfi I消化使H1-siRNA片段从pBS-H1-Sfi-siRNA质粒释放,并克隆到反向慢病毒pTYF-Sfi B/A载体中,以获得siRNA转导载体。通过DNA测序验证所有的siRNA序列。
DNA转染和HIV-1制备.为了分析对HIV-1的siRNA效应,如生产商(Qiagene)所述在12孔板中使用Superfect将293T细胞共转染pBS-H1-Sfi-siRNA(1.8μg/孔)和HIV-1DNA(0.2μg/孔)。转染后24小时收获上清液,用于MAGI和(逆转录)RT分析。为了制备HIV-1原种,将293T细胞转染HIV-1DNA,DNA加入12小时之后,以12小时间隔收集上清液3次。
慢病毒载体制备、滴度测定和转导.如前所述,通过DNA共转染生成慢病毒载体,通过离心或过滤浓缩病毒。使用β-半乳糖苷酶分析法在TE671细胞上测定病毒滴度。对于慢病毒转导,在polybrene(8μg/ml,Sigma)的存在下将细胞以本文所述的不同MOI转导。通过报道基因nlacZ分析监测转导效率。
HIV-1感染、RT和MAGI分析.将PBMC用RPMI1640培养基中的2μg/ml植物凝集素(PHA)活化1天,将细胞洗涤3次,然后以10MOI进行慢病毒siRNA载体转导。24小时后,将siRNA转导的PBMC用野生型HIV-1以MOI为20加以激发。在HIV-1激发后的不同时间点,收获上清液进行RT分析。每次收获时,对细胞进行计数,用新鲜培养基铺相同数目的活细胞。将Molt-3细胞用存在于含10μg/ml polybrene的RPMI1640中的慢病毒siRNA载体以MOI为10转导。为了测定病毒生成,将1×105细胞以300μl/孔新鲜RPMI 1640接种到24-孔板中,24小时后,收获上清液进行RT分析。
胞浆和核RNA分析.如前所述稍有变动收获核和胞浆RNA。Zaiss et al.,JVirol.2002;76:7209-7219.简言之,将细胞用冷的PBS洗2-3次,然后将细胞沉淀重悬于冰冷的含10mM Tris pH7.4、10mM NaCl、3mM MgCl2和25μl VRC(20mM,BRL)的溶液中,加入12.5μl 10%NP40,简单混合并置于冰上2-3min,使之温和裂解。800g离心2min,然后分离上清液和核沉淀物,使用TRI试剂(BRL)如生产商所述收获RNA。通过在甲醛琼脂糖凝胶上电泳、印迹并以使用对全长HIV-1或β-肌动蛋白特异的序列的随机引物探针(Stratagene,La Jolla,CA,USA)探测,对RNA进行分析。为了再次杂交,可以通过在含0.1%SDS的ddH2O中煮沸10分钟将旧的探针脱掉。
靶向多个高度保守HIV-1序列的siRNA.为了鉴定HIV-1基因组中的多个siRNA靶位点,查询了HIV Sequence Compendium。图2鉴定了整个病毒基因组中具有高度保守序列、后面为AA-二核苷酸的11个位点。这些位点包括非编码序列(U5i和U3i)和重叠gag、pol、int、vpu、env(1st vpui)和nef的编码序列(图2的下面一组)。U5i、U3i和nefi靶向所有的病毒RNA物质,而其他靶向全长的或剪接的病毒RNA。通过将两个合成的靶核苷酸退火并克隆到pBS质粒中人H1 polIII启动子之后,构建siRNA表达载体。为了产生慢病毒siRNA载体,将H1-siRNA表达序列盒从pBS-H1质粒切除,连接到慢病毒SIN绝缘子载体中内部EF1α-nlacZ报道基因的前面,如图3所示。图3的下面示出了预测的19-nt茎环siRNA前体和其相应HIV-1靶序列(2nd poli)的实例。
靶向gag、pol、int和vpu的siRNA对三个HIV-1株的有效抑制作用.采用DNA共转染来验证三个siRNA的作用。将pBS siRNA表达质粒与三个感染性分子克隆:pNL4-3、p89.6(p89)和p90CF402.1.8(p90)之一以20∶1的摩尔比共转染到293T细胞中,48h之后,收集培养上清液,分析病毒RT活性。靶向报道基因GFP的siRNA构建体(GFPi)作为对照。RT分析表明11个HIV-1特异性siRNA构建体中的5个:1st gagi、2nd poli、2nd inti和两个vpui对HIV-1NL4-3和HIV-189.6具有明显的抑制作用(>90%)。11个siRNA中的四个对HIV-190CF402.1.8,亚型A/E重组子的抑制效率>50%(2nd gagi、1st poli、2nd inti和2nd vpui)。靶向HIV-1基因组中非编码区的U5i和U3i siRNA对HIV-1NL4-3和HIV-189.6表现出~50%的抑制作用,但是对HIV-190CF402.1.8没有影响。和HIV-2分子克隆进行DNA共转染没有显示出任意siRNA构建体的抑制作用。
RT分析法测定HIV pol蛋白合成和活性.为了验证对病毒感染的siRNA效应,将293T细胞共转染pNL4-3和这些HIV-1特异性siRNA构建体或gfpi对照,48小时后,收获子代病毒,用于感染LTR-β-gal报道细胞系CD4+MAGI细胞。X-gal染色后对MAGI细胞中的子代病毒感染力进行定量比较,表明靶向病毒编码区的所有siRNA都有效抑制HIV-1感染(80~99%),其中包括nefi构建体(80%),虽然后者在RT分析中不表现出抑制作用。有意思的是,靶向HIV-1基因组中非编码区的U5i和U3i也表现出~50%的抑制作用。
慢病毒siRNA转导后预防HIV-1诱导的细胞毒性.瞬时转染分析表明质粒siRNA表达构建体在HIV-1抑制方面是有效的。因为慢病毒载体介导有效的基因递送和向靶细胞中的永久整合,可以克服瞬时siRNA基因转移的问题,因此还进一步检测了携带这些HIV-1特异性siRNA的慢病毒siRNA载体。通过将pNHP、pHEF-VSVG和pTYFsiRNA-EZ(图3)共转染到293T细胞中产生慢病毒siRNA载体,通过β-半乳糖苷酶分析法在TE671细胞上测定载体滴度。将这些不同慢病毒siRNA构建体的滴度进行比较。所有的慢病毒siRNA构建体产生1-1.5×107/ml的病毒滴度。还靶向辅助构建体的U5i、gagi、poli和inti siRNA构建体不显著影响载体滴度。2nd poli与其他构建体相比始终产生较低的载体滴度,最有可能是由于还干扰载体生成的有效的siRNA抑制。
为了验证对HIV-1的慢病毒siRNA抑制,首先对M-向性HIV-1感染敏感的两个人CD4+细胞系:贴壁淋巴瘤细胞系CEM-A和GHOST hi5细胞转导慢病毒siRNA载体gfpi、2nd gagi或2nd vpui。使慢病毒siRNA转导的CEM-A和GHOST hi5细胞增殖5天,然后用形成合胞体的HIV-1(HIV-1NL-AD8)激发,监测细胞的合胞体形成。结果表明转导gfpi的CEM-A细胞在整个培养过程中形成合胞体,多数在病毒感染后6天内死亡。相反,转导2nd gagi的CEM-A部分免受HIV-1NL-AD8的合胞体形成细胞毒效应,转导2nd vpui的CEM-A细胞大多数免受HIV-1NL-AD8的合胞体形成细胞毒效应。慢病毒siRNA转导和HIV-1NL-AD8激发后的GHOST hi5细胞中观察到了类似的效应。lacZ报道基因分析表明慢病毒转导效率接近100%。
对慢性感染的人淋巴细胞中HIV-1的慢病毒siRNA抑制.上述的转导和激发实验表明慢病毒siRNA保护细胞免受HIV-1感染和相关的细胞病变。研究了慢病毒siRNA是否抑制已建立的HIV-1感染细胞中的HIV-1。将已经慢性感染野生型HIV-1并连续产生高滴度HIV-1的MOLT-3人T细胞系转导包括gfpi、2nd poli、2nd inti、2nd vpui和后三个siRNA载体组合的慢病毒siRNA载体。使慢性HIV-1感染的MOLT-3细胞增殖超过9个月,所有的细胞都得到感染并连续产生HIV-1。转导慢病毒siRNA后,采用lacZ报道基因分析法监测siRNA转导。分析培养上清液中的病毒RT活性,以测定siRNA抑制作用。MOLT-3细胞的慢病毒转导效率>90%,三个慢病毒siRNA:2nd poli、2nd inti和2nd vpui,而非gfpi抑制慢性HIV-1阳性MOLT-3细胞中的HIV-1复制,三个不同HIV-1特异性siRNA载体的组合表现出最高的抑制效率(>95%)。
为了验证是否抑制作用由MOLT-3细胞中的HIV-1RNA降解引起,而不是由非特异性病毒干扰引起,收获并检验了胞浆和核RNA。通过琼脂糖凝胶的EtBr染色监测并显示RNA的质量。转导Mock、gfpi和2nd vpui的MOLT-3细胞的Northern分析表明转导HIV-1siRNA(2nd vpui)慢病毒的细胞中所有HIV-1RNA物质(全长和剪接的RNA)明显减少,而转导mock或gfpi的细胞中所有HIV-1RNA物质(全长和剪接的RNA)没有明显减少。siRNA抑制作用是HIV-1特异性的,因为未检测到非特异性的RNA降解,在所有这些样品中都存在类似量的β-肌动蛋白RNA。慢病毒2nd vpui抑制慢性感染的MOLT-3细胞中胞浆区(C)和核区(N)内的HIV-1RNA。
对原代外周血淋巴细胞中HIV-1的慢病毒siRNA抑制作用.为了研究对原代人淋巴细胞中HIV-1的siRNA抑制作用,将原代人淋巴细胞转导慢病毒siRNA载体,然后进行高MOI野生型HIV-1激发。将供者的PBMC用PHA活化,并转导编码gfpi、2nd poli或2nd vpui的慢病毒siRNA载体。慢病毒转导后,对PBMC进行计数,将相同数目的活细胞铺到24孔培养皿中,并用原代病毒株HIV-189.6激发。经β-半乳糖苷酶报道基因分析,估计PBMC的慢病毒转导效率~15%。HIV-1激发(dpc)后每1-2天收集培养物上清液,持续10天,进行RT活性分析。RT动力学表明:转导HIV-1特异性2nd poli和2nd vpui慢病毒载体的PBMC与转导mk和gfpi的PBMC相比HIV-189.6复制减少。用来源于不同供者、用HIV-1NL4-3激发的PBMC获得了类似的结果。
其他实施方案
应该理解,虽然本发明结合详述加以描述,但前面的说明书只是说明性的,并不限制本发明的范围,本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他特征、优点和改动也在所附权利要求书的保护范围内。
序列表
<110>CHANG,Lung-Ji
HE,Jin
<120>小干扰RNA基因治疗
<130>5853-327WO
<160>58
<170>Patentln version 3.2
<210>1
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<223>合成的寡核苷酸
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gaaa 64
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cggg 64
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gaaa 64
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gaaa 64
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agcttttcca aaaatagtaa gaatgtatag ccctctcttg aagggctata cattcttact 60
aggg 64
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cggg 64
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gaaa 64
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agcttttcca aaaattagca ggaagatggc cagtctcttg aactggccat cttcctgcta 60
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gatccccggt gaaggggcag tagtaattca agagattact actgcccctt cacctttttg 60
gaaa 64
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agcttttcca aaaaggtgaa ggggcagtag taatctcttg aattactact gccccttcac 60
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agcttttcca aaaagacagt ggcaatgaga gtgtctcttg aacactctca ttgccactgt 60
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gatccccgag cagaagacag tggcaattca agagattgcc actgtcttct gctctttttg 60
gaaa
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<400>39
agcttttcca aaaagagcag aagacagtgg caatctcttg aattgccact gtcttctgct 60
cggg 64
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gatccccgta gtgtgattgg atggccttca agagaggcca tccaatcaca ctactttttg 60
gaaa 64
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agcttttcca aaaagtagtg tgattggatg gcctctcttg aaggccatcc aatcacacta 60
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<213>人工的
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gatccccgga gagaacacca gcttgtttca agagaacaag ctggtgttct ctcctttttg 60
gaaa 64
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡核苷酸
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agcttttcca aaaaggagag aacaccagct tgttctcttg aaacaagctg gtgttctctc 60
cggg 64
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<212>RNA
<213>小家鼠
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aagcuccuuc ugcaacuuca g 21
<210>45
<211>49
<212>RNA
<213>小家鼠
<400>45
gcuccuucug caacuucagu ucaagagacu gaaguugcag aaggagcuu 49
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<211>21
<212>RNA
<213>1型人免疫缺陷病毒
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<213>1型人免疫缺陷病毒
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<213>人
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<400>58
aaggaauugg aggaaaugaa c 21
Claims (31)
1.一种慢病毒载体,包括编码小干扰RNA的核苷酸序列。
2.权利要求1的慢病毒载体,其中所述的载体包含在慢病毒毒粒中。
3.权利要求1的慢病毒载体,其中所述的小干扰RNA对癌相关基因特异。
4.权利要求3的慢病毒载体,其中所述的癌相关基因是Sca-2。
5.权利要求1的慢病毒载体,其中所述的小干扰RNA对存在于病毒中的基因特异。
6.权利要求5的慢病毒载体,其中所述的病毒是HIV。
7.权利要求6的慢病毒载体,其中所述的病毒是HIV-1,所述的基因是gag。
8.权利要求6的慢病毒载体,其中所述的病毒是HIV-1,所述的基因是pol。
9.权利要求6的慢病毒载体,其中所述的病毒是HIV-1,所述的基因是int。
10.权利要求6的慢病毒载体,其中所述的病毒是HIV-1,所述的基因是vpu。
11.权利要求1的慢病毒载体,其中所述的载体含有包括与编码小干扰RNA的核苷酸序列可操作连接的启动子的序列盒。
12.权利要求11的慢病毒载体,其中所述的序列盒相对于载体中的其他基因反向取向。
13.权利要求11的慢病毒载体,其中所述的序列盒相对于载体中的其他基因正向取向。
14.一种减少细胞中靶基因表达的方法,该方法包括下列步骤:
(A)将基因特异性小干扰RNA的慢病毒载体导入细胞;和
(B)将细胞置于基因特异性小干扰RNA能表达足够量的条件下,以导致基因表达的可检测下降。
15.权利要求14的方法,其中所述的载体包含在慢病毒毒粒中。
16.权利要求14的方法,其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
17.权利要求16的方法,其中所述的哺乳动物细胞是人类细胞。
18.权利要求16的方法,其中所述的细胞是肿瘤细胞。
19.权利要求18的方法,其中所述的基因是在癌细胞中比在正常细胞中以更高水平表达的基因。
20.权利要求19的方法,其中向细胞中导入编码基因特异性小干扰RNA的慢病毒载体的步骤导致细胞死亡。
21.权利要求16的方法,其中所述的细胞为病毒所感染,所述的靶基因是来自病毒的基因。
22.权利要求21的方法,其中所述的病毒是HIV。
23.权利要求22的方法,其中所述的病毒是HIV-1,所述的基因是gag。
24.权利要求22的方法,其中所述的病毒是HIV-1,所述的基因是pol。
25.权利要求22的方法,其中所述的病毒是HIV-1,所述的基因是int。
26.权利要求22的方法,其中所述的病毒是HIV-1,所述的基因是vpu。
27.权利要求16的方法,其中向细胞中导入编码基因特异性小干扰RNA的慢病毒载体的步骤导致对细胞中病毒复制的抑制。
28.权利要求14的方法,其中所述的载体含有包括与编码小干扰RNA的核苷酸序列可操作连接的启动子的序列盒。
29.权利要求28的方法,其中所述的序列盒相对于载体中的其他基因反向取向。
30.权利要求28的方法,其中所述的序列盒相对于载体中的其他基因正向取向。
31.权利要求14的方法,其中向细胞中导入编码基因特异性小干扰RNA的慢病毒载体的步骤导致编码小干扰RNA的核苷酸序列的表达超过3周。
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