CN1646704A

CN1646704A - 确定致病性病毒对蛋白酶抑制剂敏感性的组合物和方法

Info

Publication number: CN1646704A
Application number: CN03808382.5A
Authority: CN
Inventors: N·T·帕金; C·查皮; C·J·佩特罗普洛斯
Original assignee: Virologic Inc
Current assignee: Monogram Biosciences Inc
Priority date: 2002-02-15
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2005-07-27
Also published as: AR038557A1; WO2003070700A2; WO2003070700A3; CA2476403A1; EP1483416A4; AU2003211026A1; EP1483416B1; EP1483416A2; US20040224307A1; CA2476403C; US7384734B2; ES2381866T3; TW200303362A; ATE543915T1

Abstract

本发明提供了一种确定抗病毒药有效性的算法的研究方法，所述方法基于表型临床临界值指导的配对表型数据和基因型数据的综合分析。一方面，该算法允许使用者为患者提供有效治疗。该算法有助于预测受感染的个体是否对抗病毒化合物治疗发生应答，从而允许设计有效治疗方案而不会给患者带来不需要的副作用。而且由于避免了施用无效药物，故可以节省大量的时间和费用。

Description

确定致病性病毒对蛋白酶抑制剂敏感性的组合物和方法

本申请要求2002年2月15日提交的美国临时申请号60/357,171；2002年2月22日提交的美国临时申请号60/359,342；2002年6月26日提交的美国临时申请号60/392,377的优先权，上述申请全文引于此处作为参考。

1.发明领域

本发明涉及确定致病性病毒对抗病毒化合物敏感性的组合物和方法。所述组合物和方法可用于鉴别治疗病毒感染的有效药物治疗方案，以及鉴别和确定潜在治疗化合物的生物学有效性。

2.发明背景

自二十世纪八十年代早期以来，感染人免疫缺陷病毒(“HIV”)(获得性免疫缺陷综合征(“AIDS”)的致病因素)的人数已超过6千万。参见Lucas，2002，Lepr Rev.73(1)：64-71。HIV/AIDS如今在亚撒哈拉非洲是导致死亡的最主要原因，而且其在世界范围内导致死亡的原因中位列第四。在2001年末，全球大约有4千万HIV携带者。参见Norris，2002，Radiol Technol.73(4)：339-363。

现代抗-HIV药的靶点是HIV生命周期的不同阶段和HIV复制和/或生存必需的多种酶。已批准用于AIDS治疗的药物包括核苷逆转录酶抑制剂例如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿巴卡韦、核苷酸逆转录酶抑制剂例如替诺福韦，非核苷逆转录酶抑制剂例如奈韦拉平、依法韦仑、地拉韦啶和蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。

抗病毒药作用的一个结果是其能够对病毒复制施加足以使其选择抗药性突变株的选择压力(Herrmann等，1977，Ann NY Acad Sci 284：632-637)。当药物量增加时，复制病毒种群所受的选择压力增加从而促进抗药性突变株更快速生成。

由于抗药性的出现不可避免，因此必须设计在面对抗性病毒种群时能够最优化治疗的策略。确定抗药性对药物治疗失败(drugfailure)的影响是困难的，因为可能产生抗药性的患者也有可能具有其它能够使患者易于发生预后不良的其它因素(Richman，1994，AIDSRes Hum Retroviruses 10：901-905)。另外，每个患者通常都含有病毒突变株的不同混合物，所述混合物具有对抗病毒药不同敏感性的不同突变株。

用于评估抗病毒药抗性的传统方法是不足够的；确定HIV对抗病毒剂的抗性的经典检测法复杂、费时、昂贵、具有潜在危险，且不能针对特定患者的治疗进行定制。参见Barre-Sinoussi等，1983，Science220：868-871；Popovic等，1984，Science 224：497-500)和其变化形式(例如参见，Goedert等，1987，JAMA 257：331-334；Allain等，1987，N.Engl.J.Med.317：1114-1121；Piatak等，1993，Science259：1749-1754；Urdea，1993，Clin.Chem.39：725-726；Kellam和Larder，1994，Antimicrobial Agents and Chemo.38：23-30)。

目前通常使用两种方法检测对抗病毒药的抗性。第一种方法，称为表型分析，直接检测获自感染者病毒的病毒对特定抗病毒药的敏感性。Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44：920-928和Hertogs等，1998，Antimicrob Agents Chemother 42(2)：269-76描述了目前广泛使用的表型分析。Gunthard等，1998，AIDS Res HumRetroviruses 14：869-76和Schuurman等，1999，J Clin Microbiol.37：2291-96描述了目前流行的基因型测定法。Hirsch等，2000，JAMA283：2417-26对目前分析药物敏感性的可用检测法作了一般性分析。

第二种方法，称为基因型分析，检测病毒中能够影响药物敏感性的突变并可将特定基因突变和抗药性及药物失败联系起来。基因型分析检测取自患者的病毒，寻找与对特定药物抗性相关的特定基因突变的存在。基因型分析有一些优于表型分析的优势，最显著的是检测试验可以相对简易和快速地实施。检测可在短至数日的时间内完成，并且由于其复杂性较低，因此其在实施上会稍便宜。然而，基因型数据的解读要依赖于先前关于特定突变和药物敏感性改变间的相关性的认识。

Carrilio等(1998，J.Virol.72：7532-41)描述了对洛匹那韦敏感性降低的HIV-1变体的体外选择和鉴定。在8个氨基酸位置的9个不同突变与对洛匹那韦敏感性降低相关。后来的研究在预先用至少一种蛋白酶抑制剂治疗的HIV-感染患者的血浆样品中发现在HIV蛋白酶中11个位置的23个不同突变与对洛匹那韦的体外敏感性降低相关(Kempf等，2001，J.Virol.75：7462-69)。已有人假定了一种粗略的算法，该算法试图将对洛匹那韦的表型抗性与在11个经鉴定的位点观察到的突变数目相关联，并因此预测了洛匹那韦治疗的有效性(Kempf等，2000，Antiviral Therapy 5(suppl.3)：70，摘要89)。按照该算法，如果其蛋白酶中11个经鉴定的位点的突变为五个或低于五个突变，则病毒是对洛匹那韦治疗敏感的。如果在这11个位点的突变数目为6或更多，则预示该病毒具有对洛匹那韦治疗的抗性。

迄今为止关于使用降低的敏感性的基因型相关性来预测抗病毒药，特别是靶向针对不断进化的HIV的药物的有效性的努力充其量也是有缺陷的。能够更精确的预测给定抗病毒药或药物组合是否在对特定患者的治疗中有效的算法通过将不大可能成功的药物在其施用给该患者前鉴别出来从而节省时间和费用。更重要地是，其可通过减少在用不会改善他或她的HIV感染的强效毒素治疗时给他或她带来的损害从而提高患者的生活质量。因此，迫切需要一种预测特定药物是否在对特定患者的治疗中有效的更为精确的算法。此外，基于基因型的分析法比表型分析更快速并具有更高的成本效率。

3.发明概述

本发明提供了用于研发和使用确定抗病毒疗法或联合疗法有效性的算法的方法和组合物。该算法基于由表型临床临界值(对治疗的抗性开始而敏感性终止的点)指导的配对的表型和基因型数据的分析。该算法显著地改善了患者的生活质量，这是因为该算法通过精确预测给定的抗病毒药在治疗患者时是否有效，从而减少用不会改善他或她的HIV感染的强效毒素治疗时产生的对他或她产生的伤害。

一方面，本发明提供了能够向患者提供有效治疗方案的算法，该算法通过预测感染个体能否对抗病毒剂或联合剂治疗发生应答，从而设计出不会给患者带来不需要的副作用的有效治疗方案。而且，由于避免了无效药物的使用，故可以节省大量的时间和费用。

另一方面，本发明提供了确定病毒对抗病毒疗法敏感性的方法，包括在病毒基因组或病毒酶中检测是否存在与对抗病毒疗法敏感性降低相关的突变。

另一方面，本发明提供了确定抗病毒疗法对感染病毒个体的有效性的方法，该方法包括在来自所述个体的样品中检测是否存在与抗病毒疗法敏感性降低相关的突变。

本发明还提供了通过如上所述测定相同或不同的抗病毒疗法的有效性而监测接受抗病毒疗法的个体中病毒感染的临床进展的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了包括人免疫缺陷病毒(“HIV”)的蛋白酶中与对蛋白酶抑制剂敏感性降低相关的突变的核酸和多肽。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。

一方面，本发明提供了一种确定人免疫缺陷病毒是否可能具有对蛋白酶抑制剂治疗的抗性或敏感性的方法，该方法包括：在所述HIV中检测是否存在一个或多个表7中所列的HIV蛋白酶突变，给表7中所列出的每个突变设定加权系数，然后将所述加权系数相加从而获得所述个体的总分，其中如果所述总分等于或高于临界值则所述个体可能对所述蛋白酶抑制剂治疗具抗性，而如果所述总分低于所述临界值则所述个体可能对所述蛋白酶抑制剂治疗敏感。在一个实施方案中，临界值是6。在另一个实施方案中，临界值是7。在另一个实施方案中，临界值是8。

另一方面，本发明提供了一种确定人免疫缺陷病毒对蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性是否增加的方法，该方法包括：在所述HIV中检测是否存在一个或多个表7中所列的HIV蛋白酶突变；给表7中所列出每个突变设定加权系数，然后将所述加权系数相加从而获得所述HIV的总分，其中如果所述总分等于或高于临界值则所述HIV可能具有对蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的增高的可能性。在一个实施方案中，临界值是6。在另一个实施方案中，临界值是7。在另一个实施方案中，临界值是8。

另一方面，本发明提供了一种确定人免疫缺陷病毒感染个体是否可能具有对蛋白酶抑制剂治疗的抗性或敏感性的方法，包括：在来自所述个体的样品中检测是否存在一个或多个表7中所列的HIV蛋白酶突变，给表7中所列出的每个突变设定加权系数，然后将所述加权系数相加从而获得所述个体的总分，其中如果所述总分等于或高于临界值则所述个体可能对所述蛋白酶抑制剂治疗具抗性，而如果所述总分低于所述临界值则所述个体可能对所述蛋白酶抑制剂治疗具敏感性。在一个实施方案中，临界值是6。在另一个实施方案中，临界值是7。在另一个实施方案中，临界值是8。

另一方面，本发明提供了一种确定HIV对蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中或在编码所述蛋白酶的HIV的核酸中检测在所述蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在表明所述HIV对蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性增加，但前提是所述突变不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。在一个实施方案中，在所述HIV的蛋白酶中检测到所述突变。在另一个实施方案中，在所述HIV的编码蛋白酶的核酸中检测到所述突变。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变位于所述蛋白酶氨基酸序列的20，33，34，46，50，54，63，66，73，74，76，79，82，84或89位氨基酸，但前提是所述突变不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或184V。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变位于所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、47、53，71或95位氨基酸，但前提是所述突变不是V32I或147V。在一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变选自L10F、F53L和A71L。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变选自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。

另一方面，本发明提供了一种确定HIV感染个体对蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性是否增高的方法，包括：在来自所述个体的样品中检测，所述HIV蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示所述个体对蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性增加，但须所述突变不是K20M，K20R，M46I，M46L，I54L，I54T，I54V，L63P，V82A，V82F，V82T或I84V。在一个实施方案中，在所述HIV的蛋白酶中检测所述突变。在另一个实施方案中，在编码蛋白酶的HIV核苷酸中检测所述突变。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变位于所述HIV蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、46、50、54、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或184V。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变位于所述HIV蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸，但其前提条件是所述突变不是V32I或I47V。在一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变选自：L10F、F53L和A71L。

在另一个实施方案中，所述人免疫缺陷病毒是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。

另一方面，本发明提供了编码HIV中蛋白酶的分离的寡核苷酸，所述蛋白酶包括位于所述人免疫缺陷病毒中所述蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸的突变，其中所述突变与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。在一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约100个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约90个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约80个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约70个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约60个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约50个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约40个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约30个核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸的长度为约10～约20个核苷酸。

在另一个实施方案中，所述分离的寡核苷酸包括位于所述HIV中所述蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸的与对蛋白酶抑制剂敏感性降低相关的突变，但须所述突变不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或184V。寡核苷酸的长度可以是约10～约100个核苷酸、约10～约90个核苷酸、约10～约80个核苷酸、约10～约70个核苷酸、约10～约60个核苷酸、约10～约50个核苷酸、约10～约40个核苷酸、约10～约30个核苷酸、约10～约20个核苷酸。

在另一个实施方案中，所述分离的寡核苷酸编码HIV中包括在密码子位点20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89的突变的蛋白酶，其中所述突变与对蛋白酶抑制剂敏感性降低相关，但须所述密码子不编码20位的M或R、46位的I或L、54位的L、T或V，63位的P、82位的A、F或T或84位的V。寡核苷酸的长度可以是约10～约100个核苷酸、约10～约90个核苷酸、约10～约80个核苷酸、约10～约70个核苷酸、约10～约60个核苷酸、约10～约50个核苷酸、约10～约40个核苷酸、约10～约30个核苷酸、约10～约20个核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了编码HIV中包括在密码子位点20、33、34、50、54、63、66、73、74、76、79、82或89的突变的蛋白酶的分离的寡核苷酸，其中所述突变与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关，但须所述密码子不编码20位的M或R、33位的F或M、46位的I或L、54位的A、L、S、T或V，63位的P、73位的S或T、74位的S、82位的A、F或T或84位的V。寡核苷酸的长度可以是约10～约100个核苷酸、约10～约90个核苷酸、约10～约80个核苷酸、约10～约70个核苷酸、约10～约60个核苷酸、约10～约50个核苷酸、约10～约40个核苷酸、约10～约30个核苷酸、约10～约20个核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的1～10残基的多肽。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列的11～20残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的21～30残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的31～40残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的41～50残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的51～60残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的61～70残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的71～80残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的81～90残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列的91～99残基。

在另一个实施方案中，所述多肽与含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽具有至少70％，但低于100％的同一性。在另一个实施方案中，所述多肽含有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽含有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了通过序列特异性寡核苷酸探针和编码所述突变的人免疫缺陷病毒的核苷酸序列杂交检测蛋白酶中是否存在突变的方法，其中杂交的发生指示所述突变是否存在。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过核酸测序检测蛋白酶中是否存在突变的方法。

在一个实施方案中，个体正在接受或已经接受用所述或不同蛋白酶抑制剂的在先治疗。

在一个实施方案中，所述蛋白酶的20位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的20位氨基酸是I。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的33位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的33位氨基酸是I、F或V。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的33位氨基酸是I或V。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的34位氨基酸是含有碱性、极性或亲水性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的34位氨基酸是K。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的46位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的46位氨基酸是V。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的50位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的50位氨基酸是L或V。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、疏水性、非极性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是A或M。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是M。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是S。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的63位氨基酸是含有中性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的63位氨基酸是T。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的66位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的66位氨基酸是F或V。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的73位氨基酸是含有中性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的73位氨基酸是C或T。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的73位氨基酸是C。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是含有中性、疏水性、非极性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是A或P。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是含有中性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的74位氨基酸是S。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的76位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的76位氨基酸是V。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是含有中性、疏水性、非极性、酸性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是氨基酸含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是A。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是氨基酸含有酸性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是D或E。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的82位氨基酸是含有中性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的82位氨基酸是S。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是L。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的89位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的89位氨基酸是I或M。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的43位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的43位氨基酸是T。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的48位氨基酸是含有中性、疏水性或非极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的48位氨基酸是V。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的55位氨基酸是含有碱性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的55位氨基酸是R。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的58位氨基酸是含有酸性、亲水性或极性侧链的氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白酶的58位氨基酸是E。

另一方面，本发明提供了一种检测在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种检测在2个或多个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测在3个或多个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测在4个或多个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测在5个或多个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测在6个或多个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测在7个或多个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测在8个或多个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测在9个或多个氨基酸位点是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变的方法。

另一方面，本发明提供了一种确定HIV对第一个蛋白酶抑制剂治疗的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中检测所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在与第二个蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该HIV对所述第一个蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性增加，但须所述突变不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或184V。在一个实施方案中，第一个蛋白酶抑制剂是洛匹那韦或安泼那韦。在另一个实施方案中，第二个蛋白酶抑制剂是洛匹那韦或安泼那韦。

另一方面，本发明提供了一种确定HIV感染个体对第一个蛋白酶抑制剂治疗的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在来自所述个体的样品中检测所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在与第二个蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该个体对所述第一个蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性增加，但须所述突变不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或184V。在一个实施方案中，第一个蛋白酶抑制剂是洛匹那韦或安泼那韦。在另一个实施方案中，第二个蛋白酶抑制剂是洛匹那韦或安泼那韦。

4.附图简述

图.1图解说明HIV-1的基因组结构。

图.2是显示获自2038名患者的测试数据集的HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为蛋白酶中抗性相关突变数量的函数的散点图。基因型“临界值”为6，即如果其总分是6或更高，则该HIV被确定为具有对洛匹那韦的基因型抗性，而如果其总分低于6，则为基因型敏感性。

图.3是显示在除去了含有在与对洛匹那韦敏感性降低相关的任何位置的氨基酸的混合的样品后，HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为蛋白酶中抗性相关突变数量的函数的散点图。从该分析中排除那些同时包含野生型和突变体的样品。

图.4是显示蛋白酶中含有突变I50V的HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为这些样品中抗性相关突变数量的函数的散点图。

图.5是显示蛋白酶中含有突变V82A、F、S、T或I的HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为这些样品中抗性相关突变全部数量的函数的散点图。

图.6是显示蛋白酶中包含突变I54A、L、M、S、T或V的HIV样品对洛匹那韦(洛匹那韦倍数变化的对数)的敏感性作为这些样品中所述抗性相关突变总数的函数的散点图。

图.7是显示在除去不具有任何与蛋白酶抑制剂相关的原发突变且不具有对于任何蛋白酶抑制剂的高于2的IC₅₀倍数变化(“FC”)的样品后，HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为蛋白酶中抗性相关突变数量的函数的散点图。

图.8是显示在除去不具有任何与蛋白酶抑制剂相关的原发突变且不具有对于任何蛋白酶抑制剂的高于2的IC₅₀倍数变化(“FC”)的样品后和除去了含有在与对洛匹那韦敏感性降低相关的任何位置的氨基酸的混合的样品后，HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为蛋白酶中抗性相关突变数量的函数的散点图。仅将那些同时包含野生型或参照株和突变体的样品除去。

图.9是显示在除去不具有任何与蛋白酶抑制剂相关的原发突变且不具有对于任何蛋白酶抑制剂的高于2的IC₅₀倍数变化(“FC”)的样品后，含有蛋白酶中突变I50V的HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为蛋白酶中抗性相关突变总量的函数的散点图。

图.10是显示在除去不具有任何与蛋白酶抑制剂相关的原发突变且不具有对于任何蛋白酶抑制剂的高于2的IC₅₀倍数变化(“FC”)的样品后，含有蛋白酶中突变V82A，F，S，T或I的HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为那些样品中抗性相关突变总量的函数的散点图。

图.11是显示在除去不具有任何与蛋白酶抑制剂相关的原发突变且不具有对于任何蛋白酶抑制剂的高于2的IC₅₀倍数变化(“FC”)的样品后，含有蛋白酶中突变I54A、L、M、S、T或V的HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为那些样品中抗性相关突变总量的函数的散点图。

图.12A显示了NL4-3 HIV(GenBank登录号AF324493)蛋白酶的氨基酸序列(SEQ.ID.NO：1)。

图.12B显示了NL4-3 HIV(GenBank登录号AF324493)蛋白酶基因的核酸序列(SEQ.ID.NO：2)。

图.13显示了第82位氨基酸对洛匹那韦倍数变化的影响。

显示了中位数(水平线)，25th和75th百分位数(方框)，10th和90th百分位数(触须线)和极端值(点)。

图.14显示了54位氨基酸对洛匹那韦倍数变化的作用。显示了中位数(水平线)，25th和75th百分位数(方框)，10th和90th百分位数(触须线)和极端值(点)。

图.15是显示获自2195名患者的测试数据集的HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为蛋白酶中抗性相关突变数量的函数的散点图。基因型“临界值”是8，即，如果其总分是8或更高，则该HIV具有对洛匹那韦的基因型抗性，如果其总分低于8，则其具有基因型敏感性。

图.16是显示获自1099名患者的测试数据集的HIV样品对洛匹那韦的敏感性(Log洛匹那韦倍数变化)作为蛋白酶中抗性相关突变数量的函数的散点图。基因型“临界值”是7，即，如果其总分是7或更高，则该HIV具有对洛匹那韦的基因型抗性，如果其总分低于7，则其具有基因型敏感性。

图.17显示了HIV中与对安泼那韦(“APV)抗性相关的突变对针对洛匹那韦抗性的作用。显示了中位数(水平线)，25th和75th百分位数(方框)，10th和90th百分位数(触须线)和极端值(点)。

图.18显示了洛匹那韦倍数变化(“log LPV”)对安泼那韦倍数变化(“log APV”)的双变量散点图。

5.发明详述

本发明提供了用于研发确定抗病毒药的有效性的算法的方法和组合物，所述算法基于由表型临床临界值指导的配对的表型和基因型数据综合分析。

本发明还提供了确定病毒对抗病毒疗法敏感性的方法，确定抗病毒疗法对感染病毒个体有效性的方法，和监测接受抗病毒疗法的个体中病毒感染的临床进展的方法。另一方面，本发明还提供了核酸和多肽，它们包含人免疫缺陷病毒(“HIV”)的蛋白酶中与对蛋白酶抑制剂，例如，洛匹那韦的敏感性降低相关的突变。

5.1 缩略语

“LPV”是蛋白酶抑制剂洛匹那韦的缩写。

“APV”是蛋白酶抑制剂安泼那韦的缩写。

“PI”是蛋白酶抑制剂的缩写。

“ PT-R”和“ PT-S”分别是“表型抗性”和“表型敏感性”的缩写。

“ GT-R”和“ GT-S”分别是“基因型抗性”和“基因型敏感性”的缩写。

“PCR”是“聚合酶链反应”的缩写。

“FC”是“倍数变化”的缩写。

本文中使用的20种遗传编码的L-氨基酸的氨基酸表示法是常规的，如下所述：

氨基酸单字母缩写三字母缩写

丙氨酸 A Ala

精氨酸 R Arg

天冬酰胺 N Asn

天冬氨酸 D Asp

半胱氨酸 C Cys

谷氨酰胺 Q Gln

谷氨酸 E Glu

甘氨酸 G Gly

组氨酸 H His

异亮氨酸 I Ile

亮氨酸 L Leu

赖氨酸 K Lys

甲硫氨酸 M Met

苯丙氨酸 F Phe

脯氨酸 P Pro

丝氨酸 S Ser

苏氨酸 T Thr

色氨酸 W Trp

酪氨酸 Y Tyr

缬氨酸 V Val

除非另有描述，当多肽序列用一串单字母和/或三字母缩写表示时，该序列是以N→C方向的，这与习惯作法一致。

在本文中将序列中的各氨基酸表示为AN，其中A是序列中氨基酸的标准单字母标记，而N是序列中的位置。在本文中将氨基酸序列中的突变表示为A1，NA2，其中A1，是参照蛋白质序列中的氨基酸的标准单字母标记，A2是突变的蛋白质序列中氨基酸的标准单字母标记，而N是氨基酸序列中的位置。例如，G25M突变表示在第25位氨基酸上甘氨酸改变为甲硫氨酸。本文中，还可以将突变表示为NA₂，其中N是氨基酸序列中的位置而A₂是突变的蛋白质序列中氨基酸的标准单字母标记(例如，25M，是指在第25位氨基酸上野生型氨基酸改变为甲硫氨酸)。此外，本文中突变还可以表示为A₁N，其中A1是参照蛋白质序列中的氨基酸的标准单字母标记和N是氨基酸序列中的位置(例如，G25表示在第25位氨基酸上甘氨酸改变为任何氨基酸)。该表示法通常在当突变的蛋白质序列中的氨基酸或者是未知的或者(如果突变的蛋白质序列中的氨基酸可以是任何氨基酸)是除参照蛋白质序列所发现氨基酸之外的那些时使用。氨基酸位置根据包含突变的区域来源的蛋白质的全长序列进行计数。DNA序列中的核苷酸和点突变的表示法是类似的。

本说明书全文所使用的涉及包括特定核酸碱基序列的核酸的缩写是一般的单字母缩写。因此，当包括于核酸中时，天然存在的编码核酸碱基缩写如下：腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。除非另有所指，将表示为一串单字母缩写的单链核苷酸序列和双链序列的上链以5’-3′的方向表示。

5.2 定义

如本文所使用的，下述术语具有如下含义：除非另有所指，“原发突变”是指影响酶活性位点，即在酶底物复合物相关的、或当将病毒置于抗病毒剂的选择压力下时在复制早期重复出现的，或对针对抗病毒剂的突变的表型敏感性具有强作用的那些氨基酸位置的突变。

“ 继发突变”是指不是原发突变的且促成敏感性降低或补偿由原发突变所加的总体缺陷的突变。

“ 基因型分析”是确定生物体、生物体的部分、基因或基因部分的基因序列的检测法。所述检测法经常在HIV中使用以确定是否存在与抗药性相关的特定突变。

如本文所使用的，“ 基因型数据”是关于例如病毒基因型的数据。基因型数据的实例包括，但不限于，病毒、病毒部分、病毒基因、病毒基因部分、或与病毒核酸或蛋白质中一个或多个核苷酸或氨基酸残基具有同一性的核苷酸或氨基酸序列。

“ 表型分析”是检测病毒(例如HIV)对特定抗病毒剂的敏感性的检测法。

“ 敏感性”是指病毒对特定药物的反应。对药物敏感性减少或降低的病毒对药物的抗性增高或敏感性降低。对药物敏感性增高或增强或更高的病毒对药物的敏感性增高或抗性降低。

病毒对特定药物的表型敏感性是连续统一体。然而，其事实上可用于划定一个阈值或多个阈值用于简化对特定倍数变化结果的解读。对于已经收集了充分临床结果数据的药物，能够确定“临床临界值”，如下文所述。

“ 临床临界值”是指一个具体的点，在这个点抗性开始而敏感性消失。其可通过用特定药物治疗失败可能性显著增加的药物敏感性水平进行确定。如临床研究中所确定的，对于不同的抗病毒剂来说临界值不同。通过评估抗性和结果数据可在临床试验中确定临床临界值。治疗开始时检测药物敏感性(表型)。可在治疗过程的每个预定的时间点监测治疗应答，例如病毒负荷的改变。药物敏感性与治疗应答相关联并通过与治疗失败相关的抗性水平可确定临床临界值(全部实验结果的统计学分析)。

“ IC_n ”是指抑制浓度。其是在患者的血液或体外抑制致病性微生物(例如HIV)n％复制所需的药物浓度。因此，“IC₅₀”是指将病毒复制抑制了不存在药物时观测的水平的50％的抗病毒剂浓度。“患者IC₅₀”是指抑制来自患者的病毒的复制50％所需的药物浓度，“参照IC₅₀”是指抑制参照或野生型病毒复制50％所需的药物浓度。类似地，“IC₉₀”是指抑制病毒复制90％的抗病毒剂浓度。

“ 倍数变化”是患者病毒的药物敏感性和药物敏感的参照病毒的药物敏感性的数值对比。其是患者IC₅₀与药物敏感的参照IC₅₀的比值，即，患者IC₅₀/参照IC₅₀＝倍数变化(“FC”)。倍数变化为1.0提示患者病毒表现出与药物敏感的参照病毒一样的药物敏感性程度。倍数变化低于1提示患者病毒的药物敏感性高于参照病毒的药物敏感性。倍数变化高于1提示患者病毒的药物敏感度低于参照病毒的药物敏感性。倍数变化等于或高于临床临界值是指患者病毒具有对药物应答的较低的可能性。倍数变化低于临床临界值是指患者病毒具有对药物的敏感性。

“洛匹那韦倍数变化”是指洛匹那韦抗来自患者血浆样品的IC₅₀与洛匹那韦抗NL4-3(GenBank登录号AF324493)参照病毒株的IC₅₀的比值。

如果病毒的洛匹那韦倍数变化低于10，则该病毒对洛匹那韦“敏感”。

如果病毒的洛匹那韦倍数变化为10或高于10，则该病毒对洛匹那韦有“抗性”。

如果病毒具有一种特性，例如与针对抗病毒疗法敏感性降低相关的突变，则该病毒具有“针对抗病毒疗法敏感性降低的增高的可能性”。如果具有某种特性的病毒种群，平均来说，与其它不具有所述特性的相似病毒种群相比对抗病毒疗法更不敏感，则该病毒特性与敏感性降低相关。因此，特性存在和敏感性降低间的相关性既不必绝对化，也不需要特性对于参照的敏感性降低是必须的(即，该特性在敏感性降低上发挥诱发性的作用)或充分的(即，特性单独存在即为充分的)。

本文中术语“％序列同源性”与术语“％同源性”、“％序列同一性”和“％同一性”互换使用并是指当用序列对比程序进行比对时，2个或多个肽序列间氨基酸序列同一性的水平。例如，如本文所用的，80％同源性是指由确定的算法所确定的80％序列同一性的相同事物，并相应地与具有超过给定序列的长度的高于80％序列同一性的给定序列同源。序列同一性的示例性水平包括，但不限于，具有与特定序列60、70、80、85、90、95、98％或更高的序列同一性。

可用于确定两个序列间同一性的示例性计算机程序包括，但不限于，BLAST程序包，例如，BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，其已经公开于互联网上，其网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。还可参见Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10(特别参考公开的缺省设定，即，参数w＝4，t＝17)和Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402。当评估给定氨基酸序列相对于GenBank蛋白质序列和其它公开数据库中的氨基酸序列时，通常采用BLASTP程序实施序列检索。优选使用BLASTX程序在GenBank蛋白质序列库及其他公共数据库中检索在全部阅读框中翻译为氨基酸序列的核酸序列。BLASTP和BLASTX均使用开放缺口罚分为11.0和扩展缺口罚分为1.0的缺省参数以及用BLOSUM-62矩阵运行。参见Altschul等，1997。

为了确定2个或多个序列间的“％同一性”，使用例如，MacVector6.5版中的CLUSTAL-W程序实施优选的所选序列的比对，所述程序以缺省参数，开放缺口罚分为10.0，扩展缺口罚分为0.1，和BLOSUM 30相似性矩阵运行。

“ 极性氨基酸”是指含有在生理pH下不带电荷的侧链，但含有至少一个其中由双原子共享的电子对且靠一个原子保持的更近的键的亲水性氨基酸。遗传编码的极性氨基酸包括Asn(N)、GLN(Q)、Ser(S)和Thr(T)。

“ 非极性氨基酸”是指含有在生理pH下不带电荷的侧链并含有其中由双原子共享的电子对且由双原子的每个原子同等保持的键(即，侧链是非极性的)的疏水性氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(1)、Leu(L)、Met(M)和Val(V)。

“ 亲水性氨基酸”是指表现为根据Eisenberg等(1984，J.Mol.Biol.179：125-142)的标准化一致疏水性尺度低于0的疏水性的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Ser(S)和Thr(T)。

“ 疏水性氨基酸”是指表现为根据Eisenberg等(1984，J.Mol.Biol.179：125-142)的标准化一致疏水性尺度高于0的疏水性的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)，Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)。

“ 酸性氨基酸”是指含有pK值低于7的侧链的亲水性氨基酸。酸性氨基酸通常具有由于缺失氢离子而在生理pH下带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Asp(D)和Glu(E)。

“ 碱性氨基酸”是指含有pK值高于7的侧链的亲水性氨基酸。碱性氨基酸通常具有由于水合氢离子的联合而在生理pH下带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg(R)，His(H)和Lys(K)。

“突变”是与参照核酸或蛋白质相比，氨基酸序列或相应核苷酸序列中存在的变化。对于本发明包括HIV蛋白酶的实施方案，参照蛋白酶是存在于NL4-3 HIV(GenBank登录号AF324493)中的蛋白酶。虽然肽的氨基酸序列可直接用，例如，埃德曼(Edman)降解或质谱分析法进行确定，更典型地，肽的氨基酸序列可由编码该肽的核酸的核苷酸序列推导得出。任何本领域已知的用于确定核苷酸序列的方法都是可用的，例如，Maxam-Gilbert测序(Maxam等，1980，Method inEnzymology 65：499)，双脱氧法测序(Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad Sci.USA 74：5463)或基于杂交的方法(例如参见，Maniatis等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterScience，NY)。

病毒中的“ 抗性相关突变”(“RAM”)是与病毒针对抗病毒剂敏感性的降低相关的突变。RAM可在一些病毒，包括，但不限于人免疫缺陷病毒(“HIV”)中发现。所述突变可在一个或多个病毒蛋白质，例如，HIV的蛋白酶、整合酶、包膜蛋白或逆转录酶中发现。RAM可相对于参照株进行确定。对于本发明包括HIV蛋白酶的实施方案，所述参照蛋白酶是存在于NL4-3 HIV(GenBank登录号AF324493)中的蛋白酶。

“ 突变体”是含有相对于参照病毒、基因或蛋白质的一个或多个改变的序列的病毒、基因或蛋白质。

本文通篇所使用的术语“ 肽”、“ 多肽”和“ 蛋白质”可彼此互换。

术语“ 参照”和“ 野生型”在本文全文中可互换使用。

本文通篇所使用的术语“ 多聚核苷酸”、“ 寡核苷酸”和“ 核酸”可彼此互换。

术语“ 约”是指数字10％高于或10％低于其修饰数字。在数字必需是整数的情况下，例如，核苷酸长度或氨基酸长度，若得到的数字不是整数，则将其向上舍入或向下舍入离其最近的高于0的整数。

5.3 抗性相关突变

本发明提供了包括HIV蛋白酶中突变的核酸和多肽。优选地，HIV是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。HIV还可以是，例如，II型人免疫缺陷病毒(“HIV-2”)。在一个实施方案中，所述突变与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关。在另一个实施方案中，所述突变与对蛋白酶抑制剂敏感性的增加相关。蛋白酶抑制剂可以是本领域技术人员已知的任何蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。

一方面，本发明提供了包括HIV的蛋白酶中与对蛋白酶抑制剂，例如洛匹那韦敏感性增高或降低相关的突变的肽、多肽或蛋白质。在一个实施方案中，本发明提供了源自HIV蛋白酶的并包括与对蛋白酶抑制剂敏感性降低相关的突变的多肽。在另一个实施方案中，所述多肽包括超过一个与对蛋白酶抑制剂敏感性降低相关的突变。在另一个实施方案中，所述多肽包括与对蛋白酶抑制剂敏感性增加相关的突变。在另一个实施方案中，所述多肽包括超过一个与对蛋白酶抑制剂敏感性增加相关的突变。本发明的多肽包括由这些多肽修饰或来源自这些多肽的肽、多肽和蛋白质。在一个实施方案中，所述多肽包括翻译后修饰。在另一个实施方案中，所述多肽包括一个或多个氨基酸类似物。

在一个实施方案中，所述多肽包括一个或多个与对洛匹那韦的敏感性降低相关的突变。表1提供了与对洛匹那韦的敏感性降低相关的突变的列表。本申请文件全文所涉及的氨基酸或核苷酸位置，分别指SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中蛋白酶氨基酸或核苷酸的位置，或指其它病毒中的相应位置，所述病毒例如是在蛋白酶中以及编码相应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的蛋白酶的基因中有添加或缺失的病毒。

在另一个实施方案中，本发明提供了源自HIV蛋白酶的多肽，该多肽包括选自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M的突变。在另一个实施方案中，所述突变选自L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自K20I、M46V、I54M、L63T、V82S、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自K20I、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L63T、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。

在一个实施方案中，除了不同于SEQ ID NO：1之处在于其中包含至少一个与对蛋白酶抑制剂例如，洛匹那韦敏感性降低或增加相关的突变的序列，所述多肽含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述多肽包括SEQ ID NO：1的至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、85、90或95个连续的氨基酸。

在另一个实施方案中，所述多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的1～10残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的11～20残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列的21～30残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的31～40残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的41～50残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的51～60残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的61～70残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的71～80残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的81～90残基。在另一个实施方案中，多肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的91～99残基。

在另一个实施方案中，所述多肽与含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽具有至少70％，但低于100％的同一性。在另一个实施方案中，所述多肽含有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有高于80％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽含有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有高于90％同一性的氨基酸序列。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，将序列对齐以便实现最佳比较目的(例如，可将缺口引入第一个氨基酸或核苷酸序列中以便与第二个氨基酸或核苷酸序列进行最佳对比)。然后比较位于相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置被第二个序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸所占据，则该分子在这一位置是同一的。两个序列间的同一性百分比是序列间共有相同位置数的函数(％同一性＝#同一性位置/总#位置(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。

两个序列间同一性百分数的测定可采用数学算法完成。用于两个序列对比的数学算法的一个优选的，非限制性的实例是按Karlin和Altschul修改的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，(1993))Karlin和Altschul算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，(1990))。所述算法已引入Altschul等((1990)J.Mol.Biol.215：403-410)的NBLAST和XBLAST程序中。可采用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12实施BLAST核苷酸检索以获得与本发明的核苷酸分子同源的核苷酸序列。可采用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3实施BLAST蛋白质检索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得为了对比目的的缺口比对，可使用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所描述的缺口BLAST。或者，可使用PSI-Blast来实施迭代检索来检测分子间的亲缘关系。同前，当使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列对比的数学算法的另一优选的，非限制性的实例是Myers和Miller的算法(CABIOS(1989))。所述算法已引入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是CGC序列对比软件包的一部分。当使用ALIGN程序来对比氨基酸序列时，可使用PAM120加权余数表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。用于序列分析的其它算法是本领域已知的，并包括如描述于Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.，10：3-5中的ADVANCE和ADAM和描述于Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-8的FASTA。在FASTA中，ktup是设定检索灵敏度和速度的控制性选择。如果ktup＝2，可通过寻找对齐的残基对发现对比的两个序列中的相似区；如果ktup＝1，可检测单个对齐氨基酸。对于蛋白质序列可将ktup设为2或1，或对于DNA序列设为1～6。如果ktup不是特别指定的，则其缺省值对于蛋白质是2而对于DNA是6。

两个序列间的同一性百分数可使用与上述方法相似的技术进行确定，在含有或不含有允许的缺口时。在计算同一性百分数时，通常计算精确匹配。

在另一个实施方案中，本发明提供了含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的天然存在的或合成设计的等位基因变体。在另一个实施方案中，除了不同于由SEQ ID NO：2编码的、其中包括至少一种与对蛋白酶抑制剂例如，洛匹那韦的敏感性降低或增加相关的突变的多肽，本发明提供了由核苷酸分子编码的多肽，所述核苷酸分子是含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸分子的天然存在的或合成设计的等位基因变体。

另一方面，本发明提供了编码或涉及本发明的多肽或其生物活性部分的多聚核苷酸、寡核苷酸或核酸，包括，例如，足以用作鉴别、分析、突变或扩增本发明的核酸的杂交探针、PCR引物或测序引物的核酸分子。

在一个实施方案中，所述核酸编码包括对HIV蛋白酶中与对蛋白酶抑制剂例如，洛匹那韦的敏感性降低或增加相关的突变的多肽。在一个实施方案中，本发明提供了编码多肽的核酸，所述多肽源自HIV蛋白酶并包括一个或多个与对蛋白酶抑制剂的敏感性降低相关的突变。在另一个实施方案中，所述核酸编码包括一个或多个与对蛋白酶抑制剂的敏感性增高相关的突变的多肽。本发明的核酸包括由这些核酸序列修饰和衍生的核酸、多聚核苷酸和寡核苷酸。在一个实施方案中，核酸包括核酸类似物。

在一个实施方案中，核酸可以具有HIV基因组的长度，即，约9200个核苷酸。在另一个实施方案中，核苷酸可以具有大约是HIV蛋白酶编码序列的长度，例如，约300核苷酸。在其它实施方案中，核酸可对应于HIV基因组的片段或HIV蛋白酶编码序列的片段。例如，核酸的长度可以是约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250或300个核苷酸。或者，核酸的长度可以是，例如，约350、375、400、425、450，475或500个核苷酸。核酸的长度可以是，例如，小于3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500或9000个核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述核酸具有适于检测本文所描述的突变，例如作为探针或引物的长度和序列。

在一个实施方案中，所述核酸编码包括一个或多个与洛匹那韦敏感性的降低相关的突变的多肽。表1提供了对洛匹那韦敏感性的降低相关的突变的列表。

在另一个实施方案中，本发明提供了编码源自HIV蛋白酶并包括选自K20I、M46V、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M的突变的多肽的核酸。在另一个实施方案中，所述突变选自L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自K20I、M46V、I54M、L63T、V82S、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自：L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中、所述突变选自：K20I，E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L63T、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自：E34D、E34K、E34Q、I50L、I50V、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。

在另一个实施方案中，除了与SEQ ID NO：2不同之处在于其编码至少一个与对蛋白酶抑制剂例如，洛匹那韦敏感性降低或增加相关的突变的序列，寡核苷酸含有SEQ ID NO：2的核酸序列。在其它实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、150、180、210、240、255、270或285个连续核酸。

在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的1～30残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ IDNO：2的核苷酸序列的31～60残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的61～90残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的91～120残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的121～150残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的151～180残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的181～210残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的211～240残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ IDNO：2的核苷酸序列的241～270残基。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的271～297残基。

在另一个实施方案中，所述寡核苷酸与含有SEQ ID NO：2的核酸序列的寡核苷酸具有至少60％，但低于100％的同一性。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸含有与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有高于70％的同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸含有与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有高于80％的同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸含有与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有高于90％的同一性的核苷酸序列。两个核苷酸序列的同一性百分数可按前面所述进行确定。

除SEQ ID NO：2的核苷酸序列外，本领域技术人员会认识到导致氨基酸序列改变的DNA序列多态性可存在于种群中(例如，人类种群)。由于天然等位基因变异所述遗传多态性可存在于种群中的个体中。天然等位基因变异通常能导致特定基因的核苷酸序列中1-5％的变异。作为天然等位基因变异结果的并且未改变功能活性的任何和全部所述核苷酸变异和结果得到的氨基酸变异或多态性均包含在本发明的范围中。

在另一个实施方案中，本发明提供了适于用作检测本发明的核苷酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。本发明的核酸分子可仅包括编码全长本发明的多肽的核酸序列的部分例如，可用作探针或引物的片段或编码本发明的多肽的生物活性部分的片段。该探针可包括与其连接的标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。在各实施方案中，本发明的核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸主链上进行修饰。

5.4 发现药物抗性相关的病毒突变

另一方面，本发明提供了在病毒或病毒衍生物中发现抗性相关的突变的方法。

5.4.1 病毒和病毒样品

根据本发明的抗性相关的突变(“RAM”)可存在于任何类型的病毒，例如在动物中发现的任何病毒中。在本发明的一个实施方案中，所述病毒包括已知感染哺乳动物的病毒，所述哺乳动物包括狗、猫、马、羊、牛等。在一个优选的实施方案中，所述病毒是已知感染灵长类动物的病毒。在一个更优选的实施方案中，所述病毒是已知感染人类的病毒。感染人类病毒的实例包括，但不限于，人免疫缺陷病毒(“HIV”)、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、其它人疱疹病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲、乙和丙型肝炎病毒、鼻病毒和人***状瘤病毒。在本发明的一个实施方案中，病毒是HIV。优选地，病毒是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。HIV还可以是，例如，II型人免疫缺陷病毒(“HIV-2”)。上述是目前存在对其有效抗病毒化疗的特定病毒的代表并表示逆转录病毒家族、疱疹病毒、正粘病毒、副粘病毒、微小RNA病毒、黄病毒、肺病毒和肝DNA病毒。本发明可用于由这些家族内的其它病毒所产生的其它病毒感染以及从其它病毒家族中的目前是否存在有效治疗的病毒引起的病毒感染。

根据本发明的RAM可在用本领域任何已知的获取病毒样品的方法获得的病毒样品中发现。所述方法包括，但不限于，从病毒感染的人或动物获取病毒样品或从病毒培养物中获取病毒样品。在一个实施方案中，所述病毒样品获自病毒感染的人类个体。所述病毒样品可获自感染个体的身体的任何部分或任何预期含有病毒的分泌物。所述部分的实例包括，但不限于血液、血清、血浆、唾液、淋巴液、***、***粘液和其它体液的样品。在一个实施方案中，所述样品是血液、血清或血浆样品。

在另一个实施方案中，根据本发明的RAM存在于获自培养物的病毒中。在某些实施方案中，所述培养物可获自实验室。在其它实施方案中，所述培养物可获自保藏中心，例如，美国典型培养物保藏中心。

在某些的实施方案中，根据本发明的RAM存在于病毒衍生物中。在一个实施方案中，病毒衍生物自身不具有病原性。在另一个实施方案中，病毒的衍生物是基于质粒的***，其中质粒的复制或用所述质粒转染的细胞的复制受选择压力的是否存在的影响，从而选择增加对选择压力抗性的突变。在某些实施方案中，病毒衍生物包括所述的核酸或蛋白质，例如作为抗病毒疗法靶位的那些核酸或蛋白质。在一个实施方案中，可将所述的基因掺入载体中。例如参见，美国专利号5,837,464和6,242,187和PCT公开WO99/67427，上述各专利引入本文作为参考。在一个优选的实施方案中，基因可以是编码蛋白酶或逆转录酶的基因。

在另一个实施方案中，无须使用完整病毒。代替地，可使用掺入载体的病毒部分。优选地，抗病毒药靶向所使用的该病毒部分。

在另一个实施方案中，根据本发明的RAM存在于遗传修饰的病毒中。可使用本领域中已知任何用于遗传修饰病毒的方法对病毒进行遗传修饰。例如，可将病毒在实验室培养基中按需要的次数培养传代。在一个实施方案中，不施加选择压力(即，不对病毒施加适于具有特定特征的病毒的复制的处理)，经过随机遗传漂变(random geneticdrift)而累积新的突变。在另一个实施方案中，在病毒在培养基中培养时(即，该病毒在适于具有一个或多个特性的病毒的复制的条件下培养)，将选择压力施加于该病毒。在一个实施方案中，选择压力是抗病毒疗法。任何已知的抗病毒疗法均可用作选择压力。在一个实施方案中，所述病毒是HIV而所述选择压力是蛋白酶抑制剂。在另一个实施方案中，所述病毒是HIV-1而所述选择压力是蛋白酶抑制剂。任何蛋白酶抑制剂均可用于施加选择压力。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。通过用蛋白酶抑制剂，例如，洛匹那韦处理体外培养的HIV，技术人员可选择具有对安泼那韦抗性增加的HIV的突变株。可调整所述选择压力的严紧性以便增加或降低不具有所选特性的病毒的存活。

另一方面，根据本发明的RAM可通过诱变处理病毒、病毒基因组或病毒基因组的部分进行制备。本领域中已知的任何诱变方法均可用于该目的。在一个实施方案中，所述诱变基本上是随机的。在另一个实施方案中，基本上随机的诱变通过对病毒、病毒基因组或病毒基因组的部分进行诱变处理进行实施。在另一个实施方案中，对编码作为抗病毒疗法的靶位的病毒蛋白的基因进行诱变处理。基本随机的诱变处理的实例包括，例如，暴露于诱变剂(例如，溴乙锭、乙基甲烷磺酯、乙基亚硝基脲(ENU)等)、放射(例如，紫外线)、***和/或除去可转座元件(例如，Tn5、Tn10)或在细胞、细胞提取物或在具有增高的诱变率的体外复制***中的复制。例如参见，Russell等，1979，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 76：5918-5922；Russell，W.，1982，Environmental Mutagens and Carcinogens：Proceedings of the ThirdInternational Conference on Environmental Mutagens。本领域技术人员将能认识到虽然每一个这些诱变方法基本上在分子水平是随机的，每个都具有其自身优选的靶位。

另一方面，可能影响病毒对抗病毒治疗的敏感性的突变采用定点诱变进行制备。可使用本领域已知的任何定点诱变方法(例如参见，Maniatis等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterScience，NY)。可将所述定点诱变实施于，例如，特定的基因或基因组区、基因或基因组区的特定部分、或基因或基因组区中的一个或几个特定核苷酸。在一个实施方案中，将所述定点诱变实施于病毒基因组区、基因、基因片段或基于一个或多个标准的核苷酸。在一个实施方案中，对基因或基因的部分实施定点诱变，因为其编码已知为或疑为抗病毒疗法靶位的蛋白质，例如，编码HIV蛋白酶的基因。在另一个实施方案中，选择基因的部分或基因中的一个或少数几个核苷酸进行定点诱变。在一个实施方案中，将要进行诱变处理的核苷酸编码已知或疑为与抗病毒化合物相互作用的氨基酸残基。在另一个实施方案中，将要诱变处理的核苷酸编码已知或疑为在具有针对抗病毒治疗敏感性降低的病毒株中突变的氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述诱变处理的核苷酸编码的氨基酸残基毗邻或靠近已知或疑为与抗病毒化合物相互作用的或已知或疑为在具有针对抗病毒疗法敏感性降低的病毒株中突变的蛋白质残基初级序列。在另一个实施方案中，诱变处理的核苷酸编码毗邻或靠近已知为或疑为与抗病毒化合物发生相互作用或已知为或疑为在具有对抗病毒疗法增高的敏感性的病毒株中突变的蛋白质残基的二级、三级或四级结构氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述诱变处理的核苷酸编码氨基酸残基位于或靠近已知为或疑为与抗病毒化合物结合的蛋白质的活性位点。例如参见，Sarkar和Sommer，1990，Biotechniques，8：404-407。

5.4.2 检测病毒中是否存在突变

可通过本领域中已知的任何用于检测突变的方法检测病毒中是否存在根据本发明的RAM。可在编码特定蛋白质的病毒基因中或在该蛋白质自身，即在该蛋白质的氨基酸序列中检测突变。

在一个实施方案中，所述突变位于病毒基因组中。所述突变可位于，例如，编码病毒蛋白质的基因中，在编码病毒蛋白的基因的顺式或反式作用调控序列、基因间隔序列或内含子序列内。突变能够影响改变病毒针对抗病毒疗法的敏感性的病毒结构、功能、复制或环境的任何方面。在一个实施方案中，突变位于是抗病毒疗法靶位的编码病毒蛋白质的基因内。

可使用多种技术检测病毒基因中的突变。病毒DNA或RNA可用作所述试验技术的起点，并可根据本领域技术人员所众所周知的标准方法进行分离。

病毒DNA或RNA可用于杂交或扩增试验中，从而检测涉及基因结构异常情况，包括点突变、***、缺失和基因组重排。所述试验可包括，但不限于，Southern分析(Southern，1975，J.Mol.Biol.98：503-517)，单链构象多态性分析(SSCP)(Orita等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2766-2770)，和PCR分析(美国专利号4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188；PCR Strategies，1995 Innis等(eds.)，Academic Press，Inc.)。

用于检测基因特异性突变的所述诊断方法可包括例如，将所述病毒核酸与一个或多个标记的核酸试剂包括重组DNA分子克隆的基因或其简并变异体，在适于这些试剂与其互补序列特异性退火的条件下进行接触和孵育。优选地，这些核酸试剂的长度是至少15～30个核苷酸。在孵育后，从所述核苷酸分子杂交体中除去所有非退火的核酸。如果存在任何所述分子，则可检测到发生杂交的核酸的存在。使用所述检测方案，可将来自所述病毒的核酸固定于，例如，固体载体例如膜，或塑料表面例如微量滴定板或聚苯乙烯珠上。在该情况下，在孵育后，非退火的，标记的上述类型的核酸试剂可被很容易的去除。使用本领域技术人员众所周知的标准技术实施对剩下的，退火的，标记的核酸试剂的检测。可将核苷酸试剂退火所对的基因序列与从正常基因序列中推测的退火模式相比较从而确定基因突变是否存在。

检测基因特异性核酸分子的选择性诊断方法可包括核酸分子的扩增，例如通过PCR(美国专利号4,683,202；4,683,195；4,800,159；和4,965,188；PCR Strategies，1995 Innis等(eds.)，AcademicPress，Inc.)，随后用本领域技术人员所众所周知的技术检测扩增的分子。可将得到的扩增的序列与如果扩增的核酸仅含有各基因的正常拷贝时所期望的那些序列相比较以便测定基因突变是否存在。

此外，可采用本领域中任何已知测序方法对所述核苷酸测序。例如，所述病毒DNA可通过描述于Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463，进一步描述于Messing等，1981，Nuc.Acids Res.9：309的双脱氧法，或通过描述于Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65：499的方法进行测序。还可参见Maniatis等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterScience，NY所描述的技术。

针对所述病毒基因产物，即，病毒蛋白质或病毒肽片段的抗体也可用于在病毒蛋白质中检测突变。或者，所述病毒蛋白质或肽片段可采用本领域中任何已知的为了产生所述蛋白质的氨基酸序列的测序方法测序。所述方法的一个实例是可用于小蛋白质或多肽测序的埃德曼降解法。较大蛋白质可最初用本领域中已知的化学或酶试剂，例如，溴化氰、羟胺、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶剪切，然后通过埃德曼降解法进行测序。

5.5 检测突变体病毒的表型敏感性

本领域中任何已知方法均可用于测定突变体病毒或病毒种群对抗病毒疗法的表型敏感性。例如参见美国专利号5,837,464和6,242,187，将其全文引入此处作为参考。在某些实施方案中，实施表型分析，即病毒对给定抗病毒剂的敏感性可通过无所述突变的参照病毒的敏感性进行检测。该检测是药物敏感性的直接、定量的检测并可通过本领域中确定病毒针对抗病毒剂的敏感性的任何已知方法进行实施。所述方法的实例包括，但不限于，通过参照病毒确定IC₅₀值的倍数变化。表型分析检测了特定病毒株在存在药物抑制剂时在体外的生长能力。当与抑制所述参照病毒所需药物量相比，抑制病毒活性需要更多药物时，该病毒具有对特定药物较低的敏感性。

在一个实施方案中，对病毒株实施表型分析并用于计算药物的IC₅₀或IC₉₀。也可将分析的结果表示为每个病毒株的与药物敏感性对照株或来自同一患者的先前的病毒株相比的IC₅₀或IC₉₀中的倍数变化。因为将所述病毒直接实施每个有效抗病毒药物治疗，故可将结果直接与治疗应答相关联。例如，如果该患者病毒显示了对特定药物的抗性，则将该药物从该患者的治疗方案中除去或省略，这可使得医师可以设计在较长期更可能有效的的治疗方案。

在另一个实施方案中，采用重组病毒试验(“RVAs”)实施所述表型分析。RVAs使用通过病毒载体和扩增自患者病毒的病毒基因序列间的同源重组产生的病毒原种。在某些实施方案中，所述病毒载体是HIV载体而所述病毒基因序列可以是蛋白酶和逆转录酶序列。

在一个实施方案中，使用PHENOSENSE^TM(ViroLogic Inc.，SouthSan Francisco，CA)实施所述表型分析。参见Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44：920-928；美国专利号5,837,464和6,242,187。PHENOSENSE^TM是实现表型分析优势并克服先前分析法的缺陷的表型分析法。因为该分析法已经实现自动化，PHENOSENSE^TM在受控的条件下能够提供较高通量。结果是能够准确确定患者的HIV分离群对目前所有有效抗逆转录病毒药的敏感性图谱的检测，并将结果在收到样品后约10～约15日内直接传送给医师。PHENOSENSE^TM是准确的并能在仅一个病毒复制周期内即可获得结果，从而避免选择病毒亚群。该结果是定量的，用于衡量药物敏感性的不同程度，同时也是灵敏的，该检测可实施于病毒负荷约500拷贝/ml的样品并能检测检测浓度为总病毒种群的浓度的10％或更低的某些药物抗性病毒的少数种群。而且，所述结果为可重复的且在所实施的约95％的试验中的变化(依赖于药物)低于约1.4-2.5倍。

PHENOSENSE^TM可使用来自扩增的病毒基因序列的核酸。如5.4.1节中所述，包含病毒的样品可以是来自所述病毒感染的人或动物的样品或来自病毒细胞培养物的样品。在一个实施方案中，所述病毒样品包括遗传修饰的实验室株。

然后抗性测试载体(“RTV”)可通过采用本领域中任何已知的将基因序列掺入至载体的方法将扩增的病毒基因序列掺入复制缺陷型病毒载体的方式进行构建。在一个实施方案中，使用限制性内切酶和常规克隆方法。参见Maniatis等，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and Wiley InterScience，NY。在某些实施方案中，使用限制性内切酶ApaI和PinAI。优选地，复制缺陷型病毒载体是指示基因病毒载体(“IGVV”)。在某些实施方案中，所述病毒载体包含检测RTV复制的元件。优选地，病毒载体包含荧光素酶表达盒。

所述测定可通过首先用RTV DNA和表达另一逆转录病毒，例如，双嗜性鼠白血病病毒(MLV)的包膜蛋白的质粒共转染宿主细胞进行实施。转染后，收集病毒颗粒并用于感染新鲜靶细胞。单个病毒复制周期的完成可通过用于检测载体中复制的方法进行检测。在一个实施方案中，单个病毒复制周期的完成导致荧光素酶的生成。可在转染步骤或感染步骤以一系列浓度加入抗病毒剂。

针对抗病毒剂的敏感性可通过比较载体在存在和不存在抗病毒剂时的复制进行检测。例如，针对抗病毒剂的敏感性可通过比较在存在和不存在抗病毒剂时荧光素酶活性进行检测。敏感性病毒在存在抗病毒剂时将产生低水平的荧光素酶活性，而具有降低的敏感性的病毒将产生较高水平的荧光素酶活性。

在一个实施方案中，将PHENOSENSE^TM用于评价HIV-1对抗病毒药的表型敏感性。优选地，所述抗病毒药是蛋白酶抑制剂。更优选地，其为洛匹那韦。在某些实施方案中，所述参照病毒株是HIV株NL4-3或HXB-2.

在一个实施方案中，病毒核酸，例如，HIV-1 RNA可提取自血浆样品，完整病毒基因或其片段可采用例如(但不限于)PCR的方法进行扩增。参见例如，Hertogs等，1998，Antimicrob Agents Chemother42(2)：269-76。在一个实施例中，包含全部HIV-1 PR-和RT-编码序列的2.2-kb片段可采用巢式逆转录-PCR进行扩增。然后可将扩增的核酸库，例如，PR-RT-编码序列，与pGEMT3deltaPRT质粒共转染至宿主细胞例如CD4+T淋巴细胞(MT4)中，所述质粒中删除了大部分PR(密码子10～99)和RT(密码子1～482)序列。同源重组导致含有病毒编码序列，例如源自血浆中HIV-1 RNA的PR-和RT-编码序列的嵌合病毒产生。嵌合病毒针对目前所有靶向转染基因的产物的有效抗病毒剂(例如proRT和/或PR抑制剂)的敏感性，可通过本领域已知的任何细胞存活试验进行测定。例如，可以在能够实现高样品通量的自动化***中使用基于MT4细胞-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑的细胞存活试验。对所有抗病毒剂例如RT和PR抑制剂的抗性图谱可用单PR-RT-抗病毒图(Antivirogram)进行图解显示。

本领域技术人员已知的其它用于评价病毒对抗病毒药的表型敏感性的实验也可使用。例如参见，Shi和Mellors，1997，AntimicrobAgents Chemother.41(12)：2781-85；Gervaix等，1997，Proc NatlAcad Sci U.S.A.94(9)：4653-8，这些文件全文引入此处作为参考。

在另一个实施方案中，病毒对用抗病毒疗法治疗的敏感性通过检测在存在所述抗病毒疗法时，该抗病毒疗法的靶位的活性进行测定。在一个实施方案中，所述病毒是HIV，所述抗病毒疗法是蛋白酶抑制剂，而抗病毒疗法的靶点是HIV蛋白酶。例如参见，美国专利号5,436,131；6,103,462，这些文件全文引入此处作为参考。

5.6 将表型敏感性和基因型敏感性相关联

可将本领域中任何已知方法用于确定突变是否与病毒针对抗病毒疗法的敏感性的增加相关联并因此是根据本发明的RAM。在一个实施方案中，P值用于确定相关性的统计学显著性，这样P值越小，检测的显著性越高。优选地，P值须低于0.05。更优选地，P值须低于0.01。P值可按本领域技术人员已知的任何方法进行计算。在一个实施方案中，采用Fisher′s精确概率检验计算P值。例如参见，David Freedman，Robert Pisani & Roger Purves，1980，STATISTICS，W.W.Norton，New York。

在一个实施方案中，将某些含有被分析突变的具有低于或高于10倍的IC₅₀倍数变化的样品与不含所述突变的某些样品比较。可构建2×2表并且可使用Fisher′s精确概率检验计算P值(参见实施例5)。将小于0.05或0.01的P值归为具有统计学显著性。

5.7 确定对抗病毒疗法的敏感性

另一方面，本发明提供了一种确定病毒对抗病毒疗法的敏感性的方法。抗性相关突变(RAM)可被鉴定并将其与病毒对抗病毒疗法的降低的敏感性相关联，如上述5.3-5.6节中所述。可采用本领域的任何已知方法例如上述5.4.2节中所述检测病毒中RAM的存在。病毒中RAM的存在可指示该病毒具有对所述抗病毒疗法敏感性降低的增高的可能性。在一个实施方案中，所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。在另一个实施方案中，所述病毒是I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)。在另一个实施方案中，所述抗病毒疗法是蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定HIV对蛋白酶抑制剂治疗的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中或在所述HIV的编码所述蛋白酶的核酸中检测在所述蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关的突变，其中所述突变的存在表明与无所述突变的HIV相比例如，野生型或对照HIV，所述HIV对蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V在一个实施方案中，在所述HIV的蛋白酶中检测所述突变。在另一个实施方案中，在所述HIV的编码蛋白酶的核酸中检测所述突变。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变位于所述蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、50、54、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或I84V。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变位于所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸，但其前提条件是所述突变不是V32I或I47V。在一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变选自L10F、F53L和A71L。

另一方面，本发明提供了一种确定HIV对第一个蛋白酶抑制剂治疗的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中检测是否存在与第二个蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该HIV对第一个蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性增加。在一个实施方案中，所述第一个蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。在另一个实施方案中，所述第二个蛋白酶抑制剂是安泼那韦。在另一个实施方案中，所述蛋白酶中的突变位于蛋白酶的氨基酸序列的11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸，但其前提条件是所述突变不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A、或I84V。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定HIV感染个体对第一个蛋白酶抑制剂治疗的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在来自所述个体的样品中检测所述蛋白酶的氨基酸序列的11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在与第二个蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该个体对第一个蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或I84V。

另一方面，本发明提供了一种确定病毒感染个体对抗病毒疗法的敏感性的方法。可鉴定抗性相关突变(RAM)并将其与病毒对抗病毒疗法的降低的敏感性相关联，如上述5.3-5.6节所述。可采用本领域的任何已知方法例如上述5.4.2节中所述检测存在于来自所述个体的样品中的病毒中RAM的存在。病毒中RAM的存在可指示该个体具有对所述抗病毒疗法敏感性降低的增高的可能性。在一个实施方案中，所述病毒是HIV。在另一个实施方案中，病毒是HIV-1。在另一个实施方案中，所述抗病毒疗法是蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定HIV感染的个体对蛋白酶抑制剂治疗的降低的敏感性的可能性是否增加的方法，包括在来自所述个体的样品中检测在HIV蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性的降低相关的突变，其中所述突变的存在指示与用不含有所述突变的HIV例如，野生型或对照HIV感染的个体相比，该个体对蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或184V。在一个实施方案中，在所述HIV的蛋白酶中检测所述突变。在另一个实施方案中，在所述HIV的编码蛋白酶的核酸中检测所述突变。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定蛋白酶抑制剂治疗对HIV感染个体有效性的方法，包括在来自所述个体的样品中检测，在HIV蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、46、50、54、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示所述个体对所述蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、L33F、L33M、K43T、M46I、M46L、I50V、I54A、I54L、I54M、I54S、I54T、I54V、L63P、G73A、G73S、G73T、T74S、V82A、V82F、V82I、V82S、V82T或I84V。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变位于HIV蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸，但其前提条件是所述突变不是V32I或147V。在一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变选自L10F、F53L和A71L。

在另一个实施方案中，与所述蛋白酶抑制剂治疗敏感性降低相关的突变选自：K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50L、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、I50V、I54M、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。在另一个实施方案中，所述突变选自K20I、M46V、I50L、L63T、I84A、I84L、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、G73C、T74A、T74P、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。

5.8 构建算法

一方面，本发明提供了一种将病毒的基因型数据与所述病毒的表型数据相关联的算法的构建方法。在一个实施方案中，该表型数据涉及病毒对抗病毒疗法的敏感性。在另一个实施方案中，所述抗病毒疗法是抗病毒化合物。在另一个实施方案中，抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂。在另一个实施方案中，蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。

在一个实施方案中，构建所述算法的方法包括建立将关于病毒组的基因型数据与关于病毒组的表型数据相关联的一个规则或多个规则。

在一个实施方案中，建立包括病毒组中每一病毒的基因型数据和表型数据的测试数据集。可使用本领域中任何已知方法来收集关于病毒的基因型数据。上面已经提供了收集所述数据的方法的实例。可使用本领域中任何已知方法收集关于病毒的表型数据。所述方法的实例如上文所述。在某些实施方案中，测试数据集包括一个或多个上述RAMs。在一个实施方案中，每一基因型数据均为病毒组中病毒的病毒蛋白质的全部或部分序列。在另一个实施方案中，测试数据集中的每一基因型数据均为由病毒编码的蛋白质中相对参照病毒中的参照蛋白质的单氨基酸变化。在其它实施方案中，所述基因型包括所述病毒蛋白质中2、3、4、5、6或更多个氨基酸改变。在另一个实施方案中，病毒是HIV，而蛋白质是HIV蛋白酶。在一个实施方案中，病毒是HIV-1。在另一个实施方案中，所述参照蛋白质是来自NL4-3 HIV的蛋白酶。

在一个实施方案中，测试数据集中的每一表型数据均为病毒组中病毒针对抗病毒疗法的敏感性。在一个实施方案中，抗病毒疗法是抗病毒化合物。在另一个实施方案中，抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂。在另一个实施方案中，蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。在一个实施方案中，所述敏感性按病毒相对参照病毒的敏感性的改变进行检测。在另一个实施方案中，所述敏感性按病毒IC₅₀相对参照病毒的改变进行检测。在另一个实施方案中，将IC₅₀的变化表示为IC₅₀的倍数变化。在一个实施方案中，所述病毒是HIV。在另一个实施方案中，所述病毒是HIV-1.在另一个实施方案中，所述参照HIV是NL4-3 HIV。

测试数据集中的基因型数据和表型数据可用本领域任何已知方法进行表示或组织。在一个实施方案中，用图表的方式显示所述数据，例如，如图2和7中所示。在这类表示方法中，Y轴表示该数据集中病毒的IC₅₀相对参照病毒的倍数变化。图表中的每个点均与该数据集中的一个病毒相对应。X轴表示该数据集中病毒所含有的突变数量。点的位置同时表示突变的数量和抗病毒治疗中病毒所具有的倍数变化，上述二者均相对参照株进行检测。在另一个实施方案中，用图解的形式显示测试数据集中的基因型和表型数据，例如，如图2中所示。

一方面，按将测试数据集中的基因型数据与表型数据相关联的方式建立算法。在一个实施方案中，确定表型临界点。在另一个实施方案中，该表型是针对抗病毒疗法的敏感性。在另一个实施方案中，所述表型是针对抗病毒疗法的敏感性相对参照病毒的改变，而临界点是如下的值，即在高于该值的病毒或病毒种群被确定为具有针对抗病毒疗法的表型抗性(“PT-R”)而低于该值的病毒或病毒种群被确定为具有针对抗病毒疗法的表型敏感性(“PT-S”)。在其它实施方案中，所述临界点高于参照病毒的IC₅₀的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍。在另一个实施方案中，所述表型临界点是如上述的临床临界值。在另一个实施方案中，病毒是HIV而抗病毒疗法是用蛋白酶抑制剂的治疗。在另一个实施方案中，蛋白酶抑制剂洛匹那韦。

在另一个实施方案中，将所述表型临界点用于确定基因型临界点。在一个实施方案中，其通过将测试数据集的病毒中突变的数量与病毒的表型敏感性相关联来实施。其可通过，例如，使用与上述图2中相似的图来完成。选择基因型临界点以便使得具有超过所述数据集中的突变数量的最多的病毒具有表型抗性(“PT-R”)，而且使得具有少于所述数据集中的突变数量的最多的病毒具有表型敏感性(“PT-S”)。经过确定，测试数据集中具有等于或高于所述基因型临界值的突变数量的病毒具有对抗病毒疗法的基因型抗性(“GT-R”)，而测试数据集中具有低于所述基因型临界值的突变数量的病毒具有对抗病毒疗法的基因型敏感性(“GT-S”)。因此，在一个实施方案中，选择能使测试数据集中最大百分比的病毒或者具有表型抗性和基因型抗性(“PT-R，GT-R”)或者具有表型敏感性和基因型敏感性(“PT-S，GT-S”)的基因型临界点。

虽然该简单算法能够提供测试数据集中基因型和表型数据间相关性的有用近似值，但在大多数情况下存在显著数量的具有基因型敏感性但也具有表型抗性(“GT-S，PT-R”)或具有基因型抗性但也具有表型敏感性(“GT-R，PT-S”)的菌株，如图2和7中所示。这些不一致结果是算法不准确性的量度。因此，在某些实施方案中，还要修改所述算法以便降低测试数据集中不一致结果的百分比。在一个实施方案中，其通过从数据集中除去对应于包括含有包括野生型，在由测试算法所考虑的单个位置的突变混合的病毒种群的每个数据点来实施。如图3和实施例3中所示，其具有降低PT-S，GT-R结果的数量的作用，由此降低了不一致的结果的总百分数并因此改善了算法对测试数据集的适合度。

在另一个实施方案中，通过给在测试数据集中观测到的一个或多个突变分配不同的加权值从而降低不一致结果的百分比。不包括该步骤的算法假定测试数据集中的每个突变对病毒或病毒种群针对抗病毒治疗总抗性的贡献相等。在很多情况下这不正确。图4显示了测试数据集中几乎总与针对抗病毒疗法的表型抗性相关的突变的实例。即，几乎每一含有该突变的病毒，即使是那些仅含有全部突变的一个或两个的病毒也均具有对抗病毒疗法的表型抗性。在一个实施方案中，所述突变是“被加权的”即，被设定了增高的突变评分。突变可被设定如下加权，例如，2、3、4、5、6、7、8或更高。例如，被设定为加权2的突变将作为病毒中的2个突变进行计算。还可设定分数加权值。在另一个实施方案中，可设定低于1和低于0的值，其中突变与病毒对抗病毒疗法敏感性增高相关。

本领域技术人员将意识到存在给特定突变设定增高的加权时有关的平衡。随着突变的加权增高，GT-R，PT-S不一致结果的数量可增加。因此，如果给予某突变的加权值过高，可使算法总体不一致性升高。

因此，在一个实施方案中，为能平衡GT-S，PT-R结果的降低和GT-R，PT-S结果的增加的突变设定加权。

在另一个实施方案中，测试数据集中不同突变间的相互作用也作为因子纳入算法中。例如，可发现2个或多个突变以协同方式发挥作用，即，病毒中的突变同时发挥作用时对病毒抗性的促成作用要显著高于根据各病毒彼此不依赖时的作用所预测的促成作用。或者，可能会发现病毒中2个或多个突变同时发挥作用时所促成的病毒抗性要显著低于根据各病毒独立存在时的促成作用所预期的病毒抗性。而且，可发现2个或多个突变一起存在要比突变独立存在频繁得多。因此，在一个实施方案中，给一起存在的突变一起加权。例如，为了避免GT-R，PT-S不一致结果数量的增加，仅给一个突变设定加权1或更大，而给其它一个突变或多个突变设定加权0。

另一方面，通过将数据集的病毒中的突变的数量和类型与病毒的表型敏感性相关联可将表型临界点用于确定基因型临界点。突变类型的实例包括，但不限于，原发氨基酸突变、继发氨基酸突变、多肽上为保留净电荷的突变和不会改变特定位置氨基酸的极性、疏水性或亲水性的突变。根据本说明的技术，本发明的范围内还包括其它类型的突变是本领域技术人员所显而易见的。

在一个实施方案中，构建将一个或多类突变所需条件因子化的算法。在另一个实施方案中，算法将一个或多个突变类型的最小数量所需条件因子化。在另一个实施方案中，算法将原发或继发突变的最低数量所需条件因子化。在另一个实施方案中，原发或继发突变联合其它突变的所需条件也作为因子而纳入算法中。例如，可发现具有特定突变组合的病毒具有针对抗病毒疗法的抗性，而当该组合中任一突变，单独或与其不是该组合部分的其它突变联合而存在于病毒中时，该病毒不具有针对抗病毒疗法的抗性。

通过使用，例如，上述方法，可设计所述算法以便获得任何需要的结果。在一个实施方案中，设计所述算法以便将总一致性(PT-R、GT-R和PT-S、GT-S组的百分数之和或100-(PT-S、GT-R+PT-R、GT-S组的百分数)最大化。在某些实施方案中，总一致性高于75％、80％、85％、90％或95％。在一个实施方案中，设计所述算法以便将PT-R、GT-S结果的百分数最小化。在另一个实施方案中，设计所述算法以便将PT-S、GT-R结果的百分数最小化。在另一个实施方案中，设计所述算法以便将PT-S、GT-S结果的百分数最大化。在另一个实施方案中，设计所述算法以便将PT-R、GT-R结果的百分数最大化。

在算法构建期间或其构建后的任何时间点，其还可以在第二数据集上进行测试。在一个实施方案中，所述第二数据集包括不包含于测试数据集中的病毒，即，第二数据集是原始(naive)数据集。在另一个实施方案中，所述第二数据集包括存在于测试数据集中的一个或多个病毒和不存在于测试数据集中的一个或多个病毒。将所述算法用于第二数据集，特别是原始数据集，能够评估所述算法的预测能力。因此，在一个实施方案中，使用第二数据集评估算法的精确度，然后如上述修改所述算法的规则以便提供其精确度。在另一个实施方案中，将迭代法用于建立所述算法，由此检测算法并随后对其重复修改直至达到需要的精确度水平。

5.9 采用算法预测病毒的敏感性

另一方面，本发明还提供了采用本发明的算法预测病毒或病毒衍生物对基于病毒的基因型的抗病毒疗法的表型敏感性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中检测，是否存在一个或多个RAMs，将该算法规则用于检测到的RAMs，其中满足所述算法规则的病毒具有针对抗病毒治疗的基因型抗性，而不满足所述算法规则的病毒具有针对抗病毒疗法的基因型敏感性。在另一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中检测是否存在一个或多个RAMs，将该算法规则用于检测到的RAMs，其中得分等于或大于基因型临界值则提示该病毒具有针对抗病毒疗法的基因型抗性，而得分低于基因型临界值，则提示该病毒具有针对抗病毒疗法的基因型敏感性。

本发明的算法可用于任何抗病毒药敏感性是关注因素的病毒病，如5.4.1节中所述。在特定的实施方案中本发明的测定法可用于测定逆转录病毒对抗病毒药的敏感性。在一个实施方案中，逆转录病毒是HIV。优选地，病毒是HIV-1.

本发明的抗病毒剂可以是对抗病毒的任何有效治疗。本发明的实施可用于，例如，理解可在本发明的药物敏感性实验中进行检测的病毒的结构、生命周期和遗传成分。这些将被本领域技术人员知晓并提供，例如关键酶和抗病毒剂可靶向的其它分子。本发明的抗病毒剂的实例包括，但不限于，核苷逆转录酶抑制剂例如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿巴卡韦(abacavir)，核苷酸逆转录酶抑制剂例如替诺福韦(tenofovir)，非-核苷逆转录酶抑制剂例如奈韦拉平、依非韦仑、地拉韦定，融合抑制剂例如T-20和T-1249和蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。

在本发明的某些实施方案中，将抗病毒剂施用于逆转录病毒。在特定的实施方案中，抗病毒剂是蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，抗病毒剂是洛匹那韦。

某些与抗病毒剂治疗敏感性的降低相关的突变是现有技术中已知的。例如参见，Kempf等，2001，J.Virol.75：7462-69。其它突变可采用上述5.3-5.8节所描述的方法测定。例如，表1提供了与洛匹那韦敏感性的降低相关的突变列表。

5.10 使用算法预测个体抗病毒疗法的有效性

另一方面，本发明还提供了一种使用本发明的算法基于病毒对抗病毒疗法的基因型从而预测抗病毒疗法对感染了病毒的个体的有效性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒的衍生物中，检测是否存在一个或多个RAMs，将该算法规则用于检测到的RAMs，其中满足所述算法规则的病毒具有针对抗病毒疗法的基因型抗性，而不满足所述算法规则的病毒具有针对抗病毒疗法的基因型敏感性。在另一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒的衍生物中，检测是否存在一个或多个RAMs，将该算法规则用于检测到的RAMs，其中得分等于或大于基因型临界值提示该病毒具有针对抗病毒疗法的基因型抗性，而得分低于基因型临界值则提示该病毒具有针对抗病毒疗法的基因型敏感性。

如上面5.4.1节中所述，本发明的算法可用于任何抗病毒药敏感性是关注因素的病毒病，而本发明的抗病毒剂可以是任何对病毒有效的治疗法。在特定的实施方案中本发明的测定法用于测定逆转录病毒对抗病毒药的敏感性。在一个实施方案中，逆转录病毒是HIV。优选地，病毒是HIV-1。在本发明的某些实施方案中，将所述抗病毒剂导向逆转录病毒。在特定的实施方案中，抗病毒剂是蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，抗病毒剂是洛匹那韦。

如上面5.9节中所述，与抗病毒剂治疗敏感性的降低相关的突变可获自现有技术或采用如上面5.4-5.8节中所述方法测定。

在某些实施方案中，本发明提供了一种在感染了病毒并在之前正在进行或已经进行了相同或不同抗病毒疗法治疗的患者中监测抗病毒疗法有效性的方法，包括在所述个体的样品中检测，是否存在与抗病毒疗法治疗敏感性的降低相关的氨基酸残基，其中所述残基的存在与所述抗病毒疗法治疗敏感性的降低相关。

5.11 将对一种抗病毒疗法的敏感性与对另一种抗病毒疗法的敏感性相关联

另一方面，本发明提供了一种采用本发明的算法预测基于所述病毒对不同抗病毒疗法的基因型敏感性的抗病毒疗法对病毒的有效性。在一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中检测，是否存在一个或多个与针对抗病毒疗法抗性相关的突变并将本发明的算法规则用于检测到的突变，其中满足所述算法规则的病毒具有针对抗病毒治疗的基因型抗性，而不满足所述算法规则的病毒具有针对抗病毒疗法的基因型敏感性。在另一个实施方案中，所述方法包括在所述病毒或所述病毒衍生物中检测，是否存在一个或多个与针对抗病毒疗法抗性相关的突变并将所述算法规则用于检测到的突变，其中得分等于或高于基因型临界值则表明该病毒具有对不同抗病毒疗法的基因型抗性，而当得分低于基因型临界值时则表明该病毒具有对不同抗病毒疗法的的基因型敏感性。在另一个实施方案中，所述两种抗病毒疗法影响相同的病毒蛋白质。在另一个实施方案中，所述两种抗病毒疗法均为蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。而在另一实施方案中，两种抗病毒疗法中之一是洛匹那韦。而在另一实施方案中，与对一种蛋白酶抑制剂的抗性相关的突变还与对另一蛋白酶抑制剂的抗性相关。下述实施例8中提供了所述突变的实例。

6.实施例

下述实施例用于举例说明本发明而并非对本发明主题的限制。

6.1 实施例1：鉴定抗性相关突变的病例样品分析

本实施例说明了分析病例样品从而鉴定与对蛋白酶抑制剂例如洛匹那韦的敏感性增加或降低相关的突变的方法。

为了测定HIV-1病毒株的蛋白酶序列和其对洛匹那韦治疗的敏感性之间的关系，将2038名患者血浆样品的测试数据集进行基因型和表型分析。采用PHENOSENSE^TM(Virologic，South San Francisco，CA)HIV分析法(Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44：920-928；美国专利号5,837,464和6,242,187)实施表型分析。血浆样品取自HIV-1感染患者。除去来自相同患者的重复样品以便避免因突变的独特组合引起的可能偏倚，从患者样品获得HIV-1对洛匹那韦的IC₅₀值。将其与洛匹那韦抗NL4-3(GenBank登录号AF324493)参照病毒株的IC₅₀进行比较。将表型数据表示为洛匹那韦的50％抑制浓度(IC₅₀)时的“倍数变化”(或log倍数变化)。通过用洛匹那韦抗来自患者血浆样品的HIV-1的IC₅₀除以洛匹那韦抗NL4-3(GenBank登录号AF324493)参照病毒株的IC₅₀计算倍数IC₅₀值。

为确定与对洛匹那韦的敏感性的降低相关的基因型改变，分析每一患者的样品中HIV-1蛋白酶的完整氨基酸序列。将突变与NL4-3(GenBank登录号AF324493)参照株的蛋白酶序列进行比较。99个氨基酸位置中的88个含有至少一种突变(表2和3)。在测试数据的2038个样品中，样品的1％或更多(即，多于20个样品)中存在61个位置的突变，在20个或低于20个样品中(低于样品的1％)在剩下的38个位置存在突变。这些数据列于表2和3中。表1提供了与对洛匹那韦的敏感性降低相关的突变的列表。在除去不含与蛋白酶抑制剂相关的任何原发突变并且对任何蛋白酶抑制剂的IC₅₀倍数变化(“FC”)均不高于2(实施例5)的样品后，从2038个样品的完整测试数据集或1418个样品的数据集(用*表示)中获得表1中的数据。实施例5中描述了用于计算P值的方法。

6.2 实施例2：洛匹那韦敏感性与HIV-1蛋白酶中突变数的相关性

本实施例说明了将HIV-1的蛋白酶基因中等权的突变数量与其对洛匹那韦的敏感性相关联的简单算法是不准确的。

分析2038名患者血浆样品的数据集并鉴定与对洛匹那韦的敏感性降低相关的突变，如实施例1中所述。将对洛匹那韦的表型敏感性(洛匹那韦倍数变化)作为存在于患者的血浆样品中的HIV-1的蛋白酶中的突变数量的函数进行分析。通过用洛匹那韦抗来自患者血浆样品的HIV-1的IC₅₀除以洛匹那韦抗NL4-3(GenBank登录号AF324493)参照病毒株的IC₅₀计算每一样品的倍数变化。通过对存在于每一患者的样品中的HIV-1的蛋白酶进行测序获得基因型数据并确定相对于NL4-3(GenBank登录号AP324493)HIV序列的序列改变。SEQ.ID.No.1中给出NL4-3蛋白酶的氨基酸序列(图12A)而SEQ.ID.No.2给出NL4-3蛋白酶基因的核酸序列(图12B)。

图2显示了对洛匹那韦的抗性(Log洛匹那韦倍数变化)作为抗性相关突变数量的函数。将含有氨基酸混合物的样品作为突变体。用于该分析的突变是在Kempf研究(Kempf等，2001，J.Virol.75：7462-69)中所鉴定的突变。为了清楚地说明由Kempf提出的算法的缺陷，所述算法试图基于在HIV蛋白酶中11个已鉴定的位置观测到的突变数量来预测对洛匹那韦的表型敏感性，将该分析的图表分成四个象限。Kempf研究假定，如果HIV在这11个位点含有5个或少于5个突变，则该HIV具有对洛匹那韦治疗的敏感性，然而，如果这些突变的数量是6个或多于6个，则预测该病毒具有对洛匹那韦治疗的抗性。左下象限对应于其蛋白酶中含有5或少于5个突变且具有对洛匹那韦表型敏感性和基因型敏感性(PT-S，GT-S)的那些病毒。在该象限中发现2038个样品中的1109个或54％。上右象限对应于含有6个或多于6个突变且具有对洛匹那韦(Log洛匹那韦倍数变化≥1)的表型抗性和基因型抗性(PT-R，GT-R)的那些病毒，该象限包含样品中的637个或31％。然而，其它两个象限对应于“例外情况”，所述例外情况是指病毒根据基因型(突变数量)被预测为具有敏感性，但却表现为表型(基于Log洛匹那韦倍数变化)抗性(左上，PT-R，GT-S)的情况或病毒根据基因型被预测为具有抗性，但却表现为表型(基于Log洛匹那韦倍数变化)敏感性(右下，PT-S，GT-R)的情况。

图2显示出在182个样品(对应于初始数据集的9％，其含有2～5个突变，与期望相反)存在于上，左(PT-R，GT-S)象限中且其IC₅₀值比参照株(log倍数变化是1-2)的IC₅₀高10～100倍。相反地，某些含有6、7或8个突变的病毒并未表现出任何高于WT病毒株的对洛匹那韦的抗性，因此存在于下，右(PT-S，GT-R)象限中(110个样品(5％))。

因此从图2中可以明显的看出对洛匹那韦的敏感性和所述HIV-1蛋白酶中突变的数量之间的简单相关是非常不精确的。

6.3 实施例3：减少PT-S、GT-R不一致组的大小

本实施例说明了图2中所示的PT-S，GT-R数据可用存在含有至少一个洛匹那韦抗性相关位置上的氨基酸混合物的样品来解释。

采用实施例2的简单算法得出上，左(“PT-R，GT-S”)象限中大约9％的结果和下，右(“PT-S，GT-R”)象限(图2)中5％的结果。这些不一致的结果可能是由于(至少部分上)患者的样品包含病毒株混合物，所述病毒株含有在一个或多个与对洛匹那韦敏感性降低相关的位置上具有氨基酸残基混合的蛋白酶。当将这些样品(即含有野生型和突变型二者混合物的那些样品)从所述分析中排除时，PT-S，GT-R结果降至2％而PT-R，GT-S结果数量约保持与10％一致(图3)。在该修改的分析中使用1402个样品。

不受任何特定理论的束缚，其可用下述假说进行解释。所述研究将含有病毒株混合的样品按突变体进行处理。因此，这可以实现将包含10％突变体病毒(包含抗性相关突变)和90％未突变的或参照病毒的样品按突变体进行处理。因为突变体病毒的群体小，因此总体样品可不表现出与假设含有100％突变的样品预期一致的表型抗性。然而，为了基因型的目的，将所述样品按含有突变进行处理。因此所述样品可导致观察到低于含有100％突变体的样品所预期的表型抗性。这导致数据落在下，右象限中，该象限中所述种群具有基因型抗性(GT-R)，而具有表型敏感性(PT-S)。

将在一个或多个与对洛匹那韦敏感性降低相关的位置上含有氨基酸混合物的样品除去明显地降低了PT-S，GT-R结果，从而证实了这两者之间的关联。

6.4 实施例4：PT-R，GT-S不一致组的分析

本实施例说明了特定突变比其它对洛匹那韦抗性贡献更大。

图2中PT-R，GT-S象限中的样品对应于含有五个或少于五个与对洛匹那韦敏感性的降低相关的HIV蛋白酶中的突变的病毒。这些病毒是表型抗性的(具有高于10的倍数变化)但被预测为具有基因型敏感性(因为它们含有5个或小于5个突变)。不受任何特定理论的束缚，其可通过某些突变比其它突变更显著地促成对洛匹那韦的抗性来进行解释。这些突变的某些甚至可看作与四个或五个其它洛匹那韦相关性突变对洛匹那韦的抗性的作用相同。当这些，更显著的突变连同1、2、3或4个其它与洛匹那韦相关的突变一起存在时，给予的总抗性可足够大从而产生病毒表型抗性。

在50、54和82位上发现与PT-R，GT-S组显著相关的突变。表1提供了与对洛匹那韦的敏感性降低相关的突变的列表。图4，5和6说明了当更显著的突变(在50、54和82位的那些)存在时，洛匹那韦倍数变化高而所述样品主要存在于图的上半部，该半部与增高的表型抗性相关。图2或3和图4、5和6的比较也说明了PT-R，GT-S象限中的大多数样品是包含更具显著的突变的那些样品。

因此，很明显PT-R，GT-S组可与不呈比例地比其它突变更能促成对洛匹那韦抗性的突变的存在相关联。

6.5 实施例5：鉴定抗性相关突变的病例的替换性分析

本实施例说明了(1)一种分析病例样品以便鉴定与对蛋白酶抑制剂例如洛匹那韦敏感性增高或降低相关的突变的替换性方法；(2)将HIV的蛋白酶基因中的等权突变的数量与其对洛匹那韦敏感性相关联的简单算法是不精确的(3)PT-S，GT-R象限中所示数据可根据存在含有至少一个洛匹那韦抗性相关位置上的氨基酸混合物的样品来解释；和(4)特定突变比其它的更能促成洛匹那韦抗性。

为测定HIV-1病毒株的蛋白酶序列和其对洛匹那韦治疗的敏感性间的相关性，将2038名患者血浆样品的测试数据集进行基因型和表型分析。在2038个样品的初始点，除去那些在表型和基因型上不具有任何蛋白酶抑制剂敏感性降低表现的样品。该排除的表型标准是全部样品的LPV FC＜2而基因型标准是不存在下列任何位置(原发)的突变：30、32、46、48、50、54、82(除了V82I)、84、88或90。这导致除去了620个样品，留下1418个样品的数据集，将其按实施例1中所述进行分析。

与图2相似，将对洛匹那韦的抗性(Log洛匹那韦倍数变化)作为所述抗性相关突变的数量的函数进行作图。图7显示了在该分析(1418个样品)中所获数据的图。图7，恰如图2，也包含全部四个象限中的数据。在所分析的1418个样品中，45％(637个样品)为PT-R，GT-R，34％(489个样品)为PT-S，GT-S，13％(182个样品)为PT-R，GT-S和8％(110个样品)为PT-S，GT-R。

当(如实施例3中所述)将含有在一个或多个与对洛匹那韦敏感性降低相关的位置上具有氨基酸残基混合的蛋白酶的病毒株混合物的样品从分析中排除时，PT-S，GT-R象限中的样品数量降至4％(31个样品)。该分析导致排除555个样品，留下总共863个样品(图8)。

如实施例4中所述，在50、54和82位上发现与PT-R，GT-S组显著相关的突变。图9，10和11说明了当更显著的突变(在50、54和82位的那些)存在时，洛匹那韦倍数变化高而所述样品主要存在于图的上半部，该半部与增高的表型抗性相关。图7或8和图9、10和11的比较也说明了PT-R，GT-S象限中的大多数样品是包含更显著的突变的那些样品。

用于确定相关性统计学意义的P值按如下方法计算：对每一突变，将低于或高于LPV10倍的数据集(这里，基因型敏感性样品来自N＝863的数据集)中样品的数量在含有或不含有所研究突变的样品中进行比较。构建2×2表并采用Fisher′s精确概率检验计算P值。对于G48V的一个实例如下

G48V	PT-S	PT-R	p-值
G48V	PT-S	PT-R	p-值	不存在	275	97	2.87E-19
存在	7	50		不存在	275	97	2.87E-19

6.6 实施例6：首先改进的算法和其改善的精度的说明

本实施例说明了可通过区别地加权更显著性促成洛匹那韦抗性的突变的作用而构建降低PT-R，GT-S结果的发生率的算法。

如实施例5中所述，在2038个样品测试数据集的初始点，除去不含有任何与蛋白酶抑制剂相关的原发突变的那些样品和对任何蛋白酶抑制剂的IC₅₀倍数变化(“FC”)均不高于2的那些样品，结果得到1418个样品数据集。进一步除去含有在一个或多个与对洛匹那韦敏感性降低相关的位置上具有氨基酸残基混合的蛋白酶的病毒株混合物的样品，结果得到863个样品的最终数据集，将其用于设计能通过降低PT-R，GT-S结果的发生率而精确预测HIV对洛匹那韦敏感性的算法。

根据仅在所述测试数据集(863个样品)中观测到的数据设定最终规则。然后将该从测试数据集设计的规则在测试数据集和样品的第二组(“验证数据集”)中测试。验证数据集含有1022个样品并排除了来自包含于测试数据集中的患者的任何样品。对于测试数据集，除去不具有任何对蛋白酶抑制剂敏感性降低的表现的样品，留下了523个样品。该设计的规则或算法的精度决定于可单独根据该算法确定患者的敏感性的精度。当偏差出现时，修改算法以便使其与在测试组中观测到的结果保持一致。

然后对验证组再次测试修改的算法。第二版中所示的结果要好于最初版本的那些结果。多次重复该步骤而该结果的每个版本即使不好于也至少与其前面的版本相同。

表4，5和6总结了用于每次重复步骤或版本的规则和获自测试数据集(表4)和两个不同的验证组(表5和6)的结果。第一栏提供了重复步骤或版本数。接下来的四栏提供了，按顺序，根据所述算法，在PT-S，GT-R、PT-R，GT-R、PT-S，GT-S，PT-R，GT-S组中预期的数量。接下来的两栏提供了PT-S，GT-R和PT-R，GT-S组的百分数。接下来的一栏提供了总一致性(PT-R，GT-R和PT-S，GT-S组百分数的和，或100-(PT-S、GT-R+PT-R、GT-S组的百分数)。

最后一栏含有用于测试重复步骤的规则。将每组规则加至其前面的规则上。某些突变的加权要高于其它突变(例如，V82和I54突变的大多数)，某些一同从分析中除去(例如，I54L)而某些的加权系数在算法的进展性版本中发生变化。在版本6中，将全部V82突变体的加权系数从1增至3。然而，对于版本7，V82T的加权系数回降至1，这是因为其对洛匹那韦抗性的贡献不如其它V82突变体那样显著。图13显示了82位不同氨基酸(野生型和突变)的效应。可以看出V82T对洛匹那韦倍数变化的作用与其它V82突变体不一样大。I54突变体的预分析导致了从算法中除去I54L。然而，随后的分析显示出I54L显著地促成洛匹那韦抗性(图14)。因此，在表7中，给I54L设定加权系数1，虽然其未包含于表4所示的算法中。不受任何特定理论的束缚，从算法中除去I54L是因为其是相对罕见的突变因此其不在数据集中频繁出现。因为其是罕见的，其可对大组样品的分析产生小的作用或不产生作用，但是，当其存在于特定病毒，或来自特定患者的病毒，其显著地促成洛匹那韦抗性。

从开始至版本10，全部3个数据集的总一致性增加而PT-R，GT-S组中数据的百分比显著降低；接近测试数据集中的7倍和验证数据集中的约6倍。

表7提供了给每个突变设定的加权或加权系数的列表。

该表可用于预测特定HIV株是否可能对洛匹那韦的敏感性降低。根据表7，给对该病毒株中检测到的在表7中所列的每个蛋白酶突变设定加权系数。然后将加权系数相加从而得到HIV的总分。如果总分是6或大于6，则该HIV可能具有对洛匹那韦治疗的抗性，而如果总分低于6，则该HIV可能具有对洛匹那韦治疗的敏感性。

6.7 实施例7：二次改进的算法以及对其改良的精确度的说明

本实施例说明了可通过调整被认为具有对洛匹那韦治疗的基因型抗性或敏感性的特定HIV株所需的顺序总分从而构建降低PT-R，GT-S和PT-S，GT-R结果的发生率的算法。

分析2195个样品的联合数据集，即含有“测试数据集”和”验证数据集”的数据集。将不含有与对蛋白酶抑制剂的表型抗性相关的原发突变的，不与高于2的对任何蛋白酶抑制剂的IC₅₀倍数变化(“FC”)相关的或含有在一个或多个与对洛匹那韦敏感性降低相关的位置上具有不同氨基酸残基的蛋白酶的病毒株混合物(如果混合包含在NL4-3 HIV株中的位置上发现的氨基酸)的样品除去。将1099个样品的最终数据集用于改变实施例6中所述的算法以便改善其总一致性。

使用与表7所列相同的加权系数。在改变的算法中，临界值变为6～8，即，如果特定HIV的总分为8或更高，则HIV具有对洛匹那韦治疗的基因型抗性而如果总分小于8，则该HIV具有对洛匹那韦治疗的基因型敏感性。使用临界值8，总一致性，90.5％，高于临界值6所发现的(表8)。图15提供了使用临界值8的散点图。与图2和7对比可以观察到PT-R，GT-S和PT-S，GT-R结果的降低。

当在算法中使用临界值7时，可观测到甚至更高的91.5％总一致性(表8)。这可见于图16中。

6.8 实施例8：与安泼那韦抗性相关的突变对洛匹那韦抗性的作用

本实施例证明了与HIV的安泼那韦(“APV”)抗性的增加相关的特定突变也与洛匹那韦抗性的增加相关。

图17显示了HIV中与对安泼那韦(“APV”)抗性相关的蛋白酶突变对针对洛匹那韦抗性的作用。将具有对安泼那韦敏感性降低的HIV-1分离群在体外选择并获自用安泼那韦治疗的患者。这些分离群的基因型分析显示了对APV的抗性与HIV-1蛋白酶基因中的8个突变相关，所述突变：5个原发的(V32I、I50V、I54L/M和I84V)和3个继发的(M46I/L和I47V)。参见Maguire等，2002，Antimicrob AgentsChemother 46：731-738。无一例外地，这些突变的每一个均与对洛匹那韦的敏感性降低相关(表1)。V32I和I47V还已知可由LPV体外选择。Carrillo等，1998，J.Virol.72：7532-41。表9中总结了这些突变和这些突变彼此的结合与I84V对LPV和APV敏感性的作用。每组中APV的FC中值是9.5倍或更高，如可预期的。但是LPV FC中值通常被平行化，且通常高于APV的值。这一发现可用于研究这两个蛋白酶抑制剂间交叉抗性的程度。

在与基于单变量分析的APV FC≥2.5相关的26个突变的列表中，其中23个还与LPV FC≥2.5相关(表10)。采用回归分析法，分析了两个PIs的FC(log-转换的)间的相关性。图18显示了洛匹那韦倍数变化(“Log LPV FC”)对安泼那韦倍数变化(“Log APV FC”)的二变量散点图。深色点(图例中的“APV GT-R”)表示具有对安泼那韦基因型抗性的那些样品，而浅色点(图例中的“APV GT-S”)表示具有对安泼那韦基因型敏感性的样品。图18显示了对于具有对安泼那韦基因型抗性的样品，安泼那韦和洛匹那韦间的相关性高于(相关系数，R²＝0.52)那些具有对安泼那韦基因型敏感性的(相关系数，R²＝0.39)(从该分析中除去对任一蛋白酶抑制剂的FC＜2.5的全部样品)。具有对任一蛋白酶抑制剂PT-R的全部样品的76％，和APVGT-R样品的82％，对两者均具有抗性。而被确定为对APV GT-R的样品的95％也具有PT-R，80％也具有对LPV的PT-R(表11)。

尽管有该相关性，但APV突变单独存在不足以LPV FC＞10，需要从表1中所列的那些与对LPV敏感性降低的相关突变中8个或多个突变的累积。

本说明书所引用的全部参考文件均为全文引入作为参考。

此处提供的实际的和预测的实施例仅用于具体描述本发明而不意欲以任何方式限制本发明。

表1

洛匹那韦突变

突变 FC＜10 FC≥10 ％R:％S P值

L10F 16 25 9 ＜0.0001

L10P 15 25 3 0.0001

L10I^* 105 97 2 ＜0.0001

G16E^* 8 23 6 ＜0.0001

K20I 21 24 6 ＜0.0001

K20I^* 14 24 3 0.0001

K20M 6 10 9 ＜0.0001

K20M^* 4 10 5 0.0045

K20R 17 13 4 0.0002

L24I 7 10 8 ＜0.0001

V32I 9 18 11 ＜0.0001

V32I^* 9 18 4 0.0004

L33IFV^** 38 47 7 ＜0.0001

L33F^* 14 42 6 ＜0.0001

E34DKQ^** 4 18 25 ＜0.0001

E34Q^* 2 12 12 0.0001

K43T^* 4 22 11 ＜0.0001

M46I 49 57 6 ＜0.0001

M46L 16 19 7 ＜0.0001

M46I^* 49 57 2 ＜0.0001

M46L^* 16 19 2 0.009

M46V^* 无效无效无效无效

I47V^* 5 22 8 ＜0.0001

I47A 无效无效无效无效

I47V 5 22 25 ＜0.001

G48V 7 50 40 ＜0.0001

G48V^* 7 50 14 ＜0.0001

I50V 1 22 123 ＜0.0001

I50V^* 1 25 48 ＜0.0001

I54A 0 22 -N/A- ＜0.0001

I54L 无效无效无效无效

I54M 6 21 20 ＜0.0001

I54S 0 14 -N/A- ＜0.0001

I54T 0 5 -N/A- ＜0.0001

I54V 7 47 37 ＜0.0001

I54A^* 0 22 -N/A- ＜0.0001

I54M^* 6 21 7 ＜0.0001

I54S^* 0 14 -N/A- ＜0.0001

I54T^* 0 5 -N/A- 0.0045

I54V^* 7 47 13 ＜0.0001

K55R 13 12 5 ＜0.0001

Q58E 19 26 8 ＜0.0001

Q58E^* 18 26 3 0.0003

L63T^* 4 11 5 0.002

I66FV^** 14 12 5 0.0001

A71I 5 7 8 0.0007

G73C 2 6 17 0.0002

G73T 10 13 7 ＜0.0001

T74ASP^** 27 37 8 ＜0.0001

T74S^* 14 25 3 0.0001

L76V 1 6 34 ＜0.0001

L76V^* 1 6 12 0.0076

P79ADE^** 3 6 11 0.0006

V82A 14 73 29 ＜0.0001

V82F 2 6 17 0.0002

V82A^* 14 73 10 ＜0.0001

V82S 0 7 -N/A- ＜0.0001

V82S^* 0 7 -N/A- 0.0005

I84A^* 无效无效无效无效

I84L^* 无效无效无效无效

I84V 41 33 4 ＜0.0001

L89I^* 0 5 -N/A- 0.0045

L89M^* 7 13 4 0.0004

起始样品的数量＝2038。

*起始样品的数量＝1418(除去不具有任何与蛋白酶抑制剂相关的原发突变且不具有对于任何蛋白酶抑制剂的高于2的IC₅₀倍数变化(“FC”)的样品后)。

**对所有变体同样处理。

-N/A-：不适用(结果被0除)。

FC：IC₅₀的倍数变化。

％R：含有突变的样品占全部PT-R，GT-S样品的百分数。

％S：含有突变的样品占全部PT-S，GT-S样品的百分数。

表2

将位置数量与含有突变的样品数相关联

位置数含有突变的样品数

11 0

9 1

3 2

2 3

2 4

3 5

1 6

3 7

0 8

0 9

34 ＜10

65 ＞10

61 ＞20

46 ＞100

4 10～20

15 20～100

表3

HIV蛋白酶每个位置发现突变的样品数

位置样品数

P1 0

P9 0

D25 0

G27 0

D29 0

T31 0

P44 0

G78 0

G86 0

L97 0

N98 0

Q2 1

T26 1

A28 1

G49 1

G52 1

V56 1

P81 1

G94 1

F99 1

I3 2

L5 2

G40 2

位置样品数

W6 3

W42 3

R87 4

T96 4

R8 5

G51 5

Y59 5

T80 6

Q7 7

E21 7

G68 7

V75 12

G17 13

L38 17

L23 20

T4 24

A22 24

N83 25

E65 33

P79 39

T91 39

K45 45

L76 57

C95 59

P39 61

Q18 63

D30 74

I50 80

位置样品数

N88 89

K70 96

E34 101

I66 103

C67 110

I47 112

V32 116

V11 117

Q92 121

I85 131

L24 134

G16 136

Q61 144

K55 153

G48 156

F53 159

Q58 159

L89 186

T74 202

K43 208

K14 210

H69 213

R57 237

T12 244

D60 247

L19 297

L33 411

G73 416

位置样品数

I64 458

I84 482

I15 489

I72 518

R41 534

I13 556

K20 631

V77 708

E35 735

V82 741

M46 780

I93 823

N37 826

I54 834

M36 841

I62 897

L90 946

A71 1047

L10 1242

L63 1858

表4

算法构建和在测试数据的应用

No. PT-S，PT-R，PT-S，PT-R，％PT-R，％PT-S，一致规则GT-R GT-R GT-S GT-S GT-S GT-R
	开始 32 412 281 138 16.0％ 3.7％ 80.3％对所有突变同等加权
1 36 457 277 93 10.8％ 4.2％ 85.1％加M46V，I50V(加权为3)，I54AMS，I84AL，V82S	开始 32 412 281 138 16.0％ 3.7％ 80.3％对所有突变同等加权
	6 58 519 255 31 3.6％ 6.7％ 89.7％加L33F，I47V，G48MV，L63T，将V82AFST加权增至3
7 56 517 257 33 3.8％ 6.5％ 89.7％将V82T加权设回1
7 56 517 257 33 3.8％ 6.5％ 89.7％将V82T加权设回1	8 57 522 256 28 3.2％ 6.6％ 90.2％加V32I，E34Q，K43T，L89IM除去I54L
10 65 530 248 20 2.3％ 7.5％ 90.2％加58E，74S，76V，将加权54增至3x	8 57 522 256 28 3.2％ 6.6％ 90.2％加V32I，E34Q，K43T，L89IM除去I54L

表5

算法应用于验证数据集1

PT-S，PT-R，PT-S，PT-R，％PT-R，％PT-S，总一致性

No.

GT-R GT-R GT-S GT-S GT-S GT-R

起始 37 130 302 54 103％ 7.1％ 82.6％

1 38 140 301 44 8.4％ 7.3％ 84.3％

10 66 175 273 9 1.7％ 12.6％ 85.7％

数据集中样品的数量＝523.

表6

算法应用于验证数据集2

PT-S，PT-R，PT-S，PT-R，％PT-R，％PT-S，总一致性

No. GT-R GT-R GT-S GT-S GT-S GT-R

起始 8 86 172 41 13.4％ 2.6％ 84.0％

1 8 94 172 33 10.7％ 2.6％ 86.6％

10 25 120 155 7 2.3％ 8.1％ 89.6％

数据集中样品的数量＝307(从表7的523个样品的起始数据集中除去含有位于与对洛匹那韦的敏感性降低相关的任何位置的氨基酸的混合物的样品后)。

表7

加权系数

突变加权系数	突变加权系数
突变加权系数	突变加权系数	L10F 1L101 1G16E 1K20I 1K20M 1K20R 1L24I 1V32I 1L33F 1E34Q 1K43T 1M46I 1M46L 1M46V 1I47V 1G48V 1I50V 3I54A 3I54L 1	I54M 3I54S 3I54T 3I54V 3K55R 1Q58E 1L63T 1A71I 1L76V 1V82A 3V82F 3V82S 3V82T 1I84A 1I84L 1I84V 1L89I 1L89M 1

表8

组合数据集的分析

临界值 PT-S，PT-S，PT-R，PT-R，总一致性

GT-R GT-S GT-R GT-S

6 93 404 589 13 90.4％

7 63 434 572 30 91.5％

8 50 447 548 54 90.5％

表9

APV突变对LPV和APV敏感性的影响

基因型组 n 中位数LPV FC 中位数APV FC

野生型(所有原发位置) 623 0.6 0.6

不包含任何测试的突变 1096 2.1 1.6

32 26 12 9.5

47 8 191 26

50 42 54 20

54^a 9 160 22

84 247 7.1 11

32，47 23 7.5 12

32，84 3 124 51

46^b，54 16 138 84

47，54 3 88 42

47，84 4 28 12

54，84 22 93 67

32，47，54 17 146 40

46，54，84 29 30 47

47，54，84 3 20 24

32，46，47，54 4 208 130

32，47，54，84 5 227 130

32，46，47，54，84 6 200 130

^a仅I54L或M

^bM46I或L

表10

APV和LPV FC＞2.5相关的突变

APV APV/LPV

10 10F

11 11

23

32I 32I

33F 33F

34Q 34Q

43T 43T

47V 47V

48M 48M

50V 50V

53L 53L

54A 54A

54L 54L

54M 54M

54S 54S

54T 54T

55 55

58E 58E

66

71L 71L

76V 76V

79 79

82F 82F

84V 84V

92

95 95

％R:％S＞5的突变和P＜0.01，对于FC＞2.5

表11

LPV-APV交叉抗性的统计总结

样品百分比

类别 All^a APV GT-R

APV FC＞2.5并且LPV FC＞10 82 83

LPV FC＞10并且APV FC＞2.5 91 99

每个PT-R，两个均PI PT-R 76 82

APV FC＞2.5 61 95

LPV FC＞10 55 80

^a不具有蛋白酶抑制剂FC＞2的样品且未排除蛋白酶抑制剂原发突变；n＝1099。

序列表

<110>Petropoulos，Christos

Parkin，Neil

Chappey，Clolombe

<120>确定致病病毒对蛋白酶抑制剂的敏感性的组合物和方法

<130>11068-026-228

<140>PCT/US 03/04362

<141>2003-02-14

<150>US 60/357,171

<151>2002-02-15

<150>US 60/359,342

<151>2002-02-22

<150>US 60/392,377

<151>2002-06-26

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>99

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒

<400>1

Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly

1 5 10 15

Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val

20 25 30

Leu Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly

35 40 45

Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile

50 55 60

Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr

65 70 75 80

Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr

85 90 95

Leu Ash Phe

<210>2

<211>297

<212>DNA

<213>人免疫缺陷病毒

<400>2

cctcagatca ctctttggca gcgacccctc gtcacaataa agataggggg gcaattaaag 60

gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag aagaaatgaa tttgccagga 120

agatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat 180

cagatactca tagaaatctg cggacataaa gctataggta cagtattagt aggacctaca 240

cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg actcagattg gctgcacttt aaatttt 297

Claims

1.一种确定HIV对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中或在所述HIV的编码蛋白酶的核酸中检测在所述蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在与用所述蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在表明HIV对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。

2.一种确定HIV感染的个体对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在来自所述个体的样品中检测在HIV蛋白酶氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸是否存在与用所述蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该个体对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。

3.权利要求1或2的方法，其中在所述HIV的蛋白酶中检测突变。

4.权利要求1或2的方法，其中在所述HIV的编码蛋白酶的核酸中检测突变。

5.权利要求1或2的方法，其中与用所述蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变选自K20I、M46V、I50L、I54A、I54M、I54S、L63T、V82S、I84A、I84L、L33F、L33I、L33V、E34D、E34K、E34Q、K43T、G48V、I50V、K55R、Q58E、G73C、G73T、T74A、T74P、T74S、L76V、P79A、P79D、P79E、L89I和L89M。

6.一种分离的寡核苷酸，其长度为约10～约100核苷酸，该寡核苷酸编码HIV中的蛋白酶，该酶包括所述人免疫缺陷病毒中所述蛋白酶的氨基酸序列的20、33、34、43、46、48、50、54、55、58、63、66、73、74、76、79、82、84或89位氨基酸的突变，其中突变与对蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关，但其前提条件是所述突变不是K20M、K20R、M46I、M46L、I54L、I54T、I54V、L63P、V82A、V82F、V82T或I84V。

7.权利要求6的分离的寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为约10～约90个核苷酸。

8.权利要求6的分离的寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为约10～约80个核苷酸。

9.权利要求6的分离的寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为约10～约70个核苷酸。

10.权利要求6的分离的寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为约10～约60个核苷酸。

11.权利要求6的分离的寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为约10～约50个核苷酸。

12.权利要求6的分离的寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为约10～约40个核苷酸。

13.一种确定人免疫缺陷病毒(HIV)对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括：

(a)在所述HIV中，检测是否存在表7中所列的一个或多个HIV蛋白酶突变；

(b)对表7中提供的每一突变设定加权系数；和

(c)加上所述加权系数而获得所述HIV的总分，其中如果所述总分等于或高于6，则所述HIV耐受用所述蛋白酶抑制剂治疗的可能性增加。

14.权利要求13的方法，其中如果所述总分等于或高于7，则所述HIV耐受用所述蛋白酶抑制剂治疗的可能性增加。

15.权利要求13的方法，其中如果所述总分等于或高于8，则所述HIV耐受用所述蛋白酶抑制剂治疗的可能性增加。

16.权利要求13的方法，其中在所述HIV的蛋白酶中检测所述突变。

17.权利要求13的方法，其中在所述HIV的编码蛋白酶的核酸中检测所述突变。

18.一种确定感染人免疫缺陷病毒(HIV)的个体对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括：

(a)在来自所述个体的样品中，检测是否存在表7中所列的一个或多个HIV蛋白酶突变；

(b)对表7中提供的每一突变设定加权系数；和

(c)加上所述加权系数而获得所述个体的总分，其中如果所述总分等于或高于6，则所述个体耐受用所述蛋白酶抑制剂治疗的可能性增加。

19.权利要求18的方法，其中如果所述总分等于或高于7，则所述个体耐受用所述蛋白酶抑制剂治疗的可能性增加。

20.权利要求18的方法，其中如果所述总分等于或高于8，则所述个体耐受用所述蛋白酶抑制剂治疗的可能性增加。

21.权利要求18的方法，其中在所述HIV的蛋白酶中检测所述突变。

22.权利要求18的方法，其中在所述HIV的编码蛋白酶的核酸中检测所述突变。

23.权利要求1、2、13或18的方法，其中所述人免疫缺陷病毒是1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)。

24.权利要求1、2、13或18的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。

25.权利要求4、17或22的方法，其中所述蛋白酶中所述突变的所述是否存在通过将序列特异性寡核苷酸探针与所述人免疫缺陷病毒的编码所述突变的核酸序列杂交进行检测，其中杂交的出现指示所述突变的所述存在与否。

26.权利要求25的方法，其中所述序列特异性寡核苷酸探针与编码所述突变的核酸杂交且杂交的存在指示所述突变的存在。

27.权利要求4、17或22的方法，其中通过核酸测序检测所述蛋白酶中所述突变的所述存在与否。

28.权利要求2或18的方法，其中个体正在接受或已经接受用所述或不同蛋白酶抑制剂的先前治疗。

29.权利要求1、2、13或18的方法，其中蛋白酶含有与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的序列。

30.权利要求1、2、13或18的方法，其中蛋白酶含有与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的序列。

31.权利要求1、2、13或18的方法，其中所述方法包括在2或多个氨基酸位点检测是否存在与用所述蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变。

32.一种确定HIV对用第一个蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中检测所述蛋白酶的氨基酸序列的10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在与用第二个蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该HIV对用所述第一个蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或I84V。

33.一种确定HIV感染的个体对用第一个蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在来自所述个体的样品中检测在HIV蛋白酶氨基酸序列的10、11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、84或95位氨基酸是否存在与用第二个蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该个体对用所述第一个蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、V82A或I84V。

34.权利要求32或33的方法，其中第一个蛋白酶抑制剂是洛匹那韦或安泼那韦。

35.权利要求32或33的方法，其中第二个蛋白酶抑制剂是洛匹那韦或安泼那韦。

36.一种确定HIV对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中或在所述HIV的编码蛋白酶的核酸中检测在所述蛋白酶氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸是否存在与用所述蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该HIV对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是V32I或I47V。

37.一种确定HIV感染的个体对用蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性是否增加的方法，包括在来自所述个体的样品中检测在HIV蛋白酶氨基酸序列的10、11、32、47、53、71或95位氨基酸是否存在与用所述蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示该个体对用该蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低的可能性增加，但其前提条件是所述突变不是V32I或I47V。

38.权利要求37或38的方法，其中与用所述蛋白酶抑制剂治疗的敏感性降低相关的突变选自L10F、F53L和A71L。