CN1439051A - 编码抗肌萎缩蛋白小基因的dna序列及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一系列保留了基本生物功能的新抗肌萎缩蛋白小基因。抗肌萎缩蛋白小基因的表达可被一个调节元件及一个小的聚腺苷酸化信号调控。整个基因表达盒可轻易地包装入病毒载体,优选地为AAV载体。本发明还定义了抗肌萎缩蛋白的最小功能结构域,并提供了优化和产生抗肌萎缩蛋白小基因新变体的方式。最后,本发明提供了治疗迪谢纳肌营养不良(DMD)和贝克肌营养不良(BMD)的方法。
Description
技术领域
本发明涉及保留了全长抗肌萎缩蛋白基因基本生物功能的新抗肌萎缩蛋白小基因,并涉及使用该新抗肌萎缩蛋白小基因对哺乳动物受试者的迪谢纳肌营养不良(DMD)和贝克肌营养不良(BMD)进行治疗的方法。
发明背景
迪谢纳肌营养不良(DMD)是一种与X染色体相关的遗传性肌肉疾病,每3500个新生男婴中就有1个受其影响(Kunkel等,自然(Nature)(伦敦)322,73-77[1986])。进行性的肌肉退化和虚弱通常将患者在刚10多岁时就限制在轮椅上,并在刚20多岁时死亡。DMD由抗肌萎缩蛋白基因的隐性突变引起,该基因是目前所知的最大的基因,其在X-染色体上覆盖有近三百万个碱基对,具有79个外显子,约11kb的编码序列,以及有高的从头突变率。(Koenig等,细胞(Cell)50,509-517[1987])。
抗肌萎缩蛋白为具有3685个氨基酸(aa)的巨大棒状蛋白质,其定位于肌细胞膜内表面的下面(Watkins,S.C.等,自然333,863-866[1988])。它通过四个主要的结构域起作用:N-末端结构域(1-756aa)、中央棒状结构域(757-3122aa)、富含半胱氨酸(CR)的结构域(3123-3409aa)和远端的C-末端结构域(3410-3685aa)。N-末端结构域与细胞骨架结构的F-肌动蛋白结合,而CR结构域与远端的C-末端结构域一同通过抗肌萎缩蛋白相关蛋白(DAP)复合体锚定于细胞膜,这样抗肌萎缩蛋白交联并稳定肌细胞膜和细胞骨架。中央棒状结构域含有24个三股螺旋棒状重复序列(R1-R24)和4个铰合部(H1-H4)。每一重复序列长约109aa。(Koenig等,生物化学杂志(J Biol Chem)265,4560-4566[1990])。认为中央棒状结构域在肌肉收缩期间起“减震器”的作用。抗肌萎缩蛋白交联并稳定肌肉细胞膜和细胞骨架。功能性抗肌萎缩蛋白的缺乏导致DAP复合体的失去并引起肌纤维质膜的不稳定性。这些缺陷接下来导致慢性肌肉损害和退化性病理现象。
绝大多数DMD突变为破坏了抗肌萎缩蛋白mRNA阅读框或导入了提前结束蛋白质翻译的终止密码子(Monaco等,基因组学(Genomics)2,90-95[1998])。该疾病的较不严重等位形式为贝克肌营养不良(BMD),抗肌萎缩蛋白基因的突变通常为保留了mRNA阅读框。这样,对BMD患者而言,合成了一些功能性基因产物,但量和/或质减少,导致较轻的表型(Hoffman等,新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)318,1363-1368[1988])。
mdx小鼠(Bulfield等,美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81,1189-1192[1984])为DMD的动物模型。mdx抗肌萎缩蛋白基因中的遗传损坏为在mRNA的碱基3185处的无义突变,这引起翻译在外显子23内的提前终止。该无义突变排除了功能性蛋白质的合成。
由于对DMD缺乏有效的治疗,人们积极探索了一些新的遗传方法,包括细胞治疗和基因治疗。但成肌细胞移植的临床试验并不成功,这是因为移植细胞的存活性差(Gussoni等,自然医学(Nature Med)3,970-977[1997])。最近报道了用庆大霉素处理mdx小鼠导致对抗肌萎缩蛋白基因中提前终止密码子的抑制,并导致接下来表达功能性抗肌萎缩蛋白且将其定位至细胞膜(Barton-Davis等,临床研究杂志(J Clin Invest.)104,375-381[1999])。这种治疗对高达15%的DMD患者证明是有效的。
体细胞基因转移提供了一种新的置换缺陷抗肌萎缩蛋白基因的方法。用于将编码基因产物的遗传物质导入器官或组织的一种优选方法是使用病毒载体。在这种情况下,将编码基因产物的遗传物质***病毒基因组(或部分的病毒基因组)。指导基因产物表达的调控元件可与遗传物质一起***病毒基因组(即与基因连接***病毒基因组),或指导基因产物表达的调控元件可由病毒基因组自身提供,如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺伴随病毒(AAV)末端反向重复序列(ITR)。用病毒载体感染细胞的优点在于:病毒载体编码的分子(如由包含在病毒载体内的cDNA编码的分子)可在已摄入了病毒载体核酸的细胞中有效表达,且病毒载体***可在体内使用。在下面的子部分中分别描述了不同的病毒载体。
1.腺病毒载体:可对腺病毒基因组进行操作,使其编码并表达目标基因产物且丧失在正常裂解性病毒生活周期中复制的能力(Curiel,纽约科学院纪事(Ann N Y Acad Sci)886,158-71[1999])。来自腺病毒Ad5型dl324毒株或其它腺病毒(如Ad2,Ad3,Ad7等)毒株的合适腺病毒载体为本领域技术人员熟知。重组腺病毒是有利的,因为它们不需要***的细胞而成为有效的基因递送载体,且可用于感染大量的细胞类型,包括呼吸道上皮细胞、内皮细胞和肌细胞。另外,导入的腺病毒DNA(以及其中含有的外源DNA)不整合入宿主细胞的基因组并仍为游离的,因此避免了当导入的DNA在整合入宿主基因组(例如逆病毒DNA)时由于***诱变而可引发的潜在问题。
而且,腺病毒基因组携带外源DNA的容量相对于其它基因递送载体要大(高达8千个碱基)(Haj-Ahmand等,病毒学杂志(J.Virol.)57,267-273[1986])。目前使用的大多数复制缺陷型腺病毒载体为缺失了全部或部分的病毒E1和E3基因,但保留了多达80%的腺病毒遗传物质。Kochanek等和Chamberlain等也描述了缺失全部病毒编码区的腺病毒载体(美国专利号5,985,846和美国专利号6,083,750)。
已在营养不良的动物模型中成功测试了腺病毒载体(Ragot等,自然361,647-50[1993];Howell等,人类基因治疗(Hum Gene Ther)9,629-34[1998])。但腺病毒载体的免疫原性和不能感染成熟肌细胞仍是其在可安全用于人之前有待克服的主要障碍。
2.单纯疱疹病毒(HSV)载体:HSV载体的主要特征在于它有非常大的包装容量,它通常是复制缺陷的且不整合入宿主基因组。HSV感染神经***的细胞(Fink等,神经科学年鉴(Annu Rev Neurosci)19,265-287,[1996])。该病毒含有80多种基因,可替换其中之一(IE3)以产生HSV载体。产生缺失了许多立即早期基因产物的HSV载体可导致载体的毒性和抗原性降低且体内表达时间延长。但这些改变也导致较低的病毒产量。美国专利号5,661,033中描述了HSV载体的构建。
3.逆转录病毒载体:对缺陷的逆转录病毒为用于基因治疗目的而在基因转移中的用途进行了充分描述(Miller AD,血液(Blood)76,271-278[1990])。逆转录病毒科成员的特点在于在它们的毒粒中存在逆转录酶。在该科中包括一些属,包括Cisternavirus A、肿瘤病毒A、肿瘤病毒B、肿瘤病毒C、肿瘤病毒D、慢病毒和泡沫病毒。
重组逆转录病毒可通过将编码目标基因产物的核酸***逆转录病毒基因组而构建。另外,可去除部分的逆转录病毒基因组,使逆转录病毒复制缺陷。然后将复制缺陷的逆转录病毒包装入毒粒,毒粒再通过标准技术使用辅助病毒可感染靶细胞。在“最新分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology),Ausubel,F.M.等(编辑)Greene Publishing Associates,(1989),第9.10-9.14部分”和其它标准实验手册中可找到产生重组逆转录病毒的方法及用此类病毒体外或体内感染细胞的方法。合适的逆转录病毒载体的实例包括为本领域技术人员熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适的包装病毒细胞系的实例包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am。
逆转录病毒已被用于在体内和/或体外将多种基因导入许多种不同的细胞类型,包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞及造血干细胞(美国专利号4,868,116;美国专利号5,449,614和美国专利号6,207,455)。逆转录病毒载体需要靶细胞***,以便整合入宿主细胞的基因组,从而将核酸稳定导入细胞。因此,刺激靶细胞复制是必需的。已报道了在间接体内法中用逆转录病毒载体对造血干细胞或祖细胞的成功转导。但重组逆转录病毒载体只能容纳约8kb至10kb的外源DNA。此包装容量也限制了它在DMD遗传治疗中的用途。
4.慢病毒载体:慢病毒也属于逆转录病毒科,但它们可感染***及非***细胞。最为人们所知的慢病毒为人免疫缺陷病毒(HIV),其已被灭活并被开发为用于体内基因递送的载体。像简单的逆转录病毒一样,HIV具有称为gag、pol和env的三种基因,它也携带有六种辅助蛋白的基因,称为tat、rev、vpr、vpu、nef和vif。用逆转录病毒载体作为样板,已制备了慢病毒载体,其中转基因位于LTRs和包装序列之间(Naldni等,科学(Science)272,263-267[1996])。可去除部分的辅助蛋白同时不影响载体的产生或感染效率。
当慢病毒载体注射入啮齿动物脑、肝脏、肌肉、眼或胰岛细胞时,它们可持续表达六个月以上。人们对与慢病毒载体相关的可能存在的免疫问题知之甚少。而且似乎没有强的抗体反应。关于慢病毒载体的主要担心是它在人类应用时的安全性。但是最近对在病毒基因中具更多缺失以及安全性改善的第三代慢病毒载体的研发使得慢病毒载体可广泛用于体内基因治疗。
5.腺伴随病毒(AAV)载体:AAV是一种天然存在的缺陷病毒,它需要另一种病毒如腺病毒或疱疹病毒作为有效复制和生产性生活周期的辅助病毒(Muzyczka等,微生物学和免疫学的最新专题(Curr.Topics in Micro.and Immunol.)158,97-129[1992])。AAV载体是仅有的一种基于非致病的且复制缺陷病毒的病毒载体体系。它也是少有的几种可将其DNA整合入非***细胞并表现高频率稳定整合的病毒之一(Flotte等,美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.)7,349-356[1992];Samulski等,病毒学杂志63,3822-3828[1989])。可包装含有小至300个碱基对的AAVDNA的载体。
AAV载体已成功地用于在体内大量的组织中建立高效和长期的基因表达,且无明显的免疫反应或毒性(Xiao等,病毒学杂志70,8098-108[1996];Kessler等,美国国家科学院院报93,14082-7[1996];Xiao等,病毒学杂志72,10222-6[1998])。不像其它的病毒载体,AAV因其具有小的病毒颗粒大小(20nm)而易于越过胞外屏障,它有利于对不同成熟期肌纤维进行有效转导(Pruchnic等,人类基因治疗11,521-36[2000])。AAV也可通过血管递送至大量的肌肉群(Greelish等,自然医学5,439-443[1999])。空前的高效和安全性导致人们对AAV介导的遗传性肌肉疾病和代谢性疾病的基因治疗的兴趣增加。而AAV载体应用的主要障碍在于它有限的包装容量,其仅可包装小于4.7kb的基因(Song等,美国国家科学院院报95,14384-8[1998];Kay等,自然遗传学(Nat Genet)24,257-261[2000]),因而排除了像抗肌萎缩蛋白那样具有14kb cDNA的大基因。
可用于本发明的其它病毒载体体系来自痘苗病毒(Chen等,免疫治疗杂志(J Immunother)24,46-57[2001])以及一些RNA病毒。正在研发将正链RNA病毒科如脊髓灰质炎病毒(Bledsoe等,自然生物技术(NatBiotechnol.)18,964-9[2000])、肝炎病毒A(Romano G.干细胞(StemCells)18,19-39[2000])和辛德毕斯病毒(Wahlfors等,基因治疗(GeneTher)7,472-80[2000])在病毒感染后或用非病毒体系递送核酸后,用于高水平的基因表达。这些病毒表达可特异性复制病毒RNA的复制酶蛋白质。通过***转基因而取代病毒的衣壳基因,可产生在细胞中自主复制的嵌合RNA,并从RNA的正编码链高水平表达蛋白质。这些病毒载体非常适用于免疫策略,后者需要高的、瞬时基因表达,以诱导对被转导细胞的免疫反应。
除了病毒基因转移载体外,在过去的几年中,有效的非病毒基因转移载体也变得可临床应用(Ropert等,巴西医学生物学研究杂志(Braz J MedBiol Res.)32,163-9[1999];Lee RJ等,治疗用药物载体体系的关键性评论(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst)14,173-206[1997])。这些载体依赖哺乳动物细胞使用的大分子摄入和胞内转运的正常机制来将遗传物质递送入细胞。这些载体包括阳离子和其它脂质体、DNA-病毒结合物、RNA/DNA寡核苷酸以及令人吃惊地为裸DNA分子。物理方法如基于流体力学和基于电穿孔的方法已用于提高一些非病毒载体的基因转移效率(Zhang G等,基因治疗7,1344-9[2000];Yamashita等,癌研究(Cancer Res.)61,1005-12[2001])。最近,也报道了用与人免疫缺陷病毒TAT蛋白质的蛋白转导结构域融合的β-半乳糖苷酶腹膜内注射导致该融合蛋白质递送至小鼠的所有组织(Schwarze等,科学3,1569-1572[1999])。
已尝试了用携带抗肌萎缩蛋白基因的非病毒载体进行体细胞基因转移[Acsadi等,自然352,815-818[1991];Rando等,美国国家科学院院报97,5363-5368[2000]]。所获得的转基因表达只有非常有限的效率。
以前对产生较全长抗肌萎缩蛋白的1/2短的抗肌萎缩蛋白小基因的尝试未能保留基本的保护功能。Cox等和Greenberg等报道了在抗肌萎缩蛋白缺陷mdx小鼠的骨骼肌中Dp71的表达使其恢复了正常水平的抗肌萎缩蛋白相关蛋白(DAPs),其中所述Dp71为抗肌萎缩蛋白基因的一种71kD非肌肉产物,其由抗肌萎缩蛋白的富含半胱氨酸和C-末端结构域(外显子63-79)组成。但是Dp71的表达不能减轻肌肉退化的症状[Cox等,自然遗传学8,333-339[1994];Greenburg等,自然遗传学8,340-344[1994]]。同样地,Yuasa等(Yuasa等,欧洲生物化学会联合会快报(FEBS Lett)425,329-336[1998];Yamamoto等,人类基因治疗11,669-80[2000])显示在小鼠骨骼肌中具有完整N-和C-末端结构域以及1至3中央棒状重复序列的抗肌萎缩蛋白小基因的表达足以恢复DAP复合体,但不足以恢复肌纤维形态和防止营养不良的病理现象。
发明概述
本发明提供了大小明显减小但保护肌肉免于营养不良表型的基本功能保留的抗肌萎缩蛋白小基因。本发明也提供了携带抗肌萎缩蛋白小基因的病毒载体,其可对哺乳动物受试者生物化学上的和生理学上的缺陷介导有效的和稳定的校正。而且,本发明提供了体内认识抗肌萎缩蛋白功能性结构域并优化用于DMD基因治疗的小基因的更方便和更不费时的方法。最后,本发明提供了治疗肌营养不良的方法。
附图简述
图1示出了高度截短的抗肌萎缩蛋白小基因的构建和携带抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体。
图2a示出了用构建体AAV-MCK-Δ3849或AAV-MCK-Δ3990处理后第3个月对mdx小鼠的腓肠肌中抗肌萎缩蛋白和DAP复合体的免疫荧光(IF)分析。
图2b示出了对来自15周龄正常C57/B10小鼠、来自用载体AAV-MCK-Δ3849、AAV-MCK-Δ3990或AAV-MCK-Δ4173处理的mdx小鼠或来自未处理的mdx小鼠的腓肠肌中抗肌萎缩蛋白和DAP复合体的IF分析。
图3a示出了用AAV-MCKΔ3849处理10日龄mdx小鼠,小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的6个月处死。
图3b示出了在未处理的6月龄mdx小鼠中抗肌萎缩蛋白的表达。
图3c示出了用AAV-MCKΔ3849处理成年mdx小鼠,小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的2个月处死。
图3d示出了用AAV-MCKΔ3990处理成年mdx小鼠,小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的2个月处死。
图3e示出了用AAV-MCKΔ3849处理成年mdx小鼠,小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的4个月处死。
图3f示出了用AAV-MCKΔ3990处理成年mdx小鼠,小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的4个月处死。
图3g示出了用AAV-MCKΔ3849处理成年mdx小鼠,小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的6个月处死。
图3h示出了用AAV-MCKΔ3990处理成年mdx小鼠,小抗肌萎缩蛋白的表达。动物在病毒感染后的6个月处死。
图4a示出了处理10日龄mdx小鼠,抗肌萎缩蛋白小基因对肌肉质膜完整性的保护。
图4b示出了处理成年mdx小鼠,抗肌萎缩蛋白小基因对肌肉质膜完整性的保护。
图5a示出了含有两个棒(棒1和棒24,见图1)的构建体Δ2796的小抗肌萎缩蛋白表达的IF分析。注意在它注入年幼的mdx小鼠后肌细胞形态学和中央成核现象未改善。
图5b示出了来自含有一个棒(棒1和棒24的杂合棒,见图1和Yuasa等)的构建体CMV-M3的小抗肌萎缩蛋白表达的IF分析。注意在它注入年幼的mdx小鼠后肌细胞形态学和中央成核现象未改善。
图6示出了在AAV-MCK-Δ3990载体注射入成年mdx小鼠的TA肌后,肌肉力量的改善。对未处理的mdx TA肌(n=8)进行10个循环的拉长活化后,只有23%的力输出保留,而AAV处理的mdx TA肌(n=8)具有近40%的力输出保留。
发明详述及优选的实施方案
除非另外指出,本发明的操作规程采用本领域内组织学、病毒学、微生物学、免疫学和分子生物学的常规方法进行。此类技术在文献中有充分解释。上文或下文中引用的所有出版物、专利和专利申请全部并入作为本文的参考。
如在本说明书和所附的权利要求书中所用,单数形式的″a″、″an″和″the″包括复数形式,除非内容明确指出并非如此。
A.定义
在描述本发明时,将用到以下一些术语,下面将对这些术语进行定义。
“基因转移”或“基因递送”指的是可靠地将特定的核苷酸序列(如DNA)导入靶细胞的方法或体系。导入的核苷酸序列在体内可以游离形式存在,或整合入靶细胞的基因组中。基因转移提供了一种治疗获得性疾病和遗传性疾病的独特方法,本领域已开发了许多体系用于将基因转移入哺乳动物细胞。参见例如美国专利号5,399,346。
如此处所用,术语“有效量”指的是:通过本发明的方法,在所感染的器官或组织至少可引起部分所希望的治疗或预防效果的感染水平。这样用有效量的携带目标遗传物质的载体感染可导致用本发明方法感染的器官或组织中细胞活性的改变(如表型改变)。在一个优选的实施方案中,用有效量的携带目标遗传物质的载体感染导致了受感染器官或组织的显著量的细胞中细胞活性的改变。
基因转移“载体”指的是可将基因序列转移入细胞的任一介质,如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、脂质体、DNA-病毒结合物、RNA/DNA寡核苷酸、病毒、细菌等。这样,该术语包括克隆载体和表达载体,以及病毒载体和非病毒载体。通过将靶分子连接至载体,可使载体靶向特异的细胞。靶分子是对目标细胞或组织类型具特异性的任一介质,包括如配体、抗体、糖、受体或其它结合分子。本发明也包括起同等作用以及今后为本领域所知的此类其它载体形式。
“AAV载体”指来自一种腺伴随病毒血清型的载体以及来自多于一种AAV血清型的载体(杂合AAV载体),其中所述腺伴随病毒血清型包括人AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、禽AAV、绵羊AAV等。例如,杂合AAV载体可包括来自AAV-1和AAV-2的DNA序列。AAV载体可为将一种或多种AAV野生型基因优选地为rep和/或cap基因全部或部分删除,但保留了功能性的侧翼ITR序列。AAV载体可通过本领域公知的重组技术构建,以包含一段或多段在两端(5’和3’)侧翼具有功能性AAV ITRs的异源核苷酸序列。在操作本发明时,AAV载体可包括位于异源核苷酸序列上游的至少一个AAV ITR和一个合适的启动子序列,以及位于异源序列下游的至少一个AAV ITR。
“重组AAV载体质粒”指一类重组AAV载体,其中载体包含质粒。它通常和AAV载体一样,5’和3’ITRs在所选择的异源核苷酸序列侧翼。AAV载体也可包含转录序列(如聚腺苷酸化位点)和选择性标记基因和报告基因、增强子序列,以及其它诱导转录的调控元件。这些控制元件将在下面更充分地描述。另外,“AAV载体”可被稳定导入一株或多株细胞系以产生病毒颗粒。这样的细胞系通常被称为AAV包装细胞系。
在此用到的术语“重组AAV”、“重组AAV颗粒”或“重组AAV毒粒”定义为感染性的复制缺陷病毒,它由AAV蛋白外壳包裹(即外被以蛋白衣壳)一段异源核苷酸序列组成,该序列5’和3’侧翼同样也为AAV ITRs。关于这一点,单链AAV核酸分子(不论是有义/编码链还是反义/反编码链,如它们通常被定义的那样)可被包装入AAV毒粒;有义链和反义链同样具有感染性。当重组AAV DNA等于或小于病毒基因组全长的50%(约5,000个核苷酸)时,它能以双链发夹状DNA的形式包装入AAV毒粒。这样的颗粒也完全具有感染性。
术语“重组AAV颗粒”或“重组AAV毒粒”也指这样的杂合AAV颗粒,其中AAV蛋白外壳和被包裹的核苷酸序列可来自不同血清型的AAV。例如,杂合AAV颗粒可含有AAV-1衣壳蛋白和AAV-2 ITRs,或者反之亦然。也可用来自两种或更多的AAV衣壳蛋白基因编码序列来产生杂合的AAV衣壳蛋白。另外,通过氨基酸序列的突变、缺失和/或***可对重组AAV的衣壳蛋白进行操作,以改变重组AAV的向性(Wu等,病毒学杂志74,8635-47[2000];Girod等,自然医学5,1052-1056[1999])。
一些构建重组AAV的技术为本领域所公知。参见例如美国专利号5,173,414,Lebkowski等,分子细胞生物学(Mol Cell Biol)8,3988-3996[1988];Carter BJ,生物技术中的最新观点(Current Opinion inBiotechnology)3,533-539[1992];Muzyczka N,同上;和Zhou等,实验医学杂志(J.Exp.Med.)179,1867-1875[1994];Xiao等,病毒学杂志72,2224-32[1998]。
术语“表达调控元件”或“调节元件”总起来说是指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等,它们在受体细胞中共同提供编码序列的复制、转录和翻译。只要所选的编码序列在合适的宿主细胞中能够被复制、转录和翻译,就并不总是需要存在所有的这些调控元件。这里用到的术语“启动子”通常指的是能够被RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA调控序列。另外,启动子包含调节RNA聚合酶识别、结合和转录起始活性的序列。此类序列可为顺式作用序列或可对反式作用因子起反应。依据启动子的调节特性,它们可为组成型或调节型启动子。启动子的实例有SP6、T4、T7、SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、小鼠***瘤病毒(MMTV)类固醇诱导的启动子、莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、肌球蛋白启动子、α-肌动蛋白启动子等。另外,以上启动子的经修饰变体以及甚至合成的肌肉启动子(Li等,自然生物技术17,241-245,[1999])也包括在内。最后,启动子也可以是内源AAV启动子或AAV末端反向重复序列(ITR)。
术语“转导”指在体内或体外用复制缺陷病毒载体,如用重组AAV毒粒,将DNA分子递送入受体细胞。
术语“肌细胞”或“组织”指来自肌肉的细胞或细胞群,它包括但不限于来自骨骼肌、心肌、平滑肌(如来自消化道、膀胱和血管)的细胞或组织。本术语包括体外和体内的肌细胞。因此,例如分离的心肌细胞构成本发明的“肌细胞”,存在于受试对象体内肌肉组织中的肌细胞也构成本发明的“肌细胞”。本术语也包括分化及未分化肌细胞,如肌原细胞、肌管、成肌细胞、心肌细胞、成心肌细胞和祖细胞,其中所述祖细胞如经分化后可成为肌细胞的肌源性干细胞或骨髓源性干细胞。
“可操作地连接”指的是元件的排列,其中所描述的组分以行使它们通常功能的方式排列。因此可操作地连接至编码序列的调控元件能影响编码序列的表达。调控元件不必与编码序列相邻,只要这些调控元件能起到指导编码序列表达的作用即可。这样,例如在启动子序列和编码序列之间可存在***的不被翻译但可转录的序列,且仍认为启动子序列为“可操作地连接”至编码序列。
术语“抗肌萎缩蛋白小基因”是指大范围删除了人类抗肌萎缩蛋白cDNA中央棒状结构域和大范围删除了C-末端结构域而产生的新抗肌萎缩蛋白构建体。此外,抗肌萎缩蛋白小基因可包含改变的N-末端结构域,其中原始的蛋白质翻译起始密码子ATG周围的DNA序列被改变。这些改变的序列可增强小抗肌萎缩蛋白的合成。另外,抗肌萎缩蛋白小基因也可为杂合基因,其中一些结构域被来自utrophin或血影蛋白基因的同源结构域替代(Tinsley等,自然360,591-593[1992];Koenig等,细胞(Cell)53,219-216[1988])。尤其是utrophin与抗肌萎缩蛋白在结构和功能上是高度同源的,因此它们的主要结构域应该是可以互换的(Tinsley等,自然384,349-353[1996];Deconinck等,自然医学3,1216-21[1997];Rafael等,自然遗传学19,79-82[1998])。例如,在抗肌萎缩蛋白小基因中,抗肌萎缩蛋白的N-末端和/或C-末端结构域可被utrophin的相应部分替代。同样地,其中央棒状结构域可由来自utrophin或血影蛋白基因的棒状重复序列组成。抗肌萎缩蛋白小基因小于AAV病毒载体的5kb包装极限。另外,使用与本发明所描述的构建抗肌萎缩蛋白小基因的类似方式来构建utrophin小基因也成为可能。因为一些DMD患者完全缺乏抗肌萎缩蛋白,故抗肌萎缩蛋白小基因的产物也可能为一种新抗原。将抗肌萎缩蛋白的结构域用utrophin的那些结构域替换可降低免疫应答。
术语“小抗肌萎缩蛋白”指由抗肌萎缩蛋白小基因编码的多肽。最重要的是,小抗肌萎缩蛋白具有使肌肉免于发生营养不良的病理现象和症状的生物学功能。
符号“Δ”(δ)是包含有上述缺失的抗肌萎缩蛋白小基因的前缀。
“哺乳动物受试对象”指哺乳动物纲的任何成员,包括但不限于人类和非人类的灵长目动物(如黑猩猩)和其它类人猿和猴;农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马;驯养的哺乳动物如狗和猫;实验动物包括啮齿类动物如小鼠、大鼠和豚鼠等。本术语不指具体的年龄和性别。这样,不论是雄性的还是雌性的成年、新生及胎儿受试对象都含盖在其中了。
术语“表达盒”指的是遗传物质构建体,它包含编码序列和足够的在受体细胞中指导编码序列正确转录和翻译的调控信息。
B.发明详述
为了探究用病毒载体作为DMD基因治疗的可行性,我们设计了产生新抗肌萎缩蛋白小基因的策略,其中所述抗肌萎缩蛋白小基因足够小,以至于可被包装入逆转录病毒或AAV载体,且仍保留了保护肌肉免于病理症状所需的基本功能。我们已产生了这样的小基因,其删除了高达75%的中央棒状结构域(24个棒中的20个;4个铰合部中的2个)以及几乎所有的C-末端结构域(外显子71-78)(图1)。这些新抗肌萎缩蛋白小基因只有11kb全长抗肌萎缩蛋白编码序列的三分之一(1/3),明显小于广泛用于mdx小鼠的转基因和基因治疗研究的6.3kb贝克-型小抗肌萎缩蛋白基因(England等,自然343,180-2[1990])。该小基因包含抗肌萎缩蛋白基因的N-末端序列、抗肌萎缩蛋白基因的C-末端富含半胱氨酸(CR)结构域、抗肌萎缩蛋白基因的至少H1和H4以及至少4个棒状重复序列。棒状重复序列可选自抗肌萎缩蛋白、utrophin或血影蛋白基因的棒状重复序列,优选地选自抗肌萎缩蛋白基因的24个棒状重复序列,且最优选地选自抗肌萎缩蛋白基因的R1、R2、R3、R22、R23和R24棒状重复序列。可改变抗肌萎缩蛋白小基因的N-末端,以提高表达效率且不影响基因产物的功能。例如原来在抗肌萎缩蛋白基因翻译起始ATG密码子周围的序列可用Kozak序列替换,以增加蛋白质合成的效率。在本发明的一个实施方案中,在编码序列上游的三个核苷酸可由“AAA”变为“CCA”且编码序列中的第四个核苷酸可由“C”变为“G”。此外N-末端的一部分或全部可由utrophin基因的对应部分替换。同样,抗肌萎缩蛋白小基因的CR结构域也可用utrophin基因的对应部分替换。
可用多种方法将抗肌萎缩蛋白小基因导入哺乳动物受试对象。可用或不用基于流体动力学的方法或基于电穿孔的方法,将在表达盒中的该基因以裸DNA形式导入受试对象。可用非病毒载体如脂质体或病毒-脂质体复合体,或用病毒载体如腺病毒、HSV、杆状病毒、逆转录病毒、慢病毒且优选地用AAV,将该基因导入受试对象。抗肌萎缩蛋白小基因的表达可受一系列调控元件的调控,后者包括但不限于AAV末端反向重复序列(ITR)、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和/或增强子、CMV增强子和小鸡β-肌动蛋白启动子(CB启动子)、α-肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、肌肉特异的肌酸激酶(MCK)启动子和/或增强子等。另外,也可使用上述启动子的修饰变体和合成的肌肉启动子(Li等,同上)等。
可用免疫荧光染色和免疫印迹(Western印迹)来检测抗肌萎缩蛋白小基因的表达。该小抗肌萎缩蛋白的功能可通过测定小抗肌萎缩蛋白是否可在肌纤维质膜上恢复失去的DAP复合体(包括肌聚糖复合体)来检测,其中所述肌聚糖复合体在未经治疗的由于原发性抗肌萎缩蛋白缺陷而引起的营养不良肌肉中未发现。为了进一步研究新的小抗肌萎缩蛋白的功能,必须证实它们可保护肌肉免于病理表型。在mdx小鼠中病理变化开始于大约三周龄时,此时出现明显的肌纤维的退化/再生。此过程的特点在于在肌纤维中出现中央核,这是肌营养不良的初级病理征象。基因治疗后中央成核现象的消失或减少说明治疗是成功的。肌纤维中核的位置可由DAPI染色或H&E染色确定。
可用来自Vector Laboratories(Burlingame,CA)的Mouse-on-MouseKit,除了冷冻切片可立即用封闭缓冲液处理而无需固定步骤外,按照厂商提供的方法对厚度为8μm的肌肉冷冻切片进行免疫荧光染色,(Li等,基因治疗(Gene Ther)6,74-82[1999])。抗肌萎缩蛋白的单克隆抗体(NCL-Dys3和NCL-Dys2)和抗α-、β-和γ-肌聚糖的单克隆抗体(NCL-α-SARC,NCL-β-SARC和NCL-γ-SARC)可购自Novocastra LaboratoriesLtd(Burlingame,CA)。肌细胞核可用0.01%DAPI(Sigma,St.Louis,MO)复染10分钟。用Nikon TE-300荧光显微镜照相。
在营养不良的肌肉中,质膜的损伤和渗漏是其主要的生理缺陷,也是主要的病理原因。为了判断AAV小抗肌萎缩蛋白治疗是否可以有效地保护质膜免受机械损害,通过静脉内注射伊文氏蓝染料进行肌纤维膜完整性试验。伊文氏蓝是一种广泛用于活体的红色荧光染料,它可被正常肌纤维排除,但可被由于收缩性受损而含有营养不良肌纤维的渗漏细胞膜摄入。以前对mdx小鼠的研究揭示凋亡肌核主要在伊文氏蓝染色阳性的肌纤维中找到,因此质膜渗漏和肌细胞凋亡相关(Matsuda等,生物化学杂志(JBiochem)(东京)118,959-64[1995])。
可将伊文氏蓝染料(10mg/ml,PBS配制)以0.1mg/g体重注射入C57/B10小鼠、mdx小鼠和AAV载体处理的mdx小鼠尾静脉。染料注射后,使得小鼠继续游泳20分钟。伊文氏蓝注射后15小时,收集肌肉并冷冻切片。可在荧光显微镜下用罗丹明滤光片观察伊文氏蓝染色阳性的肌纤维。
对用含抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体处理后mdx小鼠肌收缩力的改善进行了评估。向2至3月龄的mdx小鼠胫骨前(TA)肌肉注射AAV-MCK-3990载体。注射方式为处理同一动物的一条腿,而另一条腿不处理。后者用作对照。AAV处理后6个月,mdx小鼠用戊巴比妥钠麻醉(70mg/kg,i.p.),并移去所有的TA肌,将TA肌置于直立组织室内用于体外进行力测量。肌肉用阴极电流的单相位矩形脉冲(持续1.0-ms)刺激(Grassmodel S-88刺激器和电流增幅器)。用递送持续500ms的75pps刺激频率来评估最大僵直力(P0)。测定P0后,测定TA肌在反复的拉长活化期间(这会诱发对肌肉的最大损伤)持续力产生的能力。在拉长前测定的最大力称为PISO。接下来,以1.0L0/s的恒速将肌肉从100拉长至110%L0。刺激训练每2分钟重复一次(工作负载循环为0.004),共进行10个循环。PISO的改变用于指示与由拉长活化造成的损伤相关的肌肉功能损伤。
C.优选的实施方案
下列实施例仅用于例示一些实施方案,而并不用于限制本权利要求的范围,权利要求的范围只受本说明的限制。
实施例1
抗肌萎缩蛋白小基因和携带该小基因的AAV载体
本实施例描述了高度截短的抗肌萎缩蛋白小基因和携带该小基因的AAV载体的构建。该抗肌萎缩蛋白小基因构建体主要通过PCR克隆法制备,PCR克隆法使用了Pfu聚合酶(Stratagene,CA)并以人抗肌萎缩蛋白cDNA(GenBank#NM 004006)作为模板。为了一致,核苷酸的编号只包括11,058bp抗肌萎缩蛋白的蛋白质编码序列(SEQ ID NO:1)。
如在图1中所描述的那样,抗肌萎缩蛋白小基因Δ4173(SEQ ID NO:2)包含核苷酸1-1992(N-末端,铰合部H1以及棒R1、R2和R3,SEQ ID NO:3)和8059-10227(棒R22、R23和R24,铰合部H4以及CR结构域,SEQ IDNO:4)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸,SEQ ID NO:5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3990(SEQ ID NO:6)包含核苷酸1-1668(N-末端,铰合部H1以及棒R1和R2,SEQ ID NO:7)、7270-7410(铰合部H3,SEQ ID NO:8)、8059-10227(棒R22、R23和R24,铰合部H4和CR结构域,SEQ ID NO:4)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸,SEQID NO:5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3849(SEQ ID NO:9)包含核苷酸1-1668(N-末端,铰合部H1以及棒R1和R2,SEQ ID NO:7)、8059-10227(棒R22、R23和R24,铰合部H4和CR结构域,SEQ ID NO:4)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸,SEQ ID NO:5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3531(SEQ ID NO:10)包含核苷酸1-1341(N-末端,铰合部H1和棒R1,SEQ ID NO:11)、8059-10277 (棒R22、R23和R24,铰合部H4和CR结构域,SEQ ID NO:4)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸,SEQ ID NO:5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3510(SEQ ID NO:12)包含核苷酸1-1668(N-末端,铰合部H1和棒R1和R2,SEQ ID NO:7)、8407-10277(棒R23和R24,铰合部H4和CR结构域,SEQ ID NO:13)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸,SEQ ID NO:5)。
抗肌萎缩蛋白小基因Δ3447(SEQ ID NO:14)包含核苷酸1-1992(N-末端,铰合部H1以及棒R1、R2和R3,SEQ ID N0:3)、8794-10277(棒R24,铰合部H4和CR结构域,SEQ ID NO:15)和11047-11058(抗肌萎缩蛋白的最后3个氨基酸,SEQ ID NO:5)。
通过平末端连接Pfu扩增的每一单独片段的PCR产物而制备上述构建体,这样所有的蛋白质编码序列被一起精确地剪接在一个框架内。反应中用到的PCR引物列在表1中:
表1抗肌萎缩蛋白片段的克隆中所用的PCR引物引物名称 引物序列(5′-3′) 序列位置正向引物:F1(ATG-A) ATTTTCACCATGGTTTGGTGGGAAGAAG 1-19(28bp) SEQ ID NO:16F2(H3-1) CAGCCTGACCTAGCTCCTGGACTGA 7270-7294(25bp) SEQ ID NO:17F3(R22-1) ACTCATAGATTACTGCAACAGTTCC 8059-8083(25bp) SEQ ID NO:18F4(R23-1) AGTTCTGACCAGTGGAAGCG 8407-8427(20bp) SEQ ID NO:19F5(R24-1) ACCCTTGAAAGACTCCAGGAAC 8794-8816(22bp) SEQ ID NO:20反向引物:R1(R1-2) TCTATGTAAATTGCTTTGTT 1341-1361(20bp) SEQ ID NO:21R2(R2-2) GTAAAAGAACCCAGCGGTCT 1668-1644(25bp) SEQ ID NO:22R3(R3-2) CTGTGCTGTACTCTTTTCAAGTTTT 1992-1968(25bp) SEQ ID NO:23R4(H3-2) AGGTACCTCCAACATCAAGGAAGAT 7410-7386(25bp) SEQ ID NO:24R5(Tail-2A) CTACATTGTGTCGGGAGTTTCCATGTTGTC 11058-11047 SEQ ID NO:25
10227-10210(30bp)
然后将抗肌萎缩蛋白小基因亚克隆入包含一个MCK启动子、一个来自质粒p(+enh206)358MCKCAT的595bp Hind III/BstE II片段(Shield等,分子细胞生物学(Mol Cell Biol)16,5058-68[1996])和一个60bp小polyA信号序列的AAV载体质粒(SEQ ID NO:26),产生AAV载体构建体AAV-MCK-Δ4173(SEQ ID NO:27),AAV-MCK-Δ3990(SEQ ID NO:28),AAV-MCK-Δ3849(SEQ ID NO:29),AAV-MCK-Δ3531(SEQ IDNO:30),AAV-MCK-Δ3510(SEQ ID NO:31)和AAV-MCK-3447(SEQID NO:32)。
同样,也可将抗肌萎缩蛋白小基因克隆入包含一个CMV启动子(620bp)和小polyA信号序列的AAV载体质粒(SEQ ID NO:33),产生AAV载体构建体AAV-CMV-Δ3990(SEQ ID NO:34),AAV-CMV-Δ3849(SEQID NO:35)。此外,将抗肌萎缩蛋白小基因Δ3849克隆入包含一个MCK增强子、一个CMV启动子和小polyA信号序列的AAV载体质粒,产生AAV载体构建体AAV-E-CMV-Δ3849(SEQ ID NO:36)。
按照Xiao等人所描述的三质粒共转染法精确产生重组病毒载体原液(引用同上)。接下来用以前公开的方法经CsCl密度梯度超速离心纯化AAV病毒载体两次(Snyder等,人类遗传学最新方法(Current Protocols inHuman Genetics),编辑Dracopoli等[John Wiley & Sons Ltd.,纽约],12.1.1-12.2.23页[1996])。病毒颗粒数的载体滴度通过DNA斑点印迹法测定(Snyder等,引用同上),每毫升约有5×1012个基因组拷贝(GC)。
实施例2
DAP复合体的恢复
本实施例描述了抗肌萎缩蛋白小基因产物能否仍保留其主要的生物化学功能,其中所述主要的生物化学功能包括膜下定位和与抗肌萎缩蛋白相关蛋白(DAP)复合体的相互作用。健康C57/B10小鼠和营养不良mdx小鼠购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor,Maine)。将50μl(5×1010GC)不同的AAV小抗肌萎缩蛋白载体注入十日龄mdx幼鼠或50日龄mdx成鼠后腿腓肠肌。
在载体注射后第3月和第6月时,收集肌肉以评估小抗肌萎缩蛋白的表达和DAP复合体的生物化学恢复情况,其中所述DAP复合体由于抗肌萎缩蛋白的原发性缺陷而缺失。对AAV处理肌肉的薄切片上用人抗肌萎缩蛋白特异性抗体(Dys3)进行IF染色,在大多数肌纤维中显示出广泛的载体转导以及小抗肌萎缩蛋白的正确膜下定位,尤其在用含有抗肌萎缩蛋白小基因Δ3849或Δ3990的AAV载体处理的肌肉中(图2a和2b;图3a)。如所预期的那样,当用能够识别小鼠和人抗肌萎缩蛋白C-末端区域的抗体(Dys2)对年龄相当的健康C57/B10小鼠的相应肌肉进行染色时,显示出难区分的抗肌萎缩蛋白染色模式(图2b)。如所预期的那样,该抗体(Dys2)不能对AAV处理的mdx肌肉染色,因为我们的抗肌萎缩蛋白小基因缺乏C-末端区域(数据未显示)。这个结果进一步证明了小抗肌萎缩蛋白是来自AAV载体的。相一致的是,除了极少数发生体细胞回复突变的肌纤维可被Dys2抗体识别外,未处理的mdx对照肌肉显示无抗肌萎缩蛋白染色(图2b)。而且,用AAV小抗肌萎缩蛋白载体注射成年mdx肌肉(腓肠肌),在注射AAV MCK载体后第2月和第4月(图3c-3f)或注射AAV CMV载体后第6月(图3g和3h)检查抗肌萎缩蛋白表达时,显示出相似的结果。重要的是,没有针对持续表达来自AAV载体的人源性小抗肌萎缩蛋白的肌纤维进行损害的细胞毒T淋巴细胞(CTL),无论这些AAV载体是由CMV启动子驱动的,还是由肌肉特异性的MCK启动子驱动的。
分别用抗α,β和γ肌聚糖的三种抗体进行免疫荧光染色,在邻近于抗肌萎缩蛋白抗体染色处的所有连续薄切片中都显示阳性结果。这些结果为小抗肌萎缩蛋白的生物化学功能提供了证据,它们虽缺乏C-末端结构域但仍能与DAP复合体相互作用。
实施例3
营养不良病理学的改善
本实施例显示抗肌萎缩蛋白小基因产物可保护肌肉免于表现出营养不良的病理表型。mdx小鼠的病理现象开始于约三周龄时,表现为大量的肌纤维退化/再生。该过程的特点在于肌纤维中存在中央核,是肌肉营养不良的主要病理迹象。基因治疗后中央成核现象的消失或减少表明治疗是成功的。因此,我们最初选择对出现中央成核现象前的mdx幼鼠(10日龄)检测AAV抗肌萎缩蛋白构建体,以了解是否可预防肌肉的退化/再生。
在中央成核现象开始前用AAV小抗肌萎缩蛋白(包含多于两个棒状结构域)处理,处理后第3月和第6月时对mdx肌肉进行组织学检查,通过抗肌萎缩蛋白免疫染色和肌核DAPI复染,可观察到在小抗肌萎缩蛋白阳性的肌纤维中几乎全是(~98%)外周成核现象(图2a,图2b第一列,图3a和表2)。在载体处理的mdx肌肉中小抗肌萎缩蛋白的表达和中央成核现象之间的相互排斥恰好反映出正常肌肉中的情况(图2b和表2)。另外,小抗肌萎缩蛋白表达阳性的肌纤维也显示一致的肌纤维大小和多边形形状,与正常肌肉没有明显不同(图2a和2b)。相反,未处理的mdx肌肉显示出广泛的(75.4%)中央成核现象(表2)及其它营养不良的病理征象,包括肌纤维大小的广泛变异、圆形肌纤维和纤维化(图2b)。值得注意的是,用构建体Δ2796和M3(分别含2个棒和1个棒,见图1)处理的mdx肌肉除了小抗肌萎缩蛋白的IF染色阳性外显示出与未处理的mdx肌肉相同的形态,其中小抗肌萎缩蛋白的IF染色阳性在改善肌肉形态学、病理学及预防肌肉变性/再生和中央成核现象方面是没有作用的(图5a和5b,表2)。因此,用携带含有两个以上棒(见图1)的小基因的AAV载体处理营养不良肌肉可预防营养不良病理现象,并在小抗肌萎缩蛋白阳性区域中导致正常的组织学形态(包括外周成核现象、一致的肌纤维大小和无纤维化等)。这些结果明确地证明了在mdx幼鼠中由于新的小抗肌萎缩蛋白的治疗作用而使肌肉退化不存在。
我们随后在已发生了广泛退化/再生的成年mdx小鼠(45日龄)中对携带含两个以上棒的抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体进行测试,以了解是否能停止或逆转这些病理进程。在载体注射时,大多数(~75%)的肌纤维已经经历了退化/再生,并显示出中央成核现象。在AAV小抗肌萎缩蛋白注射后第2月、第4月和第6月时,观察到广泛的抗肌萎缩蛋白的表达,并且在抗肌萎缩蛋白阳性区域中出现正常的肌纤维形态和无纤维化(图3a和3b)。相反,未处理的mdx小鼠肌肉(图3b)或未成功进行载体基因转移的处理肌肉区则显示出进行性退化和纤维化。另外,在小抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维中观察到中央成核现象的减少(从载体处理前的约75%到载体处理后的35~50%,见表2)。在健康小鼠的肌肉中也观察到了中央成核现象的部分逆转,其中所述健康小鼠的肌肉曾经历过如肌毒素处理的瞬时病理变化,大多数肌核仍保持中央定位(Martin等,肌神经(Muscle Nerve)11;588-96[1988])。在以携带全长抗肌萎缩蛋白cDNA的无功能腺病毒载体处理成年mdx肌肉后也观察到持续存在的中央成核现象。基于以上观察,我们新的小抗肌萎缩蛋白基因(含两个以上棒)在改善年幼和成年mdx肌肉营养不良的病理学方面显示出治疗效果。
实施例4
保护肌纤维膜的完整性
本实施例显示了含两个以上棒的小抗肌萎缩蛋白(见图1)能够保护肌纤维膜的完整性。最初,将伊文氏蓝注射入mdx小鼠的尾静脉,其中mdx小鼠在三个月前的幼年时间(10日龄)已用AAV载体处理。年龄相当的未处理mdx小鼠和健康C57/B10小鼠用作对照。使得小鼠不停游泳20分钟以诱生机械应力。然后收集肌肉,进行抗肌萎缩蛋白表达和伊文氏蓝染料摄入的检查。如所预料的,健康小鼠的肌肉在肌肉切片中表现出一致的抗肌萎缩蛋白染色且染料不被肌纤维摄取(见图4a,第一行)。AAV载体处理的肌肉表现出和健康肌肉一致的结果,因此抗肌萎缩蛋白的表达与伊文氏蓝染料的摄取之间相互排斥(见图4a,第二行到第四行)。染料摄取(红色荧光)仅仅出现在缺乏小抗肌萎缩蛋白表达的肌纤维中,位于未被AAV载体转导的区域中(见图4a,第二、三、四行)。相反,未处理的mdx肌肉显示出抗肌萎缩蛋白的缺乏和广泛的染料摄入(图4a,最下行)。更重要的是,以AAV小抗肌萎缩蛋白处理成年mdx肌肉,载体注射后2个月和6个月时进行分析,在保护肌纤维免于发生质膜渗漏方面也达到了类似结果(图4b)。这些结果明确地表明了,不论在mdx幼鼠还是在成年mdx小鼠,新的小抗肌萎缩蛋白都具有维护膜完整性和保护肌纤维免受机械损伤的生理功能。
表2.在幼年和成年mdx小鼠中AAV小抗肌萎缩蛋白基因转移动物* 载体注射时 注射后 %抗肌萎缩蛋白和载体 n 的年龄 的月份 阳性纤维 %中央核**mdx+Δ3510 4 12天 3 35~80 1.06(68/6413)mdx+Δ3531 4 12天 3 25~40 1.72(37/2140)mdx+Δ3849 4 10天 3 56~88 1.02(72/7098)mdx+Δ3990 4 10天 3 50~80 0.99(56/5652)mdx+Δ4173 4 10天 3 15~25 0.93(26/2791)mdx+Δ3849 4 10天 6 40~60 2.80(51/1824)mdx+Δ3990 2 10天 6 35~45 2.30(34/1478)mdx+Δ3849 2 50天 2 35~50 34.76(510/1467)mdx+Δ3990 2 50天 2 35~40 34.18(685/2004)mdx+Δ3849 4 50天 4 20~25 44.24(615/1390)mdx+Δ3990 4 50天 4 20~30 46.18(695/1505)C57/B10 4 不注射 N/A 100 1.45(56/3860)mdx 4 不注射 N/A <1 75.4(2382/3160)mdx+Δ2796 4 12天 3 30~45 72(3888/5400)mdx+M3 8 10~12天 3 20~65 81(5589/6900)
注:*未处理的对照mdx和C57/B10小鼠在实验结束时约三个月大。AAV载体由MCK启动子驱动。
**所有这些数据均收集自免疫荧光染色和DAPI复染后所拍摄的抗肌萎缩蛋白阳性肌纤维,除了具有广泛的中央成核现象和极少的抗肌萎缩蛋白阳性的未处理mdx小鼠外。
实施例5
肌肉力量的恢复
本实施例表明了在mdx小鼠中小抗肌萎缩蛋白可恢复肌肉力量。在用含抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体处理mdx小鼠后,对肌肉收缩力的提高进行了评估。将AAV-MCK-Δ3990载体注射入2~3月龄mdx小鼠的胫骨前(TA)肌肉。注射方式为处理同一动物的一条腿,而另一条腿不处理。后者用作对照。AAV处理后6个月时,以戊巴比妥钠(70mg/kg,i.p.)麻醉mdx鼠,移除整个TA肌,并将TA肌置于直立组织室内用于体外进行力测量。肌肉用阴极电流的单相位矩形脉冲(持续1.0-ms)刺激(Grass modelS-88刺激器和电流增幅器)。用递送持续500ms的75pps刺激频率来评估最大僵直力(P0)。测定P0后,测定TA肌在反复的拉长活化期间(这会诱发对肌肉的最大损伤)持续力产生的能力。在拉长前测定的最大力称为PISO。接下来,以1.0L0/s的恒速将肌肉从100拉长至110%L0。刺激训练每2分钟重复一次(工作负载循环为0.004),共进行10个循环。PISO的改变用于指示与由拉长活化造成的损伤相关的肌肉功能损伤。如图6所示,在10个循环的拉长活化后,未处理的TA肌(n=8)只有23%的力输出保留,而以AAV处理的TA肌(n=8)具有近40%的力输出保留。该结果强有力地表明抗肌萎缩蛋白小基因能保护肌肉免于机械力引起的损伤,因此恢复了肌肉力量。
总之,这些实施例表明抗肌萎缩蛋白基因能成功地减少到其11kb全长编码序列的1/3,且无损于其保护肌肉免于营养不良类型的基本功能。另外,我们首次证明了携带新的人抗肌萎缩蛋白小基因的AAV载体的肌肉注射在哺乳动物模型中可产生有效的且长期的治疗作用。来自AAV载体的小抗肌萎缩蛋白的持续表达,以及明显缺乏针对表达人抗肌萎缩蛋白的肌纤维的CTL免疫反应,都使我们认识到了在营养不良的肌肉中生物化学的和生理学的缺陷能得到长期矫正。
实施例6
逆转录病毒载体的构建和测试
基于逆转录病毒的基因转移载体被广泛用于将转基因永久导入到体外培养的细胞中。这些靶细胞可以是稳定的细胞系,或是来自新分离的组织或骨髓的原代细胞培养物。部分原代细胞培养物可能包含有祖细胞或干细胞,如造血干细胞和肌源性干细胞。这些干细胞具有分化成成熟肌细胞即肌管和肌纤维的能力。因此,从由于抗肌萎缩蛋白基因突变所致抗肌萎缩蛋白缺乏的患者体内分离出干细胞,然后在体外经逆转录病毒载体感染干细胞将抗肌萎缩蛋白小基因进行基因转移可能是一种治疗肌营养不良的有效方法。为了检测逆转录病毒载体的可用性,我们将抗肌萎缩蛋白小基因Δ3990或Δ3849(PCR产物)克隆入逆转录病毒载体质粒pLNCX(Clontech,加利福尼亚,美国)的StuI位点。分别获得在CMV启动子控制下携带抗肌萎缩蛋白小基因Δ3990或Δ3849的两种逆转录病毒载体质粒。通过将载体质粒pLNCXΔ3990或pLNCXΔ3849转染入包装细胞系AmphoPack293(Clontech,加利福尼亚,美国)产生逆转录病毒载体颗粒。以上这些逆转录病毒颗粒用于感染从mdx小鼠肌组织中分离的成肌细胞。选择性药物G418用于杀死那些未被逆转录病毒载体感染的细胞,其中逆转录病毒载体携带Neor基因,可赋予G418抗性。含Δ3990或Δ3849小基因的G418抗性成肌细胞用含2%马血清的DMED培养基培养,诱导分化为肌管。这些分化的肌管用抗小基因蛋白产物的单克隆抗体(Dys-3)进行免疫荧光染色。大多数的肌管因抗肌萎缩蛋白小基因的表达而阳性染色,这说明小基因可通过逆转录病毒成功地导入肌祖细胞。此类逆转录病毒载体感染的祖细胞或干细胞可用于迪谢纳肌营养不良和贝克肌营养不良的间接体内基因治疗。
序列表<110>肖啸<120>编码抗肌萎缩蛋白小基因的DNA序列及其使用方法<130>DE1142<140><141><150>60/200,777<151>2000-04-28<160>36<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>11058<212>DNA<213>人<400>1atgctttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaaccaa ccaacagtga aaagattctc 420ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720caacaagtga 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Claims (23)
1.编码抗肌萎缩蛋白小基因的分离的核苷酸序列,其包含:
(a)一个N-末端结构域;
(b)四至六个棒状重复序列;
(c)抗肌萎缩蛋白基因的H1结构域和抗肌萎缩蛋白基因的H4结构域;以及
(d)富含半胱氨酸的结构域,
其中N-末端结构域选自抗肌萎缩蛋白基因的N-末端结构域、抗肌萎缩蛋白基因改变的N-末端结构域或utrophin基因的N-末端结构域;棒状重复序列选自抗肌萎缩蛋白基因的棒状重复序列、utrophin基因的棒状重复序列或血影蛋白基因的棒状重复序列;富含半胱氨酸的结构域为抗肌萎缩蛋白基因的富含半胱氨酸结构域或utrophin基因的富含半胱氨酸结构域。
2.权利要求1的分离的核苷酸序列,其还包含抗肌萎缩蛋白基因的C-末端结构域的最后三个氨基酸。
3.编码抗肌萎缩蛋白小基因的分离的核苷酸序列,其包含:
a)抗肌萎缩蛋白基因的N-末端结构域或抗肌萎缩蛋白基因改变的N-末端结构域;
b)抗肌萎缩蛋白基因的四至六个棒状重复序列;
c)抗肌萎缩蛋白基因的H1结构域和抗肌萎缩蛋白基因的H4结构域;
d)抗肌萎缩蛋白基因的富含半胱氨酸结构域,
其中所述核苷酸序列少于5,000个核苷酸。
4.权利要求3的分离的核苷酸序列,其还包含抗肌萎缩蛋白基因的H2结构域和/或抗肌萎缩蛋白基因的H3结构域。
5.权利要求3的分离的核苷酸序列,其包含抗肌萎缩蛋白基因的四个棒状重复序列。
6.权利要求3的分离的核苷酸序列,其包含抗肌萎缩蛋白基因的五个棒状重复序列。
7.权利要求3的分离的核苷酸序列,其包含抗肌萎缩蛋白基因的六个棒状重复序列。
8.权利要求3的分离的核苷酸序列,其由SEQ ID NO:2组成,或由SEQ ID NO:2的充分互补链组成。
9.权利要求3的分离的核苷酸序列,其由SEQ ID NO:6组成,或由SEQ ID NO:6的充分互补链组成。
10.权利要求3的分离的核苷酸序列,其由SEQ ID NO:9组成,或由SEQ ID NO:9的充分互补链组成。
11.权利要求3的分离的核苷酸序列,其由SEQ ID NO:10组成,或由SEQ ID NO:10的充分互补链组成。
12.权利要求3的分离的核苷酸序列,其由SEQ ID NO:12组成,或由SEQ ID NO:12的充分互补链组成。
13.权利要求3的分离的核苷酸序列,其由SEQ ID NO:14组成,或由SEQ ID NO:14的充分互补链组成。
14.重组腺伴随病毒载体,其包含可操作地连接至表达调控元件的权利要求1的核苷酸序列。
15.权利要求14的重组腺伴随病毒载体,其中表达调控元件为MCK启动子或CMV启动子。
16.重组腺伴随病毒载体,其包含任一可操作地连接至表达调控元件的权利要求8、9、10、11、12和13的核苷酸序列。
17.权利要求16的重组腺伴随病毒载体,其中调控元件为MCK启动子或CMV启动子。
18.对哺乳动物受试者的迪谢纳肌营养不良和贝克肌营养不良进行治疗的方法,其包括:
(i)提供包含可操作地连接至表达调控元件的权利要求1的抗肌萎缩蛋白小基因的载体;
(ii)对哺乳动物受试者在一定条件下施用有效量的所述载体,其中所述条件导致抗肌萎缩蛋白小基因在所述哺乳动物受试者体内以提供治疗效果的水平表达。
19.权利要求18的方法,其中载体为重组腺伴随病毒。
20.权利要求18的方法,其中载体为逆转录病毒。
21.对哺乳动物受试者的迪谢纳肌营养不良和贝克肌营养不良进行治疗的方法,其包括:
(i)提供包含可操作地连接至表达调控元件的权利要求1的抗肌萎缩蛋白小基因的载体;
(ii)对哺乳动物受试者在一定条件下施用有效量的所述载体,其中所述条件导致抗肌萎缩蛋白小基因在所述哺乳动物受试者体内以提供治疗效果的水平表达,
其中抗肌萎缩蛋白小基因具有的核苷酸少于5,000,该核苷酸包含:
(a)抗肌萎缩蛋白基因的N-末端结构域或抗肌萎缩蛋白基因改变的N-末端结构域;
(b)抗肌萎缩蛋白基因的四至六个棒状重复序列;
(c)抗肌萎缩蛋白基因的H1结构域和抗肌萎缩蛋白基因的H4结构域;以及
(d)抗肌萎缩蛋白基因的富含半胱氨酸结构域。
22.权利要求21的方法,其中载体为重组腺伴随病毒。
23.权利要求21的方法,其中载体为逆转录病毒。
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