CN1434720A - 用于治疗和预防与异常血凝固有关的疾病的药用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于治疗和预防与异常血凝固有关的出血症并包含作为主要活性组分的活化凝血因子VII(FVIIa)及凝血因子X(FX)的药用组合物。所述药用组合物不含主要引起的副作用的组分，是高度安全、有效并易于处理止血。因此，所述药用组合物可以用于例如患有与凝血病症有关的出血，例如凝血因子异常(包括缺乏)，特别是由凝血因子抑制剂(抗体)引起的凝血病症的患者的止血处理。
Description
发明技术领域
本发明涉及一种用于患有凝血病症例如凝血因子失调(包括缺乏)，特别是携带凝血因子抑制剂的患者的止血处理的药剂。更详细地讲，本发明涉及一种用于治疗和预防与凝血病症有关的出血的药用组合物，所述组合物包含作为活性组分的活化因子VII(在下文中也被称为“FVIIa”)和因子X(在下文中也被称为“FX”)。
发明背景
止血反应是在活体中的一个最重要的保护机制。它通常包括：初级止血，其中血小板粘附和凝集到血管的损害部分；和次级止血，其中可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白闭塞损害部分。所述次级止血过程是通过由多种凝血因子和辅因子构成的、称作凝血级联的连续反应完成的，并有两条路线，内凝固途径和外凝固途径(图1)。因此，如果凝血级联中的任何因子或辅因子缺乏或不能正常工作，凝血就会被妨碍而导致出血。在大多数这些疾病中，追踪遗传倾向，由凝血因子先天障碍引起的典型疾病是血友病A和血友病B，它们相应地缺乏因子VIII和因子IX。
为了治疗患有血友病的患者，已经开发出了包含因子VIII或因子IX的浓缩制剂以补充所述缺乏的因子，并用于被称为是补充疗法的止血处理。然而，众所周知，经常被称为“抑制剂”的抗因子VIII抗体或抗因子IX抗体在约2-24％经受补充疗法治疗的患者中产生(Thromb.Haemost.67：第600-602页(1992年)；Int.J.Hematol.62：第175-181页(1995年)；Lancet 339期(总8793期)：第594-598页(1992年)；和Blood83：第2428-2435页(1994年))，这是补充疗法最严重的副作用之一。一旦抑制剂在患者体内产生，补充疗法就会变得无效而导致止血处理极端困难。这里也有很多报告关于抑制剂即使在缺乏遗传倾向例如血友病情况下也会本能地或以自身免疫疾病的方式产生(Thromb.Haemost.45：第200-203页(1981年))。
目前用于治疗携带抑制剂的患者的主要疗法如下：(a)中和疗法
给予超过抑制剂的过量浓缩制剂以中和抑制剂并补充止血所需的因子。(b)旁路疗法
由于因子VIII和因子IX都参与内凝固途径，因此，止血不通过(即“绕过”)内凝固途径而是通过外凝固途径来实现的。为了增强所述外凝固途径的能力，给予称为“APCC”的活化凝血酶原复合浓缩物或FVIIa制剂。(c)免疫耐受疗法
长时间内给予高剂量浓缩制剂以使得患者产生抑制剂的能力免疫上枯竭，从而导致抗体的消失。
然而，上面提到的传统疗法在个别方面有缺陷。中和疗法(a)只对具有低效价抑制剂的患者有效而对高效价抑制剂的患者无效。
在旁路疗法(b)中，已经报道APCC会引起副作用例如心肌梗塞(Am.J.Med.85：第245-249页(1988年))或DIC(Thromb.Haemost.48：第339-340页(1982年))而出现安全性问题。另一方面，FVIIa制剂是不利地，在于FVIIa半衰期短因此它必须经常给药(Transfus.Med.Rev.7：第78-83页(1993年))，而且使患者承担了许多身体上以及在经济上对所述药物高支出的负担。此外，FVIIa制剂并不是十分地有效。免疫耐受疗法(c)只对有限数量的患者有效而且也使患者承担了经济负担。
鉴于此，所述对于携带抑制剂患者的止血处理的传统方法不是十分地有效，因此，存在对更安全、更有效和易于止血处理的制剂的需要。
现有技术包括题目为“用于治疗凝血因子抑制剂的含水组合物”的第145072号(1995年)到第145075号(1995年)的日本专利公开说明书，其中研究了在所述传统APCC中的活化水平但没有阐明担负旁路活性的活性物质。另外一个现有技术是题目为“用于治疗凝血病症的药用组合物及其制备方法”的第110715号(1997年)日本专利公开说明书，其中提高了FVIIa在APCC中的含量这样增强了治疗有效性。然而，这个组合物仅仅是在APCC中增加了FVIIa，它在单独使用时被证明是有效地，因此跟上面提到的方法一样仍然有缺点。
发明公开
根据上面提到的问题，为了开发出一种用于治疗和预防与凝血病症有关的出血的药剂，本发明人已经进行了研究。结果，本发明人意外地第一次发现了一种包含FVIIa和FX组合的药用组合物对于治疗和预防由凝血病症引起的止血障碍是显著有效的，从而完成本发明。
依照本发明的所述药用组合物的优点是：(1)它是完全安全的，因为它实质上不含凝血酶原、凝血酶、因子IX、活化因子IX、磷脂和相似物，它们包含在传统的APCC中并被认为是副作用的引发剂；和(2)它不需要经常给药(所述FVIIa制剂的缺点)，除此之外，它还显示出比所述FVIIa制剂更高的止血作用。总体来说，本发明的所述药用组合物是一个期待已久的药剂，它是安全、高效并易于处理止血。它与所述传统APCC截然不同在于它实质上不含FII、FIX，并与所述FVIIa制剂截然不同在于它含有FX。
附图简述
图1是凝血级联的示意图，其中显示出了两条途径，内凝固途径和外凝固途径。
图2显示在FVIII或FIX缺乏血浆中FVIIa对APTT的作用。
图3显示在FVIII或FIX缺乏血浆中FX对APTT的作用。
图4显示在FVIII或FIX缺乏血浆中FII对APTT的作用。
图5显示在FVIII缺乏血浆中FVIIa和FX对APTT的协同作用。
图6显示在FIX缺乏血浆中FVIIa和FX对APTT的协同作用。
图7显示在血友病B抑制剂样血液中FVIIa+FX对TEG参数“r”(反应时间)的作用。
图8显示在血友病B抑制剂样血液中FVIIa+FX对TEG参数“r+k”(反应时间+凝固时间)的作用。
图9显示在血友病B抑制剂动物模型中FVIIa单独给药和FVIIa+FX给药对APTT作用的比较。
图10显示在血友病B抑制剂动物模型中FVIIa单独给药和FVIIa+FX给药对次级出血时间作用的比较。
图11显示在血友病B抑制剂动物模型中FVIIa单独给药和FVIIa+FX给药对TEG参数“r”(反应时间)作用的比较。
图12显示在血友病B抑制剂动物模型中FVIIa单独给药和FVIIa+FX给药对TEG参数“r+k”(反应时间+凝固时间)作用的比较。
实施本发明的最适方式
FVII，本发明的药用组合物中一个活性组分的前体，是由406个氨基酸残基组成的、分子量约为50,000的维生素K依赖性凝固因子。FVII以大约0.5μg/ml存在血浆中。当所述分子中的Arg152-Ile153键水解时，FVII转化为具有酶活性的双链FVIIa。FVIIa与组织因子结合在钙离子存在下活化FIX和FX。因而，FVIIa在外凝固途径中起最重要的作用。
另一方面，FX也是一个由448个氨基酸残基组成的、分子量约为59,000的维生素K依赖性血凝固因子，以5到10μg/ml存在血浆中。FX通过由FVIIa/组织因子复合物在钙离子存在下(外凝固途径)或由活化因子IX在活化因子VIII、钙离子和磷脂存在下(内凝固途径)引起的活化转化为具有酶活性的活化FX(在下文中也被称为“FXa”)。然后，FXa在活化因子V、钙离子和磷脂存在下将凝血酶原活化为凝血酶，从而引发纤维蛋白形成。
用于本发明的FVIIa和FX可以通过任何本领域所熟知的方法包括从人血液中分离或利用基因重组技术来制备。
FVIIa可以通过例如在日本专利公开说明书第155797号(1991年)、第059866号(1998年)和第059867号(1998年)中所公开的方法从血液中制备。或者，使通过在低温下融化和离心新鲜冷冻的人血浆来去除冷沉淀物而制备的低冷沉淀物血浆，经阴离子交换色谱以产生粗纯化的FVII，然后通过使用带有固定抗-FVII单克隆抗体色谱柱的亲和色谱进一步纯化。然后，所得到的纯化FVII被其他血浆蛋白，如活化因子XII或FXa活化成为FVIIa。出于安全目的，优选所得到的FVIIa尽可能少地被FII、FIIa、FIX和FIXa污染。
为了从血液中制备FX，例如，使通过在低温下融化和离心新鲜冷冻的人血浆来去除冷沉淀物而制备的低冷沉淀物血浆，经阴离子交换色谱以产生粗纯化的FX，然后通过使用带有固定抗-FX单克隆抗体色谱柱的亲和色谱进一步纯化。如上对于FVIIa所述，优选所得到的FX尽可能少地被FII、FIIa、FIX和FIXa污染以保证安全性。
这样制备的FVIIa和FX中的每一种可以通过与保证维持FVIIa和FX的活性处于最高水平的适当的稳定剂一起冻干来保存。或者，FVIIa或FX的溶液可以冻干保存。也有可能冻干与用于保存的合适浓度的适当的稳定剂混合的FVIIa和FX或冻干FVIIa和FX溶液的混合物。
依照本发明，包含FVIIa或FX作为活性组分的组合物与本领域所熟知的合适的赋形剂混合，利用本领域熟知的工艺来配制用于治疗和预防由凝血病症引起的止血障碍的药剂。本发明的所述药剂可以给予就患有凝血病症引起的止血障碍而言的任何患者。
虽然FVIIa和FX的有效剂量可以根据，例如患者年龄、疾病的症状和严重程度而变化，但是止血作用预期是通过5μg/体重(kg)到160μg/体重(kg)的FVIIa和50μg/体重(kg)到16,000μg/体重(kg)的FX来达到的。FVIIa和FX最适于利用单一给药法(大剂量注射(Bolus))或通过静脉滴注给药。
在一个优选的实施方案中，依照本发明用于治疗和预防止血障碍的所述药剂包含FVIIa和FX作为活性组分。可是在另外一个实施方案中，如果两次给药的间隔足够短，FVIIa和FX可以分别给药从而来发挥本发明的作用。
通过以下实施例，更详细地介绍本发明。实施例1 通过APTT分析对本发明组合物止血效价的评估
“活化部分促凝血酶原激酶时间”(下文中也被称为“APTT”)是利用APTT试剂来筛选内途径的检测方法。具体地说，将APTT试剂和钙离子加入到检测血浆中，然后测量纤维蛋白形成时间来评估内凝固途径中的酶效价。当内部凝血因子同典型血友病A和血友病B中一样具有定量或定性异常或者存在内部凝血因子的抑制剂时，APTT就会延长。
正常的APTT时间是30-40秒，而延长的APTT的程度(rate)依赖于具有定量或定性异常的内部凝固因子的凝血活性。在血友病具有严重临床症状，包括抑制剂的情况下，APTT格外地延长。根据Saito等报道的FVIIa制剂的临床评估(Jpn.J.Thromb.Hemost.第5卷(第3期)：158-172页(1994年))，在12个携带抑制剂的血友病患者中，APTT延长到122.0±18.7秒(平均值±SD)。可是，在给予基因工程FVIIa后20分钟，APTT缩短到82.9±21.6秒。也有报道在体外当将FVIIa加入到FVIII或FIX缺乏血浆中时，APTT明显降低(Thromb.Res.56：603-609页(1989年))。
在这个实施例中，利用因子VIII或因子IX缺乏血浆(Dade BehringMarburg GmbH制造)作为血友病样血浆，评估FVIIa、FX和FII缩短APTT的作用。肌动蛋白(商品名)(Dade Behring Marburg GmbH制造)被用作APTT试剂。在FVIIa终浓度为0到4μg/ml血浆；FX终浓度为0到80μg/ml血浆(人血浆中的正常水平：约10μg/ml血浆)；和FII终浓度为0到400μg/ml血浆(人血浆中的正常水平：约100μg/ml血浆)下评估所述凝固因子。结果显示于图2到图6中，其中图2到图4以浓度依赖的方式显示出在所述缺乏血浆中FVIIa、FX和F II中的每一种对APTT的作用，而图5和图6显示出在所述缺乏血浆中FVIIa和FX组合对APTT的协同作用。
已经发现FVIIa和FX均以浓度依赖的方式在所述缺乏血浆中缩短APTT而FII几乎不能够缩短APTT。同样利用在血浆中的终浓度分别为0到1μg/ml和0到40μg/ml来检测FVIIa和FX的组合，它们是同时加入到所述缺乏血浆中来评估APTT矫正。它揭示了在更高浓度下的FVIIa和FX可能将APTT缩短到更高程度。此外，与单独使用FVIIa或FX时观察到的作用相比，当将这些凝血因子结合时观察到了更高的作用，提供了明显的协同作用。实施例2 通过凝血弹性图对本发明组合物止血效价的评估
测量凝血过程中粘弹性变化的“凝血弹性图”(下文中也称为“TEG”)为各种各样的凝血病症提供了特定图谱，并用于测定血液的凝血能力。在血友病情况下或在存在内部凝血因子的抑制剂情况下，由于凝血被抑制因而会显示出异常的TEG图形。在数值上，TEG参数“r”(反应时间)和“r+k”(k：凝固时间)在正常人血浆中是按“r”在10到15分钟之间、“k”在6到8分钟之间和“r+k”在16到23分钟之间变化。在血友病情况下或在存在内部凝血因子的抑制剂情况下，这些参数不在所述显示出的正常范围内而且被显著地延长。根据Yoshioka等的报道(Haemostasis26(副刊1)：143-149页(1996年))，给予患有血友病A的患者FVIIa制剂，抑制剂从延长至此的参数，即“r”(超过60分钟)和“r+k”(超过80分钟)几乎恢复到正常水平，而“r”和“r+k”会随着活体中FVIIa水平下降而再次被延长。这证明了对TEG的测量可以有利地用于评估血液能力。
以上面所提到的原则为基础，将抗人FIX山羊抗体加入到人血液中来制备血友病B抑制剂样血液，其中“r”和“r+k”分别延长超过120分钟和达到不能测量的程度。将浓度分别为0.125到1μg/ml血和2.5到20μg/ml血的FVIIa和FX加入到这个血友病B抑制剂样血液中。结果，它显示出“r”和“r+k”以依赖FVIIa和FX浓度的方式被缩短，证明了在血友病B抑制剂样血液中已丧失的凝血能力被FVIIa和FX矫正了。所述结果显示于图7和图8中。实施例3 通过动物模型对本发明组合物止血效价的评估
这个实施例是利用通过给予猕猴抗人FIX山羊抗体制备的血友病B抑制剂模型进行的。所述血友病B抑制剂模型显示出APTT和出血时间的延长、TEG参数“r”(反应时间)和“r+k”(k：凝固时间)的极度延长和最大幅度(ma)的降低。
血友病B抑制剂模型是通过给猕猴快速静脉注射和静脉滴注给予抗人FIX山羊抗体制备的。比较单独FVIIa给药(80μg/kg)和组合FVIIa和FX给药(分别为80μg/kg和800μg/kg)对(1)APTT、(2)出血时间和(3)TEG的作用。所述结果显示于图9、图10和图11到图12中。
发现在给药(单独FVIIa或与FX组合)后缩短了APTT，其中组合FVIIa和FX比单独FVIIa缩短APTT更多。
出血时间按下列方法测量：利用SimplateIIR(Organon Teknika制造)在猕猴尾部沿与尾平行的方向在离尾根部约15厘米处切口而避开动脉和静脉。血压套箍缠绕到尾根部，在40mmHg血压下切割两次，然后测量出血时间(初次出血时间)。用滤纸吸去渗出血但不要碰到创口。为了测量二次出血时间，一旦出血停止，用棉片多次擦拭创口使之出血，然后如对初次出血时间所描述的测量出血时间。
已知初次出血时间通常反映由血小板引起的止血反应。实际上，与抗人FIX山羊抗体给药后正常条件相比，初次出血时间仅仅轻微地而不是显著地延长。恰恰相反，在抗人FIX山羊抗体给药后二次出血时间显著地延长了但被给予FVIIa或同时给予FVHa和FX所缩短。比较这些作用，出血时间被矫正至更接近于正常条件，而且由同时给予FVIIa和FX产生的出血时间矫正会比由单独给予FVIIa产生的矫正维持更长的时间。
同样地，TEG参数“r”和“r+k”被矫正至更接近于正常条件，而且由同时给予FVIIa和FX产生的作用会比由单独给予FVIIa产生的作用维持更长的时间。
Claims (7)
1.一种用于治疗和预防与凝血病症有关的出血的药用组合物，所述药用组合物包含作为活性组分的活化因子VII和因子X。
2.权利要求1的药用组合物，其中所述凝血病症是包括凝血因子缺乏在内的凝血因子失调，特别是显示由抗凝血因子抑制剂(抗体)引起止血障碍的凝血病症。
3.权利要求1或2的药用组合物，其中所述组合物包含浓度为1μg/ml或更高的活化因子VII和浓度为20μg/ml或更高的因子X作为活性组分。
4.权利要求1-3中任一项的药用组合物，其中所述组合物是以5-160μg/体重(kg)活化因子VII和50-1,600μg/体重(kg)因子X的剂量给药来用于止血。
5.一种治疗与凝血病症有关的出血的方法，该方法包括给予患有与凝血病症有关的出血的患者活化因子VII和因子X的组合。
6.权利要求5的方法，其中所述凝血病症是包括凝血因子缺乏在内的凝血因子失调，特别是显示由凝血因子抑制剂(抗体)引起止血障碍的凝血病症。
7.权利要求5或6的方法，其中给予5-160μg/体重(kg)的活化因子VII和50-1,600μg/体重(kg)的因子X。
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