CN118203591A

CN118203591A - 党参苷ⅰ的新用途

Info

Publication number: CN118203591A
Application number: CN202410234477.XA
Authority: CN
Inventors: 李楠; 张俊华; 张晗; 刘岩; 张鹏; 胡静; 刘涛; 朱姗; 王萌
Original assignee: Haihe Laboratory Of Modern Chinese Medicine; Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Haihe Laboratory Of Modern Chinese Medicine; Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2024-02-29
Filing date: 2024-02-29
Publication date: 2024-06-18

Abstract

本发明提供了党参苷Ⅰ的新用途，所述党参苷Ⅰ可提高UVB损伤的HEK细胞的增殖活性及UVA损伤的HSF细胞的增殖活性；显著抑制NF‑κB的转录活性；显著降低减少胶原合成及促进胶原降解的激活蛋白‑1转录活性；显著提高抗氧化反应原件的转录活性，将党参苷Ⅰ应用于制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中，可以显著减轻皮肤光老化症状。

Description

党参苷Ⅰ的新用途

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，尤其是涉及党参苷I的新用途。

背景技术

衰老是机体逐渐丧失功能走向死亡的一个过程。皮肤作为机体的最大器官，是机体与外界环境的防御屏障，比其他器官更能直观和明显地反映衰老。皮肤衰老通常分为内源性和外源性衰老，外源性衰老主要由环境因素导致。紫外线(UV)辐射是引起皮肤衰老的主要环境因素，皮肤长期暴露于UV辐射之下，会加速老化，主要表现为表面粗糙，含水量和弹性降低，胶原蛋白减少，以及皱纹形成，即所谓的皮肤光老化(也称光老化)，严重者甚至诱发癌症。

皮肤光老化是一个复杂的生物化学过程，其发病机制与氧化应激、炎症反应以及基质金属蛋白酶(MMP)高表达等机制有关。氧化应激是引起光老化的始动因素。光老化过程中会产生大量活性氧(ROS)，包括超氧阴离子、过氧化氢、单线态氧和羟自由基等。机体中存在相对完善的抗氧化***，ROS的产生和清除处于一个平衡状态。过量的ROS通过激活MAPK/NF-κB信号通路，上调促炎细胞因子最终激活AP-1转录因子，促进MMP-1、MMP-3和MMP-9等基质金属蛋白酶降解胶原，改变细胞外基质中胶原蛋白和弹性蛋白成分来降低皮肤结构的完整性。

Keap1/Nrf2信号通路是机体维持氧化/抗氧化***稳态的重要通路之一，UV辐射皮肤时，产生的大量活性氧(ROS)可通过修饰Keap1中半胱氨酸残基，改变Keap1的构象，使其与Nrf2解偶联，促进Nrf2入核；ROS也可通过激活蛋白激酶直接磷酸化Nrf2，促进Nrf2与Keap1解离，激活Nrf2，Nrf2入核后与ARE结合，启动一系列抗氧化基因表达，维持皮肤内氧化/抗氧化***稳态，保护皮肤免受损伤。

酪氨酸酶是结构复杂的多亚基含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动物及人体中，是皮肤黑色素生物合成的关键酶。

中药党参是桔梗科植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.、素花党参CodonopsispilosulaNannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川党参CodonopsistangshenOliv.等的干燥根。党参具有补中益气、增强机体免疫力的作用，党参苷I是党参中含量非常低的成分，研究极少，到目前为止还未见党参苷I在抗衰方面的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种党参苷I的新用途。

本发明采用的技术方案是：

党参苷I在制备用于促进细胞增殖的药物或护肤品中的用途。

优选的，上述党参苷I的新用途，所述细胞为HEK细胞和/或HSF细胞。

党参苷I在制备用于减少黑色素含量/减轻色素沉着的药物或护肤品中的用途。

党参苷I在制备用于降低酪氨酸酶活性的药物或护肤品中的用途。

党参苷I在制备用于防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。

党参苷I在制备抗衰老的药物或护肤品中的用途。

党参苷I在制备提高皮肤含水量的药物或护肤品中的用途。

党参苷I在制备淡化皱纹的药物或护肤品中的用途。

上述党参苷I的结构式如下所示：

一种防治皮肤光老化的药物/护肤品，主要功效成分包括上述党参苷I。

优选的，上述防治皮肤光老化的药物/护肤品，各组分按重量比计为党参苷I0.01-0.03％、山俞酸甘油酯0.3-0.4％、辛酸三甘油酯0.1-0.15％、大豆卵磷脂0.1-0.3％、聚氧乙烯硬脂酸酯1-1.82％、卡波姆9400.2-0.3％、甘油3-4.6％、羟丙甲基纤维素0.1-0.3％、尼泊金乙酯0.1-0.3％，余量是去离子水。

上述防治皮肤光老化的药物/护肤品的制备方法，具体步骤如下：

(1)将配方量的山俞酸甘油酯、辛酸三甘油酯于75℃水浴下溶于氯仿得溶液A；

(2)将配方量的大豆卵磷脂、党参苷I于75℃水浴下溶于无水乙醇得溶液B；

(3)A、B两种溶液混匀得溶液C；

(4)将配方量的卖泽52于75℃水浴下溶于去离子水中得溶液D；

(5)在磁力搅拌(500r/min)下将溶液C缓慢注入溶液D中，继续搅拌至除去有机溶剂即得党参苷I的纳米结构脂质载体；

(6)将配方量的卡波姆940、甘油、羟丙甲基纤维素、尼泊金乙酯溶于去离子水(配方量的去离子水减去配制溶液D时使用的去离子水)中，4℃溶胀12h，得空白凝胶；

(7)将空白凝胶与党参苷I的纳米结构脂质载体按照1∶1搅拌混匀，调pH至6.5即得。

上述防治皮肤光老化的药物/护肤品的使用方法：取适量直接外用涂抹于皮肤，一天一次，无需清洗。

本发明的有益效果是：

所述党参苷I可提高UVB损伤的人表皮角质形成细胞(HEK)及UVA损伤的人皮肤成纤维细胞(HSF)的增殖活性；显著抑制核因子κB(NF-κB)的转录活性；显著降低减少胶原合成及促进胶原降解的激活蛋白-1(ap-1)的转录活性；显著提高抗氧化反应原件(ARE)的转录活性；显著减少黑素细胞刺激素(α-MSH)诱导的小鼠B16黑色素瘤细胞(B16)中的黑色素含量，降低细胞内酪氨酸酶活性；可以提高光老化小鼠皮肤的含水量、减轻色素沉着，淡化皮肤皱纹，发挥明确的抗皮肤光老化的作用。将党参苷I应用于制备防治皮肤光老化的药物或护肤品中，可以显著减轻皮肤光老化症状。

附图说明

图1为党参苷I对UVB损伤HEK细胞活力的影响图，由图1可以看出不同浓度为党参苷I对UVB损伤的HEK细胞活力的影响(n＝12)，其中，^###P＜0.001vsControl^**P＜0.01vsModel^*P＜0.05vsModel。

图2为党参苷I对UVB损伤的HEK细胞LDH释放量的影响图，由图2可以看出不同浓度为党参苷I对UVB损伤的HEK细胞LDH释放量的影响(n＝12)，其中，^###P＜0.001vs Control^***P＜0.001 vs Model^**P＜0.01vsModel。

图3为党参苷I对UVA损伤HSF细胞增殖活力的影响图，由图3可以看出为党参苷I对UVA辐射HSF细胞活力的影响(n＝12)，其中，^###P＜0.001vsControl^**P＜0.01vsModel^*P＜0.05vsModel。

图4为党参苷I对UVA损伤HSF细胞LDH释放量的影响图，由图4可以看出为党参苷I对UVA辐射HSF细胞中LDH释放量的影响(n＝12)，其中，^###P＜0.001vsControl^***P＜0.001vsModel。

图5为党参苷I对核因子κB(NF-κB)转录活性影响图，由图5可以看出为党参苷I对NF-κB转录活性的影响其中，^###P＜0.001vsControl^***P＜0.001vsTNF-α^*P＜0.05vs TNF-α。

图6为党参苷I对激活蛋白-1(AP-1)转录活性影响图，由图6可以看出为党参苷I对AP-1转录活性的影响其中，^###P＜0.001vsControl^**P＜0.01vsPMA。

图7为党参苷I对抗氧化原件(ARE)转录活性影响图，由图7可以看出为党参苷I对ARE转录活性的影响其中，^***P＜0.001vsControl^*P＜0.05vsControl。

图8为党参苷I对B16细胞黑素生成的影响图，由图8可以看出党参苷I对黑色素含量的影响其中，^##P＜0.01vsControl^*P＜0.05vsα-MSH，与Control组相比，α-MSH组B16细胞黑色素生成明显增加(P＜0.01)；与α-MSH组相比，K.A.组显著降低B16细胞内的黑色素含量(P＜0.05)，10μM党参苷I溶液组显著降低α-MSH诱导的B16细胞黑色素含量(P＜0.05)。

图9为党参苷I对B16细胞酪氨酸酶活性影响图，由图9可以看出党参苷I对酪氨酸酶活性的影响其中，^###P＜0.001vsControl^**P＜0.01vsα-MSH，与Control组相比，α-MSH组B16细胞酪氨酸酶活性明显增加(P＜0.001)；与α-MSH组相比，K.A.组显著抑制B16细胞内的酪氨酸酶活性(P＜0.01)，10μM党参苷I显著抑制α-MSH诱导的B16细胞酪氨酸酶活性(P＜0.01)。

图10为党参苷I药物(或护肤品)对光老化小鼠皮肤皱纹的影响图。

图11为党参苷I药物(或护肤品)对光老化小鼠皮肤皱纹深度的影响图。

图12党参苷I药物(或护肤品)对光老化小鼠皮肤皱纹面积的影响图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

党参苷I，购自成都乐美天医药科技有限公司，含量≥98％。

HEK细胞，B16细胞，购自北京协和细胞库；HSF细胞，购自昆明细胞库；293T细胞，购自ATCC细胞库。

MEM培养基，DMEM培养基，青霉素-链霉素，0.25％胰酶+0.02％EDTA，PBS磷酸缓冲液，均购自美国Gibco公司。

胎牛血清FBS，购自以色列Biolnd公司、美国Gibco公司。

培养皿(60mm，100mm)，购自德国effendorf公司。

细胞培养板，购自美国Costar公司。

CCK-8试剂盒，购自日本Dojindo Lab公司。

HEK完全培养液，由MEM培养基加入10％胎牛血清FBS(BI)，1％青霉素-链霉素混匀即得。

HSF完全培养液，由DMEM培养基加入15％胎牛血清FBS(Gibco)，1％青霉素-链霉素混匀即得。

293T、B16完全培养液，由DMEM培养基加入10％胎牛血清FBS(BI)，1％青霉素-链霉素混匀即得。

萤光虫荧光素酶报告基因载体pGL4.44、pGL4.37、pGL4.32，海肾荧光素酶报告基因载体pGL4.75；佛波酯PMA均购自美国Promega公司。

氨苄青霉素，氢氧化钠，购自北京索莱宝科技有限公司。

蛋白胨、酵母粉均购自英国Oxoid公司。

质粒小提试剂盒、感受态细胞DH5α均购自天根生化科技有限公司。

聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Poly sciences公司。

tBHQ(Tert-Butylhydroquinone，纯度≥97％)购自美国sigma-aldrich公司。

黑素细胞刺激素(α-MSH)、左旋多巴(L-DOPA)均购自上海源叶生物科技有限公司。

曲酸(K.A.)购自上海麦克林试剂公司。

***(Dex)购自美国Sigma公司。

肿瘤坏死因子(TNF-α)购自美国Pepro Tech公司。

实施例1

党参苷I防治光老化的细胞实验I——提高UVB损伤的HEK细胞(人表皮角质形成细胞)的增殖活性

采用美国Sigma公司的SH2B型紫外光疗仪，模拟UVB辐射HEK细胞损伤模型，光谱为280～320nm，强度为12.8mW/cm²。

实验方法

取对数生长期HEK细胞，以完全培养液将细胞密度调整至1×10⁴个/mL的密度后接种于96孔板中，待96孔板中细胞长至60～70％左右，随机分为正常组(空白对照组)、UVB照射组(模型组)、0.1～10μM党参苷I溶液组，进行预给药24h。预给药时空白对照组和UVB照射组均给予完全培养液。吸弃96孔板中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100L PBS覆盖，用UVB光疗仪照射模型组、0.1～10μM党参苷I溶液组，照射剂量为1O0mJ/cm²，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24h后取出，吸取上清液置于另一新96孔板中，按LDH试剂盒操作检测LDH释放量。原96孔板用PBS润洗1次后每孔加入100μL 1×CCK-8工作液，37℃孵育1h。放置在酶标仪中于450nm处测定0D值。每组设置6个复孔，实验重复2次(n＝12)，结果见图1、2。

由图1和2可知，党参苷I作用于UVB损伤的HEK细胞后，可显著提高其增殖活性。

实施例2

党参苷I防治光老化的细胞实验——提高UVA损伤的HSF细胞(人皮肤成纤维细胞)的增殖活性

采用美国Sigma公司的SH2A型紫外光疗仪，模拟UVA辐射建立HSF细胞损伤模型，光谱为320～420nm，强度为20.0mW/cm²。

实验方法

取对数生长期HSF细胞，以完全培养液将细胞密度调整至1×10⁴个/mL的密度后接种于96孔板中，待96孔板中细胞长至60～70％左右，随机分为正常组(空白对照组)、UVA照射组(模型组)、1～100μM党参苷I溶液组，进行预给药24h。预给药时空白对照组和UVA照射组均给予完全培养液。吸弃96孔板中培养液，PBS清洗2次，每孔加入100μL PBS覆盖，用UVA光疗仪照射模型组、1～100μM党参苷I溶液组，照射剂量为10mJ/cm²，照射完成后，弃去PBS，加入完全培养液，于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育24h后取出，吸取上清液置于另一新96孔板中，按LDH试剂盒操作检测LDH释放量。原96孔板用PBS润洗1次后每孔加入100μL 1×CCK-8工作液，37℃孵育1h。放置在酶标仪中于450nm处测定0D值。每组设置6个复孔，实验重复2次(n＝12)，结果见图3、4。

由图3和4可知，党参苷I作用于UVA损伤的HSF细胞后，可显著提高其增殖活性。

实施例3

党参苷I对核因子κB(NF-κB)的转录活性的影响

1.NF-κB质粒的提取

1.1质粒的转化与验证

取100μL感受态细胞DH5α，加入1μL质粒pGL4.32样品，冰浴30min后42℃水浴中热击90s后迅速放于冰上冷却3～5min；加入适量新鲜配置的不加氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡1h；将菌液均匀涂布于新鲜配置的LB固体培养基上，晾干后，倒置培养皿，37℃培养12～16h；从培养后的LB固体培养基上挑取单个菌落，接种于适量的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h后，取1mL于离心管中，送华大基因公司测序，以进一步鉴定阳性克隆，其余的菌液加入等体积的50％甘油，于-80℃保存备用。

1.2质粒的提取及测定

取阳性克隆质粒菌液培养后按照质粒小提试剂盒说明书进行操作。提取完成后吸取1μL质粒，以洗脱缓冲液EB作为空白对照，测定其质量。

2. 293T细胞瞬时共转染

显微镜下观察293T细胞贴壁生长达到70％-80％，通过使用PEI转染试剂同时转染pGL4.32和pGL4.75后放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

3.双荧光检测分析测定NF-κB转录活性

样品溶液的配制：将浓度为2μg/mL的TNF-α母液，用DMEM完全培养基稀释得到10ng/mL浓度的TNF-α溶液。将浓度为100mM党参苷I母液，用10ng/mL浓度的TNF-α溶液稀释得到100μM，10μM，1μM的党参苷I样品溶液，将浓度为10mM的Dex母液，用10ng/mL浓度的TNF-α溶液稀释得到10μM的Dex样品溶液。

在96孔细胞培养板上分别加入TNF-α(10ng/mL)，100μM，10μM，1μM的党参苷I样品溶液，10μM的Dex样品溶液，并设置只加DMEM完全培养基的空白对照组，每孔100μL于培养箱中培养6h；

弃去上清液，用PBS清洗1遍，每孔加入25μL裂解液，振荡裂解30min后用Dua-Luciferase检测***检测。通过萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性对比得到相对荧光素酶活性值。结果见图5。

由图5可知，党参苷I可显著降低NF-κB的转录活性。

实施例4

党参苷U对激活蛋白-1(AP-1)的转录活性的影响

1.AP-1质粒的提取

1.1质粒的转化与验证

取100μL感受态细胞DH5α，加入1μL质粒pGL4.44样品，冰浴30min后42℃水浴中热击90s后迅速放于冰上冷却3～5min；加入适量新鲜配置的不加氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡1h；将菌液均匀涂布于新鲜配置的LB固体培养基上，晾干后，倒置培养皿，37℃培养12～16h；从培养后的LB固体培养基上挑取单个菌落，接种于适量的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h后，取1mL于离心管中，送华大基因公司测序，以进一步鉴定阳性克隆，其余的菌液加入等体积的50％甘油，于-80℃保存备用。

1.2质粒的提取及测定

2. 293T细胞瞬时共转染

显微镜下观察293T细胞贴壁生长达到70％-80％，通过使用PEI转染试剂同时转染pGL4.44和pGL4.75后放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

3.双荧光检测分析测定AP-1转录活性

样品溶液的配制：配置5mM的PMA(佛波酯)母液后，取适量用DMEM完全培养基稀释得到100nM浓度的PMA溶液。将浓度为100mM党参苷I母液，用100nM浓度的PMA溶液稀释得到100μM，10μM，1μM的党参苷I样品溶液。

在96孔细胞培养板上分别加入PMA(100nM)以及100μM、10μM、1μM的党参苷I样品溶液，并设置只加DMEM完全培养基的空白对照组，每孔100μL，于培养箱中培养6h后弃去上清液，用PBS清洗1遍，每孔加入25μL裂解液，振荡裂解30min后用Dua-Luciferase检测***检测。通过萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性对比得到相对荧光素酶活性值。结果见图6。

由图6可知，党参苷I可显著提高AP-1的转录活性。

实施例5

党参苷I对抗氧化原件(ARE)的转录活性的影响

1.ARE质粒的提取

1.1质粒的转化与验证

取100μL感受态细胞DH5α，加入1μL质粒pGL4.37样品，冰浴30min后42℃水浴中热击90s后迅速放于冰上冷却3-5min；加入适量新鲜配置的不加氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡1h；将菌液均匀涂布于新鲜配置的LB固体培养基上，晾干后，倒置培养皿，37℃培养12～16h；从培养后的LB固体培养基上挑取单个菌落，接种于适量的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h后，取1mL于离心管中，送华大基因公司测序，以进一步鉴定阳性克隆，其余的菌液加入等体积的50％甘油，于-80℃保存备用。

1.2质粒的提取及测定

2. 293T细胞瞬时共转染

显微镜下观察293T细胞贴壁生长达到70％-80％，通过使用PEI转染试剂同时转染pGL4.37和pGL4.75后放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

3.双荧光检测分析测定ARE转录活性

样品溶液的配制：配置100mM的tBHQ(特丁基对苯二酚)母液后，取适量用DMEM完全培养基稀释得到10nM浓度的tBHQ溶液。用DMEM完全培养基稀释制备100μM，10μM，1μM的党参苷I样品溶液。

在96孔细胞培养板上分别加入tBHQ(10nM)以及100μM、10μM、1μM的党参苷I样品溶液，并设置只加DMEM完全培养基的空白对照组，每孔100μL，于培养箱中培养6h后弃去上清液，用PBS清洗1遍，每孔加入25μL裂解液，振荡裂解30min后用Dua-Luciferase检测***检测。通过萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性对比得到相对荧光素酶活性值，结果见图7。

由图7可知，党参苷I可显著提高ARE的转录活性。

实施例6

党参苷I对B16细胞黑色素含量的影响

1.溶液的配制

精密称取α-MSH 1mg于1mL高压水中，得到600μM的α-MSH储备液，于4℃冰箱保存备用，采用完全培养液稀释得到100nM的α-MSH样品溶液；

精密称取曲酸(K.A.)10mg于1mL高压水中，得到10mg/mL的曲酸储备液，于4℃冰箱保存备用，采用完全培养基逐级稀释的方式配置其100μg/mL的样品溶液。

精密称取NaOH 4g，加入纯水搅拌使其充分溶解并定容至100mL。放置于室温储存即得1M NaOH溶液。

2.黑色素含量测定

(1)以4*10⁴个/mL的细胞密度种于100mm培养皿中，培养24h。

(2)用DMEM完全培养基将600μM的α-MSH母液稀释成浓度为100nM的α-MSH样品溶液，用100nM的α-MSH样品溶液稀释成浓度为10μM的党参苷I样品溶液和100μg/mL的曲酸样品溶液；取出培养皿，依次加入稀释过后的样品溶液，并设置只加DMEM完全培养基的空白对照组，于培养箱中培养48h。

(3)弃去上清液，用PBS清洗一遍，每皿加入700μL的0.25％胰酶-EDTA，37℃消化20s后加入DMEM完全培养液终止消化；

(4)将细胞悬液移入1.5mL离心管中，室温条件下1000rpm离心3min，得到对应的细胞沉淀；

(5)弃上清后每管加入1mL 1×PBS缓冲液，混合均匀后取10μL进行细胞计数，之后室温条件下13000rmp，离心10min获得细胞黑色素沉淀；

(6)尽量吸尽上清后，每管根据细胞数量加入对应体积的裂解液(90％1M NaOH+10％DMSO)，涡旋混匀后放入80℃金属浴加热90min，如果仍有沉淀，适当延长时间直至黑色素完全溶解；

(7)取上述(6)中每管100μL混匀的裂解液加入到96孔板内，在酶标仪405nm处测定吸光值，以裂解液(90％1M NaOH+10％DMSO)作为空白孔，结果见图8。黑色素含量计算公式：

黑色素含量/％＝(样品孔A₄₀₅-空白孔A₄₀₅)/(对照孔A₄₀₅-空白孔A₄₀₅)×100％

由图8可知，党参苷I可显著降低α-MSH诱导的B16细胞黑色素含量。

实施例7

党参苷U对B16细胞酪氨酸酶活性的影响

1.溶液的配制

精密称取α-MSH(黑素细胞刺激素)1mg于1mL高压水中，得到600μM的α-MSH储备液，采用完全培养液稀释得到100nM的α-MSH样品溶液；

精密称取曲酸(K.A.)10mg于1mL高压水中，得到10mg/mL的曲酸储备液，采用完全培养基逐级稀释的方式配置其100μg/mL的样品溶液。

精密称取L-DOPA(左旋多巴)1mg于1mL纯水中，得到5mM的L-DOPA样品溶液(现配现用)。

2.酪氨酸酶活性测定

(1)以4*10⁴个/mL的细胞密度种于6孔板中，培养24h。

(2)用DMEM完全培养基将600μM的α-MSH母液稀释成浓度为100nM的α-MSH样品溶液，用100nM的α-MSH样品溶液稀释成浓度为10μM的党参苷I和100μg/mL的曲酸样品溶液；取出6孔板，依次加入稀释过后的样品溶液，并设置只加DMEM完全培养基的空白对照组，于培养箱中培养48h。

(3)弃去上清液，用PBS清洗一遍，每孔加入500μL 0.25％胰酶，37℃消化20s后立即加入DMEM完全培养液终止消化；

(4)将细胞悬液移入1.5mL离心管中，室温条件下1000rpm离心3min；

(5)弃上清后每管加入1mL 1×PBS缓冲液，混合均匀后取10μL进行细胞计数，计数完毕后离心管室温条件下1000rpm离心3min；

(6)每管根据细胞数量加入对应体积的含1％TritonX-100的1×PBS溶液，4℃裂解30min，可以每10min涡旋几次使充***解；

(7)之后12000rpm，4℃，离心10min，将上清液转移到新的离心管内，用移液枪混匀后分别取50μL于96孔板，加入与上清液等体积的5mM L-DOPA溶液，37℃孵育30min，在酶标仪475nm测定吸光值，以5mM L-DOPA溶液作为空白孔，结果见图9。酪氨酸酶活性计算公式：

酪氨酸酶活性/％＝(样品孔A₄₇₅-空白孔A₄₇₅)/(对照孔A₄₇₅-空白孔A₄₇₅)×100％

由图9可知，党参苷I可显著抑制α-MSH诱导的B16细胞酪氨酸酶活性。

实施例8

一种防治皮肤光老化的药物(或护肤品)，是由下述方法制备得到的：

(1)按重量比取：党参苷I 0.01％、山俞酸甘油酯0.3％、辛酸三甘油酯0.15％、大豆卵磷脂0.3％、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯(卖泽52)1.82％、卡波姆9400.3％、甘油4.6％、羟丙甲基纤维素0.3％、尼泊金乙酯0.3％，余量是去离子水。

(2)制备凝胶：

(2-1)将配方量的山俞酸甘油酯、辛酸三甘油酯于75℃水浴下溶于氯仿得溶液A；

(2-2)将配方量的大豆卵磷脂、党参苷I于75℃水浴下溶于无水乙醇得溶液B；

(2-3)A、B两种溶液混匀得溶液C；

(2-4)将配方量的卖泽52于75℃水浴下溶于去离子水中得溶液D；

(2-5)在磁力搅拌(500r/min)下将溶液C缓慢注入溶液D中，继续搅拌至除去有机溶剂即得党参苷I的纳米结构脂质载体；

(2-6)再将配方量的卡波姆940、甘油、羟丙甲基纤维素、尼泊金乙酯溶于去离子水(配方量的去离子水减去配制溶液D时使用的去离子水)中，4℃溶胀12h，得空白凝胶；

(2-7)接着将空白凝胶分别与党参苷I的纳米结构脂质载体按照1∶1搅拌混匀，调pH至6.5即得防治皮肤光老化的药物(或护肤品)。

使用方法：取适量直接外用涂抹于皮肤，一天一次，无需清洗。

实施例9

保湿、亮肤、抗皱作用的考察

建立紫外线(UV)辐射ICR小鼠致皮肤衰老模型，考察党参苷I药物(或护肤品)对小鼠皮肤含水量、黑色素及皱纹生成的影响。

(1)建立光老化动物模型

先用剪刀和电动剃须刀剔除小鼠背部毛发，充分暴露其背部皮肤后，使用自制小鼠固定器固定小鼠后，SS-03AB型光疗仪辐照小鼠造模。每周照射5天，休息2天，共辐照造模9周，总辐射剂量UVB总剂量：9.45J/cm²，UVA总剂量：94.5J/cm²。造模结束后，造模成功的小鼠背部皮肤明显增厚，皮肤表面粗糙，皮肤干燥***，可见明显皱纹。

(2)实验分组

随机分成6组，分别为：空白对照组，5只，备皮，装置固定，不照射；模型组，5只，备皮，装置固定，照射；党参苷I药物(或护肤品)组(实施例8)，5只，备皮，装置固定，背部皮肤局部给予党参苷I药物(或护肤品)，照射。空白制剂(实施例8中制备的防治皮肤光老化的药物(或护肤品)中党参苷I的质量用去离子水代替即得)组，5只，备皮，装置固定，背部皮肤局部给予空白制剂，照射。

(3)党参苷I药物(或护肤品)对UV照射诱导的光老化小鼠皮肤水分的影响

皮肤水分含量测试仪(Cornemeter CM 825，Courage and Khazaka，德国)的探头是基于电容的原理进行测量。水的介电常数是81，其他物质的介电常数通常小于7，水是皮肤上介电常数最大的物质。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面的含水量。测得值是一相对值。单位用C.U.(CorneometerUnits)表示。

试验中，测试使用党参苷I药物(或护肤品)后，皮肤水分含量的变化。具体为：空白对照组不照射，模型组、党参苷I药物(或护肤品)组均进行紫外线照射，照射条件见建立光老化动物模型中。一周照射5天，每隔一周于照射5天结束后即第6天(即6d，18d，30d，42d，54d)测定皮肤含水量。分别使用皮肤水分含量测试仪测定测试区域的皮肤MMV值，每个测试区域测试3次取平均值。皮肤水分含量MMV值变化反映在测试周期内，实验区域水分含量随时间变化规律。其值越大，水分含量越大，反之，水分含量越小。测量结果如表1所示。

表1党参苷I药物(或护肤品)对UV照射诱导的光老化小鼠皮肤水分的影响(n＝5)

^###P＜0.001vs空白对照组^***P＜0.001vs模型组^**P＜0.01vs模型组^*P＜0.05vs模型组

从表1可以看出，在试验周期内，使用党参苷I药物(或护肤品)组的测试区的皮肤水分MMV值高于模型组，可以改善光老化皮肤干燥症状。

(4)党参苷I药物(或护肤品)对光老化小鼠皮肤黑色素含量的影响

组织活力成像仪(Tissue Viability lmager TiVi 700，WheelsBridge AB，瑞典)基于白光照明器发出的经过偏振光滤光片后的线性偏振光到达要分析的皮肤表面，大部分线性偏振光被皮肤表面直接反射后被探测器的滤光片阻碍，只有部分无规则的经过皮肤下层，经红血细胞吸收过后的偏振光通过了滤光片进入探测器。到达探测器的偏振光中，绿光成分由于血管中红血细胞的吸收作用被减弱，红色成分几乎没有被改变，而红血细胞周围的其他组织对绿光和红光的吸收基本相同。这样就可以得到皮肤深层的血管微循环状态，得到图像中每个点的红血细胞浓度值即TiVi值。采用TiVi 700拍摄图像，采用TiVi97色素分析软件分析黑色素含量。

试验中，测试使用党参苷I药物(或护肤品)后，皮肤黑色素含量的变化。具体为：空白对照组不照射，模型组、党参苷I药物(或护肤品)组均进行紫外线照射，照射条件见建立光老化动物模型中。一周照射5天，每隔一周于照射5天结束后即第6天(即6d，18d，30d，42d，54d)测定皮肤黑色素含量。测量结果如表2所示。

表2党参苷I药物(或护肤品)对UV照射诱导的光老化小鼠皮肤黑色素含量的影响(n＝5)

^###P＜0.001vs空白对照组^##P＜0.01vs空白对照组^***P＜0.001vs模型组^**P＜0.01vs模型组

从表2可以看出，在试验周期内，使用党参苷I药物(或护肤品)组的测试区的黑色素含量低于模型组，可以改善光老化皮肤的色素沉着问题。

(5)党参苷I药物(或护肤品)对光老化小鼠皮肤皱纹的影响

在第9周时采用(4)中组织活力成像仪(Tissue Viability lmager TiVi 700，WheelsBridge AB，瑞典)拍摄图像，皱纹分析软件Wrinkle Analyzer TiVi90通过对皱纹轮廓分析计算出皱纹的深度和体积。党参苷I药物(或护肤品)作用于UV辐射致皮肤衰老小鼠的皱纹的深度和体积分别见图10、图11、图12。测定结果显示，使用党参苷I药物(或护肤品)的测试区的皱纹深度和体积均低于模型组，具有减轻皱纹的作用。

实施例10

一种防治皮肤光老化的药物(或护肤品)，按重量比取：党参苷I 0.03％、山俞酸甘油酯0.4％、辛酸三甘油酯0.1％、大豆卵磷脂0.1％、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯(卖泽52)1％、卡波姆9400.2％、甘油3％、羟丙甲基纤维素0.1％、尼泊金乙酯0.1％，余量是去离子水。

制备方法同实施例8。

以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.党参苷Ⅰ在制备用于促进细胞增殖的药物或护肤品中的用途。

2.根据权利要求1所述的党参苷Ⅰ的新用途，其特征在于：所述细胞为HEK细胞和/或HSF细胞。

3.党参苷Ⅰ在制备用于减少黑色素含量/减轻色素沉着的药物或护肤品中的用途。

4.党参苷Ⅰ在制备用于降低酪氨酸酶活性的药物或护肤品中的用途。

5.党参苷Ⅰ在制备用于防治皮肤光老化的药物或护肤品中的用途。

6.党参苷Ⅰ在制备抗衰老的药物或护肤品中的用途。

7.党参苷Ⅰ在制备提高皮肤含水量的药物或护肤品中的用途。

8.党参苷Ⅰ在制备淡化皱纹的药物或护肤品中的用途。

9.一种防治皮肤光老化的药物/护肤品，其特征在于：主要功效成分包括权利要求1-8之一所述的党参苷Ⅰ。

10.根据权利要求9所述的防治皮肤光老化的药物/护肤品，其特征在于：各组分按重量比计为党参苷Ⅰ0.01-0.03％、山俞酸甘油酯0.3-0.4％、辛酸三甘油酯0.1-0.15％、大豆卵磷脂0.1-0.3％、聚氧乙烯硬脂酸酯1-1.82％、卡波姆940 0.2-0.3％、甘油3-4.6％、羟丙甲基纤维素0.1-0.3％、尼泊金乙酯0.1-0.3％，余量是去离子水。