CN118166157A - 西瓜低氮耐受性相关kasp分子标记及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记及其用途，本发明设计开发的与低氮耐受性紧密连锁的KASP分子标记，可以进行西瓜低氮耐受性品种的初步筛选。在西瓜耐低氮性状的选择育种过程中，往往会产生大量的分离群体，采用该分子标记，可快速选择出分离群体中耐低氮的单株用于育种改良，实现西瓜植株氮素的高效利用，加速“绿色”西瓜品种的分子育种进程。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜农艺性状分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，具体适用于西瓜低氮耐受性的快速筛选和分子标记辅助育种，提供一种新型且简便的分子标记及辅助选择方法。
背景技术
随着世界人口的迅速增长和人民生活水平的不断提高，人类对农产品的需求量也不断增加。为提高作物产量，人们通过施用大量肥料促进植物生长发育，进而导致肥料施用量逐年增加。据统计，1980年至2013年，我国氮肥施用量增加约1.6倍，而粮食产量仅增加了87% (http://data.stats.gov.cn/)。氮肥的大量施用和作物氮素利用效率低的问题不仅增加了农业生产成本，还导致了土壤酸化、水体富营养化等环境问题 (蒋志敏, 王威, 储成才 (2018) 植物氮高效利用研究进展和展望. 生命科学30: 1060-1071)。因此减少氮肥施用量、培育耐低氮的农作物新品种是解决这一问题的主要手段。
自然土壤氮素匮乏，植物已经进化出多种机制适应低氮胁迫 (Kiba T, Krapp A(2016) Plant Nitrogen Acquisition Under Low Availability: Regulation ofUptake and Root Architecture. Plant Cell Physiol 57:707-714)，如根系中转运蛋白吸收活性的增加、改变根系结构以增加对氮素的吸收、老叶中氮素的再利用等 (Nacry P,Bouguyon E, Gojon A (2013) Nitrogen acquisition by roots: physiological anddevelopmental mechanisms ensuring plant adaptation to a fluctuating resource.Plant Soil 370:1-29)。AtCLC-b可促进硝酸盐外排，提高拟南芥低氮适应性 (Shi Y, LiuD, He Y, Tang J, Chen H, Gong P, Luo JS, Zhang Z (2023) CHLORIDE CHANNEL-bmediates vacuolar nitrate efflux to improve low nitrogen adaptation inArabidopsis. Plant Physiol 193:1987-2002)。在低氮条件下，通常根系中高亲和转运蛋白家族NRT2发挥作用 (Liu X, Huang D, Tao J, Miller AJ, Fan X, Xu G (2015)Identification and functional assay of the interaction motifs in the partnerprotein OsNAR2.1 of the two-component system for high-affinity nitratetransport. New Phytol 204)。AtNRT2.1在拟南芥氮缺乏情况下发挥主要作用，负责质外体硝酸盐的吸收，定位于初生根、侧根的表皮细胞 (Wirth J, Chopin F, Santoni V,Viennois G, Tillard P, Krapp A, Lejay L, Daniel-Vedele F, Gojon A (2007)Regulation of root nitrate uptake at the NRT2.1 protein level in Arabidopsisthaliana. Journal of Biological Chemistry 282:23541-23552)。AtNRT2.4和AtNRT2.5在低氮情况下表达量上升来响应低氮胁迫(Lezhneva L, Kiba T, Feria-BourrellierAB, Lafouge F, Boutet-Mercey S, Zoufan P, Sakakibara H, Daniel-Vedele F,Krapp A (2014) The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.5 plays a role innitrate acquisition and remobilization in nitrogen-starved plants. Plant J80:230-241)。水稻中NAC类转录因子OsNAP参与调控叶片衰老过程，低氮胁迫下OsNAP过量表达可使籽粒中总氮含量明显升高，剑叶中氮等营养元素的含量降低，从而促进叶片衰老(Liang CZ, Wang YQ, Zhu YN, Tang JY, Hu B, Liu LC, Ou SJ, Wu HK, Sun XH, ChuJF, Chu CC (2014) OsNAP connects abscisic acid and leaf senescence by fine-tuning abscisic acid biosynthesis and directly targeting senescence-associated genes in rice. Proc Natl Acad Sci U S A 111:10013-10018)。OsTCP19可决定不同水稻品种在低氮水平下的分蘖数进而影响水稻产量 (Liu Y, Wang H, Jiang Z,Wang W, Xu R, Wang Q, Zhang Z, Li A, Liang Y, Ou S, Liu X, Cao S, Tong H,Wang Y, Zhou F, Liao H, Hu B, Chu C (2021) Genomic basis of geographicaladaptation to soil nitrogen in rice. Nature 590:600-605)。
西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai）是需肥较多的高产经济作物，氮肥则是西瓜优质、高产的基础。目前，在农业生产中西瓜氮肥施用量高、氮肥利用率低等问题突出，而决定西瓜低氮耐受性的关键靶标基因未被克隆，西瓜低氮耐受性相关功能性分子标记也未在育种过程中得以应用。因此，鉴定调控西瓜低氮耐受性的关键基因，并开发西瓜低氮耐受性相关的功能性分子标记，可加速西瓜“绿色”新品种的分子设计育种。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与西瓜低氮耐受性性状紧密连锁的分子标记，开发了西瓜低氮耐受性相关的KASP分子标记及其用途，本发明所获得的分子标记可用于耐低氮西瓜育种材料的筛选鉴定和分子标记辅助选择育种。
本发明第一方面，提供了一种西瓜低氮耐受性相关基因ClSIK1：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
本发明第二方面，还同时提供了上述西瓜低氮耐受性相关基因ClSIK1编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
本发明第三方面，还同时提供了一种西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记，所述分子标记位于西瓜低氮耐受性相关基因ClSIK1的第一个外显子625 bp处；所述西瓜低氮耐受性相关基因ClSIK1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述分子标记的基因型从G突变为T，T基因型对应表型为耐低氮型，G基因型对应表型为低氮敏感型。
本发明第四方面，还同时提供了检测所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂在鉴定不同低氮耐受性的西瓜材料及其后代的分子辅助选择育种中的用途。
进一步地，检测所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂包括下列引物对：
正向引物F-Fam（SEQ ID NO.3）：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGTCGCGAGTATGCAAG-3’
正向引物F-Hex（SEQ ID NO.4）：
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反向引物R（SEQ ID NO.5）：
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引物（分子标记）可委托上海生工生物工程股份有限公司合成，在ABI Step OnePCR仪上进行扩增。
进一步地，具体为：
（1）提取待测西瓜样本基因组DNA；
（2）利用检测所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂对待测西瓜样本基因组DNA进行PCR扩增；
（3）检测PCR扩增结果的荧光信号判断待测西瓜低氮耐受性，其中，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F-Hex的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型TT，表型为耐低氮型，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F-Fam的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型“GG”，表型为低氮敏感型；若PCR扩增结果荧光信号颜色均与正向引物F-Fam、正向引物F-Hex的荧光接头颜色不同，则为杂合基因型。
进一步地，所述步骤（2）中，PCR扩增使用的PCR反应体系为：20-50 ng/μl西瓜基因组DNA 5.0 μl，KASP Master Mix 5.0 μl，KASP Assay Mix 0.14 μl，总体积为10.14 μl；KASP Assay Mix 中包含正向引物F-Fam、正向引物F-Hex和反向引物R，且正向引物F-Fam、正向引物F-Hex、反向引物R的体积比为2:2:5，三种引物浓度均为10 ng/μl。
进一步地，所述步骤（2）中，PCR扩增使用的PCR反应程序为：30 ℃，1 min读取荧光信号；94 ℃，15 min预变性；94 ℃，20 s变性；61 ℃退火60 s，10个循环，每次循环后都下降0.6 ℃；94 ℃，20 s变性；55 ℃，退火60 s，31个循环；30 ℃，1 min读取荧光信号。
本发明第五方面，还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：
（1）调查西瓜自然群体材料的低氮耐受性；
（2）用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide）法提取西瓜自然群体基因组DNA；
（3）完成西瓜自然群体材料的重测序，随后进行GWAS分析（全基因组关联分析，Genome-wide association study）定位与西瓜低氮耐受性相关的区域或基因；
（4）鉴定与西瓜低氮耐受性紧密连锁的SNP变异和InDel***缺失变异；
（5）基于连锁的变异，采用KASP（竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应，Kompetitive Allele Specific Polymerase Chain Reaction）方法进行西瓜低氮耐受性相关分子标记的筛选；
（6）开发出一个与西瓜低氮耐受性性状紧密连锁的KASP分子标记。
说明：在本发明中，表1所述的西瓜品种，按照上述PCR反应程序均能实现充分分型。
本发明第六方面，还提供了一种鉴定西瓜氮素吸收效率的方法，具体为：
（1）提取待测西瓜样本基因组DNA；
（2）利用检测所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂对待测西瓜样本基因组DNA进行PCR扩增；所述检测所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂包括下列引物对：
正向引物F-Fam：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGTCGCGAGTATGCAAG-3’
正向引物F-Hex：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGTCGCGAGTATGCAAT-3’
反向引物R：
5’-CGTATCCGACCACCGCCTT-3’；
（3）检测PCR扩增结果的荧光信号判断待测西瓜低氮耐受性，其中，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F-Hex的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型TT，表型为耐低氮型，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F-Fam的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型“GG”，表型为低氮敏感型；若PCR扩增结果荧光信号颜色均与正向引物F-Fam、正向引物F-Hex的荧光接头颜色不同，则为杂合基因型。
本发明的有益效果是：设计开发的与低氮耐受性紧密连锁的KASP分子标记，可以进行西瓜低氮耐受性品种的初步筛选。在西瓜耐低氮性状的选择育种过程中，往往会产生大量的分离群体，采用该分子标记，可快速选择出分离群体中耐低氮的单株用于育种改良，实现西瓜植株氮素的高效利用，加速“绿色”西瓜品种的分子育种进程。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是西瓜自然群体中3份代表性的低氮敏感型西瓜品种和3份代表性的耐低氮型西瓜品种的照片；其中ZJU022、ZJU120和ZJU122为低氮敏感型西瓜品种，ZJU019、ZJU023和ZJU044为耐低氮型西瓜品种；NN表示正常氮处理，LN表示低氮胁迫处理。结果表明西瓜自然群体中品种间的低氮耐受性存在很大差异。
图2是西瓜自然群体材料的低氮耐受性指数频率分布直方图；
图3是西瓜自然群体低氮耐受性指数的全基因组关联分析（GWAS）结果图；
图3中的a和图3中的b分别是利用Fast-LMM算法获得的曼哈顿图和QQ图，图3中的c和图3中的d分别是利用GEMMA算法获得的曼哈顿图和QQ图。结果显示在基因组上存在多个位点与西瓜低氮耐受性性状显著关联，其中在第11号染色体上存在一个较显著的QTL。
图4是不同低氮耐受性的西瓜材料的分子标记的分型图；
其中耐低氮型基因型为T/T，低氮敏感型基因型为G/G，杂合基因型是G/T，黑色的叉表示无荧光信号的阴性对照。该分子标记在西瓜自然群体材料中表现出明显的分离，说明该标记的可靠性，可用于不同低氮耐受性西瓜材料的筛选。
图5是不同低氮耐受性西瓜材料的低氮耐受性指数分布统计图；
左侧柱代表西瓜自然群体中所有纯合G/G基因型的低氮耐受性指数；右侧柱代表西瓜自然群体中所有纯合T/T基因型的低氮耐受性指数；中间柱代表所有杂合G/A基因型的低氮耐受性指数；结果表明G/G基因型的西瓜材料和T/T基因型的西瓜材料的低氮耐受性存在显著差异，西瓜自然群体里该分子标记的基因分型与低氮耐受性表型连锁，说明该分子标记可以辅助西瓜低氮耐受性品种的育种。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的西瓜品种公众可通过商业途径购买获得，或者从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、西瓜自然群体低氮耐受性鉴定：
从种质资源库中选取191份西瓜品种，测定每个品种在低氮胁迫下的生物量变化情况来表征其低氮耐受性；具体如下：
选取长势一致的西瓜幼苗定植于改良后的西瓜Hoagland营养液中，每个品种定植8株。当幼苗长至两叶一心时，每个品种分别取4株进行正常氮处理（7.5 mM N）和低氮胁迫（0.75 mM N）处理，营养液每周更换两次。改良后的西瓜Hoagland营养液配方为：2.5 mM Ca(NO3)2·4H2O, 2.5 mM KNO3,0.5 mM KH2PO4, 1.4 mM MgSO4·7 H2O, 50 μM H3BO3, 10 μMMnSO4.4H2O, 0.76 μM ZnSO4.7H2O, 0.32 μM CuSO4.5H2O 以及 0.016 μM (NH4)6Mo7O24.4H2O, pH 6.0，低氮胁迫下减少的Ca2+和K+分别用CaCl2和KCl补充。低氮处理14天后将植株地上部与地下部分别装入信封袋中，80 °C烘干至恒重，随后测定每个西瓜品种在正常氮和低氮处理下植株的总生物量TDWCK和TDWLN，并计算其低氮耐受性。
植株低氮耐受性指数 = (TDWCK-TDWLN)/TDWCK
所得结果如表1所示，可获得以下总结性结论：不同西瓜品种对低氮的耐受性存在很大差异，例如耐低氮的西瓜品种ZJU022、ZJU120和ZJU122在低氮条件下总生物量下降较少，而低氮敏感型西瓜品种ZJU019、ZJU023和ZJU044在低氮条件下总生物量明显下降。图1是西瓜自然群体中3份代表性的低氮敏感型西瓜品种和3份代表性的耐低氮型西瓜品种照片对比；图2是西瓜自然群体材料的低氮耐受性指数频率分布直方图，可得知：西瓜自然群体低氮耐受性呈正态分布，表明该性状在西瓜自然群体中变异丰富，且是一个多基因控制的数量性状。
表1 191份西瓜材料信息及基因型
注：C.rehmii表示热迷西瓜；C.colocynthis表示药西瓜；C.amarus表示饲用西瓜；C.mucosospermus表示黏籽西瓜；CL_landrace表示地方品种西瓜；CL_cultivar表示栽培品种西瓜。
实施例2、西瓜低氮耐受性性状主效QTL定位
依据实施例1中191份西瓜材料的低氮耐受性表型数据及其全基因组重测序数据，进行全基因组关联分析，获得显著关联的QTL。具体如下：
一、提取西瓜自然群体DNA
用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide）法提取西瓜自然群体基因组DNA。
二、全基因组重测序
将质检合格的DNA样品进行Illumina HiSeq/MiSeq测序，对测序获得的raw data进行质控，随后利用BWA软件与西瓜参考基因组97103（http://cucurbitgenomics.org/ftp/genome/watermelon/97103/v2/）进行比对，并剔除MAF < 0.05、geno < 0.8的位点，最终鉴定出4703563个SNP位点，利用这些SNPs和191份西瓜种质低氮耐受性表型数据进行全基因组关联分析。
三、全基因组关联分析
本发明使用Fast-LMM和GEMMA两种算法进行全基因组关联分析，并以P = 1.0×10-5作为自定义阈值线。如图3所示，西瓜基因组第11号染色体22162064 -22420775之间与西瓜低氮耐受性性状显著关联，其中ClSIK1基因为调控西瓜植株低氮耐受性的关键基因；西瓜低氮耐受性相关基因ClSIK1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
实施例3、西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记开发与验证
根据实施例2的基因定位结果，对ClSIK1基因的启动子、外显子及内含子上的所有SNP和InDel进行分析，并利用KASP技术开发出相关的分子标记。具体如下：
一、设计引物
正向引物F-Fam和F-Hex前分别设置了各自的荧光接头（在分型图上显示为不同颜色）。如果检测的材料是纯合基因型，则在扩增时只会选择其中对应的一个引物进行扩增（例如，纯合G/G基因型只能与F-Fam发生反应）。最后根据荧光差异，分辨出所测材料是纯合G/G基因型还是T/T基因型。如果检测的材料是杂合基因型的，那么两个引物均会发生扩增，则产生的荧光信号不同于纯合基因型的材料，从而实现杂合基因型的区分。
经过分子标记的筛选，最终获得与西瓜低氮耐受性紧密连锁的KASP分子标记。所述分子标记为SNP标记，该分子标记引物组合序列如下：
正向引物F-Fam（SEQ ID NO.3）：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGTCGCGAGTATGCAAG-3’
正向引物F-Hex（SEQ ID NO.4）：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGTCGCGAGTATGCAAT-3’
反向引物R（SEQ ID NO.5）：
5’-CGTATCCGACCACCGCCTT-3’
其中，该SNP标记位于西瓜第11号染色体的22304793处，即ClSIK1基因第一个外显子625 bp处，分子标记位点前后100 bp序列如SEQ ID NO.6所示：
GACTGTTGTTCGAAGGACCGCTGGTAGTCGCAGTGGTTCCAGAGATGGAGGCGGAGGACTTGAGGGGTCCACGATGGGCAGAGCGGTCGCGAGTATGCAAnGTATGGGAGAGTTAGGGTTTGGGAAGCAGAGGAAGGGGAATGGATCACGGAGGAGTGAGGAAGGCGGTGGTCGGATACGCAGTAAGGTATCCTCGAGTTC
其中n是SNP位点，n是G或T ，突变型表现为碱基T，对应表型为耐低氮型。
二、PCR扩增
提取待测西瓜样本基因组DNA；
利用引物组合对待测西瓜样本基因组DNA进行PCR扩增；
PCR反应体系为：20-50 ng/μl西瓜基因组DNA 5.0 μl，KASP Master Mix 5.0 μl，KASP Assay Mix (F-Fam：F-Hex：R＝2:2:5的体积比，三种引物浓度均为10 ng/μl) 0.14 μl，总体积为10.14 μl；
PCR反应程序为：30 ℃，1 min（读取荧光信号）；94 ℃，15 min（预变性）；94 ℃，20s（变性）；61 ℃（-0.6 ℃/循环）退火60 s，10个循环；94 ℃，20 s（变性）；55 ℃，退火60 s，31个循环。30 ℃，1 min（读取荧光信号）。
直接在ABI Step One PCR仪上进行PCR扩增，仪器检测荧光信号后可直接获得基因分型情况，所得结果如图4、图5和表1所示。软件将检测样品按照不同的基因型分成纯合G/G基因型，纯合T/T基因型和杂合G/T基因型，G/G基因型的西瓜材料和T/T基因型的西瓜材料的低氮耐受性存在显著差异。
根据图4和图5所示，该分子标记可明显区分两个不同的纯合基因型和杂合基因型，且分型结果与重测序结果完全一致，可证明该分子标记的可靠性。该分子标记可以用于不同低氮耐受性西瓜材料的分子辅助选择育种。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记，其特征在于，所述分子标记位于西瓜基因组第11号染色体的22304793低氮耐受性相关基因ClSIK1的第一个外显子625 bp处；所述西瓜低氮耐受性相关基因ClSIK1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述分子标记的基因型从G突变为T，T基因型对应表型为耐低氮型，G基因型对应表型为低氮敏感型 。
2.检测权利要求1所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂在鉴定不同低氮耐受性的西瓜材料及其后代的分子辅助选择育种中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述检测权利要求1所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂包括下列引物对：
正向引物F-Fam：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGTCGCGAGTATGCAAG-3’
正向引物F-Hex：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGTCGCGAGTATGCAAT-3’
反向引物R：
5’-CGTATCCGACCACCGCCTT-3’。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，具体为：
（1）提取待测西瓜样本基因组DNA；
（2）利用检测权利要求1所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂对待测西瓜样本基因组DNA进行PCR扩增；
（3）检测PCR扩增结果的荧光信号判断待测西瓜低氮耐受性，其中，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F-Hex的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型TT，表型为耐低氮型，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F-Fam的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型“GG”，表型为低氮敏感型；若PCR扩增结果荧光信号颜色均与正向引物F-Fam、正向引物F-Hex的荧光接头颜色不同，则为杂合基因型。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增使用的PCR反应体系为：20-50 ng/μl西瓜基因组DNA 5.0 μl，KASP Master Mix 5.0 μl，KASP Assay Mix0.14 μl，总体积为10.14 μl；KASP Assay Mix 中包含正向引物F-Fam、正向引物F-Hex和反向引物R，且正向引物F-Fam、正向引物F-Hex、反向引物R的体积比为＝2:2:5的体积比，三种引物浓度均为10 ng/μl。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增使用的PCR反应程序为：30 ℃，1 min读取荧光信号；94 ℃，15 min预变性；94 ℃，20 s变性；61 ℃退火60 s，10个循环，每次循环后都下降0.6 ℃；94 ℃，20 s变性；55 ℃，退火60 s，31个循环；30 ℃，1 min读取荧光信号。
7.一种鉴定西瓜氮素吸收效率的方法，其特征在于，具体为：
（1）提取待测西瓜样本基因组DNA；
（2）利用检测权利要求1所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂对待测西瓜样本基因组DNA进行PCR扩增；所述检测权利要求1所述的西瓜低氮耐受性相关KASP分子标记的试剂包括下列引物对：
正向引物F-Fam：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGGTCGCGAGTATGCAAG-3’
正向引物F-Hex：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGTCGCGAGTATGCAAT-3’
反向引物R：
5’-CGTATCCGACCACCGCCTT-3’；
（3）检测PCR扩增结果的荧光信号判断待测西瓜低氮耐受性，其中，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F-Hex的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型TT，表型为耐低氮型，若PCR扩增结果荧光信号颜色与正向引物F-Fam的荧光接头颜色一致，则待测西瓜为纯合基因型“GG”，表型为低氮敏感型；若PCR扩增结果荧光信号颜色均与正向引物F-Fam、正向引物F-Hex的荧光接头颜色不同，则为杂合基因型。
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