CN117777264A - 劳氏粘虫化学感受蛋白csp、其编码基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种劳氏粘虫化学感受蛋白CSP、其编码基因及应用，旨在解决劳氏粘虫化学防治中农药用量大效果差及抗药性严重的技术问题。本申请获得了劳氏粘虫化学感受蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，克隆得到编码所述劳氏粘虫化学感受蛋白的CSP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并基于所述劳氏粘虫CSP基因核苷酸序列设计合成了一个dsRNA片段，其模板DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。以劳氏粘虫化学感受蛋白为靶标基因开发得到的CSP基因的dsRNA对提高劳氏粘虫对氯虫苯甲酰胺的敏感性具有明显作用，且无环境毒害，使用安全，在劳氏粘虫的应急化学防治中可作为增效剂使用，对于化学农药的减量增效和保障粮食安全具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明申请涉及生物防治技术领域，具体涉及一种劳氏粘虫化学感受蛋白、其编码基因及应用。
背景技术
劳氏粘虫（Mythimnaloreyi）隶属鳞翅目、夜蛾科，是一种世界范围内广泛分布的重要农业害虫，2020年和2023年先后2次被列入一类农业病虫害名录。
劳氏粘虫的幼虫食性杂，可取食多种植物，尤其喜欢禾本科植物，为害的作物主要包括小麦、大麦、玉米、水稻、甘蔗和棉花等。进入21世纪后，受气候变化、种植业结构调整和作物品种更换等多种因素的影响，劳氏粘虫的发生范围不断扩大，危害程度日益严重，给粮食安全生产带来极大威胁。
当前，化学防治依然是控制病虫危害的有效手段。但是在农业生产中由于长期大规模使用化学杀虫剂，导致了棉铃虫、粘虫和小菜蛾等多种害虫产生了较严重的抗药性。害虫的抗药性常因害虫和药剂种类不同，抗药性机制存在差异。近年来，随着对害虫抗药性机制研究的不断深入，有关化学感受蛋白参与害虫抗药性机制的研究也逐渐增多。昆虫化学感受蛋白（chemosensory proteins）是在长期进化过程中形成的一类低分子量酸性可溶性蛋白，广泛分布于昆虫触角、中肠、翅膀、跗肢和足等各种化学感受器中。目前已在小菜蛾、禾谷缢管蚜和烟粉虱等害虫中发现化学感受蛋白参与抗药性的形成，但目前尚缺乏有关劳氏粘虫化学感受蛋白参与抗药性的研究报道。
近年来，利用RNA干扰（RNAi）技术研究基因功能的报道越来越多，并逐渐发展成为一种研究害虫防治的新型技术。利用RNAi技术沉默参与害虫抗药性的基因，提高害虫对药剂的敏感性，是实现农药的减量增效和延缓害虫抗药性产生的有效措施之一。与传统化学农药相比，RNAi技术具有特异性强、无环境毒性、开发周期短、靶标变更灵活和用量更低等优势。
但目前将RNAi技术应用于劳氏粘虫防治的报道仍鲜见，且尚无关于化学感受蛋白在其防治中的应用报道。
公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
研究表明，昆虫化学感受蛋白（CSP）是广泛分布于昆虫各种化学感受器淋巴液中的蛋白，具有感受、识别、转运、传导环境化学因子刺激信息，参与调节昆虫生理节律和生长发育等多种生物功能。近年来的研究发现，昆虫化学感受蛋白在害虫的抗药性中发挥重要作用，能够作为开发昆虫生物防治药剂的有效靶点。本申请以劳氏粘虫化学感受蛋白（CSP）为靶标基因，开发得到能够用于防治劳氏粘虫的RNAi产品，从而为劳氏粘虫的生物防治提供新的方向和重要依据。
本申请旨在提供一种来源于劳氏粘虫的化学感受蛋白及其编码基因，以实现劳氏粘虫化学防治中农药的减量增效和延缓其抗药性上升。
为解决上述技术问题，本申请采用如下技术方案：
获得一种劳氏粘虫化学感受蛋白（CSP），其基因编码107个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
克隆得到编码所述劳氏粘虫化学感受蛋白的CSP基因，全长cDNA序列为342 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
基于所述劳氏粘虫CSP基因核苷酸序列设计合成了一个dsRNA片段，其模板DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述CSP基因或所述dsRNA片段能够提高劳氏粘虫对农药（如氯虫苯甲酰胺等）的敏感性，有效用于劳氏粘虫的防治中，或应用于劳氏粘虫防治药剂的制备当中。
基于所述CSP基因序列设计合成dsRNA或其片段，可使劳氏粘虫摄取dsRNA片段后对配合施用的双酰胺类农药（如氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺）的敏感性提高，从而提高对劳氏粘虫的防治效果。
本申请通过基因沉默，将CSPdsRNA导入劳氏粘虫体内，测定了CSP基因沉默后劳氏粘虫对氯虫苯甲酰胺敏感性的影响。实验结果表明，饲喂CSP基因dsRNA的劳氏粘虫幼虫，24h和48h后对氯虫苯甲酰胺的敏感性分别提高13.35%和35.00%。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：
本申请劳氏粘虫化学感受蛋白（CSP）为靶标基因开发得到的CSP基因的dsRNA对提高劳氏粘虫对双酰胺类农药（如氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺等）的敏感性具有明显作用，且无环境毒害，使用安全，在劳氏粘虫的应急化学防治中可作为增效剂使用，对于化学农药的减量增效和保障粮食安全具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本申请一实施例中劳氏粘虫化学感受蛋白CSP基因PCR扩增的电泳检测图；其中，1、2：劳氏粘虫CSP基因的PCR扩增；3：DL2000；4：阴性对照。
图2为本申请一实施例中劳氏粘虫化学感受蛋白氨基酸序列的同源性分析；其中，划横线部分为信号肽序列，矩形标注部分（ACPQCSD、ZGPCDK、FMQRNIKW）为预测的劳氏粘虫化学感受蛋白结构域。
图3 为本申请一实施例中预测的劳氏粘虫CSP的二级结构；其中，图3a为在线预测的二级结构（https://www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html）；图3b为利用PSIPRED预测的二级结构。
图4为本申请一实施例中预测的劳氏粘虫CSP的三级结构。
图5 为本申请一实施例中劳氏粘虫CSP的***进化分析。
图6为本申请一实施例中劳氏粘虫化学感受蛋白CSP基因经dsRNA处理后的表达情况。
图7为本申请一实施例中劳氏粘虫幼虫经化学感受蛋白dsRNA+氯虫苯甲酰胺处理后的死亡率。
具体实施方式
为了更好的理解本申请技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购买于常规生化试剂公司；所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规的实验室仪器设备；以下实施例中的定量试验，如无特别说明均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例一、劳氏粘虫CSP基因全长cDNA的PCR扩增及克隆
1. 总RNA提取：取劳氏粘虫2龄幼虫3头放入1.5 ml离心管中，液氮冷冻后利用研磨棒将其研成粉末，然后参照生工生物工程（上海）股份有限公司Total RNA Extractor(Trizol) 说明书提取总RNA，获得浓度 ≥ 400 ng/μL，总量 ≥ 5 μg，OD260/280为1.8～2.1的总RNA样品。
2. 劳氏粘虫CSP基因的PCR扩增及克隆
根据劳氏粘虫转录组数据获得CSP基因全长cDNA序列SEQ ID NO. 2，采用Primer5.0软件设计PCR扩增全长cDNA序列的引物：
CSP-F：5′- GAAAGTGGGCGTTACCAACATG-3′（SEQ ID NO. 4）；
CSP-R：5′- CAGCCGTATTGGCGCACAATTT-3′（SEQ ID NO. 5）。
以提取的总RNA为模板，利用cDNA第一链合成试剂盒（cDNA Synthesis Kit，TAKARA）合成cDNA第一链。以合成的cDNA为模板PCR扩增CSP基因全长cDNA序列。反应体系（50 μL）为cDNA 5 μL，10xPCR buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，rTaq DNA 聚合酶 0.5 μL， 正向引物 2 μL（10 pmol/ul），反向引物 2 μL（10 pmol/ul），超纯水31.5 μL。反应条件为：95℃预变性 4 min，95 ℃变性30 s，54℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（共35个循环），最后 72℃延伸10 min终止反应。
用1%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测（图1）、利用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收产物连接至pMD18-T载体中。连接体系为（10 μL）：1 μL T载体、1 μL T4 DNA连接酶、1 μL 10xT4连接酶Buffer、7μL回收产物。将配置好的连接体系放置16 ℃进行过夜连接后，用热激法转化至大肠杆菌TG1感受态细胞中，后经菌落PCR鉴定和测序分析，获得包含劳氏粘虫CSP基因（342 bp）的全长cDNA序列（如SEQ ID NO. 2所示）。
实施例二、劳氏粘虫CSP氨基酸序列及其同源性比对分析
利用NCBI ORF finder在线预测获得劳氏粘虫CSP基因编码的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，由107个氨基酸组成。
利用NCBI在线BLAST和 Clustalx软件对劳氏粘虫CSP基因编码的氨基酸序列进行同源性比对分析，结果如图2，劳氏粘虫CSP与NCBI上来自甜菜夜蛾Spodopteraexigua（AKT26485.1）的同源性最高，达98%，与来自草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda（UXY92029.1）的同源性为96%，与来自棉铃虫Helicoverpaarmigera（PZC83955.1）的同源性为95%，与来自双委夜蛾Athetisdissimilis（AND82447.1）和东方粘虫Mythimnaseparata（AWT22248.1）的同源性为93%。
实施例三、劳氏粘虫CSP蛋白的理化性质和结构预测
1. 劳氏粘虫CSP蛋白的理化性质
利用在线分析软件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）对劳氏粘虫CSP蛋白理化性质进行分析。结果表明，劳氏粘虫CSP的分子量为11976.12，理论等电点为9.49。利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0/）分析表明，劳氏粘虫CSP无跨膜序列。利用Signa IP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP-4.1/）进行信号肽预测结果表明，劳氏粘虫CSP蛋白的信号肽位于N端1-17位氨基酸（图2），剪切位点位于17-18位氨基酸之间，表明该蛋白为分泌蛋白。
2. 劳氏粘虫CSP蛋白的结构域及二级结构预测
利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在线分析预测劳氏粘虫CSP蛋白的结构域（motif）。结果表明，在劳氏粘虫CSP中共发现三种motif：分别为ACPQCSD (位置：22-28和72-78)、ZGPCDK（位置：33-38和51-56）和FMQRNIKW（位置：40-47和90-97）（图2）。
利用蛋白二级结构在线分析（https://www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html）和PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）对劳氏粘虫CSP进行二级结构预测。结果表明，劳氏粘虫CSP的二级结构含有6个α-螺旋和4个保守的半胱氨酸位点（图2、图3）。
3. 劳氏粘虫CSP蛋白的三级结构预测
利用Phyre2对劳氏粘虫CSP蛋白进行三级结构预测。结果显示，劳氏粘虫CSP蛋白三级结构包含6个a螺旋（图4），这些结构形成一个疏水性的口袋，可与内源和外源疏水化合物结合。
实施例四、劳氏粘虫CSP蛋白的***进化分析
利用Mega 5.0软件的最大似然法对劳氏粘虫CSP氨基酸序列构建***进化树（见图5）。结果表明，在6种昆虫的CSP氨基酸序列中，劳氏粘虫CSP与来自草地贪夜蛾和甜菜夜蛾的聚为一支，并且在该分支中来自劳氏粘虫的CSP又单独聚为一支，而来自棉铃虫、双尾夜蛾和东方粘虫的聚为另一支。
实施例五、劳氏粘虫CSP基因的RNAi分析
1. RNAi的引物合成：根据劳氏粘虫CSP基因全长cDNA序列SEQ ID NO.2。
利用e-RNAi在线设计dsRNA引物，并分别在上游和下游引物的5’端加上T7启动子序列taatacgactcactataggg，同时合成绿色荧光蛋白基因GFP引物dsGFP-F和dsGFP-R。
dsRNA-F: taatacgactcactatagggTTAAGTGTGATGTGCGTGGG（SEQ ID NO:6）；
dsRNA-R: taatacgactcactatagggGGGTAGTTTCGCTGGACAAA（SEQ ID NO:7）；
dsGFP-F：taatacgactcactatagggAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC；
dsGFP-R：taatacgactcactatagggAGATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGT。
2. dsRNA的合成：以实施例一中获得的cDNA为模板，以dsRNA-F和dsRNA-R为引物，采用P1700 T7 RiboMAXTMExpress RNAi体外转录试剂盒合成dsRNA，具体步骤按照说明书操作，并根据实际情况进行微调。反应体系（50 μL）：RiboMAXTM Express T7 2 x Buffer 25μl，双链DNA模板 1 μg，Enzyme Mix T7 Express 5 μL，加Nuclease-FreeWater补齐至50 μL。反应步骤为：37℃水浴过夜，70℃水浴10 min，放至室温自然冷却后加入DNase 1 ul和稀释200倍的RNase 1 μL，然后37℃ 水浴30 min，加入0.1倍体积3 mol/L的NaAc和1倍体积的异丙醇，混匀后置于冰上5 min，可见白色絮状沉淀，4℃，12 000 r/min离心30 min，弃上清液，加预冷的75%乙醇500 μL，4℃/12 000 r/min离心10 min，弃上清液，干燥5 min后加50～100 μL 无RNA酶污染的水溶液。使用TranscriptionClean-Up试剂盒纯化dsRNA，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。纯化后的dsRNA 用NanoDrop one超微量紫外分光光度计检测其浓度。
3. RNAi试验
幼虫的饲喂：剪取新鲜玉米叶片，随后浸泡在含有30 μg/mlCSPdsRNA的水溶液中，10 s后取出室温晾30 min左右，待水分蒸发后饲喂提前饥饿处理12 h的2龄劳氏粘虫幼虫10头，并放于人工气候箱（温度25+1℃，相对湿度70+5%，光照4000 lux，光周期为L14：D10）中饲养。每隔24 h观察幼虫状态；并于24 h和48 h随机取2头用于CSP基因表达量的检测，以饲喂含有dsGFP的水溶液（dsGFP终浓度为30ug/ml）（阴性对照）和ddH2O（空白对照）的劳氏粘虫幼虫为对照，各处理均设置4个生物学重复。
4. 基因表达量分析
参照实施例一中步骤1提取劳氏粘虫总RNA用于检测CSP基因的表达量。 Real-time PCR中CSP基因定量分析的特异性引物为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，内参基因EF-1α引物为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。
rCSP-F: TCCACGATGCAGCGACACATC（SEQ ID NO.8）；
rCSP-R: CCCGCAGTGTTCGATGCAAGAA（SEQ ID NO.9）；
EF-1α-F：TTGACGATAGAAGCGTCACCGG（SEQ ID NO.10）；
EF-1α-R：GCAGAGATTTGACCAGGGTGG（SEQ ID NO.11）。
荧光定量PCR反应体系为：10 μL SYBR Green Master Mix，0.5 μmol/L上/下游引物，0.5 μL cDNA，用ddH2O补足至20 μL。荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性 5 min，95℃变性 15s，54℃退火20 s，72℃延伸25 s，40个循环。每个样品进行4个生物学重复，用无模板的ddH2O做阴性对照。
通过2-△△Ct方法计算基因的相对表达量，以最低表达量为1，用Excel 2010对数据进行处理。结果如图6所示，结果表明饲喂dsCSP可以显著降低劳氏粘虫CSP基因的表达水平。
实施例六、dsCSP基因对氯虫苯甲酰胺的增效作用
氯虫苯甲酰胺原药用丙酮配制成浓度为20 mg/L的药液，CSPdsRNA水溶液浓度为30 μg/ml。在CSPdsRNA水溶液中加入氯虫苯甲酰胺药液，使其终浓度为2 mg/L。取新鲜玉米叶在含有氯虫苯甲酰胺+CSPdsRNA的溶液中浸10 s后取出，室内静置晾30 min后，饲喂饥饿12 h的发育一致的2龄劳氏粘虫幼虫20头，并放于人工气候箱（温度25+1℃，相对湿度70+5%，光照4000 lux，光周期为L14：D10）中饲养。每隔24 h观察幼虫状态，记录生长发育情况，统计幼虫死亡率。以饲喂终浓度为2 mg/L氯虫苯甲酰胺药液（阳性对照）和ddH2O（空白对照）的劳氏粘虫幼虫为对照，各处理均设置4个生物学重复。利用Excel 2010进行数据分析和作图。结果如图7。结果表明，与单独饲喂氯虫苯甲酰胺相比，饲喂CSPdsRNA+氯虫苯甲酰胺24 h和48 h可分别提高劳氏粘虫死亡率13.35%和35.00%，说明CSPdsRNA对氯虫苯甲酰胺具有明显的增效作用，可提高其对劳氏粘虫的致死率。
上面结合附图和实施例对本申请作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本申请发明构思的前提下，所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
Claims (9)
1.一种劳氏粘虫化学感受蛋白CSP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种劳氏粘虫CSP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.抑制权利要求2所述劳氏粘虫CSP基因表达的dsRNA。
4.根据权利要求3所述的dsRNA，其特征在于，其模板DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.含有权利要求1所述劳氏粘虫CSP基因的重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒。
6.权利要求1所述劳氏粘虫化学感受蛋白CSP、权利要求2所述劳氏粘虫CSP基因、权利要求3所述dsRNA或权利要求5所述重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒在如下（1）～（3）中至少一项的应用：
（1）防治劳氏粘虫或制备防治劳氏粘虫的产品；
（2）提高劳氏粘虫对农药的敏感性或制备提高劳氏粘虫对农药的敏感性的产品；
（3）抑制劳氏粘虫CSP基因表达或制备抑制劳氏粘虫CSP基因表达的产品。
7.含有如下活性成分中的至少一种的产品：
A、权利要求3所述dsRNA；
B、重组表达载体、超表达载体、干扰载体、重组病毒、转基因细胞系、重组菌或重组基因表达盒；
所述产品具有如下功能中的至少一种：
①防治劳氏粘虫；
②提高劳氏粘虫对农药的敏感性；
③抑制劳氏粘虫CSP基因的表达。
8.一种防治劳氏粘虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）基于权利要求2所述基因序列设计合成劳氏粘虫CSP基因特异的dsRNA；
（2）使劳氏粘虫摄入所述dsRNA，以提高劳氏粘虫对配合施用的农药的敏感性进而降低其存活率。
9.根据权利要求6所述的应用、权利要求7所述的产品或权利要求8所述的方法，其特征在于，所述农药为双酰胺类药剂中的至少一种。
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