CN116715763B - Mouse IL-6兔单克隆抗体对及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供Mouse IL‑6兔单克隆抗体对及其制备方法和应用，属于生物检测技术领域。本发明提供Mouse IL‑6兔单克隆抗体对12E1和2G9，开发出特异性针对Mouse IL‑6的双抗夹心法酶联免疫检测方法。本发明兔单克隆抗体对12E1和2G9可特异性结合鼠IL‑6蛋白，其中捕获抗体为兔单克隆抗体12E1，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体2G9，用于检测MouseIL‑6时具有特异性好、热稳定性好、检测灵敏度高等优点。

Description

Mouse IL-6兔单克隆抗体对及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种Mouse IL-6兔单克隆抗体对及其制备方法和应用。
背景技术
白介素6(Interleukin-6，IL-6)，属于白细胞介素家族，是一种细胞因子，主要在纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及多种肿瘤细胞中产生。IL-6在免疫反应、造血、炎症以及应激反应中具有重要作用。
Mouse IL-6是应激反应中的有效诱导因子，在感染和组织损伤过程中，mouse IL-6的快速产生有助于宿主防御，但过量的mouse IL-6合成参与了疾病的病理过程。此外，mouse IL-6在CD4+T细胞亚群分化中起重要作用。Mouse IL-6与IL-6Rα结合，并且通过这种结合IL-6可诱导gp130同型二聚化，导致触发Jak/Stat级联和SHP-2/ErkMAP激酶级联。
临床上，IL-6在血液中的含量与身体发生的炎症、自身免疫症以及病毒细菌感染等疾病息息相关。一般而言，正常健康成人血液内IL-6的含量低于7pg/mL；当IL-6的含量为7～150pg/mL时，则表明存在轻微炎症或感染症状；当IL-6的含量为150～250pg/mL时，则表明存在全身性炎症或一般感染症状；当IL-6的含量>250pg/mL时，则表明可能为脓毒症。IL-6在正常人体血清中含量极低，因此研究具有高灵敏度的IL-6检测方法具有重要意义。
目前，已有专利公开了关于IL-6的抗体开发，采用的免疫原主要是人源或犬源的IL-6重组蛋白，但是并无鼠源重组蛋白开发的兔单克隆抗体；且大部分现有公开的单单克隆抗体对或多单克隆抗体与单单克隆抗体的结合检测的特异性偏低。
发明内容
基于此，有必要提供新的Mouse IL-6兔单克隆抗体对及其制备方法和应用。本发明提供的Mouse IL-6兔单克隆抗体对可以用来建立特异性好、热稳定性好以及高灵敏度的Mouse IL-6的酶联免疫检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种Mouse IL-6兔单克隆抗体对，所述兔单克隆抗体对为兔单克隆抗体12E1和2G9。
其中，所述兔单克隆抗体12E1的轻链全长、重链全长、轻链可变区、重链可变区、轻链以及重链互补决定区的蛋白序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15以及SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示。
所述兔单克隆抗体2G9的轻链全长、重链全长、轻链可变区、重链可变区、轻链以及重链互补决定区的蛋白序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25以及SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQID NO.28所示。
本发明还可以提供上述Mouse IL-6兔单克隆抗体对在制备检测Mouse IL-6的试剂或者试剂盒中的应用。所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测Mouse IL-6，其中所述兔单克隆抗体12E1作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体2G9作为标记抗体。
本发明还可以提供一种检测Mouse IL-6的试剂或者试剂盒，包含兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9。所述Mouse IL-6选自重组Mouse IL-6、细胞分泌的Mouse IL-6中的至少一种。
本发明还提供上述Mouse IL-6兔单克隆抗体对的制备方法，包括如下步骤：将上述Mouse IL-6兔单克隆抗体对的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293F细胞；培养获得包含Mouse IL-6兔单克隆抗体对的上清液；纯化，即得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供Mouse IL-6蛋白兔单克隆抗体对：12E1和2G9，并依据该抗体对建立双抗夹心法酶联免疫检测Mouse IL-6的方法，所建立的方法用于Mouse IL-6蛋白的检测，具有高特异性、高灵敏度和稳定性。
附图说明
图1为实施例1重组Mouse白介素IL-6蛋白免疫兔子后血清滴度(Serum dilution)检测图。
图2为实施例1构建含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体示意图。
图3为实施例1构建含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体示意图。
图4为实施例1兔单抗抗体对中12E1的K assay数据图。
图5为实施例1兔单抗抗体对中2G9的K assay数据图。
图6为实施例1兔单克隆抗体12E1和2G9的EP assay数据图
图7为实施例1兔单克隆抗体12E1和2G9的VL序列比对图。
图8为实施例1兔单克隆抗体12E1和2G9的VH序列比对图。
图9为实施例2基于兔单克隆抗体12E1和2G9建立夹心ELISA的标准曲线图。
图10为实施例3基于兔单克隆抗体12E1和2G9的夹心ELISA的交叉蛋白识别数据图。
图11为实施例3基于兔单克隆抗体12E1和2G9的热稳定性测试结果统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
部分术语说明：“双抗体夹心酶联免疫检测法”、“双抗夹心酶联免疫法”、“双抗夹心酶联免疫检测方法”、“双抗夹心酶联免疫检测”表示同一概念，可以互换使用。“小鼠白介素IL-6”、“小鼠白介素IL-6蛋白”、“重组小鼠白介素IL-6蛋白”、“Mouse IL-6”表示同一概念，可以互换使用。
实施例1
本实施例提供抗小鼠白介素IL-6的单克隆抗体对的制备方法具体包括以下步骤：
1.1、免疫原制备：
采用的免疫原为小鼠重组Mouse IL-6蛋白(Abclonal市售)：使用Mouse IL-6NP_112445.1(Uniprot ID：P08505)蛋白序列对应NM_031168.2构建至pYURK-Chis载体，在CHO细胞中表达出具有生物活性的高质量重组鼠IL-6成熟蛋白。
1.2、动物免疫：以重组MouseIL-6蛋白为免疫原，免疫4只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对MouseIL-6的滴度，取血清按1:243K稀释后用ELISA测滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，血清滴度检测图见图1，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
1.3、分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30～40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的***、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
1.4、B淋巴细胞分选：采用中国专利CN110016462B(专利名称：从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法)说明书中第[0030]～[0044]段的方法。
1.5、编码兔单克隆抗体基因的克隆
培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
其中，PCR反应体系如下：4μLcDNA，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，12.5μL2×GloriaHiFi，6.5μL H2O。2×GloriaHiFi试剂由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供。
其中，轻链可变区引物对为：
VL-Primer-F：
5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'(SEQ ID NO:1)；
VL-Primer-R：
5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'(SEQ ID NO:2)；
重链可变区引物对为：
VH-Primer-F：
5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'(SEQ ID NO:3)；
VH-Primer-R：
5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'(SEQ ID NO:4)。
PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
1.6、单克隆抗体制备和纯化
1.6.1、为了获得多株识别MouseIL-6蛋白的兔单克隆抗体，将步骤1.5中挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图2和图3。图2和图3中，pBR322origin和f1origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40PA terminator是加尾信号，图2中Heavy chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列，图3中Light chain constant为兔单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列。
1.6.2、将含兔单克隆抗体重链恒定区(图2)和轻链恒定区(图3)的哺乳动物细胞表达载体分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理。
1.6.3、将步骤1.4中扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链可变区基因和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中；经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染72～96h获得培养上清中含有重组的识别鼠白介素IL-6的兔单克隆抗体。
使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别MouseIL-6的兔单克隆抗体，使用12％ SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
1.7、单克隆抗体筛选及鉴定
获得多株MouseIL-6兔单克隆抗体后，首先对兔单克隆抗体进行初步鉴定和筛选，包括抗体亲和力的鉴定及抗原识别表位的鉴定，具体方法如下：
1.7.1、单克隆抗体的筛选：
使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体的亲和力进行初步测定。其中使用到的材料为重组Mouse IL-6蛋白，使用浓度为150nM、75nM，兔单克隆抗体的浓度为2μg/mL；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择亲和常数≤1×10-9的抗体。
1.7.2、抗原识别表位的鉴定：
使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇。
其中使用到的材料为重组Mouse IL-6蛋白，使用浓度为5μg/mL，第一兔单克隆抗体的浓度为2μg/mL，第二兔单克隆抗体的浓度为5μg/mL。
通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位决定簇的两个抗体，分别命名为兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9。12E1单克隆抗体和2G9单克隆抗体的亲和力常数如下表：
12E1单抗和2G9单抗亲和力常数(Kassay)
Koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M)
12E1 1.85×10-6 5.63×106 3.29×10-13
2G9 2.72×10-5 4.59×106 5.93×10-12
对兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9的亲和力进行测定，测定结果见上表、图4及图5，结果显示：兔单克隆抗体12E1与重组Mouse IL-6的解离系数、结合系数以及结合常数分别为1.85×10-6、5.63×106、3.29×10-13；兔单克隆抗体2G9与重组Mouse IL-6的解离系数、结合系数以及结合常数分别为2.72×10-5、4.59×106、5.93×10-12，表明兔单克隆抗体12E1、2G9分别与重组Mouse IL-6具有高亲和力。
且与CN 112175080 B公开的人源IL-6A B兔单抗亲和力常数(见下表)相比，兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9与专利文献更具亲和力，尤其是兔单克隆抗体12E1比对应A及B的亲和力高约10-1000倍。
CN 112175080 B兔单克隆抗体A与B亲和力常数(Kassay)
Koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M)
A 3.28×10-4 4.19×105 7.80×10-10
B 1.34×10-5 3.57×106 3.75×10-12
兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9的抗原决定簇测定结果见图6。从图6中可以看出，兔单克隆抗体12E1和2G9分别识别的是不同的Mouse IL-6的抗原表位，因此二者可用于ELISA配对。
对筛选出的兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9分别进行核苷酸测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
其中，兔单克隆抗体12E1的轻链全长的核苷酸序列：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTCCTGCTCTGGCTGCCCGGAGCCAGGTGCGATATAGTCCTCACGCAAACTCCGGCGTCTGTCAGCGCAGCCGTCGGTGGCACTGTTACGATAAAATGTCAGGCCTCAGAAGACATCTATTCAAATCTCGCATGGTATCAACAAAAACCCGGACAGCCTCCGAAGCTGCTCATTTACGGGGCCTCAACAATGGCTTCAGGCGTCAGCTCAAGATTCAAAGGTAGTGGGTCAGGCACGGAATTCAACCTGATTATCAGTGACTTGGAGTGCGCTGACGCCACGACGTATTACTGTCAGGGGACAATCTATTTTTCCGGGGAGAATACCTTTGGCGGGGGTACAAAGGTTGTTGTTGAGGGAGACCCTGTGGCCCCTACGGTGCTCATATTTCCCCCGGCGGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ ID NO:5)。
兔单克隆抗体12E1的轻链可变区的核苷酸序列：
GGGCTCCTCCTGCTCTGGCTGCCCGGAGCCAGGTGCGATATAGTCCTCACGCAAACTCCGGCGTCTGTCAGCGCAGCCGTCGGTGGCACTGTTACGATAAAATGTCAGGCCTCAGAAGACATCTATTCAAATCTCGCATGGTATCAACAAAAACCCGGACAGCCTCCGAAGCTGCTCATTTACGGGGCCTCAACAATGGCTTCAGGCGTCAGCTCAAGATTCAAAGGTAGTGGGTCAGGCACGGAATTCAACCTGATTATCAGTGACTTGGAGTGCGCTGACGCCACGACGTATTACTGTCAGGGGACAATCTATTTTTCCGGGGAGAATACCTTTGGCGGGGGTACAAAGGTTGTTGTTGAGGGAGACCCTGTGGCCCCTACGGTGCTCATATTTCCCCCGGCG(SEQ ID NO:6)。
兔单克隆抗体2G9的重链全长的核苷酸序列：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTTGCCGTGCTGAAGGGAGTGCAGTGCCAAAGTCTGGAAGAATCAGGCGGGCGCTTGGTCACGCCGGGCACTCCCCTGACCCTGACTTGCACAGTGTCCGGTTTCTCTCTCTCTCGCTACTGGATGTCTTGGGTTCGCCAGGCACCTGGTAAAGGACTGGAATGGATAGGCTATATATACGGAGGTAGTGGTACAACTTGGTTTGCGAGCTGGGCGAAGGGAAGATTTACTATCTCAAAGACCTCTACGACTGTCGATTTGAAAATCACCAGCCCGACTACGGAGGACACCGCAACATACTTTTGCGCACGCGACTATGTCGATTATGATTCTGATATTGGATTTTACAACCTGTGGGGACCGGGAACTTTGGTGACTGTCAGCAGCGGACAACCGAAAGCACCCAGTGTTTTTCCTTTGGCTCCCTGTTGCGGAGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA(SEQ ID NO:7)。
兔单克隆抗体2G9的重链可变区的核苷酸序列：
GTTGCCGTGCTGAAGGGAGTGCAGTGCCAAAGTCTGGAAGAATCAGGCGGGCGCTTGGTCACGCCGGGCACTCCCCTGACCCTGACTTGCACAGTGTCCGGTTTCTCTCTCTCTCGCTACTGGATGTCTTGGGTTCGCCAGGCACCTGGTAAAGGACTGGAATGGATAGGCTATATATACGGAGGTAGTGGTACAACTTGGTTTGCGAGCTGGGCGAAGGGAAGATTTACTATCTCAAAGACCTCTACGACTGTCGATTTGAAAATCACCAGCCCGACTACGGAGGACACCGCAACATACTTTTGCGCACGCGACTATGTCGATTATGATTCTGATATTGGATTTTACAACCTGTGGGGACCGGGAACTTTGGTGACTGTCAGCAGCGGACAACCGAAAGCACCCAGTGTTTTTCCTTTGGCTCCCTGTTGCGGAGACACA(SEQIDNO:8)。
其中，兔单克隆抗体的氨基酸序列分别为：
兔单克隆抗体12E1轻链全长序列：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDIVLTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASEDIYSNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTMASGVSSRFKGSGSGTEFNLIISDLECADATTYYCQGTIYFSGENTFGGGTKVVVEGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:9)。
兔单克隆抗体12E1重链全长序列：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEWIGYIDTESGGTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGGDSPFYPYTAWGNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:10)。
兔单克隆抗体12E1轻链可变区序列：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDIVLTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASEDIYSNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTMASGVSSRFKGSGSGTEFNLIISDLECADATTYYCQGTIYFSGENTFGGGTKVVVE(SEQ ID NO:11)。
兔单克隆抗体12E1重链可变区序列：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEWIGYIDTESGGTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGGDSPFYPYTAWGNLWGPGTLVTVSS(SEQID NO:12)。
兔单克隆抗体12E1的轻链可变区的互补决定区VL-12E1-CDR1的氨基酸序列：EDIYSNLAW(SEQ ID NO:13)。
兔单克隆抗体12E1的轻链可变区的互补决定区VL-12E1-CDR2的氨基酸序列：LIYGASTMASGV(SEQ ID NO:14)。
兔单克隆抗体12E1的轻链可变区的互补决定区VL-12E1-CDR3的氨基酸序列：QGTIYFSGENTF(SEQ ID NO:15)。
兔单克隆抗体12E1的重链可变区的互补决定区VL-12E1-CDR1的氨基酸序列：FSLSSYAMI(SEQ ID NO:16)。
兔单克隆抗体12E1的重链可变区的互补决定区VL-12E1-CDR2的氨基酸序列：WIGYIDTESGGTYYATWAK(SEQ ID NO:17)。
兔单克隆抗体12E1的重链可变区的互补决定区VL-12E1-CDR3的氨基酸序列：YFCARGGDSPFYPYTAWGNL(SEQ ID NO:18)。
兔单克隆抗体2G9轻链全长序列：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPDSVEVAVGGTVTINCQASQSINNQLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQTGSSGNVDNPFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:19)。
兔单克隆抗体2G9重链全长序列：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGYIYGGSGTTWFASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDYVDYDSDIGFYNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:20)。
兔单克隆抗体2G9轻链可变区序列：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPDSVEVAVGGTVTINCQASQSINNQLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQTGSSGNVDNPFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:21)。
兔单克隆抗体2G9重链可变区序列：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGYIYGGSGTTWFASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDYVDYDSDIGFYNLWGPGTLVTVSS(SEQID NO:22)。
兔单克隆抗体2G9的轻链可变区的互补决定区VL-2G9-CDR1的氨基酸序列：QSINNQLSW(SEQ ID NO:23)。
兔单克隆抗体2G9的轻链可变区的互补决定区VL-2G9-CDR2的氨基酸序列：LIYKASTLASGV(SEQ ID NO:24)。
兔单克隆抗体2G9的轻链可变区的互补决定区VL-2G9-CDR3的氨基酸序列：QQTGSSGNVDNPF(SEQ ID NO:25)。
兔单克隆抗体2G9的重链可变区的互补决定区VL-2G9-CDR1的氨基酸序列：FSLSRYWMS(SEQ ID NO:26)。
兔单克隆抗体2G9的重链可变区的互补决定区VL-2G9-CDR2的氨基酸序列：WIGYIYGGSGTTWFASWAK(SEQ ID NO:27)。
兔单克隆抗体2G9的重链可变区的互补决定区VL-2G9-CDR3的氨基酸序列：YFCARDYVDYDSDIGFYNL(SEQ ID NO:28)。
序列测序比对结果见图7和图8：兔单克隆抗体12E1以及兔单克隆抗体2G9的轻链可变区VL以及重链可变区VH序列一致性分别为75％以及82％。
实施例2
本实施例针对Mouse IL-6蛋白的兔单克隆抗体12E1和2G9，建立双抗夹心法酶联免疫检测方法，包括如下步骤：
2.1包被：将兔单克隆抗体12E1(实施例1制备)用1×PBS稀释成2μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。
2.2洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.3封闭：将E013封闭液(在烧杯中加入90mL配置好的PBS试剂，分别加入5g Skimmilk、1g BSA和0.05mL Tween-20充分混匀，补充ddH2O至总体积100mL，室温或4℃存放使用，现配现用)以200μL/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h，取出备用。
2.4加蛋白：将标准样品(重组Mouse IL-6蛋白，义翘，50136-MNAE_LC13DE1604)、待测样品用稀释液(pH7.2的PBS缓冲液)进行稀释，稀释浓度为：100、50、25、12.5、6.25、1.56、0pg/mL，然后以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。
2.5洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.6兔单克隆抗体2G9-biotin制备：
2.6.1、将抗Mouse IL-6兔单克隆抗体2G9配成1mg/mL的溶液，用DMSO(二甲基亚砜)将NHS-LC-biotin(N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液。
2.6.2、取200μL 1mg/mL的抗Mouse IL-6兔单克隆抗体2G9溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30min后，加入50μL500mM pH＝9.0的Tris-HCl溶液终止反应。
2.6.3、最后加入4mL pH＝7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30kDa的离心柱离心，以除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。
加检测抗体：将兔单克隆抗体2G9-biotin稀释成0.1μg/mL后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。
2.7洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.8加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100×稀释后，以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。
2.9洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.10加TMB显色液：将TMB显色液以100μL/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。
2.11孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm下进行读数。
依据检测结果绘制的标准曲线见图9。结果显示，抗体对特异性识别Mouse IL-6，且灵敏度可低至1.56pg/mL。
实施例3
本实施例对抗鼠白介素IL-6的兔单克隆抗体12E1和2G9进行性能检测。具体方法如下：
3.1、对兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9进行特异性检测：
分别用3种与鼠IL-6蛋白相近的白介素蛋白对抗鼠白介素IL-6蛋白的兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9的特异性进行检测，采用实施例2中的双抗夹心法酶联免疫检测方法，每种标准品蛋白的浓度均为100pg/mL。3种白介素蛋白分别为小鼠白介素IL-1(MouseIL-1)、人白介素IL-6(Human IL-6)、小鼠白介素IL-11(Mouse IL-11)。
检测结果如图10所示，从图10中可以看出，使用本发明制备的兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9对不同白介素蛋白进行双抗夹心酶联免疫检测时，兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9只与鼠白介素IL-6结合，不与其他白介素产生任何交叉反应；说明本发明制备的兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9对鼠白介素IL-6具有高度的特异性。
3.2、对兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9热稳定性进行测试：
3.2.1.包被：将兔单克隆抗体12E1用1×PBS稀释成1μg/ml，涡旋仪混匀后，以100μl/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。
3.2.2.洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
3.2.3.封闭：将E013封闭液(在烧杯中加入90mL配置好的PBS试剂，分别加入5gSkim milk、1g BSA和0.05mL Tween-20充分混匀，补充dH2O至总体积100mL)以200μl/well加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h。
3.2.4.热破坏：将包被好的酶标板、冻干蛋白、100×浓缩的检测抗体分成三份，分别置于-20℃、4℃、37℃密封保存，7天后取出测试。
3.2.5.加蛋白：将不同条件下保存的Mouse IL-6蛋白用稀释液溶解，然后进行稀释，稀释浓度：100,50,25,12.5,6.25,3.12,1.56,0pg/mL，然后以100μl/well依次加入对应温度下保存的酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。
3.2.6.洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
3.2.7.加检测抗体：将不同条件下保存的2G9-biotin进行100×稀释后，以100μl/well依次加入对应温度下保存的酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。
8.洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
9.加SA-HRP：将100×SA-HRP浓缩液进行100×稀释后，以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。
10.洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μl，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
11.加TMB显色液：将TMB显色液以100μl/well依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。
12.孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μl终止液，立即用酶标仪在450nm下进行读数。
统计结果见图11中，兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9经-20℃处理后，测定鼠白介素IL-6浓度的结果使用Logistic曲线四参数建立的标准曲线方程为：
Y2＝0.100+4.98X2 1.205/(X2 1.205+297.82)(R2＝0.9966)，
Y2为-20℃下吸光度值的校正值(Y2＝OD450nm-OD630nm),X2为Mouse IL-6的浓度。
经4℃处理后建立的标准曲线方程为
Y3＝0.097+9.69X2 1.068/(X21.068+389.62)(R2＝0.9993)，
Y3为4℃下吸光度值的校正值(Y3＝OD450nm-OD630nm),X2为Mouse IL-6的浓度；
经37℃处理后建立的标准曲线方程为
Y4＝0.092+75.65X2 0.960/(X2 0.960+2591.89)(R2＝0.9984)，
Y4为37℃下吸光度值的校正值(Y4＝OD450nm-OD630nm)；X2为Mouse IL-6的浓度。
通过数据计算，可以发现分别经过-20℃、4℃、37℃-处理的兔单克隆抗体12E1和2G9检测Mouse IL-6蛋白浓度的变异系数小于10％(见图11)，说明本发明制备的抗抗MouseIL-6兔单克隆抗体12E1和2G9的热稳定性较强。
另外，值得说明的是，发明人团队还将本发明制备的兔单克隆抗体12E1和2G9与现有技术公开的部分抗白介素-6抗体进行比较，发现：
专利文献CN112175080B公开了抗人白介素-6高亲和力兔单克隆抗体及应用，其利用兔单克隆抗体A和B的氨基酸序列并开发了酶联免疫检测方法，但是该兔单克隆抗体A和B与Mouse IL-6结合表位单一。
专利文献CN112279913B公开了一种抗人IL-6单克隆抗体及应用，其中的单克隆抗体A、B的KD(M)分别为7.8×10-10以及3.75×10-12。而本发明采用兔单克隆抗体12E1和2G9的K assay测试中KD(M)，12E1为3.29×10-13，2G9为5.93×10-12，特异性更高。
同时，本发明中采用的是小鼠IL-6重组蛋白作为免疫原开发抗体，与上述专利文献中人IL-6以及犬IL-6重组蛋白在抗原序列上存在差异，最终优化筛选的鼠白介素IL-6兔单克隆抗体12E1和2G9的特异性更优异。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Mouse IL-6兔单克隆抗体对，其特征在于，所述Mouse IL-6兔单克隆抗体对由兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9组成；
所述兔单克隆抗体12E1的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15以及SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示；
所述兔单克隆抗体2G9的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25以及SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28所示。
2.根据权利要求1所述的Mouse IL-6兔单克隆抗体对，其特征在于，所述兔单克隆抗体12E1的轻链可变区的序列如SEQ ID NO:11所示；和/或
所述兔单克隆抗体12E1的重链可变区的序列如SEQ ID NO:12所示。
3.根据权利要求2所述的Mouse IL-6兔单克隆抗体对，其特征在于，所述兔单克隆抗体12E1的轻链全长序列如SEQ ID NO:9所示；和/或所述兔单克隆抗体12E1的重链全长序列如SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求1至3任一项所述的Mouse IL-6兔单克隆抗体对，其特征在于，所述兔单克隆抗体2G9的轻链可变区的序列如SEQ ID NO:21所示；和/或所述兔单克隆抗体2G9的重链可变区的序列如SEQ ID NO:22所示。
5.根据权利要求4所述的Mouse IL-6兔单克隆抗体对，其特征在于，所述兔单克隆抗体2G9的轻链全长序列如SEQ ID NO:19所示；和/或所述兔单克隆抗体2G9的重链全长序列如SEQ ID NO:20所示。
6.如权利要求1至5任一项所述的Mouse IL-6兔单克隆抗体对在制备检测 Mouse IL-6的试剂或者试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测Mouse IL-6，其中所述兔单克隆抗体12E1作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体2G9作为标记抗体。
8.一种检测Mouse IL-6的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至5任一项所述的兔单克隆抗体12E1和兔单克隆抗体2G9。
9.根据权利要求8所述检测 Mouse IL-6的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述 MouseIL-6选自重组Mouse IL-6、细胞分泌的 Mouse IL-6中的至少一种。
10.一种权利要求1至5任一项所述的Mouse IL-6兔单克隆抗体对的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1至5任一项所述的Mouse IL-6兔单克隆抗体对的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293F细胞；
培养获得包含Mouse IL-6兔单克隆抗体对的上清液；
纯化，即得。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101754772A (zh) * 2007-05-21 2010-06-23 奥尔德生物制药公司 针对il-6的抗体及其用途
CN111867627A (zh) * 2018-01-04 2020-10-30 维塔里斯股份有限公司 抗IL-6抗体例如克拉扎珠单抗(Clazakizumab)用于使实体器官移植接受者脱敏和/或用于预防、稳定或减轻抗体介导的排斥(ABMR)的用途
CN112175080A (zh) * 2020-10-22 2021-01-05 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗人白介素-6高亲和力兔单克隆抗体及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101754772A (zh) * 2007-05-21 2010-06-23 奥尔德生物制药公司 针对il-6的抗体及其用途
CN111867627A (zh) * 2018-01-04 2020-10-30 维塔里斯股份有限公司 抗IL-6抗体例如克拉扎珠单抗(Clazakizumab)用于使实体器官移植接受者脱敏和/或用于预防、稳定或减轻抗体介导的排斥(ABMR)的用途
CN112175080A (zh) * 2020-10-22 2021-01-05 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗人白介素-6高亲和力兔单克隆抗体及应用

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