CN116676289A - 卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来自卵菌的液泡型ATPase亚基a蛋白VHA‑a及其编码基因与应用。本发明含有液泡型ATPase亚基a蛋白具有SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，其编码基因具有SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本发明VHA‑a蛋白在卵菌中纯合敲除致死，表明该蛋白具有重要生物学功能。本发明提供的蛋白在控制卵菌病害中具有很高的应用价值，以该蛋白为作用靶标，开发的杀菌剂对控制卵菌的发生和流行具有重要的实践意义。

Description

卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种病原卵菌质子泵蛋白及其编码基因与应用，特别涉及来自卵菌中液泡型ATPase亚基a蛋白VHA-a其编码基因与应用。
背景技术
卵菌是一类真核生物，包括辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、荔枝霜疫霉(Phytophthoralitchii)、终极腐霉(Pythiumultimum)等植物病原卵菌，寄主范围广泛，可以侵染大多数的双子叶植物。大豆疫霉对大豆造成严重危害，可以引起大豆的种腐、苗枯、根腐以及茎基腐。荔枝霜疫霉可造成荔枝大量的烂果、落果，春雨、梅雨季较长的年份，烂果率达30-50％，严重影响产量和品质以及鲜果的贮运。终极腐霉可侵染苹果、草莓、柑橘、西瓜、甘蔗、番茄等150余种经济植物，引起苗枯，猝倒、根腐、脚腐、枯萎等多种病害。卵菌病害给农业和自然生态***造成严重破坏。
液泡型ATPase蛋白是一个依赖于ATP的质子泵，可以将细胞质H+泵入细胞内室。液泡型ATPase蛋白广泛分布在真核细胞的细胞膜***中，包括各种细胞的内体、溶酶体、高尔基体小泡、分泌小泡和细胞膜。液泡型ATPase亚基a蛋白是V-ATPase的一个重要亚基，该蛋白在卵菌和大部分真菌中只有一个拷贝。因此，通过抑制卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白，进而抑制各个阶段的卵菌的生长，可以达到控制辣椒疫病的目的。
发明内容
基于此，通过发明人的研究发现，包括大豆疫霉、辣椒疫霉、荔枝霜疫霉、终极腐霉等卵菌中液泡型ATPase亚基a蛋白纯合敲除致死，该亚基是卵菌正常生长必不可少的亚基。对卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白杂合转化子进行生物学表型测定，除孢子囊和游动孢子个数显著高于亲本菌株外，其他无显著变化，表明亚基a蛋白杂合敲除对表型影响较小。因此可通过调控液泡型ATPase亚基a蛋白来抑制卵菌的正常生长，从而控制卵菌病害的发生发生发展。
因此，本发明的目的之一是提供一类卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白，分别来源于大豆疫霉、辣椒疫霉、荔枝霜疫霉和终极腐霉，命名为PcVHA-a、PsVHA-a、PlVHA-a、PyuVHA-a，分别来源于辣椒疫霉菌株BYA5、大豆疫霉P6497、荔枝霜疫霉Plyn3、终极腐霉Pyuyn7，是如下A1)或A2)或A3)或A4)
A1)氨基酸序列是如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白质；
A2)在如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。
上述A1)-A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。
其中，SEQ ID No.5所示蛋白PcVHA-a，其编码基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，来源于辣椒疫霉；SEQ ID No.6所示蛋白PsVHA-a，其编码基因为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，来源于大豆疫霉；SEQ ID No.7所示蛋白PlVHA-a，其编码基因为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，来源于荔枝霜疫霉；SEQ ID No.8所示蛋白PyuVHA-a，其编码基因为SEQID No.4所示的核苷酸序列，来源于终极腐霉。
本发明目的之二是提供编码所述VHA-a蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
其中，上述PcVHA-a的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述VHA-a的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述PcVHA-a、PsVHA-a、PlVHA-a、PyuVHA-a的cDNA分子或DNA分子。
上述编码基因，序列表中SEQ ID NO.1由2616个核苷酸组成，自序列1的5’端第1至第2616位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.5所示的蛋白质(PcVHA-a)；序列表中SEQ ID NO.2由2622个核苷酸组成，自序列2的5’端第1至第2622位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.6所示的蛋白质(PsVHA-a)；序列表中SEQ ID NO.3由2616个核苷酸组成，自序列3的5’端第1至第2616位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.7所示的蛋白质(PlVHA-a)；序列表中SEQ ID NO.4由2619个核苷酸组成，自序列1的5’端第1至第2619位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.8所示的蛋白质(PyuVHA-a)。
所述的RNA分子，是所述的编码基因转录得到的RNA分子；
优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA序列转录的RNA序列。如本发明的DNA序列在严格条件下与如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4所示DNA序列能够进行分子杂交且编码如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示VHA-a的DNA序列。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
本发明目的之三是提供以上所述核酸分子相关的生物材料，包括重组载体、表达盒、重组微生物或转基因植物细胞系。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体；所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。具体的可为如下为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有所述编码基因的表达盒；
D2)含有所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制所述编码基因表达的核酸分子；
D8)含有D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制上述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)产生D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
本发明目的之四是提供一种筛选或辅助筛选卵菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述卵菌，当所述待检测物能够抑制如上任意一种DNA序列或两种DNA序列任意组合的转录，或抑制如上任意一种RNA序列或两种RNA序列任意组合的翻译，或抑制和/或失活如上所示的任意一种VHA-a蛋白的活性，则所述待测物质为卵菌抑菌和/或杀菌剂。
所述卵菌优选为辣椒疫霉、大豆疫霉、荔枝霜疫霉和终极腐霉中的一种或几种。
本发明目的之五是提供所述序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8示的VHA-a蛋白、述序列表中序列1所示的编码基因在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选卵菌抑菌或杀菌剂中的应用。所述卵菌优选为辣椒疫霉、大豆疫霉、荔枝霜疫霉、终极腐霉和终极腐霉中的一种或几种。本发明目的之六是提供一种筛选或辅助筛选卵菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述卵菌，当所述待检测物能够抑制如上DNA序列的转录，或抑制如上RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示的VHA-a蛋白，则所述待测物质为候选的卵菌抑菌和/或杀菌剂；其中，所述卵菌优选为辣椒疫霉、大豆疫霉、荔枝霜疫霉和终极腐霉中的一种或几种。
本发明目的之七是提供一种降低卵菌的活性或者使其灭活的方法，包括下述步骤：抑制所述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制所述的RNA分子中的翻译，或抑制所述的PcVHA-a蛋白的活性或使其灭活；
所述降低卵菌的活性为抑制卵菌的游动孢子产量，和/或抑制休止孢萌发，和/或破坏休止孢形态，和/或降低辣椒疫霉、大豆疫霉、荔枝霜疫霉、终极腐霉等卵菌的菌丝生长速度；
优选的，通过对卵菌序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示的基因进行基因敲除，以使序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白质灭活。所述卵菌优选为辣椒疫霉、大豆疫霉、荔枝霜疫霉、终极腐霉等卵菌。
实验证明，本发明VHA-a蛋白(PcVHA-a、PsVHA-a、PlVHA-a、PyuVHA-a)具有SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，其编码基因具有SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本发明VHA-a蛋白在辣椒疫霉、大豆疫霉、荔枝霜疫霉、终极腐霉中纯合敲除致死，表明该蛋白具有重要生物学功能。本发明提供的蛋白在控制辣椒疫霉、大豆疫霉、荔枝霜疫霉、终极腐霉等卵菌病害中具有很高的应用价值，以该蛋白为作用靶标，开发的杀菌剂对控制辣椒疫霉、大豆疫霉、荔枝霜疫霉、终极腐霉等卵菌病害的发生和流行具有重要的实践意义。
附图说明
图1上为同源臂测序验证示意图，下为辣椒疫霉PcVHA-a敲除突变体基因的PCR鉴定结果，从左到右依次为空载对照菌株、杂合敲除突变体和野生型辣椒疫霉菌株BYA5(图EV、Pca-HKO、BYA5)。
图2为野生型辣椒疫霉菌株BYA5、PcVHA-a基因杂合敲除突变体Pca-HKO、EV(空载体对照)菌丝生长速率和菌丝生长形态图。
图3为野生型辣椒疫霉菌株BYA5、PcVHA-a基因杂合敲除突变体Pca-HKO、EV(空载体对照)相对孢子囊数柱形图。
图4为野生型辣椒疫霉菌株BYA5、PcVHA-a基因杂合敲除突变体Pca-HKO、EV(空载体对照)相对游动孢子数柱形图。
图5为野生型辣椒疫霉菌株BYA5、PcVHA-a基因杂合敲除突变体Pca-HKO、EV(空载体对照)休止孢萌发率柱形图。
图6为野生型辣椒疫霉菌株BYA5、EV(空载体对照)、PcVHA-a基因杂合敲除突变体Pca-HKO温度敏感性柱形图(左)和菌丝形态图(右)。
图7为PcVHA-a、PsVHA-a、PlVHA-a、PyuVHA-a杂合敲除转化子Pca-HKO的敲除致死遗传学试验示意图。
图8为大豆疫霉PsVHA-a敲除突变体基因PCR鉴定结果。
图9为荔枝霜疫霉PlVHA-a敲除突变体基因PCR鉴定结果。
图10为终极腐霉PyuVHA-a敲除突变体基因PCR鉴定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
辣椒疫霉野生型菌株BYA5采自甘肃省白银市(Miao,J.等.2018.Phytopathology.108:1412-1419)。大豆疫霉菌株P6497为基因组测序完成的标准菌株(Tyler,B.M.等Science.313:1261-1266)，由美国Brett M.Tyler教授(Oregon StateUniversity)馈赠。荔枝霜疫霉Plyn3、终极腐霉Pyuyn7均采自云南省。辣椒疫霉交配型标准菌株PCAS1和PCAS2(Bower,L.A.等.1985.Canndian Journal of Plant Pathology.7(1):1-6)，为美国加州大学河滨分校Michael Coffey教授馈赠。以上菌株仅为本发明在实施例所使用的材料，事实上，在应用本发明所述筛选标记时，可使用任何商购途径获得疫霉菌菌株。
上述菌株均已经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定。
实施例1、辣椒疫霉PcVHA-a基因及其编码蛋白的获得
本实施例中辣椒疫霉PcVHA-a蛋白及其编码基因(或cDNA)可以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA(或cDNA)为模板，通过表1所列引物扩增获得。其中，DNA或RNA提取的材料可以为辣椒疫霉菌株BYA5的菌丝体。其中，以辣椒疫霉菌株BYA5的cDNA为模板用PcVHA-a-F和PcVHA-a-R扩增得到液泡型ATPase亚基a的编码基因PcVHA-a，如序列表中SEQ ID NO.1所示，SEQ IDNO.1由2616个核苷酸组成，自SEQ ID NO.1的5’端第1-2616位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.5所示的蛋白质(PcVHA-a)。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表1.PcVHA-a全长编码基因扩增引物
实施例2、辣椒疫霉PcVHA-a基因及其编码蛋白的功能验证
一、辣椒疫霉PcVHA-a基因的杂合敲除转化子的获得
1.1辣椒疫霉PcVHA-a基因的敲除载体的构建
(1)获得候选sgRNA
通过EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)进行PcVHA-a的sgRNA的设计，在网站中输入基因组全长进行搜索。
(2)二级结构筛选
利用网站(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html)对候选sgRNA的二级结构进行分析，选取形成发夹互补桥梁的个数小于等于3个为候选sgRNA。
(3)脱靶分析
通过JGI(https://mycocosm.jgi.doe.gov/Phyca11/Phyca11.home.html)对sgRNA进行脱靶分析，输入包括PAM区域的共23个碱基进行比对，包含9～23(含NGG)完全匹配的情况，认为脱靶的风险较高。
(4)选取理想的sgRNA进行合成(表达sgRNA的DNA分子序列为：5’-acaggttgttccagcccttg-3’，sgRNA序列为ACAGGUUGUUCCAGCCCUUG。靶向序列表中SEQ ID No.1序列5’→3’端第1819-1837位反向核苷酸序列。
(5)以PYF515(已发表载体，Fang Y,Cui L,Gu B,et al.2017.Efficient genomeediting in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9.CurrentProtocols in Microbiology,44:21A.1.1-21A.1.26.)为骨架载体，按照文献已发表方法(记载于Fang Y,Cui L,Gu B,et al.2017.Efficient genome editing in the oomycetePhytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Current Protocols in Microbiology,44:21A.1.1-21A.1.26.)构建sgRNA表达载体(结构如图2中sgRNA载体)。sgRNA编码DNA退火处理(30μL体系)：3μL正义链，3μL反义链，3μL 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，0.5M NaCl4μL，和21μLddH2O，100℃，2min；于室温缓慢冷却约3～4h；稀释1μL，加入499μL ddH2O；选用酶切位点BsaI和NneI酶切PYF515质粒，使质粒线性化；连接质粒：3μL稀释后退火处理的sgRNA片段编码DNA(5’-acaggttgtt ccagcccttg-3’)，2μL10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，1μL T4 DNA Polynudeotide，50ng PYF515线性质粒，ddH2O补至20μL，25℃，30min。将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min、热激42℃，35s，冰浴2min，加入无抗性LB摇培60min，将菌液涂于带有Amp抗性的LB平板上，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/RPL41-F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG-3’)扩增、测序验证克隆。将验证正确的含表达sgRNA的DNA分子的重组载体命名为PYF515-PcsgRNA1，该载体表达靶向序列表中序列SEQ ID No.1的5’→3’端1819-1837位反向核酸序列。
(6)以辣椒疫霉BYA5基因组DNA为模板，利用引物对(基因上游1000bp片段引物对序列为:F：5’-gtcgacggta tcgataagctttcgttgcga ttgccttga-3’，R：5’-ccttgcccatggttaatgtcctttaaacgc t-3’；基因下游1000bp片段引物对序列：F：5’-cgcgccttgaacagcaagtgaatgcatcga gc-3’，R：5’-cgcggtggcg gccgctctagadgcgcgaggctgactccatcagtcc-3’)分别扩增目的基因上游1000bp片段(序列见SEQ ID No.9)和下游1000bp片段(序列见SEQ ID No.10)；以商品化可购得的pGFP质粒为模板，利用引物对(F：5’-gacattaacc atgggcaagg gcgaggaa-3’和R：5’-cacttgctgt tcaaggcgcg cctgcggc-3’)扩增GFP片段(序列详见SEQ ID No.11)。以pBluescriptII SK+为骨架载体，选择酶切位点HindIII和XbaI(酶购自NEB公司)酶切pBluescript II SK+质粒，通过In-fusion试剂盒(Takara Code No.639650)构建同源臂替换载体(结构如图2中PcVHA-aDonor载体)。利用In-HD Cloning Kit将三个扩增片段融合连接于克隆载体pBluescript II SK+(HindIII和XbaI酶切)，50℃，15min后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min、热激42℃，35s，冰浴2min，加入无抗性LB摇培60min，将菌液涂于带有Amp抗性的LB平板上，37℃过夜培养后，使用通用引物M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PcVHA-a上游1000bp序列、GFP基因序列和PcVHA-a下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-GFP-PcVHA-a。
1.2辣椒疫霉PcVHA-a基因的杂合敲除转化子的获得
采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法获得PcVHA-a基因的敲除转化子(记载于Fang and Tyler,2016.Efficient disruption and replacement of an effector genein the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9)。具体为将3.1中构建的sgRNA表达载体(PYF515-sgRNA1)和同源臂替换载体pBS-GFP-PcVHA-a同时进行原生质体转化，转入辣椒疫霉BYA5中，将生长出来的转化子经G418抗性V8平板上25℃培养筛选，从菌落边缘打取菌丝块接种在铺有玻璃纸的V8平板上，25℃黑暗培养6d后刮取菌丝，提取转化子样品的DNA。
利用三对引物进行敲除转化子的验证，第一对引物(F：5’-gcttccagaaagtcacagta ga-3’和R：5’-catcaccttc accctctcc-3’)和第二对引物(F：5’-ttgtgcctgctgatgaacgc-3’和R：5’-cctggctgat cgagtttacg-3’)用于基因是否发生替换验证，第三对引物(F：5’-gcatggcatg gatgaactct ac-3’和R：5’-caacccgaac cagattaaca cc-3’)用于基因内部的验证。若使用前两对引物对疑似转化子进行PCR扩增时有条带，且第三对引物对疑似转化子进行PCR扩增时无条带，则可以鉴定该疑似转化子为阳性纯合转化子；若三对引物均有条带，则可以鉴定该疑似转化子为阳性杂合转化子。如图3所示，共获得了1株杂合PcVHA-a敲除转化子Pca-HKO。
二、辣椒疫霉PcVHA-a基因的杂合敲除转化子生物学性状分析
(1)菌丝生长速率检测：将供试菌株辣椒疫霉PcVHA-a基因的敲除转化子a-HKO、接于V8平板上，25℃黑暗培养6d后，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌饼，接种于V8平板上，25℃培养箱中黑暗培养6d，采用十字交叉法测量菌落直径。试验进行3次生物学重复。辣椒疫霉BYA5、空载菌株为对照。
如图2所示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5和空载相比，杂合敲除转化子Pca-HKO菌丝生长速率无显著性差异。
(2)孢子囊产量：将供试菌株接于V8平板上，25℃黑暗培养4d后，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌饼，菌丝面朝下接种于新的V8平板，在25℃黑暗条件下培养4d后继续在光照条件下培养5d，向培养皿中加入10ml无菌水使气生菌丝紧贴培养基。在100×显微镜下观察孢子囊产生情况，并选择代表性视野对孢子囊数量进行计数。试验进行3次生物学重复。
如图3所示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5和空载相比，杂合敲除转化子Pca-HKO孢子囊个数显著升高。
(3)游动孢子产量：将供试菌株接于V8平板上，25℃黑暗培养4d后，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌饼，菌丝面朝下接种于新的V8平板，在25℃黑暗条件下培养4d后继续在光照条件下培养5d，向培养皿中加入10ml无菌水。将培养皿置于4℃条件下30-40min，然后在室温条件下放置30min以上，使游动孢子充分释放。利用血球计数板对游动孢子产量进行计数。试验进行3次生物学重复。
如图4所示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5和空载相比，杂合敲除转化子Pca-HKO游动孢子个数显著升高。
(4)休止孢萌发率：利用上述方法获得游动孢子悬浮液，并用无菌水将游动孢子悬浮液浓度调至1×105-5×105个/ml。用移液器吸取100μl游动孢子悬浮液涂布于1％水琼脂平板上，室温放置3-5h至大部分野生型菌株休止孢萌发产生芽管。利用显微镜观察各菌株每100个休止孢中萌发休止孢的个数，计为休止孢萌发率。试验进行3次生物学重复。
如图5所示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5和空载相比，杂合敲除转化子Pca-HKO休止孢萌发率无显著性差异。
(5)温度敏感性：将供试菌株接于V8平板上，25℃黑暗培养3-4d后，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌饼，接种于V8平板上，分别置于4℃、13℃、18℃、25℃、30℃、和37℃下黑暗培养4d，采用十字交叉法测量菌落直径。试验进行3次生物学重复。
如图6所示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5和空载相比，杂合敲除转化子Pca-HKO温度敏感性无显著性差异。
三、辣椒疫霉PcVHA-a基因的杂合敲除转化子敲除致死遗传学验证
3.1供试培养基及试剂
1)基础培养液：MgSO4·7H2O 200mg，(NH4)2SO4 200mg，K2HPO4 120mg，CaCl2·2H2O60mg，KH2PO4 60mg，ZnSO4·7H20 6mg，去离子水定容至200mL。2)S+L培养基：卵磷脂100mg，基础培养液0.01L，葡萄糖40mg，琼脂粉15g，去离子水定容至1L(pH＝7.0)。3)S+L半选择性培养基：500mL S+L培养基，倒平板前向培养基中(40-60℃)加入卵菌选择性药剂2.5mL。4)0.25％高锰酸钾溶液：高锰酸钾1g，无菌水定容至20mL，终浓度为0.05g/mL。
3.2交配型测定
实验室前期已获得BYA5，使用交配型测定标准菌株PCA1和PCA2测定BYA5的交配型。标准菌株与BYA5进行对峙培养。与PCA1对峙培养产生卵孢子，且与PCA2对峙培养不产生卵孢子的为A2交配型。与PCA1对峙培养不产生卵孢子，且与PCA2对峙培养产生卵孢子的为A1交配型。与PCA1和PCA2对峙培养都产生卵孢子的为A1A2交配型。
3.3卵孢子获取以及卵孢子萌发
1)使用聚碳膜(激素可以穿透，菌丝无法穿透)隔开标准菌株和杂合转化子Pca-HKO的菌丝，在V8培养基上25℃黑暗培养45天，获得a-HKO自交后代。2)取菌丝琼脂块，粉碎机粉碎，转移至50mL离心管；3)4000rpm离心5min，倒去上层培养基，加无菌水30mL，650×g离心5min，倒去上清；4)经40μm细胞过滤器过滤，获得卵孢子；5)使用0.25％的高锰酸钾处理20min去除残余菌丝，刺激卵孢子萌发，650×g离心5min，弃去上清；6)加入20mL无菌水混匀，400×g离心5min，弃去上清；加入5mL无菌水悬浮卵孢子，涂布于半选择性S+L培养基上，黑光灯照射2d；7)在无菌操作台中，使用显微镜挑取单个萌发的卵孢子于V8板上，用于后续PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测分析。
3.4卡方检验
测定81株F1代PcVHA-a基因纯合率，并依据孟德尔遗传定律对结果进行分析。对F1代的分离比进行卡方检验，提出无效假设与备择假设。
Hv：表型的实际个数之比符合纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0的理论比例(敲除致死)；
Hi：表型的实际个数之比不符合纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0，即符合分离比1:2:1的理论比例(敲除不致死)；
分类数k＝3，自由度df＝3-1＝3-1＝2；
纯合(+/+)菌株的理论个数T1：81×1/3＝27；
杂合(+/-)菌株的理论个数T2：81×2/3＝54。
纯合(-/-)菌株的理论个数T2：0×1/4＝0。
计算χ2值(表2)。
查阅χ2临界值表，自由度为2时，χ2 0.05(2)＝5.9915，由χ2＝0.889＜χ20.05(2)，得到P＞0.05不能否定Hv，表明实际个数与理论个数不存在显著差异，纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0的理论比例(敲除致死)的成立(图7)。
表2F1代样品频数列联表
菌株 A(实际次数) T(理论次数) A-T 2
纯合(+/+) 31 27 4 0.593
杂合(+/-) 50 54 -4 0.296
纯合(-/-) 0 0 0 0
总计 81 81 0 0.889
上述实验证明，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5和空载体转化子相比，辣椒疫霉PcVHA-a基因的杂合敲除转化子游动孢子个数显著升高、孢子囊个数显著升高，辣椒疫霉PcVHA-a基因的纯合敲除致死。
实施例3、大豆疫霉PsVHA-a基因及其编码蛋白的获得
本实施例中大豆疫霉PsVHA-a蛋白及其编码基因(cDNA)可以大豆疫霉菌株P6497的cDNA为模板，通过表3所列引物扩增获得。其中，RNA提取的材料可以为大豆疫霉菌株P6497的菌丝体。以大豆疫霉菌株P6497的cDNA为模板用PsVHA-a-F和PsVHA-a-R扩增得到液泡型ATPase亚基a的编码基因PsVHA-a，如序列表中SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2由2622个核苷酸组成，自SEQ ID NO.2的5’端第1-2622位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ IDNO.6所示的蛋白质(PsVHA-a)。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表3.PsVHA-a全长编码基因扩增引物
实施例4、大豆疫霉PsVHA-a基因及其编码蛋白的功能验证
一、大豆疫霉PsVHA-a基因的杂合敲除转化子的获得
1.1大豆疫霉PsVHA-a基因的敲除载体的构建
载体构建方法同实施例2第一部分1.1相同。
其中，sgRNA序列见5’-gccctgtagg aactggtcga-3’所示，sgRNA序列为sgRNA:GCCCUGUAGGAACUGGUCGA，靶向序列表中SEQ ID No.2序列5’→3’端第250-270位反向核苷酸序列。将验证正确的表达sgRNA靶向序列所示片段的重组载体命名为PYF515-PssgRNA1，该载体表达靶向序列表中序列SEQ ID No.2的5’→3’端250-270位反向核酸序列。
其中，以大豆疫霉P6497基因组DNA为模板，利用引物对(基因上游1000bp片段引物对序列为F：5’-gtcgacggta tcgataagcttagagtgagg caggacttt-3’和R:5’-ccttgcccatggctgttgcg gactttttc-3’；基因下游1000bp片段引物对序列为F：5’-cgcgccttgaatagcagacg caatgag-3’和R:5’-cgcggtggcg gccgctctagacagaggtga ctcagcga-3’。)分别扩增目的基因上游1000bp片段(序列见SEQ ID No.12)和下游1000bp片段(序列见SEQ IDNo.13)；以商品化可购得的pGFP质粒为模板，利用引物对(F：5’-tccgcaacag ccatgggcaagggcgaggaa-3’和R:5’-tgcgtctgct attcaaggcg cgcctgcggc-3’)扩增GFP片段(序列详见SEQ ID No.11)。构建成功的重组表达载体命名为pBS-GFP-PsVHA-a。
1.2大豆疫霉PsVHA-a基因的杂合敲除转化子的获得
转化子获取方法同实施例2中第一部分1.2相同
其中，利用三对引物进行敲除转化子的验证，第一对引物(F：5’-cagtccatggcggtgctag-3’和R:5’-ccgttcacat caccatccag t-3’)和第二对引物(F：5’-gtcctgctggagttcgtga-3’和R:5’-agttcattct gaccacacac cat-3’)用于基因是否发生替换验证，第三对引物(F：5’-gcgcaagctg cgctactt-3’和R:5’-ttgctctgga tcaggtgggc-3’)用于基因内部的验证。如图8所示，共获得了1株杂合PsVHA-a敲除转化子Psa-HKO。
二、大豆疫霉PsVHA-a基因的杂合敲除转化子敲除致死遗传学验证
2.1供试培养基及试剂同实施例2第三部分3.1
2.2卵孢子获取和萌发方法同实施例2第三部分3.3
其中，杂合转化子Ps-HKO使用自交方法产生卵孢子，具体为使用V8培养基黑暗培养45天。
2.3卡方检验
测定108株F1代PsVHA-a基因纯合率，并依据孟德尔遗传定律对结果进行分析。对F1代的分离比进行卡方检验，提出无效假设与备择假设。
Hv：表型的实际个数之比符合纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0的理论比例(敲除致死)；
Hi：表型的实际个数之比不符合纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0，即符合分离比1:2:1的理论比例(敲除不致死)；
分类数k＝3，自由度df＝3-1＝3-1＝2；
纯合(+/+)菌株的理论个数T1：108×1/3＝36；
杂合(+/-)菌株的理论个数T2：108×2/3＝72。
纯合(-/-)菌株的理论个数T2：0×1/4＝0。
计算χ2值(表4)。
查阅χ2临界值表，自由度为2时，χ2 0.05(2)＝5.9915，由χ2＝1.041＜χ20.05(2)，得到P＞0.05不能否定Hv，表明实际个数与理论个数不存在显著差异，纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0的理论比例(敲除致死)的成立(图7)。
表4F1代样品频数列联表
菌株 A(实际次数) T(理论次数) A-T 2
纯合(+/+) 31 36 5 0.694
杂合(+/-) 77 72 -5 0.347
纯合(-/-) 0 0 0 0
总计 108 108 0 1.041
实施例5、荔枝霜疫霉PlVHA-a基因及其编码蛋白的获得
本实施例中荔枝霜疫霉PlVHA-a蛋白及其编码基因(cDNA)可以荔枝霜疫霉菌株Plyn3的cDNA为模板，通过表5所列引物扩增获得。其中，RNA提取的材料可以以荔枝霜疫霉菌株Plyn3的菌丝体。以荔枝霜疫霉菌株Plyn3的cDNA为模板用PlVHA-a-F和PlVHA-a-R扩增得到液泡型ATPase亚基a的编码基因PlVHA-a，如序列表中SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3由2616个核苷酸组成，自SEQ ID NO.3的5’端第1-2616位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.7所示的蛋白质(PlVHA-a)。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表5.PlVHA-a全长编码基因扩增引物
实施例6、荔枝霜疫霉PlVHA-a基因及其编码蛋白的功能验证
一、荔枝霜疫霉PlVHA-a基因的杂合敲除转化子的获得
1.1荔枝霜疫霉PlVHA-a基因的敲除载体的构建
载体构建方法同实施例2第一部分1.1相同。
其中，sgRNA序列为5’-gaacgagtca ctgttaatgg-3’，sgRNA序列为sgRNA:GAACGAGUCACUGUUAAUGG，靶向序列表中SEQ ID No.3序列5’→3’端第2398-2418位反向核苷酸序列。将验证正确的表达sgRNA靶向序列的重组载体命名为PYF515-PlsgRNA1，该载体表达靶向序列表中序列SEQ ID No.3的5’→3’端2398-2418位反向核酸序列。
其中，以荔枝霜疫霉Plyn3基因组DNA为模板，利用引物对(基因上游1000bp片段引物对序列为F：5’-gtcgacggta tcgataagcttgtcacttcggtaactgctg g-3’和R:5’-ccttgcccat ggctgttttt aaagcgct-3’、基因下游1000bp片段引物对序列为F：5’-cgcgccttga acagcaagtg aactgagtta-3’和R:5’-cgcggtggcg gccgctctagaaaaattgttcactgacga-3’)分别扩增目的基因上游1000bp片段(序列见SEQ ID No.14)和下游1000bp片段(序列见SEQ ID No.15)；以商品化可购得的pGFP质粒为模板，利用引物对(F：5’-ctttaaaaac agccatgggcaagggcgagg aa-3’和R:5’-tcagttcact tgctgttcaaggcgcgcctgcggc-3’)扩增GFP片段(序列详见SEQ ID No.11)。构建成功的重组表达载体命名为pBS-GFP-PlVHA-a。
1.2荔枝霜疫霉PlVHA-a基因的杂合敲除转化子的获得
转化子获取方法同实施例2中第一部分1.2相同
其中，利用三对引物进行敲除转化子的验证，第一对引物(F：5’-actggaaatgttgccgccac t-3’和R:5’-cccgttcaca tcaccatcca gt-3’)和第二对引物(F：5’-cctgctgccg gacaaccatt-3’和R:5’-gctacgccag aaccatcatc a-3’)用于基因是否发生替换验证，第三对引物(F：5’-gaggtcagga ggatacagct-3’和R:5’-gtacgtttcc acgaaggcctg-3’)用于基因内部的验证。如图9所示，共获得了1株杂合PlVHA-a敲除转化子Pla-HKO。
二、荔枝霜疫霉PlVHA-a基因的杂合敲除转化子敲除致死遗传学验证
2.1供试培养基及试剂同实施例2第三部分3.1
2.2卵孢子获取和萌发方法同实施例2第三部分3.3
其中，杂合转化子Pla-HKO使用自交方法产生卵孢子，具体为使用V8培养基黑暗培养45天。
2.3卡方检验
测定72株F1代PlVHA-a基因纯合率，并依据孟德尔遗传定律对结果进行分析。对F1代的分离比进行卡方检验，提出无效假设与备择假设。
Hv：表型的实际个数之比符合纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0的理论比例(敲除致死)；
Hi：表型的实际个数之比不符合纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0，即符合分离比1:2:1的理论比例(敲除不致死)；
分类数k＝3，自由度df＝3-1＝3-1＝2；
纯合(+/+)菌株的理论个数T1：72×1/3＝24；
杂合(+/-)菌株的理论个数T2：72×2/3＝48。
纯合(-/-)菌株的理论个数T2：0×1/4＝0。
计算χ2值(表6)。
查阅χ2临界值表，自由度为2时，χ2 0.05(2)＝5.9915，由χ2＝4＜χ20.05(2)，得到P＞0.05不能否定Hv，表明实际个数与理论个数不存在显著差异，纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0的理论比例(敲除致死)的成立(图7)。
表6F1代样品频数列联表
菌株 A(实际次数) T(理论次数) A-T 2
纯合(+/+) 16 24 -8 2.667
杂合(+/-) 56 48 8 1.333
纯合(-/-) 0 0 0 0
总计 72 72 0 4
实施例7、终极腐霉PyuVHA-a基因及其编码蛋白的获得
本实施例中终极腐霉PyuVHA-a蛋白及其编码基因(cDNA)可以终极腐霉菌株Pyuyn7的cDNA为模板，通过表7所列引物扩增获得。其中，RNA提取的材料可以以终极腐霉菌株Pyuyn7的菌丝体。以终极腐霉菌株Pyuyn7的cDNA为模板用PyuVHA-a-F和PyuVHA-a-R扩增得到液泡型ATPase亚基a的编码基因PyuVHA-a，如序列表中SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4由2619个核苷酸组成，自SEQ ID NO.4的5’端第1-2619位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.8所示的蛋白质(PyuVHA-a)。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表7PyuVHA-a全长编码基因扩增引物
实施例8、终极腐霉PyuVHA-a基因及其编码蛋白的功能验证
一、终极腐霉PyuVHA-a基因的杂合敲除转化子的获得
1.1终极腐霉PyuVHA-a基因的敲除载体的构建
载体构建方法同实施例2第一部分1.1相同。
其中，sgRNA序列为5’-ggtgtgccca tacaactttg-3’，sgRNA序列为sgRNA:GGUGUGCCCAUACAACUUUG，靶向序列表中SEQ ID No.4序列5’→3’端第1908-1927位核苷酸序列。将验证正确的表达sgRNA靶向序列的的重组载体命名为PYF515-PyusgRNA1，该载体表达靶向序列表中序列SEQ ID No.4的5’→3’端1908-1927位核酸序列。
其中，以终极腐霉Pyuyn7基因组DNA为模板，利用引物对(基因上游1000bp片段引物对序列为F：5’-gtcgacggta tcgataagcttaagacacgg cgcgcgcg-3’和5’-ccttgcccatctcttccgagcgcatccac、基因下游1000bp片段引物对序列为F：5’-cgcgccttga ggcgccctggaaagaacgac-3’和5’-cgcggtggcg gccgctctagatgttcactattgtgtaaag tg-3’)分别扩增目的基因上游1000bp片段(序列见SEQ ID No.16)和下游1000bp片段(序列见SEQ ID No.17)；以商品化可购得的pGFP质粒为模板，利用引物对(F：5’-cgctcggaag agatgggcaagggcgaggaa-3’和5’-ttctttccag ggcgcctcaaggcgcgcctg cggc-3’)扩增GFP片段(序列详见SEQ ID No.11)。构建成功的重组表达载体命名为pBS-GFP-PyuVHA-a。
1.2终极腐霉PsVHA-a基因的杂合敲除转化子的获得采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法获得PyuVHA-a基因的敲除转化子，转化子获得方法参照已报道文献进行(Feng.L.等.2021.Plos Pathogens.17:1-24)。具体为将1.1中构建的sgRNA表达载体(PYF515-PyusgRNA1)和同源臂替换载体pBS-GFP-PyuVHA-a同时进行原生质体转化，转入终极腐霉Pyuyn7，将生长出来的转化子经G418抗性V8平板上25℃培养筛选，从菌落边缘打取菌丝块接种在铺有玻璃纸的V8平板上，25℃黑暗培养3d后刮取菌丝，提取转化子样品的DNA。
转化子验证方法同实施例2中第一部分1.2相同。其中，利用三对引物进行敲除转化子的验证，第一对引物(F：5’-gcgatcggca acgctgtaat gaaa-3’和5’-ccgttcacatcaccatccag-3’)和第二对引物(F：5’-gcaatctgcc ctctccaagg-3’和5’-gggtcagtgcgtgaagaaag ta-3’)用于基因是否发生替换验证，第三对引物(F：5’-ctcaaccagttccgctcgga-3’和5’-ggtacgcaaa cttggagcca aac-3’)用于基因内部的验证。如图10所示，共获得了1株杂合PyuVHA-a敲除转化子Pyua-HKO-。二、终极腐霉PyuVHA-a基因的杂合敲除转化子敲除致死遗传学验证
2.1供试培养基
CMA(Corn Meal Agar，玉米粉琼脂)：玉米粉20-30g；琼脂15-20g；蒸馏水1000mL；PDB(Potato Dextrose Broth，马铃薯葡萄糖液体培养基)：马铃薯200g；葡萄糖20g；蒸馏水1000mL。
2.2卵孢子获取和萌发
使用已报道方法使终极腐霉Pyuyn7产生卵孢子以及萌发。在CMA培养基(CornMeal Agar，玉米粉琼脂)上25℃培养终极腐霉Pyuyn7 2周产生卵孢子。使用实施例2第三部分3.3方法提取卵孢子，将卵孢子悬浮液均匀涂布于含有4％琼脂的PDB培养基上，25℃培养1-6天。期间在无菌操作台中，使用显微镜挑取单个萌发的卵孢子于V8板上，用于后续PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测分析
2.3卡方检验
测定87株F1代PyuVHA-a基因纯合率，并依据孟德尔遗传定律对结果进行分析。对F1代的分离比进行卡方检验，提出无效假设与备择假设。
Hv：表型的实际个数之比符合纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0的理论比例(敲除致死)；
Hi：表型的实际个数之比不符合纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0，即符合分离比1:2:1的理论比例(敲除不致死)；
分类数k＝3，自由度df＝3-1＝3-1＝2；
纯合(+/+)菌株的理论个数T1：87×1/3＝29；
杂合(+/-)菌株的理论个数T2：87×2/3＝58。
纯合(-/-)菌株的理论个数T2：0×1/4＝0。
计算χ2值(表8)。
查阅χ2临界值表，自由度为2时，χ2 0.05(2)＝5.9915，由χ2＝4.190＜χ20.05(2)，得到P＞0.05不能否定Hv，表明实际个数与理论个数不存在显著差异，纯合(+/+)：杂合(+/-)：纯合(-/-)＝1:2:0的理论比例(敲除致死)的成立(图7)。
表8F1代样品频数列联表
菌株 A(实际次数) T(理论次数) A-T 2
纯合(+/+) 38 29 9 2.793
杂合(+/-) 49 58 -9 1.397
纯合(-/-) 0 0 0 0
总计 87 87 0 4.190

Claims (10)

1.一种液泡型ATPase亚基a蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：
A1)由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)在如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与卵菌敲除致死相关的由A1)衍生的蛋白质；
A4)与SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列相似性在93％以上，优选在95％以上，更优选在98％以上且具有与如SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所示的液泡型ATPase亚基a蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；
优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示的DNA序列转录的RNA序列。
4.与权利要求1所示的液泡型ATPase亚基a蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制权利要求2所述编码基因表达的核酸分子；优选的，所述核酸分子为敲除权利要求2所述编码基因的核酸分子，或者沉默权利要求2所述编码基因的核酸分子；
D8)含有或表达D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
D9)抑制权利要求3所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)含有或表达D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
5.权利要求1所述的液泡型ATPase亚基a蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料在抑制卵菌正常生长发育上或杀灭卵菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述卵菌为辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、大豆疫霉(Phytophthorasojae)、荔枝霜疫霉(Phytophthoralitchii)、终极腐霉(Pythium ultimum)。
7.权利要求1所述的液泡型ATPase亚基a蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子或权利要求4所述的生物材料在作为筛选抑制卵菌菌丝生长、孢子囊产生、游动孢子释放、孢子萌发或者杀灭所述卵菌的农药制剂中的应用。
8.一种筛选或辅助筛选卵菌病菌抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述卵菌病菌，当所述待检测物能够抑制如权利要求2所述的编码基因的转录，或抑制如权利要求3所述的RNA分子的翻译，或抑制如权利要求1所述的液泡型ATPase亚基a蛋白的活性或使其灭活，则所述待检测物为所述卵菌病菌的抑菌和/或杀菌剂。
9.一种降低卵菌病菌的活性或者使其灭活的方法，包括下述步骤：抑制如权利要求2所述的编码基因的转录或使其缺失，或抑制如权利要求3所述的RNA分子中的翻译，或抑制如权利要求1所述的液泡型ATPase亚基a蛋白的活性或使其灭活；
其中，所述降低卵菌病菌的活性为抑制卵菌病菌的游动孢子产量，和/或抑制休止孢萌发，和/或破坏休止孢形态，和/或降低卵菌病菌的菌丝生长速度；
优选的，通过对卵菌中序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示的基因进行基因敲除，以使序列表中SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白质灭活。
10.抑制权利要求1所述液泡型ATPase亚基a蛋白的表达和/或活性的物质在制备植物卵菌病菌杀菌剂中的应用；
优选的，所述抑制液泡型ATPase亚基a蛋白表达和/或活性的物质为抑制液泡型ATPase亚基a蛋白表达，和/或抑制液泡型ATPase亚基a蛋白的编码基因的转录，和/或抑制液泡型ATPase亚基a蛋白的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
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