CN116590396B - Capn8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用。该应用以CAPN8的表达变化进行中心粒细胞膜完整性评价，评价的时效性早于染料类方法，且重复性良好，对早期评价病理生理条件下的炎症和组织损伤具有重要意义。

Description

CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用。
背景技术
生物体内许多代谢过程都与膜功能有关，细胞膜组分的正常和结构的稳定是其发挥生理功能的前提，细胞膜依据其磷脂双分子层上镶嵌各种糖蛋白和膜蛋白，具有一定的流动性和选择透过性，在生物体内主要发挥信息交流和物质交换的功能。然而，某些理化因素或生物学因素可导致细胞膜破坏，失去控制物质进出功能，影响细胞内环境的平衡。因此，维持细胞膜的完整性是细胞生存和发挥生理功能的基础。
细胞膜发生损伤的同时，细胞亦可立即启动膜损伤修复的应急反应，以修补受破坏的膜结构，参与这个过程的蛋白分子即细胞膜损伤修复相关分子。目前，研究认为钙离子(Ca2+)急剧内流是细胞膜损伤后修复的启动因子，细胞膜上的Ca2+敏感结构域会对细胞内Ca2+的突然升高迅速反应。如果损伤不严重，可以通过以下三方面过程进行修复：使用胞内细胞器(特别是溶酶体)的膜修补受损膜，细胞器移动到受损膜并与受损膜融合；由小泡蛋白介导的受损膜的内吞作用；依赖于转运所需的内体分选复合物(ESCRT)的过程中受损膜的胞吐。
因此，理论上，可以通过细胞存储的细胞膜损伤后修复相关的分子含量或损伤发生后应急反应过程中产生的修复相关的分子的转录产物水平来评价细胞膜继续保持完整性的能力。但是，就我们查阅相关资料所知，只存在一些细胞膜完整性的检测装置或通过细胞膜非通透性核酸染料来检测细胞膜是否完整，还未有利用一种细胞膜相关的分子来评价细胞膜完整性的良好方法；而一旦将研究获得的该类分子用于评价细胞完整性，也将对医学实际诊疗工作中因细胞膜破裂、死亡所导致的炎症感染等疾病的辅助诊治具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的空缺，提供了CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用，该应用以CAPN8的表达变化评价中心粒细胞膜完整性，可以根据量化的实验结果，准确评价细胞膜完整性，时效性早于染料类方法，适用于革兰阴性菌，且重复性良好，对早期评价病理生理条件下的炎症和组织损伤具有重要意义，解决了现有技术中存在的问题。
本发明所采用的技术方案是：
提供了CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用。
进一步地，上述应用为CAPN8作为生物标志物非诊断目的的评价中性粒细胞膜完整性的方法。
进一步地，本发明还提供了CAPN8作为生物标志物在制备评价中性粒细胞膜完整性的试剂或试剂盒产品中的应用。所述试剂盒包括：感染信号，在mRNA水平、和/或蛋白水平检测CAPN8的表达量的试剂。
进一步地，通过对中性粒细胞在mRNA水平、和/或蛋白水平检测CAPN8的表达，根据其相对表达量评价细胞膜完整性。
进一步地，上述应用是将中性粒细胞在刺激信号感染0h的膜相关蛋白CAPN8的相对表达量设为1，计算刺激信号感染一定时间后的膜相关蛋白CAPN8的相对表达量，大于1，表明分子表达量升高，细胞膜完整；小于1，表明分子表达量较低或没有表达该分子，细胞膜不完整。
进一步地，刺激信号选择幽门螺杆菌、脂多糖或大肠埃希菌；感染时间选择2h。
进一步地，上述应用评价中性粒细胞膜完整性采用如下方法的操作步骤：
(1)建立感染体系
选取中性粒细胞提取试剂盒分离得到人外周血中性粒细胞，在37℃，5％CO2条件下，将幽门螺杆菌、脂多糖或大肠埃希菌加入装有悬浮中性粒细胞的培养皿内，得到细菌感染的中性粒细胞体系；其中，细胞浓度为1.0×106个/mL，中性粒细胞与幽门螺杆菌浓度比为1:10，中性粒细胞与大肠埃希菌浓度比为1:1，脂多糖用量为1.0μg/mL；
(2)步骤(1)的感染体系建立后，分别收集感染发生后0h、2h、4h和12h的细胞，加入异硫氰酸胍和苯酚，破碎裂解细胞；提取RNA、逆转录和实时荧光定量PCR实验，计算细胞内CAPN8的相对转录水平(以β-actin为内参)；
(3)根据所测RNA浓度，以提取的RNA为模板进行逆转录合成cDNA，设计CAPN8信号分子引物，进行实时荧光定量PCR反应，根据所得Ct值，计算2-△△Ct，得到目的基因相对转录量；获得细胞完整性与否的评价结果。
进一步地，步骤(2)具体步骤为：
①将培养皿内的细胞悬液收集于15mL离心管中，300g离心5min收集细胞；加入1mL无菌PBS洗涤细胞并转移悬液至新的Ep管中，300g离心5min，弃掉上清，随后加入1.0mL异硫氰酸胍和苯酚混合物，反复吹打，破碎裂解细胞；
②室温静置5min，加入等体积饱和酚溶液，上下颠倒混匀6-8次，置冰上15min，12000g，4℃离心15min；
③上清转移至新的Ep管中，加入等体积异丙醇，充分混匀后置于冰上静置10min，12000g，4℃离心10min；
④弃上清，75％乙醇溶液洗涤沉淀一次，12000g，4℃离心5min；
⑤弃上清，静置10min左右，使残余乙醇充分挥发，用适量DEPC水溶解沉淀，随后利用超微量分光光度计分析所得RNA纯度的浓度，-80℃保存，用于后续实验。
进一步地，步骤(3)计算2-△△Ct后，采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，每组实验至少重复3次，计量资料数据两组间均值比较正态分布采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
本发明的有益效果：
(1)本发明应用采用对中性粒细胞在mRNA水平检测CAPN8的表达，根据其表达变化判断中性粒细胞完整性与否，进而可对早期评价病理生理条件下的炎症和组织损伤具有重要意义。具体通过不同感染信号刺激中性粒细胞的实验方法进行了验证，通过将中性粒细胞与感染信号建立体外共培养模式，在共培养2h后分别在mRNA水平检测CAPN8的表达情况，计算相对表达量，将培养0h设为1，实验组的相对表达量与0h相比，大于1，说明该分子表达量升高，提示细胞膜完整；小于1，说明该分子表达量较低或没有表达该分子，提示细胞膜不完整。
(2)本发明应用的评价方法具备可靠性，重复性好。
附图说明
图1是Annexin V/PI双染法检测的幽门螺杆菌感染细胞凋亡及细胞膜通透性；
图2是qRT-PCR法检测幽门螺杆菌感染细胞膜损伤后修复相关分子的转录水平；
图3是本发明在LPS刺激及E.coli感染后检测细胞膜通透性、CAPN8分子的转录水平；
其中，图1中A为Annexin V/PI双染法检测的幽门螺杆菌感染细胞凋亡效果图；图1中B为Annexin V/PI双染法检测的幽门螺杆菌感染细胞PI染色阳性率；
图3中A-C为LPS刺激后中性粒细胞膜通透性、PI染色阳性率及CAPN8分子转录水平；图3中D-F为E.coli感染后的3、8小时中性粒细胞膜通透性、PI染色阳性率。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本发明进行详细阐述。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的方法；所使用的原料和装置，如无特殊规定，均为常规的市售产品。
本发明实施例详细介绍了细胞膜完整性评价的实验方法。中性粒细胞分别经幽门螺杆菌、大肠埃希菌、LPS刺激感染，通过qRT-PCR实验，在mRNA水平检测CAPN8的表达情况。计算细胞2h的2-△△Ct，将0h数值设为1，实验组2h与0h相比，大于1，说明该分子表达量升高，提示参与了细胞膜修复，细胞膜完整；小于1，说明该分子表达量较低或没有表达该分子，提示并没有参与细胞膜的修复，细胞膜不完整。采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，每组实验至少重复3次，计量资料数据两组间均值比较正态分布采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。该结果与Annexin V/PI双染法检测结果一致。
下面结合附图及具体实施方式对本发明上述评价的实验方法作详细描述。
1材料与方法
1.1实验主要试剂及厂家
1.2人外周血中性粒细胞采集自健康志愿者，细胞培养均采用含10％胎牛血清的RPMI 1640，在37℃培养箱中培养；细胞取生长良好，细胞存活率(台盼蓝拒染法)＞95％的细胞进行实验。
1.3方法
1.3.1RNA的提取及浓度测定
①将培养皿内的细胞悬液收集于15mL离心管中，300g离心5min收集细胞。加入1mL无菌PBS洗涤细胞并转移悬液至新的Ep管中，300g离心5min，弃掉上清，随后加入1.0mL异硫氰酸胍和苯酚混合物，反复吹打，破碎裂解细胞。
②室温静置5min，加入等体积饱和酚溶液，上下颠倒混匀6-8次，置冰上15min，12000g，4℃离心15min。
③上清转移至新的Ep管中，加入等体积异丙醇，充分混匀后置于冰上静置10min，12000g，4℃离心10min。
④弃上清，75％乙醇溶液洗涤沉淀一次，12000g，4℃离心5min。
⑤弃上清，静置10min左右，使残余乙醇充分挥发，用适量DEPC水溶解沉淀，随后利用超微量分光光度计分析所得RNA纯度的浓度。
⑥根据所测RNA浓度，以提取的RNA为模板进行逆转录。
1.3.2逆转录
(1)按照以下体系，按照每个样本1.5μg RNA的上样量计算出样本和RNAse-FreeWater所需要的体积，使得总体系为20μL。
逆转录反应体系
(2)加样完成后，瞬时离心，放在PCR仪中，按照25℃30min、42℃30min、85℃5min的程序进行反应，反应结束后得到cDNA样本，可直接用于实时荧光定量PCR，若暂时不用于实验，可放于-20℃保存。
1.3.3实时荧光定量PCR
(1)引物序列：
(2)按照以下反应体系，在八连管中加入以下各种成分，总体系为20μL；加样完成后，瞬时离心，后放于荧光定量PCR仪进行反应。
qRT-PCR反应体系
1.3.4计算△Ct目的基因＝Ct(目的基因)-Ct(同一样本的目的基因)；△△Ct＝实验组△Ct目的基因-对照组△Ct目的基因；2-△△Ct＝相对表达量(实验组/对照组)。采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，每组实验至少重复3次，计量资料数据两组间均值比较正态分布采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
1.3.5细胞凋亡及细胞膜通透性检测：采用Annexin V/PI(Propidium Iodide)双染法，即取细胞悬液适量，无菌PBS液洗涤一次，弃上清，然后用100μL凋亡缓冲液重悬细胞，加入Annexin V试剂、PI染液各5μL，避光孵育15min后加入凋亡缓冲液400μL，流式细胞仪检测。
2结果
2.1中性粒细胞经幽门螺杆菌(H.pylori)体外感染(细胞细菌比为1：10)，感染后8小时，通过Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡及细胞膜通透性，结果显示，H.pylori体外感染未造成中性粒细胞凋亡显著性改变，并且PI染色阳性率维持在较低水平，表明H.pylori体外感染过程中(8h)细胞膜通透性未发生急剧变化，膜完整性良好，具体如图1所示。
2.2中性粒细胞经H.pylori体外感染，在感染后的0、2、4、12小时时刻，收集中性粒细胞，提取RNA并逆转录生成cDNA，通过qRT-PCR法检测细胞膜损伤后修复相关分子(ANXA7、ANXA4、IQGAP、ALIX等)的转录水平，计算相对表达量，如图2所示，结果显示，CAPN8分子变化最显著，在感染后早期最能指示细胞维持细胞膜完整性的能力；这与已公开发表的现有文献资料中细胞感染后ANXA7等相关分子表达显著的相关内容不同，提示了CAPN8在中性粒细胞膜修复相关分子的特殊性与重要性。
2.3将上述结论推广至LPS(革兰阴性菌经典病原体相关分子模式)刺激的和大肠埃希菌(E.coli)(代表性革兰阴性菌)感染的体系中：
LPS刺激后8小时，通过Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡及细胞膜通透性，结果显示LPS刺激未造成中性粒细胞凋亡显著性改变，并且PI染色阳性率维持在较低水平(如图3A,B所示)，表明LPS刺激下中性粒细胞膜完整性良好。在此模型中早期(刺激后2h)，检测CAPN8的转录水平，计算相对表达量，结果显示CAPN8分子显著性升高(如图3C所示)，与前述H.pylori感染模型中所获得的结论一致。
在E.coli感染后的3、8小时，通过Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡及细胞膜通透性，结果显示，3h时中性粒细胞凋亡未显著性改变、PI染色阳性率较低，而8h时大量中性粒细胞发生死亡、PI染色阳性率较高，如图3D-F所示，表明E.coli感染的中性粒细胞膜损伤后修复能力减弱，感染后(3-8h)膜通透性急剧恶化。在此模型中早期(感染后2h)检测CAPN8的转录水平，结果显示CAPN8分子转录水平显著性降低，如图3C所示。
3、讨论
细胞膜作为细胞重要的组成部分，有效地将胞内外物质分隔开，是细胞发挥正常生理功能的天然屏障。当中性粒细胞受到损害时，细胞发生死亡，细胞组分也相应会发生明显变化。
中性粒细胞受到外界刺激，如大肠埃希菌等病原微生物，刺激Ca2+从内质网释放到细胞质，激活RAF-MEK-MAPK途径和蛋白激酶C(PKC)，诱导细胞膜和NADPH氧化酶功能复合物在超膜亚单位的组装，随后释放大量的活性氧分子(ROS)。在ROS的影响下，经过细胞内多肽精氨酸解脲酶4(PAD4)、NADPH氧化酶、髓过氧化物酶(MPO)等的激活与催化，致使细胞内容物与细胞质膜相互作用，细胞膜破裂，同时中性粒细胞发生死亡，这些过程可引起强烈的炎症反应，促进免疫性疾病和癌症的发生。
研究发现，中性粒细胞的细胞膜中存在某些分子可以保护细胞膜免于损伤，不发生膜破裂。因此，存在一种负反馈机制在细胞膜修复发挥作用，而这种细胞膜修复对于人体健康起着重要的作用。
钙蛋白酶(Calpain,CAPN)是一个依赖Ca2+的半胱氨酸蛋白酶家族，通过其底物的有限蛋白水解调节多种细胞功能，包括细胞周期、信号转导、细胞凋亡和膜运输。CAPN8主要在胃肠道表达，参与内质网和高尔基体之间的囊泡运输，文献报道其在保护胃黏膜损伤和抑制消化道肿瘤发生发展中具有重要的调节作用。
本发明提供了CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用，具体是选用中性粒细胞，与幽门螺杆菌、大肠埃希菌等消化道革兰阴性病原菌及以脂多糖刺激为信号建立体外感染/刺激体系，通过qRT-PCR技术，检测感染后早期(2h)后CAPN8的转录情况。因此，我们认为，CAPN8转录上调，提示细胞修复损伤细胞膜的能力强，能够维持细胞膜的完整性；若转录下调，则提示我们细胞失去了修复损伤的细胞膜的能力，细胞不能继续维持膜的完整性。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

Claims (4)

1.CAPN8作为生物标志物在评价中性粒细胞膜完整性中的应用，其特征在于，通过对中性粒细胞在mRNA水平、和/或蛋白水平检测CAPN8的表达，根据其相对表达量评价细胞膜完整性；
上述评价是将中性粒细胞在刺激信号感染0h的膜相关蛋白CAPN8的相对表达量设为1，计算刺激信号感染一定时间后的膜相关蛋白CAPN8的相对表达量，大于1，表明分子表达量升高，细胞膜完整；小于1，表明分子表达量较低或没有表达该分子，细胞膜不完整；刺激信号选择幽门螺杆菌或脂多糖，感染时间选择2h。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，评价中性粒细胞膜完整性采用如下方法的操作步骤：
(1)建立感染体系
选取中性粒细胞提取试剂盒分离得到人外周血中性粒细胞，在37℃，5％CO2条件下，将幽门螺杆菌、脂多糖或大肠埃希菌加入装有悬浮中性粒细胞的培养皿内，得到细菌感染的中性粒细胞体系；其中，细胞浓度为1.0×106个/mL，中性粒细胞与幽门螺杆菌浓度比为1:10，中性粒细胞与大肠埃希菌浓度比为1:1，脂多糖用量为1.0μg/mL；
(2)步骤(1)的感染体系建立后，分别收集感染发生后0h、2h、4h和12h的细胞，加入异硫氰酸胍和苯酚，破碎裂解细胞；提取RNA、逆转录和实时荧光定量PCR实验，计算细胞内CAPN8的相对转录水平(以β-actin为内参)；
(3)根据所测RNA浓度，以提取的RNA为模板进行逆转录合成cDNA，设计CAPN8信号分子引物，进行实时荧光定量PCR反应，根据所得Ct值，计算2-△△Ct，得到目的基因相对转录量；获得细胞完整性与否的评价结果。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)具体步骤为：
①将培养皿内的细胞悬液收集于15mL离心管中，300g离心5min收集细胞；加入1mL无菌PBS洗涤细胞并转移悬液至新的Ep管中，300g离心5min，弃掉上清，随后加入1.0mL异硫氰酸胍和苯酚混合物，反复吹打，破碎裂解细胞；
②室温静置5min，加入等体积饱和酚溶液，上下颠倒混匀6-8次，置冰上15min，12000g，4℃离心15min；
③上清转移至新的Ep管中，加入等体积异丙醇，充分混匀后置于冰上静置10min，12000g，4℃离心10min；
④弃上清，75％乙醇溶液洗涤沉淀一次，12000g，4℃离心5min；
⑤弃上清，静置10min左右，使残余乙醇充分挥发，用适量DEPC水溶解沉淀，随后利用超微量分光光度计分析所得RNA纯度的浓度，-80℃保存，用于后续实验。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)计算2-△△Ct后，采用GraphPadPrism 6.0软件进行统计学分析，每组实验至少重复3次，计量资料数据两组间均值比较正态分布采用t检验。
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