CN116397027B - 联合检测kras/nras/braf基因分型的复合扩增体系及试剂盒 - Google Patents
联合检测kras/nras/braf基因分型的复合扩增体系及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开一种联合检测结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变的扩增体系及试剂盒,该扩增体系及试剂盒可以通过一管式反应同时对3个基因共17种突变类型进行明确分型;相对于荧光定量等方法,本申请可明确位点具体突变分型,用于西妥昔单抗的伴随用药检测,且位点全面、操作简便、特异性高、灵敏度高、可靠性强、成本低,具备批量检测能力,可以为结直肠癌患者的个体化治疗提供更确切的依据。
Description
技术领域
本申请属于临床分子检测技术领域,具体涉及一种联合检测肿瘤患者FFPE样本中KRAS、NRAS、BRAF基因明确分型的复合扩增体系及试剂盒。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤。在我国常见恶性肿瘤死亡中,结直肠癌患者在男性占第五位,女性占第六位。发病多在60~70岁,且男性发病率高于女性。结直肠癌早期诊断不明确,癌细胞转移率高,预后效果差,导致大多数患者发现时多为晚期。
传统同病同治的治疗手段忽略了患者的个体差异,往往治疗效果不佳。个体化治疗通过相关基因的检测,可以帮助患者选择合适的靶向药物,提高治疗的针对性,最大程度的延长患者的生存期。分子靶向药物已成为结直肠癌个体化治疗和综合治疗的一线方案。目前针对结直肠癌靶向治疗的药物主要为抗EGFR(表皮生长因子受体,Epidermal growthfactor receptor,EGFR)单抗(西妥昔单抗和帕尼单抗)。多项研究表明,抗EGFR单抗的治疗疗效与RAS(KRAS与NRAS)和BRAF基因型密切相关。
靶向药物的治疗有效性受RAS和BRAF基因状态的影响。RAS与BRAF基因突变都会导致EGFR靶向药物无效或者疗效差。有文献报道,在结直肠癌患者中约30%~55%伴有KRAS基因突变,约1%~6% NRAS基因突变。研究表明西妥昔单抗仅对KRAS基因野生型的肿瘤患者有效。美国和欧洲已明确指出KRAS与NRAS基因双重野生型患者可从EGFR抑制剂治疗中获益。进行RAS基因突变检测已经成为结直肠癌患者选择一线治疗方案的关键策略。研究表明部分KRAS基因野生型患者对帕尼单抗单治疗效果不理想,与其下游基因——BRAF的突变有关。BRAF基因在结直肠癌的突变率为8%~14%。通过应用BRAF抑制剂(索拉非尼和多吉美)患者可恢复对西妥昔单抗或帕尼单抗的敏感性。BRAF基因突变往往是预后不良的指标。美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)2016年结肠癌治疗指南指出,推荐使用抗EGFR单抗进行治疗之前,先对患者进行KRAS、NRAS和BRAF基因突变检测。
目前,针对基因突变和多态性的检测方法,常见的有sanger测序法、基因芯片法、PCR-RFLP法、高分辨率溶解曲线法、PCR-Taqman MGB法、AS-PCR法、NGS法等。这些方法或存在灵敏度不足、特异性不足、成本高、临床普及度低点。不能适应临床标本检测等缺陷。
国内现有的已上市产品均采用荧光PCR法或Taqman-arms法,且基因检测专利也较多,但基本的方法均是依托于qPCR平台的检测方法。而现有产品或专利中针对KRAS/NRAS/BRAF的联合检测极少,只单一检测Kras或BRAF,且无法做到一管式检测多种突变,或无法明确相关基因的具体突变分型。有鉴于此,提出本申请。
发明内容
本申请的目的是寻求一种联合检测结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变的扩增体系及试剂盒。该体系应具有操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强和成本低的特点。
为实现上述目的,本申请具体提出如下技术方案:
本申请首先提供一种联合检测结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变的扩增体系,所述扩增体系包含扩增17个突变位点的引物组合,所述突变位点包括:
KRAS G13D,
KRAS G12D,
KRAS G12V,
KRAS G12A,
KRAS G12R,
KRAS G12S,
KRAS G12C,
KRAS Q61H,
KRAS K117N(351A>T),
KRAS K117N(351A>C),
KRAS Al46T,
KRAS A146P,
KRAS A146V,
NRAS G12D,
NRAS Q61R,
NRAS Q61K,
BRAF V600E。
进一步的,所述引物包括如下特异性引物和荧光引物序列:
KRAS G13D特异性引物:ATTGTGGTAGTTGGAGCTGGAGA
KRAS G12D特异性引物:GTACTTGTGGTAGTTGGAGCCGA
KRAS G12V特异性引物:GTTTCTTCTTGTGGTAGTTGGAGTTGT
KRAS G12A特异性引物:ATGACTGTAAACTTGTGGTAGTTGTAGCTGC
KRAS G12R特异性引物:ATTCTGAATATGAACTTGTGGTAGTAGGAGCTC
KRAS G12S特异性引物:GTTTCTTCTGACTATAAACTTGTGGTAGTTGGCGCTA
KRAS G12C特异性引物:GATTCATTTACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTAGAGCTT
KRAS G12&G13(包含KRAS G13D、KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G12A、KRAS G12R、KRAS G12S、KRAS G12C)的荧光引物:ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC
KRAS Q61H特异性引物:GATCCCTCATTGCACTGTACTCCACG
KRAS Q61H荧光引物:ACTGTAATAATCCAGACTGTGTTTC
KRAS K117N(351A>T)特异性引物:ATGTCTACTGTTCTAGAAGGCAAATCAGAA
KRAS K117N(351A>C)特异性引物:GCTACTGTTCTAGAAGGCAAATCACGG
KRAS K117(包括KRAS K117N(351A>T)和KRAS K117N(351A>C))荧光引物:AGATATTTGTGTTACTAATGACTGTGC
KRAS Al46T特异性引物:GATCGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAACATCCA
KRAS A146P特异性引物:GGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAGCATCAC
KRAS A146V特异性引物:GATGGAATTCCTTTTATTGAAACATGAGT
KRAS A146(包括KRAS Al46T、KRAS A146P、KRAS A146V)荧光引物:
ATGACATAACAGTTATGATTTTGCAGAAAAC
NRAS G12D特异性引物:AGAACTGGTGGTGGTTGGAGCTGA
NRAS G12D荧光引物:ATAGGATCAGGTCAGCGGGCTAC
NRAS Q61R特异性引物:ATTGACATACTGGATACAGCTGAACG
NRAS Q61K特异性引物:GATCTTGGACATACTGGATACAGCTGGCA
NRAS Q61(包括NRAS Q61R和NRAS Q61K)荧光引物:
GACTTGCTATTATTGATGGCAAATAC
BRAF V600E特异性引物:ATCGAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACCGA
BRAF V600E荧光引物:ATCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAG。
更进一步的,所述引物包括如下内控引物序列:
KRAS G12&G13(包含KRAS G13D、KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G12A、KRAS G12R、KRAS G12S、KRAS G12C)的内控引物序列:
GATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGCAT
KRAS Q61H内控引物序列:
ATCCTCATGTACTGGTCCCTCATTGC
KRAS K117(包括KRAS K117N(351A>T)和KRAS K117N(351A>C))内控引物序列:
ATGCCTGTTTTGTGTCTACTGTTCTAG
KRAS A146(包括KRAS Al46T、KRAS A146P、KRAS A146V)内控引物序列:
ATCTTAGCAAGAAGTTATGGAATTCCTT
NRAS G12D内控引物序列:
ATGTGAAATGACTGAGTACAAACTG
NRAS Q61(包括NRAS Q61R和NRAS Q61K)内控引物序列:
GATGGTGAAACCTGTTTGTTGGAC
BRAF V600E内控引物序列:
GATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGG。
优选的,所述引物包括如下外控引物序列:
上游外控引物:AGTGCAGGCTGCCTATCAGAACGT
下游外控引物:ATTAGGCAGAATCCAGATGCTCAAG。
进一步的,所述内控引物:特异性引物:荧光引物的浓度比为1:2-6:2-4。
进一步的,所述17个突变位点的引物分两组标价:FAM荧光标记组包括:KRASK117N(351A>C)、NRAS Q61R、KRAS K117N(351A>T)、NRAS Q61K、KRAS Q61H、KRAS A146P、KRAS A146T、KRAS A146V;HEX荧光标记组包括:KRAS G13D、KRAS G12D、KRAS G12S、KRASG12V、KRAS G12R、KRAS G12C、KRAS G12A、NRAS G12D、BRAF V600E。
本申请还提供一种结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变联合检测的试剂盒,其特征在于,包括上述任一所述的扩增体系。
进一步的,所述试剂盒为MAF-PCR试剂盒;
优选的,所述试剂盒中还包含以下成分:热启动Taq DNA聚合酶、UDG酶、PCR扩增缓冲液、质控品和内标ROX500。
本申请还提供一种上述任一所述的复合扩增体系在制备结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变检测检测试剂盒中的用途。
本申请还提供一种结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变检测的方法,其特征在于,包括利用上述任一所述的复合扩增体系对样本进行扩增的步骤。
与现有技术相比,本申请的优势至少有如下:
本申请通过多重引物扩增体系的优化设计(包括扩增区域选择、扩增片段(特异性片段和内控片段)大小选择、内控引物位置选择、错配碱基位置选择、错配碱基类型选择、5’端碱基序列设计,内控引物/荧光引物的通用性或兼容性设计等);同时基于毛细管电泳平台进行产物检测,检测结果具有灵敏度高、分辨率高、通量高、简单易于操作、便于自动化以及有专业的软件对结果进行判读等优势。
本申请能够大大增加等位基因特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力,使不同位点间的非特异***叉扩增的可能性降到最低,能够做到真正“有或无”式的扩增,不仅有很好的特异性,也具有非常好的灵敏度,能够检出40ng FFPE样本DNA中低至1%的基因突变情况,即一管式扩增3个基因共17种分型,检测灵敏度最高可达到1.0%(40ng DNA),远高于传统检测技术及需要的样本量;
另外,本申请还具有以下各方面优势:
1)结果明确:可明确KRAS\NRAS\BRAF共3个基因具体的突变分型;
2)结果直观:可根据CE检测峰图相应位置片段的有无进行判断;
3)适用样本范围广:可用于肿瘤组织样本(新鲜组织,FFPE,冰冻组织等),血液样本等;
4)操作方便:只需在反应管内加入DNA模板,即可上机完成检测,人工操作少,整个检测过程不超过3小时(不包括核酸纯化过程);
5)低成本:单管检测成本不及数字PCR的20%,性价比高。
附图说明
图1KRAS G12D位点引物筛选结果(①KRAS G12D-1以野生质粒/突变型质粒为模板扩增(同KRAS G12D-2和KRAS G12D-3);②KRAS G12D-1以混合质粒扩增结果;③KRAS G12D-4以野生质粒/混合质粒为模板扩增结果(同KRAS G12D-5);④
KRAS G12D-4以突变型质粒扩增结果(同KRAS G12D-5);⑤KRAS G12D以突变型质粒扩增结果);
图2NRAS G12D各引物位置和检测结果示意图(①NRAS G12D各引物位置;②NRASG12D各引物扩增片段检测结果示意图);
图3交叉测试结果(分别使用拷贝数为103个相应KRAS G12和G13位点阳性/阴性质粒为模板进行扩增检测,其中①KRAS G12R阳性;②KRAS G12S阳性;③KRAS G12C阳性;④KRAS G13D阳性;⑤KRAS G12D阳性;⑥KRAS G12V阳性;⑦
KRAS G12A阳性;⑧KRAS G12和G13阴性);
图4各位点比值结果(“-”表示未检出);
图5试剂盒质控品图(上图:阴性质控品,下图:阳性质控品);
图6不一致样本检测结果图对比(上图:测序结果,下图:CE结果)。
具体实施方式
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义,本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解,但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
如本申请中所使用,术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的,且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案,这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”,“所述”,包括该名词的复数形式。
本申请中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10%,优选±5%。
此外,说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类,是用于区分相似的元素,不是描述顺序或时间次序必须的。应理解,如此应用的术语在适当的环境下可互换,并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。
本申请中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者,单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。
本申请所述的联合检测结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变的扩增体系,是包含17个热点突变位点的引物组合,所述位点包括:
在一些实施方式中,所述检测方案采用的技术是多重半巢式ARMS荧光PCR技术(Multiplex Semi-nested Fluorescent PCR,MAF-PCR),采用arms引物设计原理,针对各靶标进行特异性引物的设计;同时,根据针对各检测区域设计半巢式的上游引物(内控引物),在反应体系中扩增时,通过调整半巢式引物和特异性引物的比例,达到即可提高特异性,又可提高扩增效率的目的。
特别的,所述检测技术方案包含三部分引物:检测位点特异性扩增引物、内控引物(半巢式引物)、下游引物。
在一些具体的实施方式中,所述检测体系采用上述方案,所述各检测靶点的特异性引物序列如下:
KRAS G13D特异性引物:ATTGTGGTAGTTGGAGCTGGAGA
KRAS G12D特异性引物:GTACTTGTGGTAGTTGGAGCCGA
KRAS G12V特异性引物:GTTTCTTCTTGTGGTAGTTGGAGTTGT
KRAS G12A特异性引物:ATGACTGTAAACTTGTGGTAGTTGTAGCTGC
KRAS G12R特异性引物:ATTCTGAATATGAACTTGTGGTAGTAGGAGCTC
KRAS G12S特异性引物:GTTTCTTCTGACTATAAACTTGTGGTAGTTGGCGCTA
KRAS G12C特异性引物:GATTCATTTACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTAGAGCTT
KRAS G12和G13荧光引物:ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC
KRAS Q61H特异性引物:GATCCCTCATTGCACTGTACTCCACG
KRAS Q61荧光引物:ACTGTAATAATCCAGACTGTGTTTC
KRAS K117N(351A>T)特异性引物:ATGTCTACTGTTCTAGAAGGCAAATCAGAA
KRAS K117N(351A>C)特异性引物:GCTACTGTTCTAGAAGGCAAATCACGGKRAS K117荧光引物:AGATATTTGTGTTACTAATGACTGTGC
KRAS Al46T特异性引物:GATCGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAACATCCA
KRAS A146P特异性引物:GGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAGCATCAC
KRAS A146V特异性引物:GATGGAATTCCTTTTATTGAAACATGAGT
KRAS A146荧光引物:ATGACATAACAGTTATGATTTTGCAGAAAAC
NRAS G12D特异性引物:AGAACTGGTGGTGGTTGGAGCTGA
NRAS G12荧光引物:ATAGGATCAGGTCAGCGGGCTAC
NRAS Q61R特异性引物:ATTGACATACTGGATACAGCTGAACG
NRAS Q61K特异性引物:GATCTTGGACATACTGGATACAGCTGGCA
NRAS Q61荧光引物:GACTTGCTATTATTGATGGCAAATAC
BRAF V600E特异性引物:ATCGAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACCGA
BRAF V600荧光引物:ATCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAG
进一步的,所述各检测靶点的特征还在于,包括内控引物和外控检测引物,内控和外控引物序列分别如下:
KRAS G12&G13共7个点的内控引物序列:
GATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGCAT
KRAS Q61的内控引物序列:
ATCCTCATGTACTGGTCCCTCATTGC
KRAS K117共2个点的内控引物序列:
ATGCCTGTTTTGTGTCTACTGTTCTAG
KRAS A146共3个点的内控引物序列:
ATCTTAGCAAGAAGTTATGGAATTCCTT
NRAS G12的内控引物序列:
ATGTGAAATGACTGAGTACAAACTG
NRAS Q61的内控引物序列:
GATGGTGAAACCTGTTTGTTGGAC
BRAF V600的内控引物序列:
GATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGG
所述外控引物所靶向的基因是人基因组中管家基因的序列,外控检测引物序列如下:
上游:AGTGCAGGCTGCCTATCAGAACGT
下游:ATTAGGCAGAATCCAGATGCTCAAG
在一些实施方式中,所述引物进行了特异性调整,以及特定的修饰,包括碱基的错配、磷酸化修饰、荧光基团的修饰、碱基的修饰(锁核酸修饰)以及错配碱基的引入等。
在一些实施方式中,所述方案的引物的混合比例按照内控引物:特异性引物:荧光引物=1:2-6:2-4,该比例既有利于提高特异性序列的扩增,又能够提高特异性引物的扩增效率。
在一些实施方式中,所述检测位点按照荧光标记可分为两组,FAM荧光标记组包括:KRAS K117N(351A>C)、NRAS Q61R、KRAS K117N(351A>T)、NRAS Q61K、KRAS Q61H、KRASA146P、KRAS A146T、KRAS A146V;HEX荧光标记组包括:KRAS G13D、KRAS G12D、KRAS G12S、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12C、KRAS G12A、NRAS G12D、BRAF V600E。
本申请所述的结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变联合检测的试剂盒,所述试剂盒包含上述任一所述的扩增体系。
在一些实施方式中,所述试剂盒还包含以下成分:酶混合液(热启动Taq DNA聚合酶、UDG酶)、引物混合液(10×)、PCR扩增缓冲液(2×)、质控品和内标ROX500等。
本申请所述检测试剂盒,采用的技术是多重半巢式ARMS荧光PCR法(MultiplexSemi-nested Fluorescent PCR,MAF-PCR)对靶标进行扩增,通过毛细管电泳检测技术进行扩增产物的检测分析,完成对临床样本的检测。
在一些实施方式中,所述试剂盒能够检测一管式检测KRAS\NRAS\BRAF三个基因17个热点突变的具体分型,能够大大增加等位基因特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力,使不同位点间的非特异***叉扩增的可能性降到最低,能够做到真正“有或无”式的扩增,不仅有很好的特异性,也具有非常好的灵敏度,能够检出40ng FFPE样本DNA中低至1%的基因突变情况。
本申请所述的结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变检测试剂盒的使用方法,包括利用上述的复合扩增体系对样本进行扩增的步骤;具体包括以下步骤:样本的处理及提取、PCR体系配制及PCR扩增、遗传分析仪检测扩增产物、数据分析、检测结果的判读。
下面结合实施例对本申请做进一步的较为完整、详细的描述。
实施例1联合检测体系特异性引物的设计和筛选
本申请是针对目前检测方法在灵敏度、成本、通量、操作方便性等方面存在的不足,基于毛细管电泳平台,使用多重半巢式ARMS荧光PCR技术(MAF-PCR)的基础上,通过对反应体系和扩增引物的反复优化和探索,开发出一种高灵敏、高通量、低成本、操作简单的KRAS、KRAS、BRAF基因明确分型的复合扩增体系及试剂盒。
具体的,本申请的探索研究和优化筛选过程如下:
1)特异性位点的选择:
结直肠癌是消化***常见的恶性肿瘤之一。近年来,随着西妥昔单抗的问世,结直肠癌的靶向治疗取得了长足的进步。RAS和BRAF基因突变是相互独立的,两者任何一个蛋白发生突变都会导致RAS-RAF-MAPK信号通路的激活,因此只有RAS和RAF基因野生型患者才对抗表皮因子生长受体(EGFR)单抗药物治疗有效,而突变型无效。但是针对临床西妥昔单抗的应用,检测的靶标主要为KRAS 12和13位点的某些分型。本申请在位点选择上,主要考虑与临床检测的适应性,同时,调研市场常见检测试剂盒检测靶标,以及根据Cosmic数据公布的人类KRAS,NRAS,BRAF检测位点突变频率等信息为依据,并辅以预实验评价位点混合检测的难易程度,最终确立KRAS、NRAS、BRAF三基因共17种突变类型的特异性位点,具体如下:
2)引物序列的筛选和优化
本申请设计的扩增体系包含了特异性引物、荧光引物、内控引物和外控引物,具体在引物序列的筛选设计时,充分考虑如下多方因素:包括扩增区域选择、扩增片段的大小(特异性片段和内控片段)、内控引物的位置、错配碱基的位置、错配碱基的类型、5’端碱基序列等等。
示例性,以位点KRAS G12D为例,本申请从错配碱基类型、5’端碱基序列两个因素,优化特异性引物的筛选情况,该位点筛选了如下引物(部分结果展示),具体引物及序列如下:
具体引物的测试结果如图1,使用KRAS G12D-1、KRAS G12D-2或KRAS G12D-3引物时,分别以103拷贝野生型质粒、103拷贝突变型质粒和103拷贝KRAS G12、G13位点阳性混合质粒(除KRAS G12D阳性质粒外)为模板,结果显示野生型模板、混合模板扩增时位点均存在非特异性扩增,并出现加A不完全的问题,且混合模板时出现不同位置的非特异性;而以KRAS G12D-4引物扩增时,则野生型模板和混合模板未出峰,突变型模板出现加A不完全的问题,故在KRAS G12D-4引物基础上进行5’端尾巴碱基的修改,结果显示KRAS G12D-5同KRAS G12D-4结果,但加A不完全问题得到改善,而效率上有所降低。进而继续修改得到KRASG12D引物,测试结果最佳,效率高、无非特异性扩增、混合质粒为模板扩增无杂峰(结果同KRAS G12D-4和KRAS G12D-5)和加A不完全问题,故此KRAS G12D位点的特异性引物选择KRAS G12D。
再以位点NRAS G12D位点为例,从扩增片段的大小(内控片段)、内控引物位置两个因素,介绍内控引物的选择对特异性引物的影响情况,具体的序列和筛选情况如下(部分结果展示):
各引物位置如图2,将内控引物、特异性引物、荧光引物以及外控引物混合后进行测试,分别扩增103拷贝野生型质粒与10ng二倍体野生细胞系混合模板和103拷贝突变型质粒与10ng二倍体野生细胞系混合模板,同时以无内控引物的扩增结果为对照。根据测试结果分析,如下表,NRAS G12D-F1引物混合测试结果相对于NRAS G12D-F2和NRAS G12-F对特异性引物的特异性没有影响,但是突变型峰和内控峰/外控峰比值明显偏小,且和无内控引物对照,比值同样偏小,表明NRAS G12D-F1引物未对特异性引物的扩增起到促进的作用;NRAS G12D-F2、NRAS G12-F两条引物扩增结果显示,突变型峰和内控峰/外控峰比值前者小于后者,但是无明显的差异,而与对照的突变型峰和外控峰比值相比,则有较明显的提高,表明二者对于非特异性的扩增均有益,同时考虑到实际过程中使用的样本类型为FFPE样本,存在较严重的降解,故选择效果更好、片段更小的NRAS G12-F引物。
注:“-”表示未出峰
经上述引物序列的设计优化,本申请最终确立的针对KRAS、NRAS、BRAF三基因引物扩增体系如下:
KRAS、NRAS、BRAF三个基因17种突变类型的特异性引物序列如下:
KRAS G13D特异性引物:ATTGTGGTAGTTGGAGCTGGAGA
KRAS G12D特异性引物:GTACTTGTGGTAGTTGGAGCCGA
KRAS G12V特异性引物:GTTTCTTCTTGTGGTAGTTGGAGTTGT
KRAS G12A特异性引物:ATGACTGTAAACTTGTGGTAGTTGTAGCTGC
KRAS G12R特异性引物:ATTCTGAATATGAACTTGTGGTAGTAGGAGCTC
KRAS G12S特异性引物:
GTTTCTTCTGACTATAAACTTGTGGTAGTTGGCGCTA
KRAS G12C特异性引物:
GATTCATTTACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTAGAGCTT
KRAS Q61H特异性引物:GATCCCTCATTGCACTGTACTCCACG
KRAS K117N(351A>T)特异性引物:
ATGTCTACTGTTCTAGAAGGCAAATCAGAA
KRAS K117N(351A>C)特异性引物:
GCTACTGTTCTAGAAGGCAAATCACGG
KRAS Al46T特异性引物:GATCGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAACATCCA
KRAS A146P特异性引物:GGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAGCATCAC
KRAS A146V特异性引物:GATGGAATTCCTTTTATTGAAACATGAGT
NRAS G12D特异性引物:AGAACTGGTGGTGGTTGGAGCTGA
NRAS Q61R特异性引物:ATTGACATACTGGATACAGCTGAACG
NRAS Q61K特异性引物:GATCTTGGACATACTGGATACAGCTGGCA
BRAF V600E特异性引物:ATCGAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACCGA
下划线代表引物设计过程中引入的错配碱基。
上述特异性引物除3’末端互补于等位基因位点有所变化外,引物的其他位置也引入了错配的碱基,如在引物3’端倒数第二位或第三位引入碱基错配,或第二和第三位的连续错配;针对不同的SNP/突变位点,在引物3’端倒数第二位或者第三位引入碱基错配的基础上,还在引物的其他位点增加碱基错配来满足反应特异性的要求,越远离3’端,增加错配的碱基数越多,5’端可达最多。
另外,针对上述的17个位点,本申请设计荧光引物,并对荧光引物进行优化,从而设计出共用荧光引物,有效减少体系压力。最终确定的共用荧光引物序列如下:
KRAS G12和G13荧光引物(K1213-HEX):
ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC
KRAS Q61荧光引物(KRAS Q61-FAM):ACTGTAATAATCCAGACTGTGTTTCKRAS K117荧光引物(KRAS K117-FAM):
AGATATTTGTGTTACTAATGACTGTGC
KRAS A146荧光引物(KRAS A146-FAM):
ATGACATAACAGTTATGATTTTGCAGAAAAC
NRAS G12荧光引物(NRAS G12-HEX):ATAGGATCAGGTCAGCGGGCTAC
NRAS Q61荧光引物(NRAS Q61-FAM):
GACTTGCTATTATTGATGGCAAATAC
BRAF V600荧光引物(BRAF V600-HEX):
ATCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAG
各检测位点的内控检测引物序列如下:
KRAS G12&G13共7个点的内控引物序列(KRAS G12&G13-F):
GATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGCAT
KRAS Q61的内控引物序列(KRAS Q61-R):
ATCCTCATGTACTGGTCCCTCATTGC
KRAS K117共2个点的内控引物序列(KRAS K117-R):
ATGCCTGTTTTGTGTCTACTGTTCTAG
KRAS A146共3个点的内控引物序列(KRAS A146-F):
ATCTTAGCAAGAAGTTATGGAATTCCTT
NRAS G12的内控引物序列(NRAS G12-F):
ATGTGAAATGACTGAGTACAAACTG
NRAS Q61的内控引物序列(NRAS Q61-F):
GATGGTGAAACCTGTTTGTTGGAC
BRAF V600的内控引物序列(BRAF V600-F):
GATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGG
所述检测体系的外控检测引物序列如下:
上游HBB-F:AGTGCAGGCTGCCTATCAGAACGT
下游HBB-R:ATTAGGCAGAATCCAGATGCTCAAG。
下划线代表引物设计过程中引入的错配碱基。
3)引物浓度的优化:
在筛选好引物后,对引物组合中各引物的浓度又进行了优化调整,确立各位点引物比例情况为内控引物:特异性引物:荧光引物=1:2-6:2-4,如下为示例性一种最优的具体各引物的使用和终浓度如下表:
将本实施例设计的引物按照上述终浓度进行混合,同时,针对检测的17个位点分别设计了相应位点分型的阳性质粒,并送生工进行合成。使用混合后的引物进行各种突变类型真实样本和合成的质粒的进行相互扩增检测,以确定各位点在扩增时,除目的分型样本外,其他位点阳性样本是否对各位点造成互相干扰的情况,检测结果见图3(展示部分交叉测试结果图)。
通过上述交叉测试结果显示,本申请于一管中可以检测KRAS/NRAS/BRAF三个基因17个热点突变的具体分型,且相互之间不造成任何干扰,同时也避免造成假阳性。
实施例2、检测性能评价
与市面已有试剂盒相比,本申请检测体系的一个显著特点是能够一管式检测KRAS、NRAS、BRAF三个基因共17种热点突变,且检测丰度能够达到1%。另外,本申请的另一个特点,则是试剂盒扩增样本需求总量较低,具有较高的灵敏度。
本实施中为体现上述显著性的特点,选择代表性突变类型KRAS G12D、KRAS G13D、KRAS G12V,将对应的DNA样本梯度稀释20ng/μL、40ng/μL、60ng/μL,每个浓度梯度重复扩增检测5次,以100%可检出的最低浓度作为估计检测限。然后,在估计检测限附近制备若干浓度梯度样本,每个浓度重复扩增检测20次,确定100%检出率水平下的最低DNA浓度。最后,在最低DNA浓度条件下,针对各位点阳性样本设置不同丰度的样本,进行各位点检测丰度的确认,并选取本体系检测范围内的所有位点阳性样本和自制丰度的阳性样本对最低样本需求量进行验证。
选用了3例常见突变的阳性样本,浓度设置为20ng、40ng、60ng三个梯度,将上述各浓度样本重复扩增检测5次,结果显示如下表:
备注:以1/5为例,1表示实际检测结果中符合条件的样本数量,5表示检测样本总数量。
当样本量为20ng时,各样本分别重复检测5次时,出现突变位点丢点情况;而当40ng上样量则不存在此种问题,将40ng作为初步的估计检测限。为进一步确定本体系的最低样本需求量,选取上述突变类型样本,并稀释成30ng/μL、40ng/μL、50ng/μL,对扩增检测20次的结果进行分析,扩增检测结果如下表:
/>
备注:以19/20为例,19表示实际检测结果中符合条件的样本数量,20表示检测样本总数量。
结果显示,40ng符合最低检出样本需求量的标准和要求。为确定本申请体系能够检测的各位点的最低丰度情况,在确定的最低样本需求量的基础上,选取17个位点的阳性样本,并制备丰度为1%、2%、3%、4%、5%的样本,每个样本各重复扩增检测3次,统计各样本各位点的突变峰和相应质控峰的比值,检测结果如图4,从结果中比值可知,各位点的检测丰度如下表所示:
针对不同位点,制备40ng/ul浓度条件下上述丰度阳性样本和正常丰度样本,各样本分别进行20次重复扩增检测,统计各样本检出率情况,检测结果见下表:
/>
综上结果可知,对40ng/μL的试剂盒检测范围内17种突变类型的临床及检测限样本进行扩增测试,重复20次检测,各检测结果一致,且符合率100%,未出现检出异常的情况。因此,由本实施例可知,本申请检测体系能够一管式利用最低40ng样本量检测17个位点低至1%丰度的明确突变类型。
实施例3、KRAS、NRAS、BRAF基因突变联合检测试剂盒的制备和应用
本实施例提供了一种KRAS、NRAS、BRAF基因突变检测试剂盒,所述试剂盒包括引物Mix、扩增缓冲液、酶混合液、质控品(阴性和阳性)、分子内标和无核酸酶纯水。
所述试剂盒包含的引物组合如实施例1确定引物部分,引物在生工生物工程(上海)有限公司进行合成,并且所有引物按照实验摸索的比例进行混合,配制成10×引物Mix。
所述试剂盒还包含酶混合液,其中有Taq DNA聚合酶和UDG酶。
此外,所述试剂盒所包含PCR扩增缓冲液,其中有dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP,Mg2+等。
试剂盒的使用如下:
一、样本的制备:
使用FFPE DNA提取试剂盒对石蜡包埋组织切片样本进行DNA的提取,并采用NanoDrop2000(Thermo)测定DNA的浓度及纯度,并将DNA稀释到相应的浓度,保存于4度或-20度备用。
二、检测方法
步骤1:PCR扩增体系的配制/分装(在试剂准备区完成)
按照下表各组分进行PCR扩增体系的配制,振荡混匀后,根据样本数量进行分装,每管19ul。
组分名称 | 每20ul体系各组分用量(ul) |
PCR扩增缓冲液 | 10 |
10×引物mix | 2 |
酶混合液(含UDG酶) | 0.5 |
模板 | - |
水 | 补足至20 |
共计 | 20 |
步骤2:加入模板(在标本制备区完成)
向对应PCR反应管中,加入各准备好的FFPE DNA样本1ul,同时,设置质控对照(质控:1ul质控品,阴性对照:1ul无核酸纯水)。
步骤3:PCR扩增(在扩增区完成)
将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内,设置反应体系为20μL。
按以下反应程序进行PCR扩增:
步骤4、扩增产物的检测(产物检测室)
配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液:(0.5μL分子量内标+8.5μL甲酰胺)×检测样品数,涡旋振荡混匀10-15秒;用移液器给每个检测孔分装9μL的甲酰胺和内标混合物;取1ul扩增产物(稀释1-20倍)加入甲酰胺和内标混合物里,盖上封板胶盖。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。
步骤5、数据分析
向GeneMapper软件中导入相关文件,输入检测仪下机的原始数据(.fsa文件),分析数据。
步骤6、结果的判读:
以无核酸酶纯水为模板进行扩增,无任何扩增产物;
各检测样本质控位点及外控位点峰高≥175rfu,各检测位点峰高不超阈值(30000rfu);
根据片段大小,对出峰位点进行峰的标注,质控品出峰情况如图5;
按照标注的峰,进行突变位点有效产物峰峰高/相应质控位点内对应位点有效产物峰峰高比值的计算,其中,KRAS基因突变位点G12A、G12C、G12D、G12R、G12V、G13D、G12S对应质控位点内对应位点为K12&K13-WT,KRAS基因突变位点K-Q61H对应质控位点内对应位点K-Q61H-WT,KRAS基因突变位点K117-T、K117-C对应K117N-WT,KRAS基因突变位点A146T、A146V、A146P对应质控位点内对应位点A146-WT;NRAS基因突变位点N-G12D对应质控位点内对应位点为N12-WT,NRAS基因突变位点N-Q61K、N-Q61R对应质控位点内对应位点N-Q61-WT;BRAF基因突变位点V600E对应质控位点内对应位点V600E-WT。
得到各位点的比值后,如果KRAS G13D、KRAS K117N(351A>C)、NRAS Q61R各位点存在比值≤0.06时,则说明相应的位点未发生突变,反之,存在比值>0.06时,则说明相应位点发生了突变;如果KRAS G12D、KRAS G12S、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12C、KRAS G12A、KRAS K117N(351A>T)、NRAS G12D、NRAS Q61K、BRAF V600E、KRAS Q61H、KRAS A146P、KRASA146T、KRAS A146V各位点存在比值≤0.08时,则说明相应的位点未发生突变,反之,存在比值>0.08时,则说明相应位点发生了突变。
实施例四:临床样本检测和验证
本实施例使用所述发明体系制备成的试剂盒,对临床样本直接进行扩增检测,具体以临床样本为例进行扩增检测来体现本试剂盒的使用方法和检测过程。
收集临床病例诊断为结直肠癌的患者FFPE标本,并使用Qiagen的FFPE样本DNA提取试剂盒,进行患者FFPE标本DNA的提取,具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。制备好的DNA样本,经NanoDrop2000(Thermo)测定质量和浓度,放于4度备用。
按照实施例三对提取的临床样本DNA进行扩增检测,扩增检测结果如下表:
/>
/>
/>
本实施例共检测了1481例临床样本,上表展示其中前100例结果,以及与sanger测序结果的对比,阳性率约为34.8%(516/1481),其中与sanger测序结果一致率98.38%(1457/1481),针对不一致样本,采用数字PCR试剂盒(部分购自新羿生物,部分自建)进行检测验证,经数字PCR试剂盒检测验证均为低丰度突变样本,检测结果与CE结果均一致,符合率100%(24/24)。如图6所示,展示了其中一例不一致样本结果,数字PCR检测丰度为3.5%,远高于公认的金标准sanger测序灵敏度20%。
由此,可说明本试剂盒经过对临床样本的检测,以及不同方法的验证,确定本试剂盒具有较高的灵敏度和准确性,能够准确的检测临床样本。
最后应说明的是,以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一种联合检测结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变的扩增体系,其特征在于,所述扩增体系包含扩增17个突变位点的引物组合,所述突变位点包括:
KRAS G13D,
KRAS G12D,
KRAS G12V,
KRAS G12A,
KRAS G12R,
KRAS G12S,
KRAS G12C,
KRAS Q61H,
KRAS K117N(351A>T),
KRAS K117N(351A>C),
KRAS Al46T,
KRAS A146P,
KRAS A146V,
NRAS G12D,
NRAS Q61R,
NRAS Q61K,
BRAF V600E;
所述引物包括如下特异性引物和荧光引物序列:
KRAS G13D特异性引物:ATTGTGGTAGTTGGAGCTGGAGA,
KRAS G12D特异性引物:GTACTTGTGGTAGTTGGAGCCGA,
KRAS G12V特异性引物:GTTTCTTCTTGTGGTAGTTGGAGTTGT,
KRAS G12A特异性引物:ATGACTGTAAACTTGTGGTAGTTGTAGCTGC,
KRAS G12R特异性引物:ATTCTGAATATGAACTTGTGGTAGTAGGAGCTC,
KRAS G12S特异性引物:GTTTCTTCTGACTATAAACTTGTGGTAGTTGGCGCTA,
KRAS G12C特异性引物:GATTCATTTACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTAGAGCTT,
KRAS G12&G13荧光引物:ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC,
KRAS Q61H特异性引物:GATCCCTCATTGCACTGTACTCCACG,
KRAS Q61H荧光引物:ACTGTAATAATCCAGACTGTGTTTC,
KRAS K117N(351A>T)特异性引物:ATGTCTACTGTTCTAGAAGGCAAATCAGAA,
KRAS K117N(351A>C)特异性引物:GCTACTGTTCTAGAAGGCAAATCACGG,
KRAS K117荧光引物:AGATATTTGTGTTACTAATGACTGTGC,
KRAS Al46T特异性引物:GATCGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAACATCCA,
KRAS A146P特异性引物:GGTTATGGAATTCCTTTTATTGAAGCATCAC,
KRAS A146V特异性引物:GATGGAATTCCTTTTATTGAAACATGAGT,
KRAS A146荧光引物:ATGACATAACAGTTATGATTTTGCAGAAAAC,
NRAS G12D特异性引物:AGAACTGGTGGTGGTTGGAGCTGA,
NRAS G12D荧光引物:ATAGGATCAGGTCAGCGGGCTAC,
NRAS Q61R特异性引物:ATTGACATACTGGATACAGCTGAACG,
NRAS Q61K特异性引物:GATCTTGGACATACTGGATACAGCTGGCA,
NRAS Q61荧光引物:GACTTGCTATTATTGATGGCAAATAC,
BRAF V600E特异性引物:ATCGAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACCGA,
BRAF V600E荧光引物:ATCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAG;
所述引物还包括如下内控引物序列:
KRAS G12&G13 内控引物序列:
GATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGCAT;
KRAS Q61H内控引物序列:
ATCCTCATGTACTGGTCCCTCATTGC;
KRAS K117内控引物序列:
ATGCCTGTTTTGTGTCTACTGTTCTAG;
KRAS A146内控引物序列:
ATCTTAGCAAGAAGTTATGGAATTCCTT;
NRAS G12D内控引物序列:
ATGTGAAATGACTGAGTACAAACTG;
NRAS Q61内控引物序列:
GATGGTGAAACCTGTTTGTTGGAC;
BRAF V600E内控引物序列:
GATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGG。
2.根据权利要求1所述扩增体系,其特征在于,所述引物还包括如下外控引物序列:
上游外控引物:AGTGCAGGCTGCCTATCAGAACGT;
下游外控引物:ATTAGGCAGAATCCAGATGCTCAAG。
3.根据权利要求1-2任一所述的扩增体系,其特征在于,所述内控引物:特异性引物:荧光引物的浓度比为1:2-6:2-4。
4.根据权利要求1-2任一所述的扩增体系,其特征在于,所述17个突变位点的引物分两组标记:KRAS K117N(351A>C)、NRAS Q61R、KRAS K117N(351A>T)、NRAS Q61K、KRAS Q61H、KRAS A146P、KRAS A146T、KRAS A146V 进行FAM荧光标记; KRAS G13D、KRAS G12D、KRASG12S、KRAS G12V、KRAS G12R、KRAS G12C、KRAS G12A、NRAS G12D、BRAF V600E 进行HEX荧光标记。
5.一种结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变联合检测的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-4任一所述的扩增体系。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒为MAF-PCR试剂盒;所述试剂盒中还包含以下成分:热启动Taq DNA聚合酶、 UDG酶、 PCR扩增缓冲液、 质控品和内标ROX500。
7.权利要求1-4任一所述的复合扩增体系在制备结直肠癌KRAS\NRAS\BRAF基因突变检测试剂盒中的用途。
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