CN116179482A - 一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，涉及高通量筛选抗原特异性抗体的技术领域。所述高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法主要包括B细胞的扩增、相应抗原的体外刺激以获得抗原特异性BCR，通过单细胞BCR配对高通量测序获得相应抗原肽刺激的Ig序列，从而获得抗原特异性重链与轻链配对BCR，本发明抗原特异性筛选过程准确性高，速度快，能够对已知病原和未知病原进行处理，同时能够同步处理多种抗原获得其对应的Ig序列，提升筛选的便捷性，降低筛选成本。

Description

一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法

技术领域

本发明涉及高通量筛选抗原特异性抗体的技术领域，具体涉及一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法。

背景技术

不同于其他药物开发，抗体药物在开发上存在天然挑战，即如何快速开发有效针对特异性抗原的中和抗体药物，这也是目前生物医药业行业所关注的本质问题。不管是多克隆抗体还是单克隆抗体或者是基因工程抗体的筛选，在技术上单次几十至几百的抗体筛选仍然处于低通量，与抗体谱的巨大数据相比，低通量技术只为我们揭示了抗体序列信息的冰山一角，而且获得序列信息包含大量非特异性的序列。目前抗体筛选的方法虽然有多种，但是仍需一种稳定，高效，高通量的抗体筛选方法。

随着高通量测序技术在抗体领域中的应用，使得一次测序可获得数以百万计的B细胞的抗体可变区域序列，越来越接近人体抗体谱真实数量，抗体的研究从而进入大数据时代。大容量和多样性好的抗体基因库是成功筛选功能抗体的基础。目前用于基因库筛选的所有展示技术均采用了一种表型选择压力的原理，即依赖于受体-配体的竞争结合力，这样的筛选过程一方面通过展示技术富集了目标抗体，另一方面可能导致筛选环节中的一些稀有分子、低结合力分子、可溶性表达量过低的分子或产量较低的抗体被漏筛。例如在筛选抗病毒的中和性抗体过程中，经常发现获得的高亲和力抗体没有较好的中和作用，这是因为获得的高亲和力抗体并不是针对中和作用的靶标，因而获得的抗体是不相关的抗体。而DNA测序过程没有选择压力，可以释放较完整的基因库的序列信息，有利于捕获目标基因。

目前通过测序来获得抗体库的方法：1.利用流式或微流控分选技术筛选出具有抗原结合功能的B淋巴细胞，然后进行高通量测序获得编码抗体的信息。未采用单细胞测序，因此在重链和轻链配对的过程中只能通过已有的大数据进行人工智能来预测配对情况，但是这个方法仅限于已有数据的抗体库，对于未知的抗原比如新冠，没有太多的抗体库可以作为参考，就需要大量的验证工作。2.在单细胞测序的应用下，可以获得B细胞的重链与轻链的配对信息。不管是在基于96孔或384孔的这种可自由设计的操作或成熟产品比如10x等单细胞制备仪器，都只能作为一个下游的单细胞测序应用中的一个工具，辅佐上游实验设计。

申请号为2021114340545的专利公开了“一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法”，主要是一种高通量测序的方法，但是其技术特征为TCR的相关测序，通过T淋巴细胞具有细胞毒性作用，具有识别肿瘤细胞或异己细胞进行杀伤作用，因此可将抗原特异性TCR通过基因工程技术构建TCR-T用于细胞免疫治疗。该现有技术其并不能直接应用于抗体药的开发和相应的实验研究，而对于可识别抗原的免疫受体蛋白(Ig)的相应研究则可以将Ig受体作为抗体药物直接用于治疗相关疾病，比如新冠的中和抗体药的开发。

另外凭借目前的生物学知识，仍旧很难通过抗体的基因(或蛋白)序列来预测一个单克隆抗体的生物学性质，如结合的亲和力、是否中和能力或信号通路激活能力等，所以需要将所获得的抗体基因信息，进行基因合成并构建到相应的表达载体中进行小量表达纯化后，进行功能学上面的验证；这一步骤既耗时、又耗费，同时由于早期筛选中仍旧存在着一定的非特异性结合，有很大比例的抗体不能特异性结合对应的抗原或具有相应的生物学功能。

这些通过测序获得抗体库的筛选仍然还需要前期抗体产生的设计平台。众所周知，B淋巴细胞作为原代细胞，在体外的培养需要各种细胞因子的辅助，细胞因子种类选择、培养浓度的优化等，对B淋巴细胞的存活率关系重大。如细胞因子浓度过低将不足以支持B淋巴细胞在体外的存活和抗体的分泌、而浓度过高又容易造成细胞凋亡；同时对于不同种属来源的B淋巴细胞，其培养条件也不尽相同。因此如何优化培养条件，提高B淋巴细胞在体外的存活率、和分泌单克隆抗体的能力，是该技术平台的核心问题。目前有研究团队从经免疫后的动物或人体内分选获得浆细胞(Plasma cell)，从中扩增编码抗体轻重链基因，从而获得相应的单克隆抗体。但由于浆细胞表面缺乏丰富的细胞表面标志物，且也没有结合于膜表面的IgG分子，无法利用流式细胞或其他相应技术对抗原特异性浆细胞进行分选，因此不大适合于高通量筛选；浆细胞作为B淋巴细胞的终极分化状态，目前尚未见有文献报道可以在体外进行培养；另外，从浆细胞中获得抗体的多样性如何，也需要进一步探讨。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，利用独特的实验设计，并基于特异性抗原获得相应的抗体表达平台再进行高通量测序技术获得所有相关抗体表达的序列信息，利用后续实验验证技术及生物信息学分析获得真实有效的抗体库，不仅实现B淋巴细胞的原代细胞的稳定扩增且获得有效刺激，而且实现测序结果准确，高效，高通量筛选抗体库的目的。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，所述筛选方法包括以下步骤：

(1)B细胞扩增，预留部分扩增细胞作为对照进行筛选并进行高通量测序；

(2)对剩余B细胞进行相应单一抗原或多抗原组合体外刺激；

(3)对刺激后的B细胞进行分选获得相应抗原特异性抗体表达的B细胞；

(4)对分选后的B细胞进行单细胞BCR高通量测序，分析并获得相应抗原肽刺激的Ig序列库。

优选的，所述高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法包括对于未知病原和已知病原的抗原特异性抗体Ig序列筛选。

优选的，所述对于未知病原的抗原特异性抗体Ig序列筛选的具体方式为从发病或已感染过的患者外周血样本中进行分离PBMC，经过HASI细胞培养技术平台培养扩增记忆B细胞，再通过患者相应的抗原多肽制备体外诱导B细胞扩增，获得相应抗原特异性抗体表达的B细胞进行高通量测序，通过生信分析获得潜在的抗原特异性的抗体表达序列。

优选的，所述对于已知病原的抗原特异性抗体Ig序列筛选的具体方式为根据数据库信息获得大量抗原多肽或新生抗原多肽，结合HASI细胞培养技术进行体外诱导刺激B淋巴细胞，筛选大量特异性抗体表达的B细胞并进行相应的单细胞BCR高通量测序，通过生信分析获得潜在的抗原特异性的抗体表达序列。

优选的，所述步骤(2)中抗原为相应的病毒抗原多肽或不同疾病的抗原肽组合。

优选的，对于未知病原的抗原特异性的抗体表达序列检测，在B细胞扩增和体外刺激过程中筛选出CD19+CD27-CD23+B细胞、CD27+CD38-B细胞进行高通量测序；对于已知病原的抗原特异性的抗体表达序列检测，在B细胞扩增和体外刺激过程中筛选出CD40+CD38-CD27 B细胞进行高通量测序。

本发明提供一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，与现有技术相比优点在于：

(1)本发明在相同的成本下，一次性可以获得不同疾病类型对应的抗原特异性BCR的信息。

(2)本发明可以直接获得抗原特异性BCR的重链轻链的配对信息。

(3)本发明中采用肿瘤或疾病相关多肽，抗原特异性筛选过程准确性高，速度快，可以区分背景BCR以及抗原特异性BCR。

附图说明：

图1为本发明实施例1中不同时间点每个抗原(A-H)对应刺激产生的抗原特异性BCR克隆频率总和；

图2为本发明实施例2中捐赠者1的外周血分离的B细胞进行高通量多肽抗原pool刺激，其产生不同抗原特异性BCR的表达分布图；

图3为本发明实施例2中捐赠者2的外周血分离的B细胞进行高通量多肽抗原pool刺激，其产生不同抗原特异性BCR的表达分布图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

用新冠表面蛋白进行激活的具体操作：

1、提前3天培养3T3-CD40L细胞系细胞(DMEM+10％FBS)；

2、分离患者外周血PBMC，并检测患者HLA类型；

3、将PBMC细胞用培养基重悬(1640培养基，10％胎牛血清，10mM HEPES，2mMGlutamax，1％双抗，50ng/ml IL-2，20ng/ml IL-4，2.5μg/ml CpG-C ODNs，10ng/mlAPRIL)，悬液按照1E5/ml的细胞密度配置与1E4/ml的3T3-CD40L细胞共同置于96孔板中培养，每孔250uL，放置37℃培养箱中培养7天；

4、7天之后收集96孔板中的细胞2000rpm离心5min，PBS清洗一遍，完全培养基清洗一遍；

5、收集细胞并将细胞沉淀重悬于10ml培养基中，计数；

6、用完全培养基(1640培养基，10％胎牛血清，10mM HEPES，2mM Glutamax，1％双抗，50ng/ml IL-2，20ng/ml IL-4，2.5μg/ml CpG-C ODNs，10ng/mlAPRIL)将细胞悬液配置成1E5/ml置于6孔板培养7天，每孔1ml，期间补充完全培养基；

7、7天以后收集扩增的B细胞并预留1E6的细胞进行筛选CD19+CD27-CD23+B细胞进行高通量测序，同时对CD27+CD38-B细胞进行高通量测序；

8、剩余的B细胞进行铺板，密度为5E6/ml的细胞；

9、根据已公布新冠病毒抗原的序列获得相应其表面蛋白序列进行合成；

10、根据抗原刺激方案添加多肽进行体外刺激(5ug/ml)；

11、分别刺激12、18、24、36小时以后进行收集并分选CD19+CD27-CD23+B细胞同时收集CD27+CD38-B细胞；

12、对分选后的细胞进行单细胞BCR高通量测序，分析并获得相应抗原肽刺激的BCR受体序列库，为后续中和试验等提供高效高通量的抗体库。

其具体筛选结果如下表1所示：

表1(SARS-CoV-2：YP_009724390.1)

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实施例2：

用不同疾病抗原肽进行刺激的具体操作：

1、提前3天培养MS5细胞系细胞(DMEM+10％FBS)；

2、分离健康人外周血PBMC，并检测其HLA类型；

3、将PBMC细胞用培养基(1640培养基，10％胎牛血清，10mM HEPES，2mM Glutamax，1％双抗，50ng/ml IL-2，20ng/ml IL-4，5ng/ml IL-21，50uMβ-ME，10ng/ml BAFF，1ug/mLR848)重悬，悬液按照1E5/ml的细胞密度配置与1E4/ml的MS5细胞共同培养于96孔板，每孔250uL，放置37℃培养箱中培养5天；

4、5天之后收集96孔板中的细胞2000rpm离心5min，PBS清洗一遍，完全培养基(1640培养基，10％胎牛血清，10mM HEPES，2mM Glutamax，1％双抗，50ng/ml IL-2，20ng/mlIL-4，5ng/ml IL-21，50uMβ-ME，10ng/ml BAFF)清洗一遍；

5、收集细胞并将细胞沉淀重悬于10ml培养基中，计数；

6、用完全培养基将细胞悬液配置成5E4/ml置于6孔板，每孔500ul，培养9天，期间补充完全培养基；

7、9天以后收集扩增的B细胞，预留1E6细胞分选CD40+CD38-CD27 B细胞进行免疫组高通量测序；

8、剩余的B细胞采用多抗原组合刺激进行铺板，密度为1E6/ml的细胞。

9、根据已有序列随机获得相应的疾病/病毒特异性的抗原表位多肽序列；

10、根据下表2中各病原设计多抗原组合刺激方案添加多肽pool进行体外刺激：

其中多抗原组合刺激的方式为将多种疾病/病毒的抗原进行不同浓度比例的混合后进行刺激，以下表2中的A、B组疾病/病毒为例，可按照以下相应的浓度配比：

Pool1:A(0.1ng/ml)+B(100ng/ml)

Pool2:A(1ng/ml)+B(10ng/ml)

Pool3:A(10ng/ml)+B(1ng/ml)

Pool4:A(100ng/ml)+B(0.1ng/ml)以此类推，对相应待检测的多组疾病/病毒进行组合后进行刺激，可以同时检测多组病原；

11、刺激24小时以后进行收集并分选CD40+CD38-CD27 B细胞；

12、分选后的细胞进行单细胞BCR高通量测序，分析并获得相应抗原肽刺激的BCR受体序列库，为后续中和试验等提供准确高效高通量的抗体库。

具体结果如下表2所示：

表2：

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参考表1、表2，通过高通量刺激扩增抗原特异性B细胞的方案并结合高通量测序获得大量抗原特异性Ig序列；通过优化扩增方案和算法分析配合单细胞测序后可高通量的获得每个抗原特异性的BCR heavy链和light链序列。

实施例3：

分离不同捐献者的外周血PBMC按照上述实施例2进行多抗原刺激，观察其产生不同抗原特异性BCR的表达分布，详见图2-图3。

参考图2-图3，不同来源的外周血分离的B细胞在进行高通量多肽抗原刺激后，产生不同抗原特异性BCR具有差异性，其相关BCR总频数与克隆种类数均不相同。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：

(1)B细胞扩增，预留部分扩增细胞作为对照进行筛选并进行高通量测序；

(2)对剩余B细胞进行相应单一抗原或多抗原组合体外刺激；

(3)对刺激后的B细胞进行分选获得相应抗原特异性抗体表达的B细胞；

(4)对分选后的B细胞进行单细胞BCR高通量测序，分析并获得相应抗原肽刺激的Ig序列库。

2.根据权利要求1所述的一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，其特征在于：所述高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法包括对于未知病原和已知病原的抗原特异性抗体Ig序列的筛选。

3.根据权利要求2所述的一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，其特征在于：所述对于未知病原的抗原特异性抗体Ig序列筛选的具体方式为从发病或已感染过的患者外周血样本中进行分离PBMC，经过HASI细胞培养技术平台培养扩增记忆B细胞，再通过患者相应的抗原多肽制备体外诱导B细胞扩增，获得相应抗原特异性抗体表达的B细胞进行高通量测序，通过生信分析获得潜在的抗原特异性的抗体表达序列。

4.根据权利要求2所述的一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，其特征在于：所述对于已知病原的抗原特异性抗体Ig序列筛选的具体方式为根据数据库信息获得大量抗原多肽或新生抗原多肽，结合HASI细胞培养技术进行体外诱导刺激B淋巴细胞，筛选大量特异性抗体表达的B细胞并进行相应的单细胞BCR高通量测序，通过生信分析获得潜在的抗原特异性的抗体表达序列。

5.根据权利要求1所述的一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，其特征在于：所述步骤(2)中抗原为相应的病毒抗原多肽或不同疾病的抗原肽组合。

6.根据权利要求2所述的一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，其特征在于：对于未知病原的抗原特异性的抗体表达序列检测，在B细胞扩增和体外刺激过程中筛选出CD19+CD27-CD23+B细胞、CD27+CD38-B细胞进行高通量测序；对于已知病原的抗原特异性的抗体表达序列检测，在B细胞扩增和体外刺激过程中筛选出CD40+CD38-CD27B细胞进行高通量测序。

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