CN116023356A - 羟基红花黄色素a的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然药物提取领域，具体涉及一种羟基红花黄色素A的制备方法。所述羟基红花黄色素A制备方法包括以下步骤：提取与浓缩；絮凝；HZ色谱3#树脂柱分离；HZ001阳离子树脂交换；凝胶柱分离；浓缩与干燥。本发明的制备方法解决了目前的羟基红花黄色素A提取工艺存在的流程长、收率低、生产成本高的问题。本发明提供了一种制备工艺流程短，耗能低，产品纯度高的羟基红花黄色素A制备方法，有效提高羟基红花黄色素A的收率。
Description
技术领域
本发明属于天然药物提取领域，具体涉及一种羟基红花黄色素A的制备方法。
背景技术
红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花。夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干。具有活血通经，散瘀止痛之功效。红花是一种常见的活血化淤中药，可用于治疗冠心病、心绞痛等诸多血液循环障碍。也用于治疗经闭，痛经，恶露不行，症瘕痞块，胸痹心痛，瘀滞腹痛，胸胁刺痛，跌扑损伤，疮疡肿痛。
红花中富含红花黄色素，且红花黄色素在所述红花中的比例为20％-30％。羟基红花黄色素A是红花黄色素的主要药效物质。羟基红花黄色A (Hydroxysafflor yellow A)是具有单查尔酮苷类结构的化合物，是红花药理功效的最有效水溶性部位，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合，是红花黄色素的活血化瘀有效成分。具有抗凝血酶诱导的血小板聚集活性，抗炎活性，细胞保护活性，和抗肿瘤活性，以及抗血小板和抗心肌缺血的功效。同时羟基红花黄色素A也可用于制作保健和化妆品，还是很好的食品染料。红花黄色素是天然食品染色剂。由于其呈鲜艳黄色，毒性极低，着色力强，色调稳定，被广泛应用于果汁型饮料、糖果、糕点彩装等食品着色。
现有技术中虽然已经公开了羟基红花黄色素A及其分离和纯化方法，如中国专利申请CN201010606888.5公开一种羟基红花黄色素A的制备方法，该方法利用高速逆流色谱从红花中快速大量制备高纯度羟基红花黄色素A，为红花制剂及羟基红花黄色素A的药理药效学研究提供了物质基础。中国专利申请CN02132781.5公开一种羟基红花黄色素A的制备方法，该制备方法通过提取、分离醇沉、纯化制备得到羟基红花黄色素A。
然而，现有的羟基红花黄色素A产品纯度不高。从现有的红花黄色素的纯度上来看，基本都存在10-20％以上的杂质物质，因此在分离之后还需要进一步继续纯化。这些杂质的结构性质均都未能定性，存在一定的质量不可控性。另外，目前的红花黄色素提取工艺还存在的流程长、能耗大、收率低、和生产成本高等问题。
本发明旨在提供一种羟基红花黄色素A的制备方法，采用了更加环保的浸提方法进行提取，相对于超声提取方法，显著降低了羟基红花黄色素A制备过程中的能耗水平，进而提供了一种能耗低，环保的制备方法。本来发明提供的羟基红花黄色素A制备方法具有工艺流程短，能耗低，环保，产品纯度高，有效降低了红花黄色素的生产成本。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种羟基红花黄色素A的制备方法，通过优化的工艺提取、分离和纯化步骤而获得的羟基红花黄色素A制备方法，提供一种能够快速、低成本制备高纯度的羟基红花黄色素A的方法。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种羟基红花黄色素A的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取与浓缩：取红花使用60-90％(体积浓度)的乙醇进行提取，将提取液进行浓缩，制得浓缩液；
(2)絮凝：将浓缩液使用脱乙酰基壳聚糖溶液进行絮凝，制得絮凝处理液；
(3)HZ色谱3#树脂柱分离：将絮凝处理液经HZ色谱3#树脂柱分离，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，收集洗脱液；
(4)HZ001阳离子树脂交换：将(3)中的洗脱液使用HZ001阳离子树脂进行交换处理，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，收集洗脱液；
(5)凝胶柱分离：将(4)中洗脱液经过LH-20凝胶柱分离，上样后用纯化水洗脱，上样洗脱速度为0.2-0.4BV/h，收集洗脱液；
(6)浓缩与干燥：减压浓缩至干，粉碎成细粉，乙醇50℃保温搅拌2小时，抽滤，滤饼再用乙醇浸泡洗涤2次，抽滤，后进行真空干燥，得到羟基红花黄色素A。
优选地，(1)中，所述提取使用80-90％的乙醇(体积浓度)提取。
优选地，(1)中，所述提取的温度为65-70℃。
优选地，(2)中，絮凝时使用的试剂为1％浓度的冰乙酸制成的含2％脱乙酰基壳聚糖的溶液。
优选地，(2)中，所述絮凝的处理过程为：先将搅拌速度降低至15-60rpm搅拌下搅拌后，加入红花药材量4-6％的硅藻土进行处理5-10min，静置1-3h。
优选地，(2)中，所述絮凝的处理过程为：先将搅拌速度降低至15-60rpm搅拌下搅拌后，加入红花药材量5％的硅藻土进行处理5min，静置2h。
优选地，(2)中，所述絮凝的处理过程为在80rpm的搅拌速度状态下加入药材量3.0-3.5％的1％冰乙酸制2％脱乙酰基壳聚糖溶液，继续搅拌1-5分钟，降低搅拌速度至15-60rpm后加入药材量5％的硅藻土搅拌5分钟，静置2小时。
优选地，(3)中，所述HZ色谱3#树脂柱分离，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时(洗脱液用紫外检测器在403nm吸收波长下监测到强烈吸收时或洗脱液的白利度由10°Bx降至8°Bx时，或洗脱液颜色明显由浅黄色转为浅红色)开始以每份0.02-0.04BV分段收集洗脱液5-10份，分别取1μ点样于同一聚酰胺板于35-40％的乙酸中展开，合并斑点明显的洗脱液并继续收集洗脱液至1-2BV。
优选地，(3)中，所述HZ色谱3#树脂柱分离，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时，开始以每份0.04BV分段收集洗脱液8份，分别取1μ点样于同一聚酰胺板于36％乙酸中展开，合并斑点明显的洗脱液并继续收集洗脱液至1.5BV。
优选地，(4)中，所述HZ001阳离子树脂交换，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，当流出液开始变黄时开始收集，收集量为上样药液量及柱床体积之和，收集液用氨水调节pH至4.2-4.7，45℃以下减压浓缩至20-30℃下的相对密度为1.07-1.10。
优选地，(5)中，所述凝胶柱分离，凝胶柱为LH-20柱，上样后用纯化水洗脱，上样洗脱速度为0.2-0.4BV/h，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时开始以每份0.02-0.04BV收集6-8份，再以每份0.02-0.04BV收集，收集总量为0.3BV，分别取1μl点样于同一聚酰胺板于30-40％乙酸中展开，合并亮黄色斑点明显的洗脱液。
优选地，(5)中，所述乙酸为36％的乙酸。
优选地，(6)中，所述浓缩与干燥在40-60℃下，优选为45℃，进行减压浓缩。
优选地，(6)中，将减压浓缩的产物进行粉碎成细粉，然后填加细粉8-10倍量(V/W)的乙醇在40-60℃下保温搅拌1-3小时，抽滤，滤饼再用乙醇浸泡洗涤1-3次；再在30-50℃、-0.090--0.050MPa真空下，干燥4-8小时后，向干燥箱中放入1/3-2/3的湿品量厚度的五氧化二磷，继续在30-50℃、-0.090--0.050MPa真空干燥4-8小时。
优选地，(6)中，所述浓缩与干燥过程为：将凝胶柱分离后的样品，在45℃以下减压浓缩至干，粉碎成细粉，加细粉的9倍量(V/W)乙醇50℃保温搅拌2小时，抽滤，滤饼再用乙醇浸泡洗涤2次，每次用细粉量的2倍量(V/W)，抽滤，湿品置托盘中控制厚度约0.3g/cm2，30℃、-0.090MPa真空干燥5小时后向干燥箱中放入1/3湿品量等厚度五氧化二磷，继续50℃、-0.090MPa真空干燥5小时，即得羟基红花黄色素A。
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
(1)本发明提供一种制备羟基红花黄色素A化合物的新方法，通过优化的工艺提取、分离和纯化步骤而获得的羟基红花黄色素A制备方法，提供一种能够快速、低成本制备高度的羟基红花黄色素A的方法。
(2)本发明提供的制备方法具有工艺流程短，耗能低，产品纯度高，有效降低了红花黄色素的生产成本，能够快速，低成本制备高纯度的羟基红花黄色素A。
附图说明
图1：实施例1产物的液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1.提取与浓缩
取红花，提取溶液为80％乙醇68℃浸提二次，第一次12倍量(V/W)提取1.5小时，第二次10倍量(V/W)提取1小时，滤过，药渣离心，药液合并，45℃以下减压浓缩至相对密度1.03(45℃)。
2.絮凝
在80rpm的搅拌速度状态下加入药材量3.3％的1％冰乙酸制2％脱乙酰基壳聚糖溶液，继续搅拌5分钟，降低搅拌速度至30rpm后加入药材量5％的硅藻土搅拌5分钟，静置2小时，离心。
3.HZ色谱3#树脂柱分离
将絮凝后的样品以0.5BV/h的速度上样于HZ色谱3#树脂柱(购于上海华震科技有限公司)，(100～150目，柱床高度800mm，每1ml树脂上样药液量以药材计不超过[14.3(mg/g)÷药材羟基红花黄色素A含量(mg/g)÷90％(转移率)×80％]g或以羟基红花黄色素A计不超过11mg，药液温度为常温，再生时以1BV/h的速度依次用1％氢氧化钠、纯化水、70％乙醇分别洗脱1BV，再用纯化水洗脱约3BV至无醇，上样后用纯化水以0.75BV/h的速度洗脱，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时(洗脱液用紫外检测器在403nm吸收波长下监测到强烈吸收时或洗脱液的白利度由10°Bx降至8°Bx时，或洗脱液颜色明显由浅黄色转为浅红色)，开始以每份约0.04BV分段收集洗脱液8份，分别取1μ点样于同一聚酰胺板于36％乙酸中展开，合并斑点明显的洗脱液并继续收集洗脱液至1.5BV。
4.HZ001阳离子树脂交换
以0.5BV/h的速度上样于HZ001阳离子树脂交换柱(50～80目，柱床高度不低于800mm，每1ml树脂上样药液量以药材计不超过2.1g，药液温度为常温，再生时以1BV/h的速度用4％盐酸溶液洗脱4BV，再用约4BV的纯化水洗脱至pH约4)，上样后用纯化水以0.5BV/h的速度洗脱，当流出液开始变黄时开始收集，收集量为上样药液量及柱床体积之和，收集液用氨水调节pH至约4.5，45℃以下减压浓缩至相对密度约1.08(25℃)。
5.凝胶柱分离
上样于LH-20柱(Fine，柱床高度800mm，每1ml凝胶上样药液量以药材计不超过0.7g，且药液体积不超过凝胶柱体积的10％，上样药液温度为常温，再生时以0.3BV/h的速度用0.3％碳酸钠溶液洗脱0.2BV，再用约1.5BV纯化水洗脱至中性)，上样后用纯化水洗脱，上样洗脱速度均为0.3BV/h，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时开始以每份约0.02BV收集7份，再以每份约0.03BV收集，收集总量约为0.3BV，分别取1μl点样于同一聚酰胺板于36％乙酸中展开，合并亮黄色斑点明显的洗脱液。
6.浓缩与干燥
将凝胶柱分离后的样品，在45℃以下减压浓缩至干，粉碎成细粉，加细粉的9倍量(V/W)乙醇50℃保温搅拌2小时，抽滤，滤饼再用乙醇浸泡洗涤2次，每次用细粉量的2倍量(V/W)，抽滤，湿品置托盘中控制厚度约0.3g/cm2，30℃、-0.090MPa真空干燥约5小时后向干燥箱中放入1/3湿品量等厚度五氧化二磷，继续50℃、-0.090MPa真空干燥约5小时，即得羟基红花黄色素A。羟基红花黄色素A的纯度为98.7％。
实施例2
1.提取与浓缩
取红花，提取溶液为80％乙醇68℃浸提二次，第一次12倍量(V/W)提取1.5小时，第二次10倍量(V/W)提取1小时，滤过，药渣离心，药液合并，45℃以下减压浓缩至相对密度1.03(45℃)。
2.絮凝
在80rpm的搅拌速度状态下加入药材量3.3％的1％冰乙酸制2％脱乙酰基壳聚糖溶液，继续搅拌5分钟，降低搅拌速度至30rpm后加入药材量5％的硅藻土搅拌5分钟，静置2小时，离心。
3.HZ-816树脂柱分离
将絮凝后的样品以0.5BV/h的速度上样于HZ-816树脂柱(100～150目，柱床高度800mm，每1ml树脂上样药液量以药材计不超过[14.3(mg/g)÷药材羟基红花黄色素A含量(mg/g)÷90％(转移率)×80％]g或以羟基红花黄色素A计不超过11mg，药液温度为常温，上样后用用30％乙醇以0.5BV/h的速度洗脱，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时(洗脱液用紫外检测器在403nm吸收波长下监测到强烈吸收时或洗脱液的白利度由10°Bx降至8°Bx时，或洗脱液颜色明显由浅黄色转为浅红色)，开始以每份约0.04BV分段收集洗脱液8份，分别取1μ点样于同一聚酰胺板于36％乙酸中展开，合并斑点明显的洗脱液并继续收集洗脱液至1.5BV。
4. 724树脂柱分离
以0.5BV/h的速度上样于724树脂柱(50～80目，柱床高度不低于800mm，每1ml树脂上样药液量以药材计不超过2.1g，药液温度为常温，再生时以1BV/h的速度用4％盐酸溶液洗脱4BV，再用约4BV的纯化水洗脱至pH约4)，上样后用纯化水以0.75BV/h的速度洗脱，当流出液开始变黄时开始收集，收集量为上样药液量及柱床体积之和，收集液用氨水调节pH至约4.5，45℃以下减压浓缩至相对密度约1.07(45℃)。
5.凝胶柱分离
上样于LH-20柱(Fine，柱床高度800mm，每1ml凝胶上样药液量以药材计不超过0.7g，且药液体积不超过凝胶柱体积的10％，上样药液温度为常温，再生时以0.3BV/h的速度用0.3％碳酸钠溶液洗脱约0.2BV，再用约1.5BV纯化水洗脱至中性)，上样后用纯化水洗脱，上样洗脱速度均为0.3BV/h，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时开始以每份约0.02BV收集7份，再以每份约0.03BV收集，收集总量约为0.3BV，分别取1μl点样于同一聚酰胺板于36％乙酸中展开，合并亮黄色斑点明显的洗脱液。
6.浓缩与干燥
将凝胶柱分离后的样品，在45℃以下减压浓缩至干，粉碎成细粉，加细粉的9倍量(V/W)乙醇50℃保温搅拌2小时，抽滤，滤饼再用乙醇浸泡洗涤2次，每次用细粉量的2倍量(V/W)，抽滤，湿品置托盘中控制厚度约0.3g/cm2，30℃、-0.090MPa真空干燥约5小时后向干燥箱中放入1/3湿品量等厚度五氧化二磷，继续50℃、-0.090MPa真空干燥约5小时，即得羟基红花黄色素A。羟基红花黄色素A的纯度为90.1％。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种羟基红花黄色素A的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取与浓缩：取红花使用60-90％的乙醇进行提取，将提取液进行浓缩，制得浓缩液；
(2)絮凝：将浓缩液使用壳聚糖和/或硅藻土进行絮凝，制得絮凝处理液；
(3)HZ色谱3#树脂柱分离：将絮凝处理液经HZ色谱3#树脂柱分离，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，收集洗脱液；
(4)HZ001阳离子树脂交换：将(3)中的洗脱液使用HZ001阳离子树脂进行交换处理，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，收集洗脱液；
(5)凝胶柱分离：将(4)中洗脱液经过LH-20凝胶柱分离，上样后用纯化水洗脱，上样洗脱速度为0.2-0.4BV/h，收集洗脱液；
(6)浓缩与干燥：将(5)中洗脱液进行浓缩与干燥，得到羟基红花黄色素A。
2.根据权利要求1所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(1)中，所述提取使用80-90％的乙醇提取；所述提取的温度为65-70℃。
3.根据权利要求1所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(2)中，所述絮凝使用的试剂为1％浓度的冰乙酸制成的含2％脱乙酰基壳聚糖的溶液。
4.根据权利要求3所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(2)中，所述絮凝的处理过程还包括在壳聚糖溶液处理后将搅拌速度降低至15-60rpm搅拌下后，加入红花药材量4-6％的硅藻土进行处理5-10min，静置1-3h。
5.根据权利要求1所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(3)中，所述HZ色谱3#树脂柱分离，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时开始以每份0.02-0.04BV分段收集洗脱液5-10份，分别取1μ点样于同一聚酰胺板于35-40％的乙酸中展开，合并斑点明显的洗脱液并继续收集洗脱液至1-2BV。
6.根据权利要求1所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(4)中，所述HZ001阳离子树脂交换，上样后用纯化水以0.5-1BV/h的速度洗脱，当流出液开始变黄时开始收集，收集量为上样药液量及柱床体积之和，收集液用氨水调节pH至4.2-4.7，45℃以下减压浓缩至20-30℃下的相对密度为1.07-1.10。
7.根据权利要求1所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(5)中，所述凝胶柱分离，凝胶柱为LH-20柱，上样后用纯化水洗脱，上样洗脱速度为0.2-0.4BV/h，当羟基红花黄色素A黄色色带到达柱子底部时开始以每份0.02-0.04BV收集6-8份，再以每份0.02-0.04BV收集，收集总量为0.3BV，分别取1μl点样于同一聚酰胺板于30-40％乙酸中展开，合并亮黄色斑点明显的洗脱液。
8.根据权利要求1所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(6)中，所述浓缩与干燥在40-60℃下，进行减压浓缩。
9.根据权利要求1-8任一所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(6)中，将减压浓缩的产物进行粉碎成细粉，然后填加细粉8-10倍量的乙醇在40-60℃下保温搅拌1-3小时，抽滤，滤饼再用乙醇浸泡洗涤1-3次；再在30-50℃、-0.090--0.050MPa真空下，干燥4-8小时后，向干燥箱中放入1/3-2/3的湿品量厚度的五氧化二磷，继续在30-50℃、-0.090-
-0.050MPa真空干燥4-8小时。
10.根据权利要求1所述的羟基红花黄色素A的制备方法，其特征在于，(6)中，所述浓缩与干燥过程为：将凝胶柱分离后的样品，在45℃以下减压浓缩至干，粉碎成细粉，加细粉的9倍量乙醇50℃保温搅拌2小时，抽滤，滤饼再用乙醇浸泡洗涤2次，每次用细粉量的2倍量，抽滤，湿品置托盘中控制厚度约0.3g/cm2，30℃、-0.090MPa真空干燥5小时后向干燥箱中放入1/3湿品量等厚度五氧化二磷，继续50℃、-0.090MPa真空干燥5小时，即得羟基红花黄色素A。
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| CN101195647A (zh) * | 2006-12-06 | 2008-06-11 | 杨炜 | 羟基红花黄色素a及其制备方法和应用 |
| CN102127124A (zh) * | 2010-12-27 | 2011-07-20 | 中国科学院新疆理化技术研究所 | 一种羟基红花黄色素a的制备方法 |
| CN102702150A (zh) * | 2012-06-19 | 2012-10-03 | 浙江永宁药业股份有限公司 | 一种羟基红花黄色素a的制备方法和应用 |
| CN106810525A (zh) * | 2015-12-02 | 2017-06-09 | 武汉绿孚生物工程有限责任公司 | 一种从红花中提取羟基红花黄色素a的方法 |
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