CN115044538A - 一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用,该方法利用患者来源含有自然感染HPV细胞,在气液界面(Air‑liquid interface,ALI)3D分化培养,可直接观察到HPV复制的完整周期和子代病毒。收集ALI 3D分化培养物DNA,通过标准pUC19‑HPV18E2/E7质粒作参照,可以计算出HPV18DNA拷贝数。经过药物处理ALI 3D分化培养物,可以直接分析药物对HPV DNA拷贝数的作用效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物动物细胞系技术领域,特别涉及一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用。
背景技术
人***瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一种最小的双链DNA病毒,多数的HPV感染在一定时期内会被机体的免疫***清除,但高危型人***瘤病毒(HR-HPV)的持续感染可进展为癌前病变和HPV相关的癌症,包括泌尿生殖道肿瘤(***、***癌、***癌、***癌)以及头颈肿瘤。***前病变称为宫颈上皮内瘤样病变(cervicalintraepithelial neoplasia,CIN),根据病情进展程度分为不同级别CIN I、CIN II、CINIII。随着病情的恶化,最终进展为***。
虽然HPV疫苗可以预防限定的几种HPV亚型病毒的感染,但是对于已经感染HPV的患者没有保护作用。而且HPV疫苗在不同国家的可及性、接种意愿、接种率和保护效率存在较大差异,预计在未来几十年里,HPV感染导致的癌前病变及癌症仍将是对于人类健康的主要威胁之一。由于缺乏自然感染的HPV体外模型及其生物学特征的研究,迄今为止还没有靶向HPV感染及HPV所致癌前病变和肿瘤的有效治疗药物。
因此,急需开发一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法。
发明内容
本发明目的是提供一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用,建立目前世界上唯一的患者来源自然感染HPV的ALI 3D模型,该模型采用3D培养,结合患者来源自然感染HPV的CIN细胞,可以在体外直观研究HPV复制的完整周期,可以通过病毒拷贝数变化来筛选抗HPV药物。
为实现所述目的,本发明采用如下技术方案:
在本发明的第一方面,提供了一种抗人***瘤病毒药物筛选模型的构建方法,所述方法包括:
将多个Millicell***式细胞培养皿分别置于六孔板的每个单孔中,形成六个含有内孔和外孔的培养装置,即包括Millicell***式细胞培养皿组成的内孔,以及位于所述内孔外周与所述六孔板之间形成的外孔;
将原代上皮细胞培养基重悬保藏编号为CCTCC NO:C2015124的含有自然感染HPV18的女性宫颈上皮内瘤样病变细胞,并接种到所述内孔中;
将原代上皮细胞培养基加入到所述外孔中;
将所述含有内孔和外孔的培养装置于湿热培养箱中培养,培养48h后将所述内孔和所述外孔中的培养基均更换为分化培养基;
将所述含有内孔和外孔的培养装置置于湿热培养箱中平衡,以使内孔中的细胞与细胞之间形成紧密连接;
移除所述内孔和所述外孔中所有的培养基,向所述外孔中加入分化培养基,置于湿热培养箱中进行3D分化培养,获得抗人***瘤病毒药物筛选模型。
进一步地,所述Millicell***式细胞培养皿的直径为0.4μm,所述六孔板的每个单孔中放≤3个所述Millicell***式细胞培养皿。
进一步地,所述重悬中,用300μl的原代上皮细胞培养基重悬5×105个保藏编号为CCTCC NO:C2015124的含有自然感染HPV18的女性宫颈上皮内瘤样病变细胞,并接种0.3ml到所述内孔中。
进一步地,每个所述外孔加入3.5ml的所述原代上皮细胞培养基。
进一步地,所述平衡的时间为14~18h。
进一步地,所述分化培养中,向所述外孔中加入2ml的分化培养基,且每2天更换所述外孔中的分化培养基。
在本发明的第二方面,提供了采用所述方法制备得到的抗人***瘤病毒药物筛选模型。
在本发明的第三方面,提供了所述的抗人***瘤病毒药物筛选模型在筛选抗人***瘤病毒药物中的应用。
进一步地,所述应用的方法包括:
将含有病毒基因的标准质粒进行梯度稀释,获得连续梯度浓度的不同标准品,并计算对应标准品的DNA拷贝数;
对所述各标准品的HPV18E7区域进行QPCR定量,得到的Ct值为y轴,Log起始拷贝数为x轴,通过Bio-Rad软件绘制标准曲线,获得线性方程式;
在ALI 3D分化培养的第10~12天加入药物处理,分化培养至17~19天,收集DNA样本;后对所述样本目的DNA的HPV18E7区域进行QPCR定量,得到的Ct值代入所述线性方程式,获得HPV18 DNA起始拷贝数,通过所述拷贝数评价药物对患者来源自然感染HPV的抑制效果。
进一步地,所述含有病毒基因的标准质粒为pUC19-HPV18 E2/E7质粒。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
本发明实施例提供的一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用,所述模型基于患者来源自然感染HPV的细胞,在气液界面ALI 3D分化培养条件下,首次可以直接地观察到自然感染的HPV病毒在体外的复制与增殖并完成子代病毒的包装成熟。在此ALI3D分化培养物上,加入抗病毒药物处理后,收集ALI 3D分化培养的不同时间点的DNA,通过计算病毒拷贝数的变化,可直观分析药物抑制HPV的效果,从而进行抗HPV药物的筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1含有HPV18宫颈上皮内瘤样病变(CIN)细胞及其ALI 3D培养的药物筛选体系的构建;
图2为ALI 3D分化培养的人宫颈上皮内瘤样病变细胞的HPV18 DNA拷贝数增加;
图3为ALI 3D分化培养的人宫颈上皮内瘤样病变细胞中观察到成熟子代病毒颗粒;
图4为伏立诺他(Vorinostat)在ALI 3D培养条件下对HPV18 DNA拷贝数的抑制作用;
图5为KU55933在ALI 3D培养条件下对HPV18 DNA拷贝数的抑制作用;
图6为绘制的标准曲线图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明实施例,本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例,而非限制本发明实施例。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
除非另有特别说明,本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明实施例提供一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用,总体思路如下:
目前的HPV理论知识主要来自***细胞系或转染外源HPV病毒基因建立的细胞系,如CaSki或HeLa,分别为整合型的HPV16或HPV18***细胞株。由于原代上皮细胞培养一直以来都是极其困难的,很难建立来自于患者的HPV自然感染的原代上皮细胞,到目前为止,还未报道过含有HPV18的来自女性生殖道组织的癌前病变及癌细胞株。
本发明采用的细胞系即患者来源自然感染HPV18细胞(CIN18)的分类命名为人宫颈上皮内瘤变细胞HCINC/HL-017,保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC,地址:中国.武汉.武汉大学,邮编:430072,保藏编号为CCTCC NO:C2015124。该细胞系来源的临床标本为HPV18感染患者的宫颈上皮内瘤样病变临床组织样本1–2cm3,无其它治疗。该细胞未导入任何外源基因,病毒来自自然感染的CIN组织。该细胞显微镜下观察细胞的形态,排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。经PCR鉴定,表明该株细胞为自然感染的携带有HPV18亚型。以上内容详细记载于授权公告号为CN109666643A的专利中。
将所述细胞系通过本发明的3D培养方法获得了抗人***瘤病毒药物筛选模型,具体地,所述方法包括:
步骤S1、将多个Millicell***式细胞培养皿分别置于六孔板的每个单孔中,形成六个含有内孔和外孔的培养装置,即包括Millicell***式细胞培养皿组成的内孔,以及位于所述内孔外周与所述六孔板之间形成的外孔;
作为一种具体的实施方式,
所述Millicell***式细胞培养皿的直径为0.4μm,所述六孔板的每个单孔中放≤3个所述Millicell***式细胞培养皿。
在其他实施方式中,所述六孔板替换为其他孔板,所述Millicell***式细胞培养皿的直径可根据需要进行选择。
步骤S2、将原代上皮细胞培养基重悬保藏编号为CCTCC NO:C2015124的含有自然感染HPV18的女性宫颈上皮内瘤样病变细胞,并接种到所述内孔中;
作为一种具体的实施方式,
所述重悬中,用300μl的原代上皮细胞培养基重悬5×105个保藏编号为CCTCC NO:C2015124的含有自然感染HPV18的女性宫颈上皮内瘤样病变细胞,并接种0.3ml到所述内孔中。
步骤S3、将原代上皮细胞培养基加入到所述外孔中;
作为一个具体的实施方式,
每个所述外孔加入3.5ml的所述原代上皮细胞培养基。所述原代上皮细胞培养基的配方为DMEM与Ham's F 12NUTRIENT MIX按体积比4:1混合的培养基,同时添加4~6%(v/v%)胎牛血清(FBS)、1~3nM三腆甲状腺氨酸(triiodothyronine),0.4~0.65%胰岛素(insulin)试剂、9~11ng/mL表皮生长因子(epithelial growth factor〈EGF〉)、0.3~0.5μg/mL氢化可的松(hydro-cortisone)、35~45μg/mL庆大霉素(gentamicin)、45~55nMcalpeptin、35~45ng/ml重组人IL-lRA,及3μg/ml重组人R-Spondin-1。
步骤S4、将所述含有内孔和外孔的培养装置于湿热培养箱中培养,培养48h后将所述内孔和所述外孔中的培养基均更换为分化培养基;
步骤S5、将所述含有内孔和外孔的培养装置置于湿热培养箱中平衡,以使内孔中的细胞与细胞之间形成紧密连接;
所述平衡的时间为14~18h。
步骤S6、移除所述内孔和所述外孔中所有的培养基,向所述外孔中加入分化培养基,置于湿热培养箱中进行3D分化培养,获得抗人***瘤病毒药物筛选模型。
所述分化培养中,向所述外孔中加入2ml的分化培养基,且每2天更换所述外孔中的分化培养基。
所述分化培养基的配方为:
DMEM与F12按体积比1:1混合的培养基,同时添加0.5-1.2μM胰岛素(Sigma-Aldrich I6634)、0.05-0.2μM铁传递蛋白(Sigma-Aldrich T0665),0.05-0.15μM氢化可的松(Sigma-Aldrich H0396),0.005-0.015μM三碘甲状腺氨酸(Sigma-Aldrich T6397),1-4μM肾上腺素(Sigma-Aldrich E4642),0.1-1ng/mL表皮生长因子,2x 10–8-8x 10–8M视黄酸(Sigma-Aldrich R2625),0.1-1μM磷酸乙醇胺(Sigma-Aldrich P0503),0.1-1μM氨基乙醇(Sigma-Aldrich E0135),1-5μM硫酸锌(Sigma-Aldrich Z0251),100U/mL青霉素G硫酸(Sigma-Aldrich P3032),100μg/mL链霉素硫酸盐(Sigma-Aldrich S9137),0.5-1.5mM氯化钙(Sigma-Aldrich C3881)。
ALI 3D分化培养14d、16d、18d、20d提取DNA,Q-PCR分析HPV18 DNA拷贝数随分化时间延长逐渐增加如图2。进一步收集ALI 3D培养18d的样本,透射电镜观察到了成熟病毒颗粒如图3。说明HPV18在ALI 3D分化过程中不仅启动了病毒复制增殖,还完成了病毒颗粒包装的整个生命周期。
利用ALI 3D培养患者来源自然感染HPV的细胞,药物处理后,通过病毒拷贝数的变化,观察药物对HPV病毒的抑制效果。
综上表明,该模型采用3D培养,结合患者来源自然感染HPV的CIN细胞,可以在体外直观研究HPV复制的完整周期,可以通过病毒拷贝数变化来筛选抗HPV药物。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用进行详细说明。
实施例1、一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法
1、本发明一种抗人***瘤病毒药物筛选模型的构建方法,所述方法包括:
气液界面(ALI)3D培养,又称类器官筏式培养,具体如下:
(1)将0.4μm的Millicell PCF insert(12mm size,Millipore)放入六孔板中,每孔最多放3个inserts。
(2)用300μl的原代上皮细胞培养基重悬5×105个人宫颈上皮细胞(保藏编号为CCTCC NO:C2015124),然后接种到每个insert中。
(3)每个孔板内部即insert***加入3.5ml的原代上皮细胞培养基。
(4)将放有insert的六孔板放入37℃,5%CO2湿热培养箱中培养48小时。
(5)将insert内部及外部中的培养基更换为分化培养基。
(6)将放有insert的培养皿放入湿热培养箱中平衡约16小时,使insert内部的细胞与细胞之间形成紧密连接。
(7)移除insert内部及外部所有的培养基,外部的培养皿中加入2ml的分化培养基,开始3D分化培养。
(8)在37℃,5%CO2湿热培养箱中培养宫颈上皮内瘤样病变细胞14天。每2天更换insert***的培养基。分化14d、16d、18d、20d收样。如果是给药处理,就用分化培养基配药,分化第11天到第18天连续给药,第18天收样。
2、透射电子显微镜观察病毒颗粒
CIN细胞在ALI 3D培养的14天、16天、18天、20天,收集3D分化培养物,用电子显微镜专用固定剂(武汉大学医学生物结构研究中心提供)固定,连续超薄切片并制作成铜网,透射电镜下观察并拍照。
结果如图3所示,表明透射电镜观察到了成熟病毒颗粒。
实施例2、病毒拷贝数的计算
1、将含有病毒基因的标准质粒进行梯度稀释,获得连续梯度浓度的不同标准品,DNA拷贝数计算公式:copies/mL=(6.02×1023copies/mol)×(C g/mL)/(MW g/mol),MW=base counts×660(daltons/base)。再通过上述计算公式并计算对应标准品的DNA拷贝数;
所述含有病毒基因的标准质粒为pUC19-HPV18 E2/E7质粒。构建方法为:
①载体线性化:EcoRⅠ酶切环状pUC19 DNA,凝胶电泳分离酶切产物后,切胶回收DNA条带,并使用Nanodrop-ND5000测定回收的DNA浓度,此时回收的DNA就是线性化的pUC19。
②利用ABclonal的MultiF Seamless Assembly Mix的说明书设计目的基因的引物,从而使***的目的片段与线性化pUC19载体之间,具有能够同源拼接的Overlaps序列(一般是20-25bp)。
表1
③目的基因的获取:用Takara的高保真酶PCR扩增含有Overlaps序列的DNA片段。
④同源重组反应体系:
表2
DNA片段pmol数计算公式如下:pmol=(质量ng)×1000/(碱基对数×650Da),载体使用量为80ng左右,***片段总pmol量是载体总pmol量3倍时,克隆效率最好。
⑤同源重组反应条件:反应混合物在50℃条件下孵育30min。最后,将反应产物立即冰浴,再进行DH5α转化及克隆筛选。
2、将标准品pUC19-HPV18 E2/E7依次10倍梯度稀释5次,共得到6个不同浓度(具体为原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)的标准品(10倍浓度梯度),将对应的数值分别代入上述公式中,计算出不同浓度的标准品对应的起始拷贝数,以不同浓度的标准品为模板,利用表3中的引物HPV18 E7-F和HPV18 E7-R(β-actin作为内参)对其进行荧光定量PCR(Q-PCR),反应结束后可得到不同浓度模板的Ct值,由于每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数Log copies存在一定的线性关系,以起始拷贝数的对数Log copies为横坐标,Ct值为纵坐标,通过Bio-Rad软件绘制标准曲线,获得线性方程式(如图6),具体为y=-2.864x+42.728,R2=0.985。
表3
3、以样本目的DNA为模板,同样对其HPV18E7区域进行QPCR定量。得到的Ct值代入线性方程式,从而可以获得HPV18 DNA起始拷贝数。
4、采用上述方法计算ALI 3D分化培养14d、16d、18d、20d的HPV18 DNA拷贝数,结果如图2所示,表明ALI 3D分化培养14d、16d、18d、20d提取DNA,Q-PCR分析HPV18DNA拷贝数随分化时间延长逐渐增加。
上述图2和图3的结果说明HPV18在ALI 3D分化过程中不仅启动了病毒复制增殖,还完成了病毒颗粒包装的整个生命周期。
实施例3、基于ALI 3D培养条件下患者来源自然感染HPV细胞的病毒拷贝数筛选抗HPV药物的方法
1、在正常***上皮细胞和患者来源自然感染HPV18的CIN细胞上测定药物毒性和抑制率。伏立诺他(Vorinostat)和KU-55933(ATM抑制剂)为例。
(1)将细胞用0.05%胰酶消化,制备成单细胞悬液;
(2)接种于96孔板,每孔接种细胞悬液100μL,每孔约为2500个细胞,于37℃、5%CO2培养箱培养过;
(3)加入药物处理24h后,采用CCK8测定细胞存活率。
(4)得到的数据用GraphPad Prism 8.0.1处理并绘图,再分别计算CC50或IC50。
立诺他(Vorinostat)和KU-55933的药物毒性CC50的结果如表4所示。
表4
组别 | CIN18(CC50) | 正常***上皮细胞(CC50) |
伏立诺他(Vorinostat) | 5.204μM | 16.907μM |
KU-55933 | 14.235μM | 16.752μM |
2、在ALI 3D分化培养的第11天加入药物处理,分化培养至18天,收集DNA样本,计算HPV18 DNA拷贝数。
1)ALI培养物DNA提取
ALI培养物在分化14d、16d、18d、20d收样。如果是给药处理,就用分化培养基配药(DMSO为对照),分化第11天到第18天连续给药,第18天收样。
2)将ALI 3D培养物的insert上的组织刮下来后,按照商业化DNA提前试剂说明书提取样本总DNA。最后用Nanodrop-ND5000测样品DNA总浓度。
3)制作标准曲线
线性方程式见实施例2。
4)通过QPCR对HPV 18DNA扩增进行分析
以3D培养物的DNA为模板,同样采用表1的引物对其HPV18E7区域进行QPCR定量。得到的Ct值代入上述线性方程式,从而可以获得HPV18 DNA起始拷贝数。
图4为伏立诺他(Vorinostat)在ALI 3D培养条件下对HPV18 DNA拷贝数的抑制作用;
图5为KU55933在ALI 3D培养条件下对HPV18 DNA拷贝数的抑制作用。
通过比较HPV18拷贝数,评价药物对患者来源自然感染HPV的抑制效果。具体评价结果为:在ALI 3D培养条件下,伏立诺他(Vorinostat)可以显著抑制HPV18病毒DNA拷贝数(与DMSO对照相比),而KU55933尽管没有伏立诺他那么强的抑制效果,但是与DMSO对照相比也显示出具有统计学差异的抑制作用。
由上可知,与采用CC50法评价药物抑制率(常规2D培养条件下)相比,本发明提供的基于ALI 3D培养条件下患者来源自然感染HPV细胞的病毒拷贝数筛选抗HPV药物的方法具有的优点为:保证了病毒完整的生命周期和DNA增殖的条件下,通过收集DNA定量PCR扩增,不仅结果直观和客观,方法简便易操作且稳定性好。
最后,还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样,倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种抗人***瘤病毒药物筛选模型及其构建方法与应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgtaaaac gacggccagt atgcagacac cgaaggaa 38
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttacattgtc atgtatccca cc 22
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgggatacat gacaatgtaa atgcatggac ctaaggca 38
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatccccggg taccgagctc ttactgctgg gatgcaca 38
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgggatacat gacaatgtaa atgcatggac ctaaggca 38
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatccccggg taccgagctc ttactgctgg gatgcaca 38
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcacggcatc gtcaccaact 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catcttctcg cggttggcct 20
Claims (10)
1.一种抗人***瘤病毒药物筛选模型的构建方法,其特征在于,所述方法包括:
将多个Millicell***式细胞培养皿分别置于六孔板的每个单孔中,形成六个含有内孔和外孔的培养装置,即包括Millicell***式细胞培养皿组成的内孔,以及位于所述内孔外周与所述六孔板之间形成的外孔;
将原代上皮细胞培养基重悬保藏编号为CCTCC NO:C2015124的含有自然感染HPV18的女性宫颈上皮内瘤样病变细胞,并接种到所述内孔中;
将原代上皮细胞培养基加入到所述外孔中;
将所述含有内孔和外孔的培养装置于湿热培养箱中培养,培养48h后将所述内孔和所述外孔中的培养基均更换为分化培养基;
将所述含有内孔和外孔的培养装置置于湿热培养箱中平衡,以使内孔中的细胞与细胞之间形成紧密连接;
移除所述内孔和所述外孔中所有的培养基,向所述外孔中加入分化培养基,置于湿热培养箱中进行3D分化培养,获得抗人***瘤病毒药物筛选模型。
2.根据权利要求1所述的一种抗人***瘤病毒药物筛选模型的构建方法,其特征在于,所述Millicell***式细胞培养皿的直径为0.4μm,所述六孔板的每个单孔中放≤3个所述Millicell***式细胞培养皿。
3.根据权利要求1所述的一种抗人***瘤病毒药物筛选模型的构建方法,其特征在于,所述重悬中,用300μl的原代上皮细胞培养基重悬5×105个保藏编号为CCTCC NO:C2015124的含有自然感染HPV18的女性宫颈上皮内瘤样病变细胞,并接种0.3ml到所述内孔中。
4.根据权利要求1所述的一种抗人***瘤病毒药物筛选模型的构建方法,其特征在于,每个所述外孔加入3.5ml的所述原代上皮细胞培养基。
5.根据权利要求1所述的一种抗人***瘤病毒药物筛选模型的构建方法,其特征在于,所述平衡的时间为14~18h。
6.根据权利要求1所述的一种抗人***瘤病毒药物筛选模型的构建方法,其特征在于,所述分化培养中,向所述外孔中加入2ml的分化培养基,且每2天更换所述外孔中的分化培养基。
7.一种采用权利要求1-6任一项所述方法制备得到的抗人***瘤病毒药物筛选模型。
8.权利要求7所述的抗人***瘤病毒药物筛选模型在筛选抗人***瘤病毒药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述应用的方法包括:
将含有病毒基因的标准质粒进行梯度稀释,获得连续梯度浓度的不同标准品,并计算对应标准品的DNA拷贝数;
对所述各标准品的HPV18E7区域进行QPCR定量,得到的Ct值为y轴,Log起始拷贝数为x轴,通过Bio-Rad软件绘制标准曲线,获得线性方程式;
在ALI 3D分化培养的第10~12天加入药物处理,分化培养至17~19天,收集DNA样本;后对所述样本目的DNA的HPV18E7区域进行QPCR定量,得到的Ct值代入所述线性方程式,获得HPV18 DNA起始拷贝数,通过所述拷贝数评价药物对患者来源自然感染HPV的抑制效果。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述含有病毒基因的标准质粒为pUC19-HPV18 E2/E7质粒。
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- 2022-06-30 CN CN202210771706.2A patent/CN115044538A/zh active Pending
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