CN114903871A - 负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物和制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物和制备方法及应用，属于医药技术领域；抗炎纳米组合物中含有雷公藤甲素、L‑抗坏血酸棕榈酸酯、胆固醇和水，按质量份数计，L‑抗坏血酸棕榈酸酯：胆固醇：雷公藤甲素=2:3:0.6，水：雷公藤甲素=1~2:1；包括以下制备步骤：将L‑抗坏血酸棕榈酸酯和胆固醇分别溶于甲醇溶液，按质量比例均匀混合后得到纳米粒载体溶液；将雷公藤甲素溶于甲醇溶液，得到纳米粒载物溶液；按质量比例在纳米粒载体溶液中先加入纳米粒载物溶液，除去甲醇有机溶剂后，再加入水搅拌得到抗炎纳米组合物溶液。本发明制备出一种安全有效的抗炎纳米组合物，应用在治疗类风湿性关节炎时，在降低对肝肾毒性的同时，能够提高雷公藤甲素的药理活性。

Description

负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物和制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种降低雷公藤甲素毒性的药物组合物，具体涉及负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物和制备方法及应用，属于医药技术领域。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是关节的全身性自体免疫性疾病，滑膜关节的拥有属性增生，关节炎症，软骨侵蚀和骨质破坏。在疾病的后期，软骨、骨骼和其他邻近组织的破坏往往是不可逆转的，这将最终导致严重的关节畸形，甚至残疾。全球RA的发病率为0.4％-1.3％。目前可用的抗风湿药物，包括非甾体类药物、糖皮质激素和生物制剂，不能从根本上治愈RA，只能缓解其症状和进展。
在中国，草药作为替代性RA药物已广泛应用了几十年，而雷公藤中的主要有效成分为雷公藤甲素(Tp)，雷公藤甲素又叫雷公藤内酯醇是一种环氧化二萜内酯化合物，它是雷公藤多苷的主要活性成分，具有免疫抑制、抗炎、抗风湿和抗肿瘤作用。Tp通过抑制促炎细胞因子和炎症介质的产生，抑制血管生成，保护类风湿性关节炎软骨和基因调控，在治疗类风湿性关节炎中具有独特的疗效。然而，其应用受到水溶性差和多器官毒性的限制，这些毒性主要与损害肝脏、肾脏和生殖***有关。
现有技术中为降低雷公藤甲素的毒性、提高其水溶性大多采用多种药物配伍的形式：如申请公布号为CN201810460972.7的一种外用雷公藤甲素脂质纳米粒，该纳米粒用于治疗皮肤慢性湿疹药物中，无有机溶剂残留、工艺过程易控制，可大规模生产，但其仅仅降低了雷公藤甲素的毒性作用，未有增加疗效的作用。另外如申请公布号为CN111494319A的雷公藤甲素复方组合物及其制备方法与应用，该复方组合物采用甘草酸铵盐来保护对机体的损伤从而降低药物毒性、并提高了其抗肿瘤的治疗效果，但其配方中采用成分较多，增加了其复方脂肪乳的药物制备成本，制备工艺相对复杂。
因此，探索一种制备工艺简单，并能够降低雷公藤甲素的毒性，同时增强其抗风湿药理活性的组合物，对于提高雷公藤甲素在临床上的安全应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是：克服现有技术中存在的问题，提供负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物和制备方法及应用，制备一种安全有效的抗炎纳米组合物，应用在治疗类风湿性关节炎时，在降低对肝肾毒性的同时，能够提高雷公藤甲素的药理活性，达到减毒增效的功能。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物，所述抗炎纳米组合物中含有雷公藤甲素、L-抗坏血酸棕榈酸酯、胆固醇和水，按质量份数计，L-抗坏血酸棕榈酸酯：胆固醇：雷公藤甲素＝2:3:0.6，水：雷公藤甲素＝1～2:1。
负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备纳米粒载体溶液：
将L-抗坏血酸棕榈酸酯和胆固醇分别溶于甲醇溶液，得到质量浓度为 0.5～5mg/mL的L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和质量浓度为0.8～2.5mg/mL的胆固醇甲醇溶液，再将L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和胆固醇甲醇溶液按质量比为 1～2:1～2的比例均匀混合，得到纳米粒载体溶液；
S2、配制纳米粒载物溶液：
将雷公藤甲素溶于甲醇溶液，得到质量浓度为1.0mg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，即得到纳米粒载物溶液；
S3、制备抗炎纳米组合物溶液：
将上述制备得到的L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液、胆固醇甲醇溶液和雷公藤甲素甲醇溶液按质量比为2:3:0.6的比例均匀混合，40℃条件下采用旋转蒸发仪旋转蒸发除去甲醇有机溶剂，加入与雷公藤甲素质量比为1～2:1的水，并在1000rpm 搅拌0.5～3h，即得抗炎纳米组合物溶液。
优选的，所述L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液的质量浓度为1.5～2.5mg/mL，所述胆固醇甲醇溶液的质量浓度为1.0～2.0mg/mL，所述L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和胆固醇甲醇溶液的混合质量比为1:1～2；搅拌时间为0.5～2h。
较佳的，所述L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液的质量浓度为2.0mg/mL，所述胆固醇甲醇溶液的质量浓度为2.0mg/mL，所述L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和胆固醇甲醇溶液的混合质量比为1:1.5；搅拌时间为0.5h。
所述抗炎纳米组合物溶液中加入的水为纯水、去离子水或高纯水。
本发明的负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物在降低雷公藤甲素毒性中的应用。
本发明的负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物在制备类风湿性关节炎药物中的应用。
本发明的有益效果是：
1)本发明通过L-抗坏血酸棕榈酸酯和胆固醇制备纳米粒载体溶液，负载雷公藤甲素后制备出抗炎纳米组合物，将该抗炎纳米组合物应用于关节炎动物试验中，实验结果表明，抗炎纳米组合物与雷公藤甲素原料药组相比具有显著的抗炎作用，且能够明显降低由雷公藤甲素所引起的肝脏、肾脏、睾丸以及关节组织毒性，达到了减毒增效的目的。
2)本发明通过正交实验筛选的最佳工艺条件制备得到的抗炎纳米组合物，其包封率可达(71.36±2.73)％，载药量为(6.77±0.99)％，平均粒径为(191.6 ±1.4)nm，分散指数PDI为(0.191±0.73)，Zeta电位为(-45.22±0.92)mV。
3)本发明制备得到的抗炎纳米组合物，粒径小、均一性好，体外药物释放实验中较雷公藤甲素原溶液释药减少30％，且测得在不同环境下具有良好的物理稳定性和储存稳定性。
附图说明
图1为单因素实验中L-抗坏血酸棕榈酸酯质量浓度对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI的影响结果图；
图2为单因素实验中胆固醇质量浓度对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI 的影响结果图；
图3为单因素实验中搅拌时间对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI的影响结果图；
图4为单因素实验中L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液与胆固醇甲醇溶液的质量比例对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI的影响结果图；
图5为最佳工艺条件下制备的抗炎纳米组合物的透射电子显微镜像图；
图6为关节炎动物实验中各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平比较图；
图7为关节炎动物实验中各组小鼠血清中ALT、AST、BUN、CRE的水平比较图；
图8为关节炎动物实验中各组小鼠肝组织中GSH-Px、SOD、MDA水平的比较图；
图9为关节炎动物实验中各组小鼠肝脏组织HE染色结果对照图；
图10为关节炎动物实验中各组小鼠肾脏组织HE染色结果对照图；
图11为关节炎动物实验中各组小鼠睾丸组织HE染色结果对照图；
图12为关节炎动物实验中各组小鼠关节组织HE染色结果对照图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的解释说明。
实施例：以下制备步骤中以及抗炎纳米组合物的性能测定中采用的仪器包括：精密电子天平、磁力搅拌器、旋转蒸发仪、紫外-可见分光光度计和高效液相色谱仪。
负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备纳米粒载体溶液：
将L-抗坏血酸棕榈酸酯和胆固醇分别溶于甲醇溶液，得到质量浓度为 0.5～5mg/mL的L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和质量浓度为0.8～2.5mg/mL的胆固醇甲醇溶液，再将L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和胆固醇甲醇溶液按质量比为 1～2:1～2的比例均匀混合，得到纳米粒载体溶液；
S2、配制纳米粒载物溶液：
将雷公藤甲素溶于甲醇溶液，得到质量浓度为1.0mg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，即得到纳米粒载物溶液；
S3、制备抗炎纳米组合物溶液：
将上述制备得到的L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液、胆固醇甲醇溶液和雷公藤甲素甲醇溶液按质量比为2:3:0.6的比例均匀混合，40℃条件下采用旋转蒸发仪旋转蒸发除去甲醇有机溶剂，加入与雷公藤甲素质量比为1～2:1的水，并在1000rpm 搅拌0.5～3h，即得抗炎纳米组合物溶液。
按照以上制备方法即可制备得到负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物，根据实验需求制备抗炎纳米组合物溶液并做以下测试实验。
检测方法：
1)粒径分布测定，取已制备的抗炎纳米组合物溶液，测定平均粒径和分散指数PDI，散射角度为90°，检测时间为120s，每份样品测定3次，取平均值。其中PDI＝数均粒径/重均粒径，越接近1均一性越好。
2)纳米粒载药量和包封率的测定，色谱条件：流动相为乙腈-水(33：67)，检测波长218nm；流速1.0mL/min，柱温25℃；进样量20μL。
线性范围考察：采用精密电子天平精密称取雷公藤甲素对照品5mg，加5mL 甲醇溶解摇匀，得1.0mg/mL雷公藤甲素对照品溶液。分别精密量取上述雷公藤甲素对照品溶液0.5，0.25，0.1，0.08，0.05，0.02，0.01，0.005，0.001mL于1.5mL 离心管中，加无水甲醇至1mL，配成浓度分别为500，250，100，80，50，20， 10，5，1μg/mL的系列标准溶液，按上述色谱条件进样，依次进样20μL。以峰面积对进样浓度(μg/mL)做线性回归，得标准曲线方程：Y＝42.596X-73.87 (R2＝0.9997)。
包封率及载药量的测定：精密称取抗炎纳米组合物混悬液2mL于超滤管中，于4℃下离心30min(4000rpm/min)分别收集上相及下相。HPLC法测定上相及下相中雷公藤甲素的含量，按下述公式进行包封率及载药量的计算：
包封率(EE，％)＝纳米粒中药物质量/(上相中药物质量+下相中药物质量) ×100％；载药量(％)＝上相中药物质量/(上相中药物质量+下相中药物质量+材料量)×100％。
1、单因素实验对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI的影响。
1.1、L-抗坏血酸棕榈酸酯质量浓度对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI的影响。
将L-抗坏血酸棕榈酸酯溶于甲醇溶液，分别配置成质量浓度为5、2.5、2.0、 1.5、1.0、0.8、0.5mg/mL的系列溶液；配置质量浓度为2.0mg/mL的胆固醇甲醇溶液；按质量比为1:1的比例分别将不同浓度的L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和胆固醇甲醇溶液均匀混合，挥发尽甲醇有机溶剂，加入纯水，1000rpm搅拌30min，对粒径及PDI进行考察，结果如图1所示。
如图1中所示，随着L-抗坏血酸棕榈酸酯质量浓度的增加，纳米粒载体的粒径先减小后增大，当L-抗坏血酸棕榈酸酯的质量浓度为2.0mg/mL时粒径及PDI 值较好，因此初步确定L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液的质量浓度为2.0mg/mL。
1.2、胆固醇质量浓度对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI的影响。
在初步确定L-抗坏血酸棕榈酸酯质量浓度的基础上，对胆固醇的质量浓度进行考察。分别配置质量浓度为2.5、2.0、1.5、1.0、0.8mg/mL的胆固醇甲醇溶液，按1.1中的方法制备纳米粒载体，观察纳米粒载体的粒径及分散指数PDI的变化，结果如图2所示。
如图2中所示，随着胆固醇质量浓度的增加，纳米粒载体的粒径先减小后增大，当胆固醇质量浓度为2.0mg/mL时粒径最小，此时分散指数PDI也较稳定，故初步确定胆固醇甲醇溶液的质量浓度为2.0mg/mL。
1.3、搅拌时间对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI的影响。
取上述优化的实验条件，室温下以1000r/min的速度分别搅拌0.5、1.0、1.5、 2、3h，对搅拌时间进行考察，其结果如图3所示。
如图3中所示，粒径在0.5h到1.5h之间没有明显变化，当搅拌时间为2.0h 时，粒径明显下降，综合考虑，初步确定搅拌时间为2.0h。
1.4、L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液与胆固醇甲醇溶液的质量比例对纳米粒载体的粒径和分散指数PDI的影响。
将质量浓度为2mg/mL的L-抗坏血酸棕榈酸酯和2mg/mL的胆固醇甲醇溶液分别按2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2的比例进行混合，按照上述方法制备纳米粒载体，观察不同比例下纳米粒载体的粒径及分散指数PDI的变化，其结果如图4 所示。
如图4所示，随着比例的增大，纳米粒载体的粒径先减小后增大，当二者比例为1:1时，纳米粒载体的粒径最小。
2、正交试验验证对纳米粒载体影响较大的4个因素的综合评价。
根据单因素考察结果，选取对纳米粒载体影响较大的4个因素进行考察，分别为L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液的质量浓度(VC酯质量浓度)、胆固醇甲醇溶液的质量浓度、搅拌时间以及L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液与胆固醇甲醇溶液的质量比(VC酯：胆固醇)；每个因素各取3个水平(如下表1)。通过spss软件设计了L9(34)正交试验表来进行配方工艺优化，以粒径、分散指数PDI、包封率、载药量为评价指标，确定最优的处方制备工艺。
表1为正交试验中主要考察因素及水平
Figure BDA0003634954570000081
Figure BDA0003634954570000091
表2为L9(34)正交试验结果
Figure BDA0003634954570000092
由上表可以看出各因素影响的主次顺序为：A(VC酯质量浓度)>C(搅拌时间)>B(胆固醇质量浓度)>D(VC酯：胆固醇)。通过比较4个因素的3个水平，可以确定VC酯质量浓度A2>A1>A3；胆固醇质量浓度B3>B2>B1；搅拌时间C1>C2>C3；VC酯：胆固醇D2>D3>D1。根据方差分析，故可以确定最优方案为A2B3C1D2，即最优处方制备工艺为：L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液的质量浓度为2mg/mL、胆固醇甲醇溶液的质量浓度为2mg/mL、搅拌时间为0.5h，L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液与胆固醇甲醇溶液的质量比为1:1.5。
3、根据正交实验得到的纳米组合物配方工艺的性能验证。
3.1按正交实验筛选的最佳工艺条件，制备3批载药纳米组合物，并对其包封率和载药量进行测定。
结果表明，采用优化的工艺条件制备的3批纳米组合物的包封率可达(71.36 ±2.73)％，载药量为(6.77±0.99)％，平均粒径为(191.6±1.4)nm，PDI为 (0.191±0.73)，Zeta电位为(-45.22±0.92)mV。
3.2纳米组合物形态观察。
如图5所示，为透射电子显微镜下观察纳米组合物的微观形态图。将纳米组合物溶液加蒸馏水分散，取一滴加到碳涂层的铜网上，风干，磷钨酸染色，在透射电子显微镜下观察纳米组合物的微观形态。
3.3体外药物释放实验。
采用透析法考察纳米组合物的体外释放特性。取1mL纳米组合物溶液于透析袋中(截留相对分子质量为1000Da)中；另取1mL雷公藤甲素溶液于透析袋中，作为对照。将透析袋放入pH为7.4的磷酸缓冲液中(含0.5％吐温-80)作为释放介质，释放介质体积为40mL；然后于37℃的恒温振荡器中振荡0.5、1、2、 5、8、12、24h时，取样2mL，同时补充相同体积的释放介质。将所取样品溶液按色谱条件进行分析，测定雷公藤甲素的含量，计算累计释放率，并绘制释放曲线。
从体外释放结果可知，雷公藤甲素溶液在2h内释放可达90％左右；而纳米组合物溶液在初始阶段药物释放较快，后期释药平缓，24h内释药达60％左右。
3.4纳米组合物稳定性实验。
取纳米粒适量，分别以PBS、DMEM培养基、含10％血清的DMEM培养基稀释4倍后，置于37℃、100r/min的恒温振荡器中振荡，分别于振荡0、2、4、 6、8、10、12、24h时测定粒径、PDI，以考察纳米组合物的稳定性。实验结果表明纳米组合物在PBS、DMEM培养基、含10％血清的DMEM培养基中振荡24h内，其粒径及PDI均无明显变化，表明其具有良好的物理稳定性。
将纳米组合物分别置于室温及4℃冰箱放置7天，检测纳米粒粒径、PDI及 Zeta电位的变化。实验结果表明7天时纳米粒粒径和PDI均无明显变化，Zeta 电位略有下降，表明其具有良好的储存稳定性。
4、关节炎动物实验。
4.1动物模型的建立。
将牛胶原醋酸溶液与弗式完全佐剂1：1混合，用手持匀浆机充分乳化(此过程在冰上进行)。乳化完全标准：用微量加样枪吸取少量胶原乳液滴入清水中，若乳剂未扩散则表示乳化完全。将制备好的乳剂在小鼠尾根部2cm处皮下注射 0.15mL致炎，21d后于尾根部2cm处注射牛胶原醋酸溶液和弗式不完全佐剂(1： 1，v/v)的混合乳液0.05mL加强免疫。
4.2分组和给药。
分组：将造模成功的小鼠随机分为VC酯组、模型组、VC酯-TP纳米粒低、中、高剂量组及TP低、中、高剂量组，每组10只，另取10只小鼠作为对照组。
给药：分组次日给予药物干预，低、中、高剂量TP组分别静脉注射0.1、0.2 和0.25mg/kg，低、中、高剂量VC酯-TP纳米粒组分别静脉注射0.1、0.2、0.25mg/kg (纳米粒中TP浓度相当于原药)，VC酯组静脉注射50mg/kg，模型组及正常组不做处理，间隔给药28天。
4.3ELISA法检测各组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。
给药结束后，采用眼眶静脉丛采血法留取血液样本，置于洁净EP管中，室温放置2小时于3000rpm 4℃离心10min，分取血清置于-80℃冰箱保存备用。按照ELISA试剂盒说明书检测小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。(这些因子能够激活NF-kB，促进环氧化酶COX-2的产生，诱导一氧化氮合酶(iNOS)的产生，进一步促进炎症介质***素E2(PGE2)和一氧化氮的产生，从而诱导炎症细胞浸润和滑膜细胞增殖，导致发炎的滑膜浸润到邻近关节软骨和骨，从而引起软骨和骨骼的破坏。
如图6A显示，模型组中IL-6的释放量增加，与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.005)。其余各组IL-6的释放量与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。模型组小鼠血清IL-6水平明显高于空白对照组、TP(High)组、TP-VC(Low)组、VC 组(P<0.005)，显著高于TP-VC(Middle)组和TP-VC(High)组(P<0.0001)，TP(Low) 组和TP(Middle)组与模型组相比无显著性差异(P>0.05)。TP-VC(Low)组和 TP-VC(Middle)组与同剂量TP组相比有显著性差异(P<0.05)。
如图6B显示，与空白对照组相比，模型组及TP(Low)组IL-1β的释放量明显增加(P<0.005)，TP(Middle)组有显著性差异(P<0.05)，其余各组IL-1β的水平与正常对照组之间无显著性差异(P>0.05)。与模型组相比，TP-VC(High)组IL-1 β水平显著降低(P<0.0001)，TP(Low)组和TP(Middle)组IL-1β水平明显下降 (P<0.005)，VC组IL-1β水平与模型组相比有显著性差异(P<0.05)，其余各组的IL-1β水平与模型组相比无显著性差异(P>0.05)。TP-VC各组与同剂量TP各组相比均有明显下降(●P<0.05；●●P<0.005)。
如图6C显示，与正常对照组相比，模型组、TP(Low)组和TP(Middle)组TNF- α水平均有明显上升(***P<0.001；****P<0.0001)。其余各组TNF-α水平与正常组相比无显著性差异。VC组TNF-α水平较模型组有显著降低(P<0.0001)， TP-VC各剂量组及TP(High)组中TNF-α释放量均有所降低，与模型组相比具有显著性差异(###P<0.001；##P<0.005；#P<0.05)。此外，TP(Low)组和TP(Middle) 组TNF-α释放量与同剂量TP组相比明显下降(P<0.05)。
综上所述，根据TNF-α、IL-1β、IL-6检测结果表明，TP、VC和TP-VC 纳米组合物均能降低CIA诱导的小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平。特别是，TP-VC 纳米组合物组以剂量依赖的方式显示出显著的抗炎作用，可以减轻炎症关节的病理变化。
4.4血生化指标检测(肝功：谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST；肾功：血尿素氮BUN、肌氨酸酐CRE)。
将血清样本丛-80℃冰箱移至4℃冰箱，30min后再放置于室温环境中。提前 30min将试剂盒从冰箱取出，平衡至室温。按照试剂盒操作方法测定血清ALT、 AST、BUN、CRE水平。
如图7A所示，模型组及TP原药组AST释放量增加，其中TP(Middle)组和 TP(High)组AST水平与正常对照组相比具有显著性差异(*P<0.05；***P<0.001)，模型组及TP(Low)组AST水平虽有上升，但与正常对照组相比无显著性差异 (P>0.05)。其余各组AST水平与正常组相比无显著性差异(P>0.05)。与模型组相比，TP原药组AST水平升高，其中TP(High)组AST水平明显上升(P<0.001)。与TP原药组相比，TP-VC组小鼠AST水平均有明显下降(P<0.05)。
图7B显示，模型组及TP原药组ALT释放量增加，与正常组相比具有显著差异(*P<0.05；**P<0.05；****P<0.0001)。与模型组相比，TP-VC组及VC组小鼠ALT水平均有明显下降，其中TP-VC(Low)组小鼠ALT水平显著降低 (P<0.05)，其余各组虽有降低，但与模型组相比，无显著性差异。与TP原药组相比，TP-VC组小鼠AST水平均有明显下降(●P<0.05；●●P<0.005)。
见图7C，BUN结果显示，TP原药组BUN释放量呈剂量依赖性增加，其中TP(Middle)组和TP(High)组与正常对照组相比具有显著性差异(*P<0.05； **P<0.005)，TP(Low)组与正常组相比无意义(P>0.05)。TP(High)组BUN较模型组明显升高(P<0.05)，TP-VC(Low)组呈下降趋势，且与模型组相比有差异 (P<0.05)。其余各组与模型组相比，均无显著性差异。与TP原药组相比，TP-VC 组小鼠BUN水平均有明显下降(●P<0.05；●●P<0.005)。
见图7D，CRE结果显示，与正常对照组相比，模型组及TP(Low)CRE水平显著增加(P<0.005)，TP(Middle)组及TP(High)组CRE水平极显著升高 (P<0.0001)。与模型组相比，TP(High)组CRE水平显著升高(P<0.005)，TP-VC (Low)组及VC组CRE水平显著下降(#P<0.05；##P<0.005)。与TP原药组相比，TP-VC组小鼠CRE水平均有明显下降(●P<0.05；●●P<0.005；●●●● P<0.0001)。
综上所述，与TP原药组相比，TP-VC组减轻炎症关节对肝肾的病理影响。
4.5氧化应激相关指标的测定(谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、超氧化物歧化酶SOD、自由基ROS、丙二醛MDA)。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力测定：通过与GSH共同抑制脂质过氧化的启动或终止脂质过氧化的发展，从而阻断新自由基的产生。超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定：该酶能清除超氧阴离子自由基(O2-)，阻断该自由基对脏器的损伤。GSH-Px、SOD两种抗氧化酶活性的高低能够间接反应机体清除氧自由基的能力。ROS含量测定：正常情况下，该自由基在抗菌、消炎和抑制肿瘤等方面具有重要意义；但是，在疾病或某些外源性药物和毒物入侵后，机体抗氧化体系可能会发生紊乱，ROS代谢平衡失调，导致ROS大量蓄积，从而引起脂质过氧化反应。丙二醛(MDA)浓度测定：MDA被称为氧化应激标志物，可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度
如图8A所示，模型组及TP原药组GSH-Px水平较正常对照组下降，但无显著性差异(P>0.05)，TP-VC各剂量组小鼠GSH-Px水平上升，但与正常对照组相比并未有显著性差异(P>0.05)。与模型组相比，TP(Middle)组及TP(High)组 GSH-Px水平明显升高(P<0.05)。与TP原药组相比，TP-VC各剂量组小鼠GSH-Px 均有升高，但仅TP-VC(High)组与同剂量TP(High)组之间有显著性差异 (P<0.005)。
如图8B显示，模型组、TP各剂量组、TP-VC各剂量组及VC组MDA水平均高于正常对照组，但仅TP各剂量组与正常对照组之间有显著性差异(*P<0.05； ***P<0.001；****P<0.0001)。TP各剂量组、TP-VC各剂量组及VC组MDA水平均高于模型组，除TP(Middle)组和TP(High)组与模型组有显著性差异(P<0.005) 外，其余各组与模型组相比均无差异性。TP-VC各剂量组小鼠MDA水平均低于同剂量TP原药组，但仅TP-VC(High)组与同剂量TP(High)组之间差异显著 (P<0.05)。
如图8C所示，模型组、TP各剂量组、TP-VC各剂量组及VC组SOD水平均低于正常对照组，除模型组、TP-VC(Low)组及TP(Middle)组外，其余各组与正常对照组相比均有显著性差异(*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001)。TP(High) 组SOD水平显著低于模型组(P<0.05)。TP-VC各剂量组小鼠SOD水平与TP各剂量组小鼠相比有所升高，但并无显著性差异(P>0.05)。
综上所述，SOD、GSH-Px及MDA检测结果显示，TP使小鼠体内抗氧化酶水平失衡，而经TP-VC纳米组合物治疗的小鼠中抗氧化酶水平趋于正常，表明该纳米组合物可以显著改善肝脏中的氧化应激。
4.6病理学检测，组织病理学观察正常组、模型组、给药组的肝、肾、睾丸及关节组织切片。
(1)对肝脏组织病理学的影响：
见图9，肝脏组织病理学观察结果显示，正常对照组小鼠肝细胞排列整齐、结构清晰，无明显病理改变；模型组小鼠肝细胞排列较紊乱，部分细胞稍肿胀呈空泡状，出现核固缩；雷公藤甲素组小鼠肝细胞排列紊乱，核固缩，胞质疏松呈网状，并伴有炎细胞浸润，且随剂量的逐渐增加，肝病理损伤程度逐渐加重。与雷公藤甲素原料药组相比，TP-VC纳米组合物组小鼠的肝组织病变明显减轻。
(2)对肾脏组织病理学的影响：
见图10，肾脏组织病理学观察结果显示，正常对照组小鼠肾脏肾小球结构完整，肾小管细胞排列紧密，管腔清晰可见；与正常对照组相比，雷公藤甲素组小鼠肾小球明显萎缩，且随着剂量的增加，萎缩程度逐渐加重，局部可见基膜塌陷甚至管腔闭塞。但与雷公藤甲素原料药组相比，TP-VC纳米组合物组小鼠的肾组织病变明显减轻。
(3)对睾丸组织病理学的影响：
见图11，睾丸组织病理学观察结果显示，正常对照组小鼠睾丸生精上皮厚，细胞层次宽，***发育良好，管腔内可见丝状***细胞排列紧密。模型组小鼠睾丸管腔内丝状***细胞少于正常对照组。在雷公藤甲素的毒性作用下，雷公藤甲素组小鼠曲细精管萎缩变形或扭曲成不规则状，生***数量及管腔内***细胞数量明显少于正常对照组，且随着剂量的增加，睾丸病理损伤程度逐渐加重。与雷公藤甲素原料药组相比，TP-VC纳米组合物组小鼠的睾丸组织病变有所减轻。
(4)对小鼠关节组织病理变化的影响：
见图12，各组小鼠关节病理学观察结果显示，正常对照组小鼠未见炎性细胞浸润，软骨组织表面光滑，无明显结构破坏。模型组小鼠关节结构破坏严重，炎症细胞浸润明显，软骨组织遭到破坏，界限不清晰。TP各剂量组、TP-VC各剂量组及VC组小鼠关节组织相对完整，个别组有少量炎症细胞浸润，与模型组小鼠相比有明显改观。
结合上述关节炎动物实验的对比结果，表面本发明制备出的抗炎纳米组合物在治疗类风湿性关节炎时，与雷公藤甲素原料药组相比具有显著的抗炎作用，且能够明显降低由雷公藤甲素所引起的肝脏、肾脏、睾丸以及关节组织毒性。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物，其特征在于：所述抗炎纳米组合物中含有雷公藤甲素、L-抗坏血酸棕榈酸酯、胆固醇和水，按质量份数计，L-抗坏血酸棕榈酸酯：胆固醇：雷公藤甲素＝2:3:0.6，水：雷公藤甲素＝1～2:1。
2.根据权利要求1所述的负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、制备纳米粒载体溶液：
将L-抗坏血酸棕榈酸酯和胆固醇分别溶于甲醇溶液，得到质量浓度为0.5～5mg/mL的L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和质量浓度为0.8～2.5mg/mL的胆固醇甲醇溶液，再将L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和胆固醇甲醇溶液按质量比为1～2:1～2的比例均匀混合，得到纳米粒载体溶液；
S2、配制纳米粒载物溶液：
将雷公藤甲素溶于甲醇溶液，得到质量浓度为1.0mg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，即得到纳米粒载物溶液；
S3、制备抗炎纳米组合物溶液：
将上述制备得到的L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液、胆固醇甲醇溶液和雷公藤甲素甲醇溶液按质量比为2:3:0.6的比例均匀混合，40℃条件下采用旋转蒸发仪旋转蒸发除去甲醇有机溶剂，加入与雷公藤甲素质量比为1～2:1的水，并在1000rpm搅拌0.5～3h，即得抗炎纳米组合物溶液。
3.根据权利要求2所述的负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物的制备方法，其特征在于：优选的，所述L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液的质量浓度为1.5～2.5mg/mL，所述胆固醇甲醇溶液的质量浓度为1.0～2.0mg/mL，所述L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和胆固醇甲醇溶液的混合质量比为1:1～2；搅拌时间为0.5～2h。
4.根据权利要求3所述的负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物的制备方法，其特征在于：较佳的，所述L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液的质量浓度为2.0mg/mL，所述胆固醇甲醇溶液的质量浓度为2.0mg/mL，所述L-抗坏血酸棕榈酸酯甲醇溶液和胆固醇甲醇溶液的混合质量比为1:1.5；搅拌时间为0.5h。
5.根据权利要求2所述的负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物的制备方法，其特征在于：所述抗炎纳米组合物溶液中加入的水为纯水、去离子水或高纯水。
6.权利要求1-5中任一所述的负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物在降低雷公藤甲素毒性中的应用。
7.权利要求1-5中任一所述的负载雷公藤甲素的抗炎纳米组合物在制备类风湿性关节炎药物中的应用。
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