CN114736869A - 一种黏膜黑色素瘤3d类器官及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种黏膜黑色素瘤3D类器官及其培养方法和应用。本发明还公开了培养所述黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基，针对黏膜黑色素瘤细胞的表型特点，通过选用特定的培养基组分，并按照一定的配比进行复配，能够有效地在3D环境中形成黏膜黑色素瘤细胞类器官。通过本发明所述培养基及方法获得的黏膜黑色素瘤类器官，可用于药物的筛选和作用靶点研究等，具有广泛应用前景。

Description

一种黏膜黑色素瘤3D类器官及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，涉及一种黏膜黑色素瘤3D类器官及其培养方法和应用。
背景技术
黏膜黑色素瘤(mucosal melanoma，MM)是一种侵袭性较强的黑色素瘤的罕见亚型，可发生于口腔、口咽、鼻腔/鼻窦、食管、直肠肛管、生殖道、泌尿道等黏膜组织中。MM约占黑色素瘤总体的1％左右，与皮肤黑色素瘤相比，发生于头颈等黏膜的黑色素瘤，恶性程度更高，高复发率和远处转移率，预后差、死亡率高，多数报道显示其5年生存率低于25％。
黑色素瘤的发病具有一定的种族特异性：白种人较易发生皮肤恶性黑色素瘤，黏膜黑色素瘤则比较少见；而黄色人种的黏膜和肢端黑色素瘤则更为常见。在亚洲人群中，黏膜黑色素瘤为黑色素瘤第二大亚型，黏膜恶性黑色素瘤占全身恶性黑色素瘤发病比例达到22.6％-30％，高于欧美人群。
良好的肿瘤临床前模型是肿瘤研究的重要基石，包括黏膜黑色素瘤在内的各种肿瘤新靶点和新疗法的研究、开发和验证都离不开临床前肿瘤模型的应用。保留患者肿瘤遗传学背景和生物行为学特性，同时可以模拟临床病人肿瘤异质性的体内外肿瘤模型是肿瘤研究的有效工具。
皮肤黑色素瘤的临床前研究模型丰富多样，包含了目前大多数临床前模型类型，而相比较而言，黏膜黑色素瘤的临床前模型尤其缺乏，一定程度上阻碍了该疾病的研究进程。近期国际知名杂志Cancer cell报道了来自英国爱丁堡大学的Elizabeth Patton教授等人联合美国国立卫生研究院(NIH)的Glenn Merlino教授对黑色素瘤临床前模型的***论述，其中阐述了黑色素瘤模型近年来最前沿的模型发展进展，并强调当前黑色素瘤新疗法面临的五个重要挑战，其中一点就是对于罕见类型的黑色素瘤(特别是黏膜黑色素瘤)的治疗困境，而缺乏临床前模型是阻碍对这一类疾病认知和治疗策略提出的重要原因。所以构建不同类型的黏膜黑色素瘤临床前模型能够辅助进行药物筛选、药效评估，模拟肿瘤侵袭转移等临床特征，进而推动靶向治疗策略的评估、转化和应用是黏膜黑色素瘤亟需解决的问题。
对于发生于口腔颌面头颈部的黏膜恶性黑色素瘤(OMM)，本发明课题组一直努力开展相关临床前模型，这些模型包括头颈黏膜黑色素瘤病人源性移植瘤模型(patient-derived xenograft，PDX)和病人源性小鼠原位移植瘤模型(patient-derived-tumor-orthotopic xenograft，PDOX)、病人源性的肿瘤细胞(patient derived tumor cell,PDC)等，研究组在OMM-PDX,OMM-PDC的构建方面取得了相对成熟的经验，并开展了临床前探索实验。如在课题组前期研究结果与相关文献报道的基础上，通过构建黏膜黑色素瘤病人源性肿瘤细胞模型进行药物敏感性的筛选，选出针对特定突变敏感性的药物，为c-kit突变的患者的靶向治疗提供选择依据。通过构建黏膜恶性黑色素瘤PDX，发现Ponatinib比Imatinib更有效抑制c-kit V560D，K642E和D816V突变的移植瘤生长，为头颈黏膜恶性黑色素瘤的靶向治疗提供潜在的选择。
类器官(organoids)的定义如同其名称一样，就是类似器官的模型，是一类各种细胞在体外一定条件下培养时形成的能够进行自我组装的微观三维结构。病人源性肿瘤类器官(Patient-derived organoids，PDO)技术的发展极大的促进了肿瘤的研究，取得了许多令人振奋的成就，同样为黏膜黑色临床前模型构建带来机遇，为黏膜黑色素瘤的基础与临床转化研究提供了新的可能。然而目前利用正常上皮组织或上皮来源的恶性肿瘤组织构建PDO的技术方法已经相对成熟，如果口腔黏膜上皮、头颈鳞状上皮细胞癌组织构建PDO已经广泛报告。然而关于间叶组织来源的恶性肿瘤的PDO构建方法和研究鲜有报告。黏膜黑色素瘤起源间叶细胞，目前尚无关于黏膜黑色素瘤类器官相关的研究报道。尽管当前关于口腔黏膜黑色素瘤的临床前模型已有相关报道，如细胞系、PDC和PDX，但关于口腔黏膜黑色素瘤类器官模型构建仍缺乏有效的参考经验。其主要原因可能是，黏膜黑色素瘤取材相对困难、黏膜黑色素瘤的生物学行为和遗传学背景与其他黑色素瘤亚型显著不同。
因此，探寻口腔黏膜黑色素瘤类器官的构建方法，为口腔黏膜黑色素瘤的基础与转化研究提供更多行之有效的临床前研究工具，对于全面地了解这类口腔难治性恶性肿瘤具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种黏膜黑色素瘤3D类器官及其培养方法和应用，用于解决培养黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基及培养方法等问题，实现培养获得形态和黑色素瘤标志物表达与原发黏膜黑色素瘤表达相一致的3D类器官的目的。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种黏膜黑色素瘤3D类器官及其培养方法和应用。
本发明的目的之一是提供一种培养黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基，所述培养基包括：基础培养基，以及以基础培养基为基准的以下成分：2-20mM HEPES缓冲液、1-5mMGlutaMAX、0.2-2mg/ml Primocin、0.5-5v％B27补充剂、0.75-2mM N-Acetylcysteine、20-100ng/ml rhEGF、0.05-0.3uM A83-01、2-20mM Nicotinamide、300-800ng/ml Wnt3a、0.05-0.3μg/ml Noggin、0.05-0.3μg/ml R-spondin-1以及0.5-5v％的胎牛血清。
所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基、DMEM、高糖DMEM培养基、αMEM培养基和RPMI1640培养基中的至少一种。
上述浓度成份范围可根据实际培养进行调整。
本发明的另一目的是提供如上所述的培养基在培养黏膜黑色素瘤3D类器官中的应用。
本发明的另一目的是提供一种黏膜黑色素瘤3D类器官的培养方法，所述方法包括，将破碎后的黏膜黑色素瘤组织细胞采用如上所述的培养基进行培养，获得所述的黏膜黑色素瘤3D类器官。
本发明中，所述黏膜黑色素瘤组织可以选自黏膜黑色素瘤瘤患者肿瘤组织。在一些更优选实施方式中，所述黏膜黑色素瘤组织选自已经构建成功的黏膜黑色素瘤PDX组织。
本发明的另一目的是提供一种由上述培养方法培养的黏膜黑色素瘤3D类器官。
本发明的另一目的是提供如上所述的类器官在作为药物评价模型中的应用，所述药物评价模型为抗肿瘤药物评价。
本发明的另一目的是提供一种抗肿瘤药物的评价方法，包括如下步骤：
(1)利用所述方法培养获得的类器官；
(2)使用类器官组织进行抗肿瘤药物敏感性评价。
如上所述，本发明的一种黏膜黑色素瘤3D类器官及其培养方法和应用，具有以下有益效果：
本发明的黏膜黑色素瘤组织类器官的培养基针对于黏膜黑色素瘤这类间叶组织来源细胞的生长特点，选用了多种细胞因子成份按照特定的比例进行复配，获得的培养基中，含有适宜含量的细胞因子、信号通路调控因子，黏膜黑色素瘤组织可以在较短的时间内形成与真实组织形态和性质接近的3D类器官。
本发明的培养基及培养方法可以完成黏膜黑色素瘤的传代培养，并能保持3D类器官的形态和性质，达到一定规模复制黏膜黑色素组织类器官的需求。
通过本发明的培养基或方法获得的黏膜黑色素瘤3D类器官能够模拟黏膜黑色素瘤细胞的生理环境，可以有效地维持组织细胞特异性，组织形态和基因分型高度一致；可以用于筛选黏膜黑色素瘤的治疗药物，研究黏膜黑色素瘤的发生发展机制，不仅满足科学研究的需要，还可以在临床用药指导方面，如通过活检样本的体外3D培养，为患者的药物用药指导提供有益选择。
附图说明
图1为细胞和BME的混合物接种24孔板后的照片，见黑色巧克力样凝胶滴。
图2黏膜黑色素瘤PDO镜下形态学观察。A第7天，B、C第21天镜下观。
图3接种21天后成球，部分胶滴中肉眼可见黑色细胞球体，红色箭头所示。
图4：AEC红显染色结果阳性或阴性对照。口腔黏膜组织中黏膜上皮显著表达上皮标志物AE1/AE3,而黏膜下黑色肿瘤组织及黏膜下***表达为阴性；黑色素瘤组织表达HMB45，而黏膜组织表达为阴性。
图5：为实施例1中肿瘤组织来源为已构建的黏膜黑色素瘤PDX肿瘤组织(黑色瘤体)。
图6为实施例1中黏膜黑色素瘤PDO镜下形态学观察。A第7天，B、C第21天镜下观。
图7：为实施例1中接种培养21天后成球的类器官，收集球体，用琼脂糖凝胶包裹黑色素瘤类器官球体，用于石蜡包埋，凝胶中肉眼可见黑色类器官球体。
图8：黏膜黑色素瘤类器官HE染色。
图9：黏膜黑色素瘤PDO表达黑色素瘤标志物HMB45、Melan-A和S100，上皮标志物AE1/3表达阴性。PDO(C)分子表达与肿瘤来源PDX组织(B)及原发患者表达情况相一致，即HMB45、Melan A和S100阳性，AE1/3阴性。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供一种黏膜黑色素瘤类器官的体外培养方法，通过提取PDX来源黏膜黑色素瘤细胞，诱导构建类器官，通过HE染色、免疫组化验证黏膜黑色素瘤类器官的形态和细胞因子表达，得到了与活体黏膜黑色素瘤组织形态和基因分型高度一致的类器官。
本发明提供了一种培养黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基，所述培养基包括：基础培养基，以及以基础培养基为基准的以下成分：HEPES缓冲液、GlutaMAX、Primocin、B27补充剂、N-Acetylcysteine、rhEGF、A83-01、Nicotinamide、Wnt3a、Noggin以及R-spondin-1。具体地，所述培养黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基包括基础培养基，以及以基础培养基为基准的以下成分：2-20mM HEPES缓冲液、1-5mM GlutaMAX、0.2-2mg/ml Primocin、0.5-5v％B27补充剂、0.75-2mM N-Acetylcysteine、20-100ng/ml rhEGF、0.05-0.3μM A83-01、2-20mM Nicotinamide、300-800ng/ml Wnt3a、0.05-0.3μg/ml Noggin、0.05-0.3μg/ml R-spondin-1以及0.5-5v％的胎牛血清。
其中，所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基、DMEM、高糖DMEM培养基、αMEM培养基和RPMI1640培养基中的至少一种。
其中，v％是指某物质占Advanced DMEM/F12的体积百分比。例如0.5-2v％B27是指在100mL Advanced DMEM/F12中，B27的体积为0.5-2mL。
其中，HEPES缓冲液在Advanced DMEM/F12中的浓度为2-20mM，可以是2-5mM、5-10mM、10-15mM、15-20mM；具体可以是5、10、15、20mM。优选地，为10-15mM；更进一步优选地，为10mM。
其中，GlutaMAX在Advanced DMEM/F12中的浓度为1-5mM，可以是1-1.5mM、1.5-2mM、2-2.5mM、2.5-3mM、3-4mM、4-5mM，具体可以是1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mM。优选地，为0.5-3mM；进一步优选地，为1-2.5mM；更进一步优选地，为2mM。
其中，Primocin在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.2-2mg/ml，可以是0.2-0.5mg/ml、0.5-1mg/ml、1-1.5mg/ml、1.5-2mg/ml，具体可以是0.2、0.5、1、1.5、2mg/ml。优选地，为0.5-1.5mg/ml；更进一步优选地，为1mg/ml。
其中，B27补充剂占Advanced DMEM/F12的体积百分数为0.5-5v％，可以是0.5-1.0v％、1.0-2v％、2.5-3v％、3.5-4v％、4-4.5v％、4.5-5v％，具体可以是0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5v％。优选地，为1-3％；进一步优选地，为1.5-2.5％；更进一步优选地，为2％。
其中，N-Acetylcysteine在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.75-2mM，可以是0.75-1mM、1-1.2mM、1.2-1.5mM、1.5-2mM，具体可以是0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mM。优选地，为0.8-1.2mM；更进一步优选地，为1mM。
其中，rhEGF在Advanced DMEM/F12中的浓度为20-100ng/ml，可以是20-40ng/ml、40-60ng/ml、60-80ng/ml、80-100ng/ml，具体可以是20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/ml。优选地，为20-80ng/ml；进一步优选地，为35-70ng/ml；更进一步优选地，为50ng/ml。
其中，A83-01在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.05-0.3μM，可以是0.05-0.08μM、0.08-0.1μM、0.1-0.15μM、0.15-0.2μM、0.2-0.25μM、0.25-0.3μM，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.3μM。优选地，为0.08-0.15μM；更进一步优选地，为0.1μM。
其中，Nicotinamide在Advanced DMEM/F12中的浓度为2-20mM，可以是2-5mM、5-8mM、8-10mM、10-12mM、12-15mM、15-20mM，具体可以是2、4、6、8、10、12、14、16、18、10mM。优选地，为5-15mM；优选地，为8-12mM；更进一步优选地，为10mM。
其中，Wnt3a在Advanced DMEM/F12中的浓度为300-800ng/ml，可以是300-350ng/ml、350-400ng/ml、400-450ng/ml、450-500ng/ml、500-550ng/ml、550-600ng/ml、600-650ng/ml、650-700ng/ml、700-750ng/ml、750-800ng/ml，具体可以是300、400、500、600、700、800ng/ml。优选地，为380-650ng/ml；进一步优选地，为400-600ng/ml；更进一步优选地，为500ng/ml。
其中，Noggin在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.05-0.3μg/ml，可以是0.05-0.1μg/ml、0.1-0.15μg/ml、0.15-0.2μg/ml、0.2-0.25μg/ml、0.25-0.3μg/ml，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3μg/ml。优选地，为0.05-0.15μg/ml；进一步优选地，为0.08-0.12μg/ml；更进一步优选地，为0.1μg/ml。
其中，R-spondin-1在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.05-0.3μg/ml，可以是0.05-0.1μg/ml、0.1-0.15μg/ml、0.15-0.2μg/ml、0.2-0.25μg/ml、0.25-0.3μg/ml，具体可以是0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2、0.22、0.25、0.28、0.3μg/ml。优选地，为0.05-0.15μg/ml；进一步优选地，为0.08-0.12μg/ml；更进一步优选地，为0.1μg/ml。
在一些优选实施方式中，所述培养黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基包含：500mlAdvanced DMEM/F12(Gibco)，以及以Advanced DMEM/F12为基准的以下成分：10mM HEPES缓冲液、2mM GlutaMAX、1mg/ml Primocin、2v％B27补充剂、1mM N-Acetylcysteine、50ng/mlrhEGF、0.1μM A83-01、10mM Nicotinamide、500ng/ml Wnt3a、0.1μg/ml Noggin以及0.1μg/ml R-spondin-1。
胎牛血清上皮组织来源的类器官模型中为非必须添加物，在黏膜黑色素瘤类器官的培养中，胎牛血清的添加有助于黏膜黑色素瘤类器官的生长。其中，胎牛血清占AdvancedDMEM/F12的体积百分数为0.5-5v％。可以是0.5-1.0v％、1.0-1.5v％、1.5-2v％、2.5-3v％、3.5-4v％、4-4.5v％、4.5-5v％，具体可以是0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3、3.5、4、4.5、5％。优选地，为0.8-3v％；进一步优选地，为1.5-2.5v％；更进一步优选地，为2v％。
在一些更优选实施方式中，所述培养基包含：500ml Advanced DMEM/F12(Gibco)，以及以Advanced DMEM/F12为基准的以下成分：10mM HEPES缓冲液、2mM GlutaMAX、1mg/mlPrimocin、2v％B27补充剂、1mM N-Acetylcysteine、50ng/ml rhEGF、0.1μM A83-01、10mMNicotinamide、500ng/ml Wnt3a、0.1μg/ml Noggin、0.1μg/ml R-spondin-1以及2v％的胎牛血清。
本发明所述培养黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基中，作为优选，还包含Y-27632、FGF-10、Dexamethasone、N2、FGF-2、Prostaglandin E2、CHIR 99021、Forskolin、烟酰胺、***中的至少一种。优选地，所述培养基还包含Y-27632、FGF-10、Dexamethasone、N2、FGF-2、Prostaglandin E2、CHIR 99021和Forskolin。在一些优选实施方式中，所述培养基包括：基础培养基，以及以基础培养基为基准的以下成分：HEPES缓冲液、GlutaMAX、Primocin、B27补充剂、N-Acetylcysteine、rhEGF、A83-01、Nicotinamide、Wnt3a、Noggin、R-spondin-1、胎牛血清、Y-27632、FGF-10、Dexamethasone、N2、FGF-2、Prostaglandin E2、CHIR 99021、Forskolin。在另一些优选实施方式中，所述培养基包括：基础培养基，以及以基础培养基为基准的以下成分：HEPES缓冲液、GlutaMAX、Primocin、B27补充剂、N-Acetylcysteine、rhEGF、A83-01、Nicotinamide、Wnt3a、Noggin、R-spondin-1、胎牛血清、Y-27632、FGF-10、Dexamethasone、N2、FGF-2、Prostaglandin E2、CHIR 99021、Forskolin、烟酰胺和***。
其中，Y-27632在Advanced DMEM/F12中的浓度为2-20μM，可以是2-5μM、5-8μM、8-10μM、10-12μM、12-15μM、15-20μM，具体可以是2、4、6、8、10、12、14、16、18、10μM。优选地，为5-15μM；优选地，为8-12μM；更进一步优选地，为10μM。
其中，FGF-10在Advanced DMEM/F12中的浓度为50-300ng/ml，可以是50-100ng/ml、100-150ng/ml、150-200ng/ml、200-250ng/ml、250-300ng/ml，具体可以是50、80、100、120、150、180、200、220、250、280、300ng/ml。优选地，为60-180ng/ml；进一步优选地，为80-120ng/ml；更进一步优选地，为100ng/ml。
其中，Dexamethasone在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.75-2μM，可以是0.75-1μM、1-1.2μM、1.2-1.5μM、1.5-2μM，具体可以是0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μM。优选地，为0.8-1.2μM；更进一步优选地，为1μM。
其中，N2占Advanced DMEM/F12的体积百分数为0.5-3v％，可以是0.5-1.0v％、1.0-1.5v％、1.5-2v％、2.5-3v％，具体可以是0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3％。优选地，为0.6-2％；进一步优选地，为0.8-1.5％；更进一步优选地，为1％。
其中，FGF-2在Advanced DMEM/F12中的浓度为3-12ng/ml，可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12ng/ml。优选地，为3-9ng/ml；进一步优选地，为4-7ng/ml；更进一步优选地，为5ng/ml。
其中，Prostaglandin E2在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.5-3μM，可以是0.5-0.75μM、0.75-1μM、1-1.2μM、1.2-1.5μM、1.5-2μM、2-2.5μM、2.5-3μM，具体可以是0.5、0.8、1、1.2、1.5、2、2.5、3μM。优选地，为0.8-1.2μM；更进一步优选地，为1μM。
其中，CHIR 99021在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.1-0.3μM，具体可以是0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3μM。优选地，为0.15-0.25μM；更进一步优选地，为0.2μM。
其中，Forskolin在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.5-3μM，可以是0.5-0.75μM、0.75-1μM、1-1.2μM、1.2-1.5μM、1.5-2μM、2-2.5μM、2.5-3μM，具体可以是0.5、0.8、1、1.2、1.5、2、2.5、3μM。优选地，为0.8-1.2μM；更进一步优选地，为1μM。
其中，Antibiotic-Antimycotic占Advanced DMEM/F12的体积百分数为0.5-3v％，可以是0.5-1.0v％、1.0-1.5v％、1.5-2v％、2.5-3v％，具体可以是0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3v％。优选地，为0.6-2v％；进一步优选地，为0.8-1.5v％；更进一步优选地，为1v％。
其中，所述烟酰胺在Advanced DMEM/F12中的浓度为5-30mmol/L；可以是5-10、10-15、15-20、20-25、25-30mmol/L。
其中，所述***在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.2-2μmol/L。
在一些更优选实施方式中，所述培养基包含：500ml Advanced DMEM/F12(Gibco)，以及以Advanced DMEM/F12为基准的以下成分：10mM HEPES缓冲液、2mM GlutaMAX、1mg/mlPrimocin、2v％B27补充剂、1mM N-Acetylcysteine、50ng/ml rhEGF、0.1μM A83-01、10mMNicotinamide、10μM Y-27632、100ng/ml FGF-10、1μM Dexamethasone、1v％N2、5ng/mlFGF-2、1μM Prostaglandin E2、0.2μM CHIR 99021、1μM Forskolin、500ng/ml Wnt3a、0.1μg/ml Noggin、0.1μg/ml R-spondin-1、1v％Antibiotic-Antimycotic、以及2v％的胎牛血清。
本发明的培养基和方法，能够获得组织形态和基因分型与真实组织高度一致的类器官。培养过程中，最大程度保证活细胞的比例，可以缩短培养的时间。各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，结合独特的消化酶和消化方法，以及接种培养方法，使得黏膜黑色素瘤组织细胞在培养过程中能够更好的表现出其固有的活性特征，实现高度近似于活体黏膜黑色素瘤组织的综合特性。采用本发明的培养基培养获得的黏膜黑色素瘤类器官，会聚集成团，类似于活性黏膜黑色素瘤组织的形态和结构。
本发明还提供了如上所述的培养基在培养黏膜黑色素瘤3D类器官中的应用。本发明的黏膜黑色素瘤类器官的培养基针对于黏膜黑色素瘤组织来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照特定比例进行复配，获得的培养基中，含有适宜含量的细胞因子、信号通路调控因子，黏膜黑色素瘤细胞能够在较短的时间内形成与真实组织形态和性质接近的3D类器官。本发明的培养基成本低、可操作性强、重复性好，且经过多次传代培养的类器官，依然能够保证类器官的形态和细胞因子的表达水平接近于真实组织。
作为优选，本发明的黏膜黑色素瘤组织来源于黏膜黑色素瘤PDX组织或人黏膜黑色素瘤肿瘤组织。
本发明还提供了一种由上述培养方法培养的黏膜黑色素瘤3D类器官。本发明的黏膜黑色素瘤3D类器官能够模拟黏膜黑色素瘤细胞的生理环境，可以有效地维持组织细胞特异性，组织形态和基因分型高度一致；
本发明还提供了如上所述的类器官在作为药物评价模型中的应用，所述药物评价模型为抗肿瘤药物评价。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物的评价方法，包括如下步骤：
(1)利用所述方法培养获得的类器官；
(2)使用类器官组织进行抗肿瘤药物敏感性评价。
由于本发明构建的黏膜黑色素瘤3D类器官组织形态和基因分型与在体肿瘤高度一致，可以用于筛选黏膜黑色素瘤的治疗药物，真实反应药物的治疗效果，大大简化药物筛选的流程，满足科学研究需要。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
材料与方法
一、黏膜黑色素瘤类器官培养步骤
将收集的组织样本按照酶消化法制备成单细胞悬液，样本可以来源于临床样本和PDX瘤体，具体步骤如下。
1.酶消化法获取单细胞悬液
提前配制消化液：配制组织消化液(1640培养基，其中含1mg/ml IV型胶原酶，200U/L透明质酸酶，200U/L Dnase I，0.05％Tyrpsin-EDTA)。
具体流程如下：
i.如黏膜黑色素瘤样本来源于消化道、鼻腔口腔等有菌部位活检样本，则将肿瘤组织置于75％酒精3秒，若样本有坏死溃破，则用0.05％次氯酸钠浸泡10秒(若为黏膜黑色素瘤移植瘤PDX来源的肿瘤组织样本，则不用经酒精和次氯酸钠处理)。去除表面坏死组织，然后用含5％青霉素-链霉素、1×Primocin抗生素的PBS清洗一次；观察肿瘤内部是否存在坏死，若有，则去除，用上述PBS清洗一次。
ii.将清洗过的肿瘤组织置于6cm小皿，将组织用纤维手术剪剪碎成1-3mm3大小的组织块；将1-2块组织置于10％***或4％多聚甲醛用于后续组织学分析；
iii.将剪碎的组织，4℃，200g，3min离心，去除上清。
iv.组织消化：按组织消化液：肿瘤组织10:1的体积比例向肿瘤组织中加入组织消化液，然后加入C-tube(美天旎)，均匀混合。美天旎组织分离仪器调整为Tumor.03.01模式(适用于质地较软肿瘤)，进行组织粗分离。若无美天旎仪器，可用剪刀将组织尽量剪碎，一般也可满足实验需求。
v.将运行完程序后的c-tube置于37℃摇床，消化30-60min，密切观察肿瘤组织消化情况，约每15-20min，轻微震荡c-tube，避免组织聚团影响消化。
vi.当消化液成浑浊时，黏膜黑色素瘤样本一般悬液为黑褐色，摇晃离心管，未见明显剩余肿瘤组织时，终止消化，加入等体积含10％FBS，1％青霉素-链霉素，1×Primocin抗生素的1640培养基，4℃，200g，3min离心，去除上清。
vii.用约10ml1640培养基重悬，100μm滤网过滤未完全解离组织。70μm的滤网二次过滤。将滤过得到的细胞悬液，4℃，200g，3min离心，去除上清。
viii.再次用10ml 1640培养基重悬细胞，计数。将细胞悬液离心，根据细胞密度和实验需求，用预冷的黏膜黑色素瘤培养基，将细胞重悬为5*105/mL的细胞悬液备用。
2.类器官接种
在上述步骤消化细胞期间，准备类器官接种实验试剂耗材。
培养板(如24孔或48孔板)可以在开始一系列操作前就可以放进培养箱进行预热，预热时间至少30min；
黏膜黑色素瘤类器官培养基提前置于培养箱中预热；
BME胶要放在冰上融化；
实验用枪头需要提前冷藏预冷；
黏膜黑色素瘤类器官接种具体步骤如下：
i.取适量上述步骤配好的细胞悬液原液与BME胶按照1:1体积比混合，重悬细胞。
注：冰上操作，移液枪在枪头在吸取细胞前用含有血清的常规培养基浸润一下，即吸取培养基后在打出，防止粘连损失细胞。
ii.取出预热的24孔板，将细胞和BME的混合物滴在预24孔板培养板的底部中间位置，每滴约30～40μl(可以20-50ul)(如图1所示)，由于黑色素瘤一般含有大量色素，一般在首次接种时会有大量色素及细胞碎片等导致凝胶液滴呈黑色巧克力状表现，随着传代次数增加，后期色素会逐渐变少。注：操作迅速，避免胶凝固。
iii.将培养板倒置在37℃培养箱中，30min后，BME液滴固化，翻转培养板并沿每孔中的侧壁小心加入黏膜黑色素瘤类器官培养基，以没过凝胶球体为准，一般24版滴加500μL。
iv.将培养板置于37℃培养箱培养，每3～5天更换一次培养基，从各个孔中小心吸出培养基，然后加入新鲜的预热的黏膜黑色素瘤类器官培养基(预热可以防止凝固的胶变成液态)，理想情况下是14-21天后首次传代(不同组织生长速度不同)。
v.在培养期间定期进行类器官形态观察，拍照记录，一般在7天左右可见小的细胞球体(图2A)，21天可见细胞球体明显增大(图2B-C)，部分可有肉眼可见的球体(图3)。
3.黏膜黑色素瘤类器官传代
类器官传代的本质是将原来的胶破坏掉并且去掉，在此基础上通过机械吹打或酶消化法将上一代培养形成的细胞球体变成单细胞多微小细胞团块，进行传代生长，以重新形成类器官。一般球体长到50～100μm大小即可传代或者用于鉴定。
机械吹打法
i.吸除孔板中的培养基，向其中加入预冷的PBS，使用1ml枪头吹打胶体，机械破碎法破碎胶体，将PBS连同破碎的胶体还有细胞球一起吸到15ml离心管，离心管中预先加少量预冷PBS。
ii.4℃低温离心，500-700g离心3min；离心后，吸掉上清液(不要倾倒)，加5ml冰PBS重悬,并吹打，将细胞团块吹散，至肉眼看不到明显的细胞团块即可。
iii.4℃低温离心，500-700(g)离心3min；弃上清，加适量预冷培养基与基质胶混合，细胞悬液原液与BME gel按照1:1重悬细胞。
若球体无法通过机械破碎，则选用酶消化法进行传代，具体如下：
i.吸除孔板中培养基，加预冷PBS，蓝枪头对着胶体吹打，机械破碎法破碎胶体，将PBS连同破碎的胶体还有细胞球一起吸到15ml离心管，离心管中预先加少量预冷PBS。(将胶连同PBS一起被弃掉)。
ii.加冰PBS重悬，轻柔吹打，静置至大球沉淀到底为止，将大部分上清液吸到新的15ml离心管A中(因为这部分上清液中有一些小球含有上一步机械吹打产生的单细胞)；向离心管中加胰酶2ml，消化3～4min，消化至2min时轻柔吹打几下。之后用有血清培养基终止消化，将离心管A中的液体转移到旧离心管中一起进行离心，300-500g，3min，弃上清。
iii.加培养基重悬，密度同接种步骤相同，按照细胞悬液原液与BME gel按照1:1重悬细胞，接种。
4.黏膜黑色素瘤类器官冻存
获取细胞悬液步骤同上述第1点中所述。离心弃上清，用10％DMSO+90％FBS 1ml重悬类器官细胞悬液，再转入冻存管，放入梯度降温盒程序放入-80℃冰箱降温，第二天转运到液氮罐保存。
5.黏膜黑色素瘤类器官的包埋
待类器官管球体长50～100μm大小时，收集球体，可采用冰冻切片或石蜡包埋的方法进行鉴定。石蜡包埋法主要用琼脂包裹后进行石蜡包埋的方法。具体如下：
i.取材与固定：将待传代鉴定的类球体按照前节方法收集，PBS清洗离心后，去除PBS。10％***溶液室温固定2h。
ii.用1ml移液器将细胞球体转移到一次性塑料包埋模具中，枪头减去尖端5mm。尽量吸除磨具中的固定液，避免球体被吸走。
iii.预包埋及脱模：提前水浴锅70℃预热琼脂溶液至粘稠状态，沿着模具四角缓慢将热琼脂滴入含有球体的一次性塑料包埋模具中，缓慢加到组织上直至琼脂包裹全部组织。
iv.待琼脂室温凝固，连同模具将预包埋组织依次放入70％酒精、85％酒精、95％酒精、100％酒精脱水，每次5-10min。这样以便于琼脂块脱模。
v.脱水：琼脂块依次入70％酒精30min，85％酒精30min，95％酒精30min，100％酒精2h。
vi.透明及浸蜡：过程同常规包埋法。
vii.包埋切片染色。
6.黏膜黑色素瘤PDO与原发灶一致性鉴定
将PDO生长获得的肉眼可见的瘤体组织按照上述方法进行包埋,切片进行HE染色，与临床患者肿瘤组织HE染色进行组织形态学对比。同时，黏膜黑色素瘤和对应病人原发灶黏膜黑色素瘤相关标志物(S100、HMB45、Melan-A)以及上皮标志物AE1/AE3进行免疫组化染色(红染)对比。
免疫组化染色步骤如下：
将蜡块切成4μm厚的切片进行免疫组织化学染色，柠檬酸钠修复液水浴加热进行抗原修复，3％过氧化氢脱色素处理60min，PBS洗涤后加入上述一抗，室温(22-25℃)1.5小时，室温PBS洗去一抗，10min×3次，加入二抗室温反应30min，室温PBS洗去二抗，10min3次，AEC红显9min，苏木素复染9min，水溶性封片剂封片。
选取发生于口腔的黏膜黑色素瘤组织进行上皮和黑色素瘤组织免疫组化染色，作为阳性阴性的对比参照，包括口腔黏膜上皮(Epithelium)及黏膜黑色素瘤组织(melanoma)。如：在黑色素瘤组织中表达HMB45,而在黏膜上皮中这HMB45表达为阴性。在黏膜上皮中上皮标志物AE1/AE3表达阳性，而在黑色素瘤组织中AE1/AE3表达阴性(图4)。
实施例1黏膜黑色素瘤类器官培养
标本来源为既往研究中构建成功的黏膜黑色素瘤PDX肿瘤组织(图5)。PDX的构建参照本发明人课题组既有方法，即将患者来源的活检或手术组织，接种到免疫缺陷小鼠皮下。具体操作为，一次性无菌培养皿，分别倒入适量0.04％次氯酸钠一份，加有1％青霉素-链霉素双抗的PBS或无血清培养基三份。将离体黏膜黑色素瘤肿瘤组织取出，在次氯酸钠溶液中清洗10秒，迅速放入PBS或无血清培养基中洗去肿瘤表面次氯酸钠，用无菌器械修剪肿瘤组织表面坏死及纤维组织，并换用PBS或无血清培养基清洗两遍，每次2分钟，将组织剪碎成2～3mm大小的小块。将麻醉后的小鼠侧腹用酒精进行消毒，以手术剪剪出约5mm大小切口，使用显微镊从侧腹缓慢钝性分离至腋窝和腹股沟，用显微镊将肿瘤组织接种至腋窝和腹股沟处，每个部位接种约2～3块肿瘤组织。当移植瘤皮下成瘤后，用于后续实验。PDX肿瘤来源患者为一例女性口腔黏膜黑色素瘤患者，原发灶位于上颌牙龈，术后病理诊断为：黏膜黑色素瘤。
具体实施步骤参照上述实验步骤，本实施例简述如下：
将收集的组织样本按照上述所用的酶消化法制备成单细胞悬液。计数后，用预冷的黏膜黑色素瘤培养基，将细胞重悬为5*105/mL的细胞悬液备用。
将细胞悬液与BME胶按照1:1混合，24孔板接种，每孔接种40μL,倒置于培养箱中30分钟。添加500μL黏膜黑色素瘤培养基。Advanced DMEM/F12培养基中添加的具体成分如下表(以Advanced DMEM/F12培养基为基准)：
Figure BDA0003606195760000161
在培养期间定期进行类器官形态观察，拍照记录，一般在培养7天后可见细胞团块(图6A)，培养21天后可见细胞球体明显增大(图6B-C)。
进一步收集类器官球体利用琼脂包埋法进行石蜡固定；收集的球体肉眼可见(图7)。
类器官球体的鉴定
球体包埋后对石蜡切片进行HE染色(图8)，由图8可知，；
将类器官组织与对应原发病人原发灶黏膜黑色素瘤相关标志物(S100、HMB45、Melan-A)以及上皮标志物AE1/AE3进行免疫组化染色(红染)对比，结果如图9所示，本实施例制备的类器官与原发灶肿瘤表达分子一致。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (11)

1.一种培养黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包括：基础培养基，以及以基础培养基为基准的以下成分：HEPES缓冲液、GlutaMAX、Primocin、B27补充剂、N-Acetylcysteine、rhEGF、A83-01、Nicotinamide、Wnt3a、Noggin以及R-spondin-1。
2.一种培养黏膜黑色素瘤3D类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包括：基础培养基，以及以基础培养基为基准的以下成分：2-20mM HEPES缓冲液、1-5mM GlutaMAX、0.2-2mg/ml Primocin、0.5-5v％B27补充剂、0.75-2mM N-Acetylcysteine、20-100ng/mlrhEGF、0.05-0.3μM A83-01、2-20mM Nicotinamide、300-800ng/ml Wnt3a、0.05-0.3μg/mlNoggin、0.05-0.3μg/ml R-spondin-1。
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括：Advanced DMEM/F12培养基，以及以Advanced DMEM/F12培养基为基准的以下成分：10mM HEPES缓冲液、2mMGlutaMAX、1mg/ml Primocin、2v％B27补充剂、1mM N-Acetylcysteine、50ng/ml rhEGF、0.1μM A83-01、10mM Nicotinamide、500ng/ml Wnt3a、0.1μg/ml Noggin以及0.1μg/ml R-spondin-1。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，包括以下至少一项：
1)所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基、DMEM、高糖DMEM培养基、αMEM培养基和RPMI1640培养基中的至少一种；
2)所述培养基还包括胎牛血清；优选地，所述培养基还进一步包括Y-27632、FGF-10、Dexamethasone、N2、FGF-2、Prostaglandin E2、CHIR 99021、Forskolin、Antibiotic-Antimycotic、烟酰胺、***中的至少一种；更优选地，所述培养基还包括胎牛血清、Y-27632、FGF-10、Dexamethasone、N2、FGF-2、Prostaglandin E2、CHIR 99021、Forskolin和Antibiotic-Antimycotic。
5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，包括以下至少一项：
1)所述胎牛血清在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.5-5v％；
2)所述Y-27632在Advanced DMEM/F12中的浓度为2-20μM；
3)所述FGF-10在Advanced DMEM/F12中的浓度为50-300ng/ml；
4)所述Dexamethasone在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.75-2μM；
5)所述N2在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.5-3v％；
6)所述FGF-2在Advanced DMEM/F12中的浓度为3-12ng/ml；
7)所述Prostaglandin E2在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.5-3μM；
8)所述CHIR 99021在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.1-0.3μM；
9)所述Forskolin在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.5-3μM；
10)所述Antibiotic-Antimycotic在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.5-3v％；
11)所述烟酰胺在Advanced DMEM/F12中的浓度为5-30mmol/L；
12)所述***在Advanced DMEM/F12中的浓度为0.2-2μmol/L。
6.如权利要求1～5任一项所述的培养基在培养黏膜黑色素瘤3D类器官中的应用。
7.一种黏膜黑色素瘤3D类器官的培养方法，其特征在于，所述方法包括，将破碎后的黏膜黑色素瘤细胞采用如权利要求1～5任一项所述的培养基进行培养，获得所述的黏膜黑色素瘤3D类器官。
8.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述黏膜黑色素瘤选自黏膜黑色素瘤患者来源的原发样本或黏膜黑色素瘤PDX组织来源的肿瘤组织。
9.一种由权利要求7或8所述的培养方法培养的黏膜黑色素瘤3D类器官。
10.如权利要求9所述的类器官在作为药物评价模型中的应用，所述药物评价模型为抗肿瘤药物评价。
11.一种抗肿瘤药物的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用权利要求9所述的类器官；
(2)使用类器官组织进行抗肿瘤药物敏感性评价。
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