CN114555788A - 免疫细胞工程化用于体外细胞治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了传染非粘附细胞问题的解决方案。含有乙醇和等渗盐溶液的组合物及其使用方法能够有效传递化合物和组合物进入非粘附细胞，例如，T细胞。

Description

免疫细胞工程化用于体外细胞治疗
相关申请
本申请根据美国法典第35U.S.C.§119(e)，享有2019年9月6日提交的美国临时申请第62/897,250号、2020年5月11日提交的美国临时申请第63/022,944号和2020年7月1日提交的美国临时申请第63/047,054号的优先权，这些申请的全部内容通过引用全部并入本文。
技术领域
本发明涉及将药物传递到哺乳动物细胞中进行免疫治疗。
背景技术
不同细胞类型之间细胞转染效率纯在差异。已经证明，使用常规方法转染悬浮细胞(例如，非粘附细胞)是十分困难的。因此，需要便于转染这种细胞的组合物和方法。此外，需要改进生产策略以确保免疫细胞的效率和细胞治疗。
发明内容
本发明提供了一种用于体外细胞治疗应用的免疫细胞工程化的解决方案。这里描述的组合物和方法促进细胞工程化技术，所述细胞工程化技术能够实现需要复杂修饰和高水平细胞功能的下一代细胞治疗产品。如本文所述，SOLUPORETM传递方法是一种简单、快速和高效地将货物传递到初代免疫细胞，同时保持细胞活性和功能性的非病毒方式。此外，这些经过改造的免疫细胞，例如T细胞，可以降低T细胞耗尽的可能性，从而能够将其用于复杂的治疗需求。
因此，这里提供的是包括外源性货物的免疫细胞(或免疫细胞群)，例如T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞、巨噬细胞或其他免疫细胞，其中，与参照免疫细胞在货物传递后24小时所得的基因或者蛋白水平相比，所述包括外源性货物的免疫细胞在货物传递后24小时的基因或蛋白质的表达水平分子曲线的log2倍数变化在3以内。该基因或蛋白是激动蛋白1(AP-1)信号转导通路的成员，其分子曲线与运送的货物类型无关。所述参照免疫细胞是一种没有经历细胞工程过程或细胞激活步骤的免疫细胞。例如，未使用电穿孔方法、病毒转导方法或其他方法(包括SOLUPORETM方法)操纵控制免疫细胞来将货物运送到细胞内。
例如，与对照免疫细胞中的基因或蛋白质的水平相比，包含外源性货物的免疫细胞的分子曲线具有的log2倍数变化在3以内、或log2倍数变化在2以内、或log2倍数变化在1以内的基因或蛋白质的表达。例如，在货物交付后6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时或大约6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时评估分子曲线(基因表达曲线)。作为选择，包含外源性货物的免疫细胞的分子曲线与在参照免疫细胞相比，在货物传递后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、1周、2周、4周、1个月、2个月、3个月或者4个月的基因或蛋白质水平的log2倍数变化在3以内、或log2倍数变化在2以内、或log2倍数变化在1以内的基因或蛋白质的表达。
细胞工程化过程可以包括电穿孔，这是一种向细胞施加电场以增加细胞膜通透性的过程(也称为电转移)。此外，细胞工程化过程可以指用于细胞内传递的任何已知的转染方法，包括SOLUPORETM传递方法、膜破坏方法(电穿孔、声波穿透、磁检测、光学操作)或基于载体的方法(例如，脂质纳米颗粒)。
分子曲线是指免疫细胞的基因表达、基因组曲线、蛋白质表达、蛋白质活性或蛋白质组曲线。在其他实施例中，具有外源性货物的免疫细胞的分子曲线具有的基因或者蛋白表达水平与参照免疫细胞中基因或蛋白水平内相比，其log2倍数变化在2以内。在进一步的实施例中，具有外源性货物的免疫细胞的分子曲线具有的基因或者蛋白表达水平与参照免疫细胞中基因或蛋白水平内相比，其log2倍数变化在1以内。
在各个实施例中，免疫细胞的外源性货物包括核酸、小分子、蛋白质、多肽或其组合。例如，该核酸包括信使核糖核酸(MRNA)、小干扰RNA(SiRNA)、短发夹状RNA(ShRNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其任意组合。
外源性货物或“有效载荷”是用来描述化合物的术语，例如，含有mRNA的核酸，或通过水溶液穿过细胞膜并进入细胞内部的组合物。
本发明的免疫细胞(例如具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos(v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物，FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物)、Jun(v-Jun禽肉瘤病毒17癌基因同源物)或其组合在其中的表达水平与参照免疫细胞中表达水平相比，log2的倍数变化在3以内。例如，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos、Jun或其组合在其中的表达水平与参照免疫细胞中表达水平相比，log2的倍数变化为-3。
在其他实施例中，本发明的免疫细胞(例如具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos、Jun或其组合在其中的表达水平与参照免疫细胞中表达水平相比，log2的倍数变化在2以内。在进一步的实施例中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos、Jun或其组合在其中的表达水平与参照免疫细胞中表达水平相比，log2的倍数变化在1以内。
在一些实施方案中，Fos包括人Fos，包括如SEQ ID NO:1所示的示例性核酸序列。在一些实施方案中，Jun包括人Jun，包括如SEQ ID NO:2所示的示例性核酸序列。
本发明的免疫细胞(例如具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos、Jun、FosB(FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B；SEQ ID NO:3)、BATF(碱性亮氨酸拉链ATF-样转录因子)、BATF(碱性亮氨酸拉链ATF-样转录因子；SEQ ID NO:4)、或者BATF3(碱性亮氨酸拉链ATF-样转录因子3；SEQ ID NO:5)或其组合在其中的表达水平与参照免疫细胞(不具有外源性货物的免疫细胞)中表达水平相比，log2的倍数变化在3以内，log2的倍数变化在2以内，或者log2的倍数变化在1以内。在实施方案中，本发明的免疫细胞(例如具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos、Jun、FosB、BATF、或者BATF3在其中的表达水平与参照免疫细胞(不经历细胞工程化过程或者细胞活化步骤的免疫细胞)中表达水平相比，log2的倍数变化在大约-3以内，log2的倍数变化在大约-2以内，或者log2的倍数变化在大约-1以内。例如(负数)，基因表达水平少于参照免疫细胞中的表达水平。
在实施例中，本发明的免疫细胞(例如具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos、Jun、FosB、BATF、或者BATF3在其中的表达水平与参照免疫细胞中表达水平相比，log2的倍数变化在1以内。在实施例中，本发明的免疫细胞(例如具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos、Jun、FosB、BATF、或者BATF3在其中的表达水平与参照免疫细胞中表达水平相比，log2的倍数变化在2以内。在实施例中，本发明的免疫细胞(例如具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线，其中Fos、Jun、FosB、BATF、或者BATF3在其中的表达水平与参照免疫细胞中表达水平相比，log2的倍数变化在3以内。
在实施方案中，外源性货物包括核酸。例如，所述货物包括信使核糖核酸(mRNA)。例如，mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。例如，该CAR靶向CD19(差异化集群19)。编码CD19 CAR的示例性mRNA包括SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在其他实施例中，mRNA编码TRAIL-DR5(TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)死亡受体5)变体mRNA(SEQ ID NO:10)、TRAIL DNA(SEQ ID NO:11)，例如，参见美国专利第7994281号，通过引用整体并入本文。在其他实施例中，mRNA编码IL-15(白细胞介素15)mRNA或TCR(T细胞受体)mRNA。
在其他实施例中，外源性货物包括Cas9(CRISPR相关蛋白9)蛋白，例如包括TRAC(T细胞受体α常数)或PD-1(程序性死亡配体1)的引导RNA。例如，Cas9蛋白序列包括SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。靶向gRNA的人TRAC序列包括SEQ ID NO：25。靶向gRNA的人PDCD1的序列包括SEQ ID NO：26。
在其他实施例中，外源性货物包含Cas12a蛋白(CRISPR相关蛋白12a)，其包括含有TRAC和PD-1的引导RNA。Cas12a蛋白质序列包括SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在实施例中，外源性货物包含MAD7蛋白质，其包括含有TRAC或PD-1的引导RNA。在实施例中，外源性货物包含SGCA，其包括含有TRAC或PD-1的引导RNA。在实施例中，外源性货物包含Cas13，其包括含有TRAC或PD-1的引导RNA。或者，外源性货物包含碱基编辑器，例如Cas9n，或锌指核酸酶，或MegaTALs。
在实施例中，外源性货物包括睡美人(Sleeping Beauty)100转座子/转座子***，或睡美人1000转座子/转座子***，或小猪Bac转座子/转座子***，或TcBuster转座子/转座子***。
在其他实施例中，外源性货物包括DNA，例如，CD19 CAR DNA,TRAIL DNA或者IL-15DNA。
在实施例中，外源性货物包含山中因子，所述山中因子用于从成年人类细胞中产生稳定诱导的多能干细胞。例如，山中因子包括c-Myc(Myc原癌基因、bHLH转录因子，SEQ IDNO:13)、Klf4(Kruppel样因子4，SEQ ID NO:14)、Oct4(八聚体结合转录因子4，SEQ ID NO:15)或Sox2(SRY(性别决定区Y)-框2，SEQ ID NO:16)。
在进一步的实施例中，所述外源性货物包括siRNA(小干扰性RNA)，例如，抗PD-1。在进一步的实施例中，所述外源性货物包括shRNA(短发夹RNA)，例如，抗PD-1。
术语“外源性”指来自或衍生于细胞外的货物(或有效载荷)，例如免疫细胞，而不是起源于免疫细胞内的内源性试剂。
可以使用各种方法来描述免疫细胞的分子曲线。例如，可以使用DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、细胞因子分析或其组合来完成分子曲线。例如，分子曲线是通过RNA分析得出的。在一些实施方案中，RNA分析包括RNA定量。在一些实施方案中，通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)、复合qRT-PCR、荧光原位杂交(FISH)及其组合进行RNA定量。在一些实施方案中，通过DNA分析进行分子曲线分析。在一些实施方案中，DNA分析包括从一个或多个已识别的细胞中扩增DNA序列。在一些实施方案中，通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增。在一些实施方案中，分子曲线通过RNA或DNA测序产生。在一些实施方案中，RNA或DNA测序通过(包括但不限于)全转录组分析、全基因组分析、基因组的整个或靶向区域的条形码测序及其组合的方法进行的。在其他实施例中，分子曲线通过蛋白质分析(包括例如在蛋白质组水平上的分析)产生。
在实施方案中，具有外源性货物的免疫细胞的分子曲线所体现的基因或者蛋白(例如，AP-信号传导通路)表达水平与参照免疫细胞中基因或蛋白水平相比，其log2倍数变化为大约-3，log2倍数变化为大约-2、或者log2倍数变化为大约-1。例如，具有外源性货物的免疫细胞的分子曲线所体现的在AP-1信号传导通路中的基因或者蛋白表达水平与参照免疫细胞中基因或蛋白水平相比，其log2倍数变化为-1。例如，具有外源性货物的免疫细胞的分子曲线所体现的在AP-1信号传导通路中的基因或者蛋白表达水平与参照免疫细胞中基因或蛋白水平相比，其log2倍数变化为-2。在其他实施例中，具有外源性货物的免疫细胞的分子曲线所体现的的基因或者蛋白表达水平与参照免疫细胞中基因或蛋白水平相比，其log2倍数变化为-1。
在实施方案中，具有外源性货物的免疫细胞的分子曲线所体现的基因或者蛋白表达水平与参照免疫细胞中基因或蛋白水平相比以及与AP-1(激活因子蛋白-1)信号传导通路中的基因或者蛋白水平相比，其log2倍数变化在大约3以内，其log2倍数变化在大约2以内、或者其log2倍数变化在大约3以内，其log2倍数变化在大约1以内。AP-1是一致转录因子，其通过应答各种刺激因子(包括细胞因子、生长因子、压力和细菌和病毒感染)来调节基因表达。AP-1控制一系列细胞内过程，包括分化、扩增和凋亡。例如，耗尽的T细胞显示较低的AP-1因子表达水平，所述AP-1因子包括Fos、Jun和/或Fosb(FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B)。例如，Fos具有人核酸序列如SEQ ID NO:1所示。在其他实施例中，Jun包括SEQ ID NO:2核酸序列。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞包含至少两种或两种以上外源性货物(例如，3、4、5、6、7、8、9或10种外源性货物)。外源性货物包括核酸(例如，RNA(核糖核酸)、mRNA(信使RNA)或DNA(脱氧核糖核酸))、蛋白质或肽、小化学分子或其任何组合。
本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)具有许多优点，例如，使用SOLUPORETM方法处理的免疫细胞很少或没有表现出T细胞衰竭或T细胞无能的表型特征。T细胞无能是T细胞在缺乏共刺激信号的情况下受到刺激的一种功能失调状态。T细胞衰竭是指由于长时间的抗原刺激，T细胞效应子功能逐渐丧失。此外，T细胞刺激是指T细胞受体(TCR)/CD3(分化簇3)复合物和共刺激受体(如CD28(分化簇28))的结合，从而导致细胞激活。由于SOLUPORETM方法处理的细胞很少或没有表现出T细胞衰竭或无能的表型特征，因此它们更适合临床使用，换句话说，它们的免疫功能得到保留，因此与电穿孔细胞相比具有更高的临床效益。
T细胞“衰竭”是指在慢性病毒感染或癌症或其他操作(如细胞表面受体(如CD3或CD28)与配体(如抗CD3抗体或抗CD28抗体)长期接触抗原期间，T细胞反应不良的状态。“T细胞衰竭”的特点是T细胞功能丧失。耗尽的T细胞显示出不同于功能效应或记忆T细胞的转录谱，其特征是抑制性细胞表面受体的表达，包括PD-1、LAG-3(淋巴细胞激活基因3)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3)、TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)，以及CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、IL-2(白细胞介素2)、TNF(肿瘤坏死因子)和IFN-γ(干扰素-γ)细胞因子的产生。NFAT(活化T细胞的核因子)和AP-1转录因子协同在诱导无能和衰竭等低反应状态中发挥核心作用。耗尽的细胞表现出AP-1因子(FOS、FOSB和Jun)的低表达。此外，T细胞无能可能指的是一种耐受机制，在这种机制中，淋巴细胞在遇到抗原后本质上功能失活，但在低反应状态下保持较长时间的存活。
在实施方案中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)包括未受刺激的免疫细胞。例如，不使用CD3、CD28或其组合的配体刺激免疫细胞。换句话说，免疫细胞不与CD3或CD28配体接触，例如，与CD3、CD28或两者结合的抗体或抗体片段。
在各方面中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌至少一种细胞因子，与未经历细胞工程过程的免疫细胞的分泌水平相比，所述细胞因子分泌水平的log2倍数变化在3以内。在其他实施方案中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌至少一种细胞因子，与未经历细胞工程过程的免疫细胞的分泌水平相比，所述细胞因子分泌水平的log2倍数变化在2以内。在其他实施方案中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌至少一种细胞因子，与未经历细胞工程过程的免疫细胞的分泌水平相比，所述细胞因子分泌水平的log2倍数变化在1以内。例如，与参照免疫细胞相比，本发明的免疫细胞不会导致细胞因子的非特异性分泌(也称为“释放”，并指从细胞(例如免疫细胞)释放细胞因子)。
在实施方案中，与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IL-2(白细胞介素2)和/或IL-8(白细胞介素8)的水平的log2倍数变化在3以内。在实施方案中，与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IL-2(白细胞介素2)和/或IL-8(白细胞介素8)的水平的log2倍数变化在2以内。在实施方案中，与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IL-2(白细胞介素2)和/或IL-8(白细胞介素8)的水平的log2倍数变化在1以内。
在实施方案中，与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IL-2(白细胞介素2)和/或IL-8(白细胞介素8)的水平的log2倍数变化为-3。
在实施方案中，与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IL-2(白细胞介素2)和/或IL-8(白细胞介素8)的水平的log2倍数变化为-2。在实施方案中，与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IL-2(白细胞介素2)和/或IL-8(白细胞介素8)的水平的log2倍数变化为-1。
在实施方案中，IL-2(例如，人IL-2)包括的核酸序列如SEQ ID NO:17所示。在其他实施方案中，IL-8(例如，人IL-IL-8)包括的核酸序列如SEQ ID NO:18所示。
在实施方案中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IFN-γ(干扰素γ)、IL-2、TNFα(肿瘤坏死因子α)、IL-8、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、IL-10(白细胞介素10)、MIP-1α(巨噬细胞炎性蛋白1α)，MIP-1β(巨噬细胞炎性蛋白1β)、IL-17A(白细胞介素17A)、不规则趋化因子或ITAC(干扰素诱导T细胞α趋化剂)或其组合的水平与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，其log2的倍数变化在3以内。在实施方案中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IFN-γ(干扰素γ)、IL-2、TNFα(肿瘤坏死因子α)、IL-8、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、IL-10(白细胞介素10)、MIP-1α(巨噬细胞炎性蛋白1α)，MIP-1β(巨噬细胞炎性蛋白1β)、IL-17A(白细胞介素17A)、不规则趋化因子或ITAC(干扰素诱导T细胞α趋化剂)或其组合的水平与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，其log2的倍数变化在2以内。在实施方案中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、TNFα、IL-8、GM-CSF、IL-10、MIP-1α、MIP-1β、IL-17A、不规则趋化因子、ITAC或其组合的水平与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，其log2的倍数变化在1以内。
在实施例中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、TNFα、IL-8、GM-CSF、IL-10、MIP-1α、MIP-1β、IL-17A、不规则趋化因子、ITAC或其组合的水平与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，其log2的倍数变化大约为-3。在其他实施例中，在其他实施例中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、TNFα、IL-8、GM-CSF、IL-10、MIP-1α、MIP-1β、IL-17A、不规则趋化因子、ITAC或其组合的水平与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，其log2的倍数变化大约为-2。在其他实施例中，本发明的免疫细胞(例如，具有外源性货物的免疫细胞)分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、TNFα、IL-8、GM-CSF、IL-10、MIP-1α、MIP-1β、IL-17A、不规则趋化因子、ITAC或其组合的水平与未经历细胞工程过程的免疫细胞相比，其log2的倍数变化大约为-1。
本文还提供了一种通过非粘附性免疫细胞的质膜传递货物(或“外源性货物”)的方法。因此，该方法包括提供非粘附细胞群，并将该细胞群与一定体积的等渗水溶液接触，该水溶液包括有效载荷以及浓度大于0.2％(v/v)的醇，其中，非粘附性免疫细胞的免疫功能包括未经历细胞工程步骤的细胞的表型，其中免疫功能选自(i)细胞因子释放；(ii)基因表达；和(iii)代谢率。
例如，醇浓度约为0.2％(v/v)或更高，或醇浓度约为0.5％(v/v)或更高，或醇浓度约为2％(v/v)或更高。或者，醇浓度为5％(v/v)或更高。在其他实施例中，醇浓度为10％(v/v)或更高。
例如，所述醇包括乙醇，例如，10％的乙醇或者更多。在一些实施例中，所述水溶液包括20-30％的乙醇，例如，27％的乙醇。
例如，电穿孔(细胞工程过程)包括一种细胞内传递方法，其中向细胞施加电场以增加细胞膜通透性(也称为电转移)。如本文所用，术语“细胞工程过程”可指用于细胞内传递的任何已知转染方法，包括SOLUPORETM传递方法、膜破坏方法(电穿孔、声穿孔、磁检测、光操作)或基于载体的方法(脂质纳米粒)。电穿孔的典型形式包括整体电穿孔和流过电穿孔。电穿孔的供应商和仪器包括Maxcyte、Lonza-Nucleofector、Cellectis-Pulse Agile、BioRad-Gene Pulser、Thermofisher-Neon或Celetrix-Nanopulser。
本文提供了通过非粘附细胞的质膜传递有效载荷(或“外源性货物”)的方法。该方法包括提供非粘附细胞群；以及将细胞群与一定体积的等渗水溶液相接触，所述等渗水溶液包括有效载荷和浓度大于0.1、0.5、1、2、2.5、5％(v/v)浓度或更高浓度的醇。
在一些实施例中，水溶液包括醇，并且所述醇可包括乙醇。在其他实施例中，所述水溶液包含大于10％的乙醇、20-30％的乙醇或约27％的乙醇。在一些实施例中，水溶液包含12.5-500mM氯化钾(KCl)或约106mM的KCl。
用于将外源性货物传递至细胞的水溶液包含12.5-500mm之间的盐，例如氯化钾(KCl)。例如，溶液相对于哺乳动物细胞(如人类T细胞)的细胞质是等渗的。这种示例性等渗传递溶液为106mM KCl。
在其他实施例中，所述水溶液可包括5％至30％的乙醇浓度(例如，0.2％至30％)。所述水溶液可包括75％至98％的H2O、2％至45％的乙醇、6至91mM的蔗糖、2至500mM的KC1、2至35mM的醋酸铵和1至14mM(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)(HEPES)中的一种或多种。例如，所述传递溶液含有106mM KCl和27％乙醇。例如，所述传递溶液含有106mM KCl和10％乙醇。例如，所述传递溶液含有106mM KCl和5％乙醇。例如，所述传递溶液含有106mM KCl和2％乙醇。
示例性非粘附/悬浮细胞包括原代造血干细胞(HSC)、T细胞(例如，CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞)、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、人脐血CD34+细胞、B细胞或诸如Jurkat T细胞系的细胞系。非粘附细胞的表面可以是基本上融合，例如融合率大于75％。细胞融合是指细胞在表面上相互接触。例如，它可以表示为估计(或计算)的百分比，例如，10％的融合意味着10％的表面(例如组织培养血管)被细胞覆盖，100％意味着它被完全覆盖。例如，非粘附细胞可以向下旋转，通过真空或组织培养基从细胞群顶部抽吸，或通过抽吸或真空从血管底部移除。这些细胞可以形成单层细胞。例如，对于10、25、50、75、90、95或100％汇合的细胞。
在实施方案中，免疫细胞在货物交付之前未被激活。在其他实施例中，在免疫细胞与外源性货物接触之前，免疫细胞未与CD3、CD28或其组合的配体接触。
在实施方案中，非粘附细胞包括外周血单核细胞。在一些实施例中，非粘附细胞包含免疫细胞(例如，T淋巴细胞)且免疫细胞未受刺激，例如由CD3或CD28或其任何组合所刺激。在其他实施例中，非粘附细胞包括免疫细胞，例如T淋巴细胞。
在实施方案中，免疫细胞包括未受刺激的免疫细胞。例如，不使用CD3、CD28或其组合的配体刺激免疫细胞。换句话说，免疫细胞不与CD3或CD28配体接触，例如，与CD3、CD28或两者结合的抗体或抗体片段。在实施例中，非粘附细胞群包含单层。例如，单层与所述水溶液的喷雾接触。
该方法涉及将传递溶液中的外源性货物传递至包含单层的非粘附细胞群。例如，所述单层细胞与水传递溶液的喷雾接触。该方法将有效载荷/货物(化合物或组合物)传递到细胞的细胞质中，其中，与通过电穿孔或核感染传递的有效载荷相比，细胞群具有更高的存活率，这是溶解***的一个显著优点。
在某些实施方案中，非粘附细胞/悬浮细胞的单层驻留在膜过滤器上。在一些实施例中，在用传递溶液的喷雾接触细胞单层后振动膜过滤器。在向细胞喷洒传递溶液之前、期间和/或之后，可振动或搅动膜过滤器。
待传递到细胞中的溶液的体积可以是任意单位，例如喷雾，例如水性颗粒上的多个液滴。相对于单个细胞或相对于融合或基本融合(例如，至少75％，至少80％融合，例如，85％，90％，95％，97％，98％，100％)细胞群的暴露表面积描述所述体积。例如，每个细胞的体积可以在6.0x10-7微升和7.4x10-4微升之间。每个细胞的体积在4.9x10-6微升和2.2x10-3微升之间。每个细胞的体积可以在9.3x10-6微升和2.8x10-5微升之间。每个细胞的体积约为1.9x10-5微升，大约在10％以内。每个细胞的体积在6.0x10-7微升和2.2x10-3微升之间。体积可以在2.6x10-9微升/平方微米的暴露表面积和1.1x10-6微升/平方微米的暴露表面积之间。体积可以在5.3x10-8微升/平方微米的暴露表面积和1.6x10-7微升/平方微米的暴露表面积之间。每平方微米暴露表面积的体积约为1.1x10-7微升。
在本说明书中，术语“大约”指的是在给定数量或者度量的10％以内。
细胞融合是指细胞在表面上相互接触。例如，它可以表示为估计(或计算)的百分比，例如，10％的融合意味着10％的表面(例如组织培养血管)被细胞覆盖，100％意味着它被完全覆盖。例如，贴壁细胞在组织培养孔、平板或***表面上二维生长。非粘附细胞可以向下旋转，通过真空或组织培养基从细胞群顶部抽吸，或通过抽吸或真空从血管底部移除。
有效载荷(外源性货物)可以包括小化学分子，肽或蛋白质，或核酸。小化学分子可小于1,000Da。化学分子可包括MitoTrackerg Red CMXRos，碘化丙啶，甲氨蝶呤和/或DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)。肽可以是约5,000Da。肽可以包括艾卡拉肽(商品名为Kalbitor，其是一种具有60个氨基酸的多肽，用于治疗遗传性血管性水肿并在心胸手术中预防失血)、利拉鲁肽(以商品名Victoza上市销售用于治疗II型糖尿病，以商品名Saxenda上市销售用于治疗肥胖)和艾替班特(商品名为Firazyer，其是一种肽模拟物，用于治疗遗传学血管性水肿的急性发作)。小干扰性核糖核酸(siRNA)分子的长度可以是大约20-25个碱基对，或者可以是大约10,000-15,000Da。所述siRNA分子可以减少任意一种基因产物的表达，例如，降低临床相应目标基因或者模型基因的基因表达，例如，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA、GAPDHsiRNA-FITC、亲环蛋白B siRNA、和/或核纤层蛋白siRNA。蛋白质治疗剂可以包括肽、酶、结构蛋白质、受体、细胞蛋白质，或者循环蛋白质、或者其片段。所述蛋白质或者多肽是大约100-500,000Da，例如，是1,000-150,000Da。所述蛋白质可以包括任何治疗、诊断、或者研究性质的蛋白质或肽，例如β-乳球蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)，和/或辣根过氧化酶。在其他实施例中，所述蛋白质可以包括癌症特异性凋亡蛋白质，例如肿瘤坏死因子有关的凋亡诱导蛋白质(TRAIL)。在其他实施例中，蛋白质可包括癌症特异性凋亡蛋白，例如肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导蛋白(TRAIL)。
抗体的分子量通常约为150,000Da。所述抗体可以包括抗肌动蛋白抗体、抗GAPDH抗体、抗Src抗体、抗Myc抗体和/或抗Raf抗体。所述抗体可以包括绿色荧光蛋白质(GFP)质粒、GLuc质粒和BATEM质粒。所述DNA分子可以大于5,000,000Da。在一些实施例中，所述抗体可以是鼠衍生的单克隆抗体，诸如替伊莫单抗tiuxetin、莫罗单抗-CD3、托西莫单抗、人类抗体，或者人源化的鼠(或者其他种族来源的)抗体。在其他实施例中，所述抗体可以是嵌合的单克隆抗体，诸如阿昔单抗、巴利昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗，或者美罗华。在依旧其他实施例中，所述抗体可以是人源化的单克隆抗体、诸如阿仑单抗、贝伐珠单抗、妥珠单抗、达(克)珠单抗、吉妥单抗、曲妥珠单抗、塔西单抗、伊匹单抗或者帕尼单抗。所述抗体可以包括一种抗体片段，诸如abatecept、阿柏西普、阿法赛特，或者依那西普。本发明不但包括一种完整的单克隆抗体，而且包括一种免疫活性抗体片段，例如Fab或者(Fab)2片段；一种工程设计的单链FV分子；或者嵌合分子，例如一种含有一种抗体(例如鼠源)和另一种抗体(例如人源)的其余部分的结合特异性的抗体。
所述有效载荷可以包括治疗剂。治疗剂，例如，药物，或者活性试剂指的是任意对治疗或者诊断目的有效的化合物，该术语可以被理解为任意能够对患者施用治疗疾病的化合物。因此，治疗剂可以包括蛋白质、肽、抗体、抗体片段和小分子。美国专利第7,667,004号(通过引证在此全部并入本文)中描述的治疗剂可被用于这里所描述的方法中。所述治疗剂可以包括顺式铂氨、阿斯匹林、斯达汀(例如，匹伐他汀、阿伐他汀、洛弗斯特丁、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、丙嗪盐酸、氯丙嗪盐酸、甲硫哒嗪盐酸、硫酸多粘菌素B、二氯羟喹、苯氟雷司盐酸和苯基偶氮吡啶二胺盐酸)和氟苯氧丙胺中的至少一个。所述有效载荷可以包括诊断剂。所述诊断剂可以包括可检测的标记或者标记物，诸如次甲基蓝、专利蓝和靛氰绿中的至少一种。所述有效载荷可以包括荧光分子。所述载荷物可以包括可检测的纳米颗粒。所述纳米颗粒可以包括量子点。
所述有效载荷(“外源性货物”)包括醇类。术语“醇类”指的是一种包括附着于至少一个碳原子的羟基(-OH)功能性基团的多原子有机化合物。所述醇类可以是一元醇并且可以包括至少一个碳原子，例如，甲醇。所述醇可以包括至少两个碳原子(例如乙醇)。在其他方面，所述醇类包括至少三个碳原子(例如异丙醇)。所述醇类可以包括至少四个碳原子(例如，丁醇)，或者至少七个碳原子(例如，苯甲醇)。示例性的有效载荷可以仅仅包括50％(v/v)的醇类，更优选的，所述有效载荷包括2-45％(v/v)的醇类，5-40％的醇类，和10-40％的醇类。所述有效载荷可以包括20-30％(v/v)的醇类。
最优选的，所述有效载荷可以包括25％(v/v)的醇类。作为选择，所述有效载荷可以包括2-8％(v/v)的醇类，或者2％的醇类。所述醇类可以包括乙醇并且所述有效载荷包括5，10，20，25，30，或者40％(v/v)的所述乙醇。示例性的方法可以包括甲醇当作所述醇类，并且所述有效装载可以包括5，10，20，25，30，或者40％(v/v)的所述甲醇。所述有效装载可以包括2-45％(v/v)的甲醇，20-30％(v/v)，或者25％(v/v)的甲醇。优选的，所述有效装载可以包括20-30％(v/v)的甲醇。进一步地中作为选择，所述醇类是丁醇并且所述有效装载可以包括2、4或者8％(v/v)的丁醇。
在本主题内容的一些方面，所述有效载荷是一种等渗溶液或者缓冲液。
根据本发明主题内容，所述有效载荷可以包括至少一种盐。所述盐选自NaC1、KC1、Na2HPO4、C2H3O2NH4和KH2PO4中的一种。例如，KCl浓度范围为2mM至500mM。在一些优选的实施方案中，所述浓度大于100mM，例如106mM。根据本主题内容的示例性方法，有效载荷可包括糖(例如，蔗糖或双糖)。根据示例性方法，有效载荷包含小于121mM的糖、6-91mM或26-39mM的糖。此外，有效载荷包括32mm糖(例如蔗糖)。任选地，所述糖是蔗糖，有效载荷包括6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8或89.6mM蔗糖。
在实施方案中，用于穿过免疫细胞的质膜传递外源性货物的方法还包括传递至少两种外源性货物(或“两种有效载荷”)。所述外源性货物包括核酸、小分子、蛋白质、多肽或其组合。例如，核酸包括信使核糖核酸(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其任何组合。在一些实施方案中，免疫细胞包括两种外源性货物、3种外源性货物、4、5、6、7、8、9或10种外源性货物。
在实施方案中，同时传递至少两个外源性货物意味着两个外源性货物的同时传递(例如，双重传递)。例如，本发明的免疫细胞(包含外源性货物)可***纵以包含第二外源性货物。如本文所用，术语“操纵”可指用于细胞内传递的任何已知转染方法，包括SOLUPORETM传递方法、膜破坏方法(电穿孔、声穿孔、磁检测、光操作)或基于载体的方法(脂质纳米粒)。
在实施方案中，所述至少两种外源性货物被顺序传递。例如，顺序传递可能指传递一件外源性货物，然后传递第二、第三或第四件外源性货物。例如，本发明的免疫细胞(包含外源性货物)随后可进一步***纵以包含第二外源性货物。如本文所用，术语“操纵”可指用于细胞内传递的任何已知转染方法，包括SOLUPORETM传递方法、膜破坏方法(电穿孔、声穿孔、磁检测、光操作)或基于载体的方法(脂质纳米粒)。例如，电穿孔包括一种细胞内传递方法，其中向细胞施加电场以增加细胞膜通透性(也称为电转移)。
在其他方面，本文提供了一种通过非粘附细胞的细胞质膜传递外源性货物的方法，该方法包括以下步骤：提供非粘附细胞群，并使用至少两种细胞内传递方法，所述方法选自：(i)将细胞群与一定体积的等渗水溶液相接触，所述水溶液包括外源性货物和浓度大于0.5％(v/v)的醇，(ii)病毒转导，(iii)，电穿孔或(iv)核感染，从而将两种外源性货物传递至免疫细胞。例如，水溶液包含醇，并且所述醇包含乙醇。水溶液中的醇浓度大于0.2％(v/v)，或大于0.5％(v/v)，或大于2％(v/v)，或大于5％(v/v)，或大于10％(v/v)，在一些实施例中，水溶液包含20-30％乙醇，例如27％乙醇。
在实施方案中，细胞内传递方法包括将细胞群与一定体积的等渗水溶液相接触，该水溶液包括外源性货物和浓度大于0.5％(v/v)的醇，随后进行病毒转导。在其他实施例中，细胞内传递方法包括病毒转导，随后将细胞群与一定体积的等渗水溶液接触，该水溶液包括外源性货物和浓度大于0.5％(v/v)的醇。
从以下对其优选的实施方案及其权利要求书的描述中，本发明的其他特征和优点将显而易见。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文只描述了合适的方法和材料。本文引用的所有已发布的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。本文引用的通过登录号表示的Genbank和NCBI文件通过引用全部并入本文。本文引用的所有其他已出版参考文献、文件、手稿和科学文献均通过引用并入本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意在限制。
附图简要说明
图1A-1D是条形图，显示了使用SOLUPORETM传递方法有效功能化T细胞。显示了(图1A)PBMC(外周血单核细胞)启动的T细胞和(图1B)CD3+(分化簇3)纯化的T细胞在GFP mRNA传递后24小时的模型货物、GFP(绿色荧光蛋白)表达和细胞活力。图1C是显示TRAC(T细胞受体α常数)RNPs(核糖核蛋白)传递2天后CD3表达和细胞活力的条形图。图1D是显示PD-1(程序性死亡蛋白1)INDEL(碱基***或删除)效率的条形图，通过Sanger测序和TIDE(通过分解跟踪INDEL)分析进行量化，以及在PDCD1(程序性细胞死亡蛋白1)RNPs传递后第4天收获的细胞中的细胞活力。所有研究均使用3名捐赠者的细胞，n＝2。
图2A-2D是显示SOLUPORETM传递方式可以实现双重传递和顺序货物传递并可进行多次修改。图2A是条形图，显示了在双重传递相应的mRNAs(n＝3)后24小时通过流式细胞术检测CD19(分化簇19)CAR(嵌合抗原受体)和GFP的共表达以及细胞活力。图2B是一系列具有代表性的流式细胞术图，显示了来自一个供体的数据，显示了仅表达CAR、仅表达GFP以及同时表达CAR和GFP的细胞群。图2C是一系列条形图，显示了在第0天连续传递TRAC RNP和第2天连续传递CD19 CAR mRNA后，流式细胞仪检测CD19 CAR、CD3敲除的表达和第3天的细胞活力，n＝3。图2D是代表性的流程图，显示了来自一个供体的数据，显示了在细胞群中仅表达CD3、仅表达CAR以及共表达CD3和CAR。
图3A-3C是对数据的描述，结果表明，与SOLUPORETM传递方法相比，通过细胞内传递方法完成的细胞因子释放和免疫基因表达的扰动最小。图3A是一系列线形图，显示了与通过Luminex多重试验测量GFP mRNA的传递方法以及电穿孔传递方法相比，SOLUPORETM传递方法完成之后活化T细胞释放的细胞因子，共包括5个供体，每个供体进行2个技术重复。图3B是一系列火山图，其中每个点代表一个基因，其在图中的位置代表与参照细胞相比其上调或下调的程度。火山图显示，来自3个供体的未激活T细胞研究(研究1)的结果是模拟转染，在处理后6小时或24小时收集RNA，并使用Nanostring CAR-T表征面板将基因表达与未处理的参照细胞进行比较。与未经处理的参照细胞相比，火山图显示了转染后6小时和24小时单个基因的倍数变化和p值。图3C是一个过滤后的热图，表明基因表达改变了1个log2倍数以上(>2倍)，具有统计学显著性p<0.05，仅显示了至少一组中发生改变的基因。绿色、红色和黑色(如阴影和箭头所示)分别代表下调、上调和不变。另见表7、8和9。
图4A和4B是显示不同细胞内传递方法对T细胞增殖率和体内植入有不同影响的图表。图4A是一个线形图，显示了使用SOLUPORETM传递方法或电穿孔法进行GFP mRNA传递之后的T细胞增殖，N＝5名供体，每个供体有N＝5次技术重复。图4B是显示注射后28天NOD scidIL-2Rγnull(非肥胖糖尿病(NOD)严重联合免疫缺陷(scid)小鼠脾脏中人类CD45+(分化簇)细胞植入的图表。
图5A是通过阻抗分析从3个不同供体测得的传递后24小时和体外杀死RAJI肿瘤细胞时T细胞中CAR表达的曲线图。图5B是用于评估CD19 CAR T在已建立模型中杀死RAJI细胞的能力的示意性方案的示意图。将表达2.5x 105荧光素酶的RAJI细胞注射到NOD scid IL-2Rγ缺失小鼠体内，然后在3天后注射入经SOLUPORETM或电穿孔处理的1x 106、2x 106或4x106细胞中，每组n＝10只小鼠。在动物被安乐死的第15天测量生物发光。图5C是描绘第15天生物发光成像的照片图像。图5D是一系列点图，显示在第15天通过流式细胞术分析人类CD3表达在小鼠血液中检测到人类T细胞。图5E是一个条形图，显示在第15天，通过流式细胞术分析人类CD20(分化簇20)的表达，在小鼠血液中检测到RAJI肿瘤细胞。图5A-5E证明CD19CAR-T细胞在体外和体内均显示出有效的细胞毒性。CAR-T细胞由SOLUPORETM产生CD19 CARmRNA的传递方法或电穿孔介导的传递。
图6A-6I是线型图，显示了通过Luminex多重试验测量GFP mRNA的SOLUPORETM传递方法或者电穿孔传递方法之后活化T细胞释放的细胞因子，使用5个供体，每个供体包括2个技术重复。图6A是显示干扰素-γ释放的图表。图6B是显示IL-10(白细胞介素10)释放的图表。图6C是显示TNF-α(肿瘤坏死因子-α)释放的图表。图6D是显示GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)释放的图表。图6E是显示MIP-1a(巨噬细胞炎性蛋白1a)释放的图表。图6F是显示MIP-1b(巨噬细胞炎性蛋白1b)释放的图表。图6G是显示ITAC(干扰素诱导T细胞α趋化剂)释放的图表。图6H是显示不规则趋化因子释放的图表。图6I是显示Il-17A(白细胞介素17A)释放的曲线图。总之，图6A-6I中的细胞因子释放数据表明SOLUPORETM传递方法对T细胞造成的压力最小，证据是与未经处理的参照细胞相比，其细胞因子释放没有差异。相反，电穿孔过程导致T细胞释放IL-2和IL-8。
图7是未过滤热图的图像，表明基因表达变化超过1个log2倍数(>2倍)，统计显著性为p<0.05，包括所有分析的基因。绿色、红色和黑色(如阴影和箭头所示)分别代表下调、上调和不变。
图8是显示免疫相关基因曲线研究的通路分析的图像。蓝色是基因的下调，红色是基因转染6小时后的上调。米色或浅蓝色/红色表示基因表达更类似于UT，米色代表没有变化。颜色越接近颜色键的远边缘，基因表达的倍数变化越高，深蓝为-15，深红为15z激活分数。基因名称显示在y轴上，x轴从左到右依次显示“治疗模拟N(F115)vs.UT”和“治疗模拟vs.UT”。
图9A-9C是条形图，显示了为每个供体(图9A-供体1；图9B-供体2和图9C-供体3)计算的体外RAJI细胞杀伤试验的曲线下面积(AEC)的结果。
图10是显示AP-1(激动蛋白1)信号通路的示意图。
图11是研究1和研究2中AP-1相关基因的列表(参见实施例4)。研究1和2中的细胞都是未受刺激的细胞。研究2是一个重复，仅包括24小时分析和EO-115电穿孔法。
图12是描述log2倍数变化与线性变化的图示。在表中显示出基因表达差异的比较或计算，如表中所示，显示为log2倍数变化或线性倍数变化。基因或蛋白质表达的增加或减少可以表示为倍数差异或对数差异。术语“logbase 2”或log2用于沿着一个轴将结果均一化，该轴上的上调基因和下调基因的值相等。示例性计算如下所示：
处理后的基因A vs参照＝7.0(过表达)；
处理后的基因B vs参照＝7.0或者处理后的vs参照＝0.142(低表达)。
两者都以相同的强度过度表达或表达不足，然而，线性标度不能反映这种变化。或者，基因A上调7.0倍，基因2下调0.142倍。当以log2的形式表达时，基因A上调2.81倍，基因B下调-2.81倍。
图13描绘了在溶质穿孔或核感染后对活化T细胞进行的表面程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)染色的图像。
图14是在溶质穿孔或核感染后对活化T细胞进行表面簇分化69(CD69)染色的图像。
图15描绘了一个条形图，显示了用或没有用mRNA GFP进行溶质穿孔或核感染(电穿孔方案EO115)方法活化的人类T细胞，并在转染后6小时收集上清液。进行了铬乳酸盐测定。使用Microsoft Excel从标准曲线推断L-乳酸浓度，数据显示为相对于对照组的倍数变化。5名供体，n＝2。
图16A和16B描绘了一系列利用海马痕迹进行计算的插图。根据耗氧率(OCR)曲线(图16A)计算备用呼吸能力(SRC)、最大呼吸和基础氧化磷酸化率(OxPhos)以及根据细胞外酸化率(ECAR曲线)计算糖酵解储备、糖酵解能力和基础糖酵解率(图16B)。
图17描绘了一系列显示活化的人类T细胞的线形图，这些T细胞要么被mRNA GFP进行溶质穿孔或者核感染(EO115)，要么在没有货物的情况下进行溶质穿孔或者核感染(模拟)。如上所述，收集细胞并进行海马试验。显示OCR和ECAR痕量(n＝1)。
图18描绘了一系列条形图，显示了溶质穿孔的或受核感染T细胞的糖酵解、氧磷、糖酵解能力和最大呼吸。这些数据描述了转染后约18小时细胞的代谢活动。
图19A描绘了通过流式细胞术分析转染后24小时CAR阳性细胞上GFP表达的图像。图19B是一个条形图，显示转染24小时后使用NC-3000评估的活性。n＝1/3的捐赠者。UT＝未经治疗的对照组。PBMC启动的T细胞在激活后第3天(LV-CAR)用CD19 CAR慢病毒载体转导。在病毒传递24小时后收集细胞，随后使用SOLUPORETM技术转染GFP mRNA。
具体实施方案
本文提供的是细胞工程技术，该细胞功程技术使需要复杂修饰和高水平细胞功能的下一代细胞治疗产品成为可能。非病毒工程技术解决了与病毒载体相关的限制。电穿孔是应用最广泛的非病毒方式，但其对细胞功能的影响的担忧导致了对替代方法的探索。如本文所述，SOLUPORETM传递方法是一种简单、快速、高效地将货物传递到初级免疫细胞，同时保持细胞活力和功能的非病毒方法。
病毒传递方法的挑战
安全、灵活和高效地在细胞内传递外源性物质是许多细胞工程应用的关键要求，所述细胞工程应用的例子包括血液***恶性肿瘤和疾病的治疗，其中免疫细胞在体外被修饰以替换、纠正或***靶基因。虽然病毒转导最常用于基因操作，但其具有众所周知的局限性。
从开始生产到批量释放用于细胞治疗的良好生产规范(GMP)载体(包括获取质粒DNA进行转染)的时间线可能很长，成本也很高。围绕载体生产的可扩展性和相关成本的挑战促使人们对非病毒替代品的开发产生兴趣。病毒传递***也易受载体介导的遗传毒性影响，如随机***破坏正常基因、意外癌基因激活或***突变，导致不良免疫原性和严重副作用。除了生物安全问题外，病毒载体货物包装能力的限制也推动了细胞内传递方法的发展，该方法可用于传递更广泛的生物活性结构。在任何一种细胞内传递方法中，更广泛的复用潜力与灵活性相结合，以适应加速的生产时间线以及细胞类型和大小之间的变化，同时避免与病毒载体相关的副作用，是具有吸引力的属性，使其更安全、更经济。
CAR T细胞疗法
自体CAR T细胞疗法在重新移植或难治性癌症患者的队列中显示出前所未有的疗效和持久的反应，这些患者患有选定的液体肿瘤，迄今已有两种CAR T产品获得批准。这些细胞产品产生的概念正在推动体外细胞治疗领域的研究、开发和商业活动。尽管复杂的制造过程和物流过程创造了药物制造的新范式，但这些“活”药物还是取得了成功。早期突破性产品的工程化是通过病毒载体实现的，虽然这种传递方式仍然很重要，但可用性、复杂性、成本、安全性和效率等问题意味着下一代疗法需要先进的基因转移技术。本发明提供了含有外源性货物分子的工程细胞群，以解决先前将核酸和其他分子引入细胞的方法的缺点和挑战。如果工程细胞治疗成功的承诺能够在替代性早期液体肿瘤患者和实体肿瘤患者中实现，那么关键的重点领域必须包括液体肿瘤细胞治疗的优化，加快创新周期，使实体瘤和制造工艺转型获得成功。这里描述的无病毒方案在所有这些方面都发挥着关键作用，最终改善了患者的体验。本文所述的方法不依赖于病毒或将细胞置于电流中来介导外源性分子进入细胞的传递。本文所述的方法不依赖脂质纳米粒子来介导外源性分子进入细胞的传递。
非病毒传递
与传统的病毒转导不同，非病毒替代品可以将更广泛的构建物传递到更多样化的细胞类型中，同时规避细胞治疗中载体生产的密集生物安全和监管要求。
细胞内传递可以通过一系列技术来实现，大致分为两大类：膜破坏法和载体法。
细胞内传递方法大致可分为两大类，即物理/机械方法，如电穿孔、声穿孔、磁检测、光手术、基因枪、微量注射、细胞收缩/挤压，以及非病毒载体，如脂质纳米粒子。虽然电穿孔平台能够有效运送货物，但也存在一些挑战，如增殖能力丧失、效力降低、细胞内钙水平持续升高。
阳离子聚合物和脂质等化学载体可以在不引起显著免疫反应的情况下将遗传物质输送到细胞中，然而，迄今为止，它们的效率无法与病毒载体相比。
膜破坏模式，即SOLUPORETM传递方法，有可能提高处理吞吐量、缩短制造时间、最小化处理步骤，但同时也能生产出功能强大的细胞。
一些物理转染方法可能会影响细胞健康，从而对其增殖能力产生有害影响，并伴随着基因表达曲线的变化。
良好的体外增殖和效应子功能与体内抗肿瘤功能的改善相关，因此，SOLUPORETM细胞内传递方法允许将多种货物转染到多种细胞类型，同时最小程度地干扰正常细胞功能。
为了解决与干扰正常细胞功能相关的后果，开发了SOLUPORETM传递方法。SOLUPORETM传递方法是一种非病毒、非电气(不利用向细胞施加电流的方式)技术，允许细胞膜瞬时渗透，以实现快速向细胞内传递具有不同成分、性质和大小的货物，如大分子和核酸。正如所证明的那样，SOLUPORETM传递方法成功地促进了基因编辑工具(如CRISPR/Cas9和mRNA)向原代人类免疫细胞(包括人类T细胞)的传递，而不会对细胞功能产生负面影响。
此外，SOLUPORETM传递平台是一项先进技术，旨在满足细胞治疗领域的开发和制造需求。这项技术是非病毒性的，这意味着与病毒载体相关的许多问题，如可用性、安全性、过程复杂性和相关成本，则不再令人担忧。基因工程工具的不断进步也意味着基因组靶向现在可以通过非病毒方法实现。
如本文所述，SOLUPORETM传递方法的传递效率通过广泛的货物类型以及其在处理使用不同方案培养的T细胞群方面的灵活性进行了评估。虽然其他非病毒仪器(例如，电穿孔仪)通常需要细胞特异性程序和缓冲液，但同样的SOLUPORETM传递方法程序和缓冲液可用于多种细胞类型，其中细胞密度是变化的主要参数。下面提供了细胞接种密度表(使用平均细胞大小计算预测范围)。在实现可预测流程的结果中可以看到高度的一致性。
表18:细胞接种密度
Figure BDA0003574995470000291
Figure BDA0003574995470000301
该平台在不损害细胞活力的情况下支持双重和顺序基因编辑的能力是一个重要特征。如果要提高液体和固体肿瘤自体细胞疗法的靶向性和疗效，细胞将需要使用与制造工艺一致的步骤进行多次修饰。这可能涉及多路复用或顺序工程步骤。类似的要求也适用于异源基因方法，其中细胞排斥和GvHD问题意味着可能需要复杂的编辑。病毒载体容量和电穿孔毒性的限制意味着这些模式可能不适用于某些复杂的工程机制。此外，即使是研究级病毒载体的设计和生产也需要很长的准备时间，这意味着开发阶段的时间可能比预期的要长。这一点在实体瘤治疗方法的进展中尤其值得关注，因为在实体瘤治疗中，靶向性和有效性的挑战意味着需要测试大量候选靶抗原同时增强细胞潜能。有必要以快速、高通量的方式评估大量细胞成分，如果完全依赖于病毒载体，可能会受到高度限制。因此，SOLUPORETM传递方法解决了这些问题，并与液体肿瘤CAR T的优化和固体肿瘤治疗有效进展所需创新周期的加速相兼容。
使用SOLUPORETM传递方法处理的细胞保留关键的免疫功能，并将耗尽降至最低
如果细胞工程化要发挥作用，就必须保持细胞功能。因此，在该领域有兴趣开发替代的非病毒递送方法，该方法既高效又对细胞温和。本文报告的研究表明，SOLUPORETM传递方法对T细胞中的蛋白质和基因表达的影响最小，重要的是，生物属性(如增殖和基因表达曲线)得以保留。此外，使用SOLUPORETM传递方法，CAR T细胞在体外和体内杀死细胞，从而证明了这些细胞的功能。
虽然电穿孔是最广泛使用的非病毒货物传递方法，但之前已经对T细胞通过该方法进行工程化，结果发现工程化后的T细胞中蛋白质和基因表达的非特异性变化以及抗肿瘤效果的降低。SOLUPORETM传递方式只改变了少量免疫相关基因的表达。在使用SOLUPORETM传递方法(传递后6小时)的6小时组中确定的10个基因中，8个与电穿孔6小时组相同，表明这些基因可能与破坏细胞膜或两种给药方法共同的其他方面有关。
电穿孔显著影响T细胞中的基因表达，这一发现与在缺乏外源刺激的情况下电穿孔T细胞中细胞内钙水平增加和转录活性增加的研究一致(见Zhang M,et a.J ImmunolMethods 2014；408:123-131，全文通过引用并入本文)。内质网释放的钙导致转录因子NFAT(活化T细胞的核因子)的激活，NFAT是耗竭的中枢调节因子之一。
在电穿孔细胞中，参与AP-1(激动蛋白1)信号传导的基因表达增加，这一观察结果表明，转录因子如AP-1和NFAT可能在细胞对电穿孔的应激反应中发挥作用。本文描述的结果支持了这一研究，表明电穿孔诱导的这些关键通路的扰动有助于细胞耗竭，从而使得这些细胞不适合哺乳动物细胞治疗。相比之下，SOLUPORETM传递方法对这些通路的干扰最小，处理后的细胞曲线与参照细胞的曲线保持接近。
电穿孔，包括核感染，会减少细胞增殖作用，这被认为是由激活DNA损伤反应途径引起的。这是基因编辑方法的一个问题，目前尚不清楚电穿孔的这些效应最终如何影响细胞治疗产品的效力。虽然电穿孔的CAR T细胞在12天的RAJI肿瘤小鼠模型中的表现与使用SOLUPORETM传递方法的细胞相似，但电穿孔细胞未能如30天的体内植入模型中预期的那样植入，表明细胞的适应性受到负面影响。
人们也越来越对工程化未激活T细胞从而减少细胞耗竭的可能性感兴趣。根据本发明，未激活的细胞被工程化并随后扩增。这种方法的另一个优点是所需的货物量大大减少。本文和其他人的研究结果表明，电穿孔在转录水平上诱导未激活T细胞的扰动(表明细胞耗竭)，从而使核感染/电穿孔成为不太理想的应用方法。相比之下，SOLUPORETM这种传递方法有可能实现这些细胞的工程化。
AP-1信号传导和T细胞耗竭
激动蛋白1(AP-1)是一种转录因子，调节基因表达以响应多种刺激(包括细胞因子、生长因子、应激、细菌和病毒感染)。AP-1控制许多细胞过程，包括分化、增殖和凋亡。
激动蛋白-1(AP-1)是一组转录因子，由四个亚家族组成：
1)Jun(“v-Jun禽肉瘤病毒17癌基因同源物，Jun癌基因”或“c-Jun”)、c-Jun(转录因子AP1)、JunB(转录因子Jun-B)、JunD(转录因子Jun-D亚型deltaJunD))，
2)Fos(c-Fos(原癌基因)-FosB(也称为FosB和G0/G1开关调节蛋白3(G0S3))，Fra1(Fos相关抗原1(Fra1))，Fra2(Fos相关抗原2(Fra2))，
3)Maf(肌肉腱膜纤维肉瘤)-(c-Maf(也称为原癌基因c-Maf或V-Maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物)，MafB(也称为V-Maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B)，MafA(转录因子MafA)，Mafg/f/k(bZip Maf转录因子蛋白)，Nrl(神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白)，以及
4)ATF激活转录因子(ATF2(激活转录因子2)、LRF1/ATF3(环腺苷酸依赖性转录因子ATF-3)、BATF(碱性亮氨酸拉链转录因子，ATF样)、JDP1(DnaJ(Hsp40)同源物，C亚家族)、JDP2(Jun二聚蛋白2))。
这些AP-1转录因子调节广泛的细胞过程，从细胞增殖和存活到肿瘤转化、分化和凋亡。AP-1转录因子是同源或异源二聚体形成蛋白。AP-1蛋白家族的成员在反式激活AP-1反应基因的潜力和形成二聚体的能力上存在显著差异。例如，Fos亚家族不能同源二聚，但它们可以与Jun成员形成稳定的异二聚体。Fos和Jun蛋白具有较高的反式激活潜能，而JunB、JunD、Fra-1和Fra-2等其他蛋白则较弱。早期使用小鼠成纤维细胞进行研究证实了一些AP-1成员对其他成员的拮抗性。例如，cJun转录活性被JunB减弱，这是由于它们的激活域不同。然而，目前的观点表明，AP-1组分的差异表达及其相互作用的细胞内容决定了AP-1转录因子的复杂功能。
在T细胞中，AP-1转录因子具有多效性，并在免疫***的不同方面发挥中心作用，如T细胞激活、Th分化、T细胞无能和衰竭。MAPK(MAP激酶)信号级联对调节AP-1转录激活和多种AP-1靶基因的DNA结合活性非常重要。
T细胞无能是T细胞的一种无反应状态，在这种状态下，T细胞在没有阳性共刺激信号的情况下被激活，而T细胞衰竭是指CD8+T细胞的状态，由于慢性病毒感染或癌症期间抗原暴露时间过长，其反应较差。无能T细胞的一些特征是增殖受到抑制，并且它们无法响应TCR(T细胞受体)的参与合成IL-2。
T细胞耗竭的特点在于抑制性受体的高表达以及广泛的转录和表观遗传学改变，但导致耗竭T细胞功能受损的机制尚不清楚。阻断PD-1(程序性死亡蛋白1)可以使一些耗竭的T细胞恢复活力，但不能使其完全恢复功能，并且PD-1阻断与CAR T细胞联合使用进行试验，并未显示出任何功效。通过补剂信号CAR表达使健康的T细胞耗竭，在此模型中，耗竭的人类T细胞表现出AP-1转录因子结合基序的广泛表观基因失调，并且，参与衰竭相关基因调控的bZIP和IRF转录因子的表达增加。参见Lynn RC et al.Nature.2019；576(7786):293-300；该文献通过引用全部并入本文。
与未经处理的细胞相比，核感染后未激活的T细胞中AP-1信号传导通路的几个成员的基因表达发生了改变，对体内T细胞活性的影响尚不清楚。相比之下，使用SOLUPORETM处理的细胞显示的基因表达曲线与未处理细胞的基因表达谱非常接近，表明这些细胞受到的干扰最小，并且可能在体内保持更正常的活性。
这里提供了AP-1(SEQ ID NO:27)的人氨基酸序列，并且可以从GenBank中获得，以P05412.2的编目号对公众开放，通过引证在此并入本文。
Figure BDA0003574995470000341
AP-1的典型标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基255-310(螺旋区)、残基255-306(螺旋区)、残基8、58、63、89和93(磷酸化作用)。AP-1蛋白质的片段长度小于全长蛋白质的长度，例如，片段长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基，但对于上述AP-1来讲，片段长度小于例如331个残基。
下面提供了人AP-1核酸序列(下划线部分表示起始密码子和终止密码子)，并且可以从GenBank中获得，以NM_005354.6的编目号对公众开放，通过引证在此并入本文(SEQ IDNO:28)。
Figure BDA0003574995470000351
AP-1的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基139-1182(编码区)。
AP-1信号传导通路如图10所示。参与AP-1信号传导通路的相关基因包括FOS、Jun、FOSB(FOS原癌基因)、BATF(碱性亮氨酸拉链转录因子ATF-样)、BATF3(碱性亮氨酸拉链转录因子ATF-样3)、IRF4(干扰素调节因子4)、NFATc1(活化T细胞的核因子，细胞质1)，MAP2K2(双特异性丝裂原活化蛋白激酶2)、MAPK3(丝裂原活化蛋白激酶3)、MAP2K7(双特异性丝裂原活化蛋白激酶7)、PLCG1(磷脂酶C，γ1)、NFKB2(核因子NF-κB p100亚单位)、NFKB1A(核因子NF-κB p105亚单位)。
本文提供了Fosb(FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B)(SEQ ID NO:3)的人类氨基酸序列，并可通过GenBank登录号NP_001107643.1公开获取，通过引用并入本文。
Figure BDA0003574995470000361
Fosb的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基1-302(编码区)、残基255-306(螺旋区)、残基8、58、63、89和93(磷酸化)。FosB蛋白质的片段长度小于全长蛋白质的长度，例如，片段长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基，但在上述FosB的情况下，片段长度小于例如302个残基。
人类Fosb核酸序列(起始密码子和终止密码子加下划线)如下所示，可从GenBank登录号NM_006732.1处获得，通过引用并入本文(SEQ ID No:29)。
Figure BDA0003574995470000371
Figure BDA0003574995470000381
Fosb的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基594-1610(编码区)、残基3754-3759(调控位点)或残基3775(聚A位点)。
本文提供了BATF(碱性亮氨酸拉链转录因子，ATF-样，SEQ ID NO:4)的人类氨基酸序列，可通过GenBank登录号CH471061.1公开获取，通过引用并入本文。
Figure BDA0003574995470000382
BATF的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基1-125(编码区)。BATF蛋白质的片段长度小于全长蛋白质的长度，例如，片段长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100或更多个残基，但在上述BATF的情况下，片段长度小于例如125个残基。
人类BATF核酸序列(起始密码子和终止密码子加下划线)如下所示，可从GenBank登录号NM_006399.3处获得，通过引用并入本文(SEQ ID No:30)。
Figure BDA0003574995470000391
BATF的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基243-620(编码区)、残基306-410(外显子)、残基411-941(外显子)；残基922-927(polyA序列)；残基941(polyA位点)。
本文提供了BATF3(碱性亮氨酸拉链转录因子，ATF样3)(SEQ ID NO:5)的人类氨基酸序列，并可通过GenBank登录号NP_061134.1公开获取，通过引用并入本文。
Figure BDA0003574995470000392
BATF3的典型标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基1-127(编码区)、残基2或31(磷酸化位点)、残基37-62(基本基序)或残基63-91(亮氨酸拉链)。BATF3蛋白质的片段长度小于全长蛋白质的长度，例如，片段长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100或更多个残基，但在上述BATF3的情况下，片段长度小于例如127个残基。
人类BATF3核酸序列(起始密码子和终止密码子加下划线)如下所示，可从GenBank登录号NM_018664.2处获得，通过引用并入本文(SEQ ID No:31)。
Figure BDA0003574995470000401
BATF3的典型标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基224-607(编码区)、314-418(外显子)、419-981(外显子)、908-913(多聚A信号序列)或残基926或981(多聚A位点)。
FOS(“c-FOS”或“v-FOS FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物，FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌 基因同源物”)
c-Fos是一种原癌基因，是逆转录病毒癌基因v-Fos的人类同源物。cFos是一个更大的Fos转录因子家族的一部分，所述Fos转录因子家族包括c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2。c-Fos编码一个62kDa的蛋白质，它与c-jun(jun转录因子家族的一部分)形成异二聚体，导致AP-1(激活蛋白-1)复合物的形成，该复合物在目标基因的启动子和增强子区域的AP-1特异性位点结合DNA，并将细胞外信号转化为基因表达的变化。它在许多细胞功能中起着重要作用，并被发现在多种癌症中过度表达。
本文提供了FOS的人类氨基酸序列(SEQ ID NO:32)，可在GenBank登录号AY212879.1处公开获取，通过引用并入本文。
Figure BDA0003574995470000411
FOS的典型标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基147-199(卷曲区)。FOS蛋白质的片段长度小于全长蛋白质的长度，例如，片段长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基，但在上述FOS情况下，片段长度小于例如380个残基。
人类FOS核酸序列(起始密码子和终止密码子加下划线)如下所示，可从GenBank登录号NM_005252.2处获得，通过引用并入本文(SEQ ID No:1)。
Figure BDA0003574995470000412
Figure BDA0003574995470000421
FOS的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基156-1298(编码区)、1803-1808(polyA区)和2079-2084(polyA区)。
Jun(“v-Jun禽肉瘤病毒17癌基因同源物，Jun癌基因”或“c-Jun”)
c-Jun是一种由Jun基因编码的蛋白质。c-Jun与c-Fos结合形成AP-1早期反应转录因子。c-jun是第一个发现的致癌转录因子。原癌基因c-Jun是病毒癌蛋白v-Jun(P05411)的细胞同源物。人类Jun编码一种与病毒蛋白高度相似的蛋白质，该蛋白质直接与特定的靶DNA序列相互作用以调节基因表达。
Jun及其在AP-1形成中的二聚体形式都受到多种细胞外刺激因子的调节，所述刺激因子包括肽生长因子、促炎细胞因子、氧化和其他形式的细胞应激以及紫外线照射。例如，紫外线照射是提高c-jun表达的有效诱导剂。c-jun转录由其自身产物jun自动调节。jun(AP-1)与jun启动子区域中高亲和力AP-1结合位点的结合诱导jun转录。这种通过刺激自身转录的积极自动调节可能是延长细胞外刺激信号的机制。这一机制对c-jun在癌症中的活性具有生物学意义。
丝氨酸63和73以及苏氨酸91和93处的Jun磷酸化作用能够增加c-Jun靶基因的转录。因此，可以通过jun N-末端激酶(JNK)的N-末端磷酸化来调节c-jun活性。研究表明，Jun在压力诱导的细胞凋亡和增殖中的活性(AP-1活性)受其N端磷酸化情况的调节。
本文提供了Jun的人类氨基酸序列(SEQ ID NO:33)，可在GenBank登录号AAV38564.1处公开获取，通过引用并入本文。
Figure BDA0003574995470000431
Jun的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基255-306(卷曲线圈区域)。Jun蛋白质的片段长度小于全长蛋白质的长度，例如，片段长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200或更多个残基，但在上述Jun的情况下，片段长度小于例如331个残基。
人类Jun核酸序列(起始密码子和终止密码子加下划线)如下所示，可从GenBank登录号NM_002228.3处获得，通过引用并入本文(SEQ ID NO：2)。
Figure BDA0003574995470000441
Jun的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基1044-2039(编码区)、3302-3307(调控区)、2624(polyA区)。
T细胞耗竭
T细胞“耗竭”是指在慢性病毒感染或癌症期间，由于抗原暴露时间延长，T细胞反应不佳的状态。“T细胞耗竭”的特征是T细胞功能丧失，这可能是感染或疾病的结果。耗竭的T细胞显示出不同于功能效应子或记忆T细胞的转录程序，其特征是能够表达抑制性细胞表面受体，所述抑制性细胞表面受体包括PD-1(程序性死亡蛋白1)、LAG-3(淋巴细胞激活基因3)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3)，TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)和CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，以及IL-2(白细胞介素2)、TNF(肿瘤坏死因子)和IFN-γ(干扰素-γ)细胞因子产生。NFAT(活化T细胞的核因子)和AP-1转录因子协同发挥核心作用，诱导低反应状态(例如，无能和耗竭)。耗竭的细胞表现出AP-1因子(FOS、FOSB和Jun)的低表达。例如，见Wherry,J.和Kurachi,M.“Molecular and cellular insightsinto T cell exhaustion”Nat Rev Immunol.2015August；15(8):486-499，该文献通过引用全部并入本文。
SOLUPORETM传递方法对T细胞功能性的作用
本文所述数据提供了对SOLUPORETM过程T细胞功能性的理解。具体而言，比较核转染细胞和电穿孔转染的细胞的T细胞的功能性。在实施例中，比较和评估了溶质穿孔、核转染和电穿孔(两者都利用向细胞施加电流)，包括无货物(例如模拟)或模型货物(例如mRNAGFP)。使用上述转染方法，进行了许多功能性分析，包括1)表型分析、2)细胞因子释放、3)约700多个免疫相关基因的基因表达曲线分析，以及4)代谢率分析。
随着免疫细胞转染完成的细胞因子释放
将病毒传递至工程细胞的***易受载体介导的遗传毒性影响，导致不良的免疫原性和严重的副作用。电穿孔是一种常用的工具，用于将外源性物质输送到细胞中用于治疗目的，但电穿孔会诱导破坏性后果，所述破坏性后果包括细胞因子的非特异性释放。使用本文所述的SOLUPORETM传递方法，在SOLUPORETM传递方法处理的细胞与未经处理的参照细胞相比，未发现显著差异。相比之下，在电穿孔免疫细胞(例如，T细胞)就会观察到显著差异。
例如，使用本文所述方法未受干扰的细胞因子包括IL-2(白细胞介素2)、IFN-γ(干扰素γ)、TNFα(肿瘤坏死因子α)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、IL-8(白细胞介素8)、IL-10(白细胞介素10)、MIP-1α(巨噬细胞炎性蛋白1α)，MIP-1β(巨噬细胞炎性蛋白1β)、不规则趋化因子、ITAC(干扰素诱导T细胞α趋化剂)和IL-17A(白细胞介素17A)。相比之下，电穿孔细胞在IL-2和IL-8方面表现出显著差异。
本文提供了IL-2(SEQ ID NO:34)的人类氨基酸序列，可在GenBank登录号NP_000577.2处公开获取，通过引用并入本文。
Figure BDA0003574995470000461
IL-2的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于小于全长蛋白质长度的片段，例如，片段长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100或更多残基，但在上述IL-2的情况下小于例如153个残基。
人类IL-2核酸序列(起始密码子和终止密码子加下划线)如下所示，可从GenBank登录号NM_000586.2处获得，通过引用并入本文(SEQ ID NO：17)。
Figure BDA0003574995470000471
IL-2的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基295-756(编码区)、295-354(信号肽)、355-753(成熟肽)。
本文提供了IL-8(SEQ ID NO:35)的人类氨基酸序列，可在GenBank登录号NP_001341769.1处公开获取，通过引用并入本文。
Figure BDA0003574995470000472
IL-8的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于小于全长蛋白质长度的片段，例如，片段长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多残基，但在上述IL-8的情况下小于例如95个残基。IL-8的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基1-95(蛋白前体)；残基1-20(信号肽)。
人类IL-8核酸序列(起始密码子和终止密码子加下划线)如下所示，可从GenBank登录号NM_001354840.3处获得，通过引用并入本文(SEQ ID NO：18)。
Figure BDA0003574995470000481
IL-8的示例性标志性残基、结构域和片段包括但不限于残基91-378(编码区)或91-150(信号肽)。
CAR plus传递
CAR plus指的是一种细胞群，该细胞群经历1)病毒转导后，随后采用额外的细胞内传递方法(例如SOLUPORETM传递方法、电穿孔或核转染，或其任何组合)，或2)SOLUPORETM传递方法用于传递外源性货物，然后对细胞进行额外的细胞内传递方法(例如，病毒转导、SOLUPORETM传递方法、电穿孔或核转染，或其任何组合)。当细胞首先被病毒转导，然后使用SOLUPORETM传递方法进行细胞内传递时，病毒成分可能仍然存在。
SOLUPORETM传递方法与经过其他货物传递操作方法的细胞一起使用。例如，SOLUPORETM传递方法用于将外源性货物(例如mRNA)传递至已经被病毒转导的细胞(图19A和图19B)。或者，首先使用SOLUPORETM传递方法递送外源性货物，例如mRNA，然后对细胞进行其他的传递操作，例如病毒转导。
示例性的其他细胞内传递方法包括SOLUPORETM传递方法、病毒转导、电穿孔、核转染或其任何组合。可用于细胞内传递的示例性病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)或单纯疱疹病毒(HSV)。在优选实施例中，该病毒为慢病毒。
用于基因传递应用的病毒总结
Figure BDA0003574995470000491
Pharmaceutics 2020,12,183,通过引证在此全部并入本文。
基因编辑和***-删除分析
基因编辑是一种基因工程，在细胞基因组的特定位置***、删除、修改或替换DNA。这种编辑的常用方法是使用工程核酸酶，在基因组中的所需位置产生位点特异性双链断裂(DSB)。通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)可修复上述被诱导的双链断裂，导致靶向突变(“编辑”)。NHEJ可以通过在DSB位点引入***、删除、易位或其他DNA重排技术导致基因破坏。或者，可以通过提供供体DNA模板来进行精确的DNA编辑，所述供体DNA模板编码所需的DNA变化，旁边是与DSB上游和下游区域同源的序列。然后，细胞同源性定向修复(HDR)导致外源DNA模板的序列在DSB位点并入。
电穿孔可导致细胞损伤和应力，进而导致细胞增殖率降低。电穿孔效应可能会降低基因编辑所需的DNA修复途径的效率，从而降低基因编辑的效率。SOLUPORETM传递方法不会损伤细胞或减少细胞增殖，因此比电穿孔更适合实现有效水平的基因编辑。
此外，为了产生适合同种异体应用或靶向实体瘤的效应子细胞，有必要进行复杂的编辑。然而，如果在细胞中同时使用多个核酸酶和DNA模板，就会出现多个DSB，并且无法控制每个模板在基因组中的***位置。因此，为了确保给定的外源DNA模板***所需区域，需要按顺序而不是同时进行多个编辑。然而，由于电穿孔技术苛刻且会造成细胞损伤，因此进行多轮电穿孔非常具有挑战性。相比之下，SOLUPORETM技术对细胞更加温和，可以进行多次顺序转染(见实施例2)。这样可以更好地控制细胞中复杂的编辑机制。
外源性货物
被传递到免疫细胞中的外源性货物(或“有效载荷”)描述的是一种化合物或组合物，其通过水溶液穿过细胞质膜输送到细胞内部。外源性货物可包括核酸(例如，RNA(核糖核酸)、mRNA(信使RNA)或DNA(脱氧核糖核酸))、蛋白质或肽、小化学分子或其任何组合。小的化学分子可以小于1000Da。小分子是一种质量小于2000道尔顿的化合物。小分子的分子质量优选小于1000道尔顿，更优选小于600道尔顿，例如，化合物小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、200道尔顿或100道尔顿。
在优选实施例中，外源性货物包含核酸，例如信使RNA(mRNA)。包含mRNA的外源性货物包括CD19-CAR-2代mRNA(SEQ ID NO:6)、CD19-CAR-3代mRNA(SEQ ID NO:8)、TRAIL-DR5(TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)死亡受体5)变体mRNA(SEQ ID NO:10)、TRAIL(SEQ ID NO:11)、IL-15(白细胞介素15)mRNA、TCR(T细胞受体)mRNA。
在其他实施例中，外源性货物包含Cas9(CRISPR相关蛋白9)蛋白质，例如具有包括TRAC(T细胞受体α常数SEQ ID NO:25)或PD-1(程序性死亡配体1SEQ ID NO:26)的引导RNA。在其他实施例中，外源性货物包含Cas12a蛋白(CRISPR相关蛋白12a)，包括含有TRAC和PD-1的引导RNA。在一些实施例中，外源性货物包含MAD7蛋白质(参见Price MA,et al,RosserSJ.Expanding and understanding the CRISPR toolbox for Bacillus subtilis withMAD7 and dMAD7 Biotechnol Bioeng.2020；117(6):1805-1816，该文献通过引用并入本文)，以及包括TRAC或PD-1的指导RNA。在实施例中，外源性货物包括SgCas(参见2017年5月22日出版的Petris G,et al.Hit and go CAS9 delivered through a lentiviral basedself-limiting circuit.Nat Commun.2017；8:15334.，该文献通过引用并入本文)，以及包括TRAC或PD-1的指导RNA。在实施例中，外源性货物包含Cas13，其具有包括TRAC或PD-1的引导RNA。或者，外源性货物包含碱基编辑，例如Cas9n，或锌指核酸酶，或MegaTALs。
在实施例中，外源性货物包括睡美人100转座子/转座子***，或睡美人1000转座子/转座子***，或小猪Bac转座子/转座子***，或TcBuster转座子/转座子***。
在其他实施例中，外源性货物包括DNA，例如，CD19 CAR DNA,TRAIL DNA或者IL-15DNA。
在实施例中，外源性货物包含用于从成年人类细胞产生稳定诱导多能干细胞的山中因子。例如，山中因子包括c-Myc(Myc原癌基因、bHLH转录因子)、Klf4(Kruppel样因子4)、Oct4(八聚体结合转录因子4)或Sox2(SRY(性别决定区Y)-框2)。
在进一步的实施例中，外源性货物包括例如针对PD-1的siRNA(小干扰RNA)。在进一步的实例中，外源性货物包含shRNA(小发夹RNA)，例如针对PD-1的shRNA。
CD19 CAR mRNA序列如下所示(SEQ ID NO: 6)
Figure BDA0003574995470000521
信号肽(下划线)
Vl-cd19(加粗)
(G4S)3连接体(斜体)
VH-cd19(加粗+加下划线)
cd28-Hinge/TM/cO-刺激域(加粗+斜体)
cd3Z-信号传导域(加粗+斜体+加下划线)
CD19 CAR蛋白序列如下所示(SEQ ID NO:7)
Figure BDA0003574995470000531
阿维塔斯CD19 CAR mRNA序列如下所示(SEQ ID NO:8)
Figure BDA0003574995470000532
阿维塔斯CD19 CAR蛋白序列如下所示(SEQ ID NO:9)
Figure BDA0003574995470000541
全长E195R/D269H TRAIL(DR5)-变体：(846核苷)mRNA如下所示(SEQ ID NO:10)
Figure BDA0003574995470000542
全长E195R/D269H TRAIL(DR5变体)蛋白序列如下所示(SEQ ID NO:36)标记 E195R/D269H成粗体并加下划线。
Figure BDA0003574995470000543
全长TRAIL蛋白序列如下所示(SEQ ID NO:11)
Figure BDA0003574995470000551
RNPs
人TRAC靶向gRNA的序列是AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:25)，而对于人PDCD1靶向gRNA的序列是GTCTGGGCGGTGCTACAACT(SEQ ID NO:26)。
使用以下引物，通过RT-PCR从人ES-聚(A+)RNA扩增人cDNA的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc：对于人Oct4引物为5’-GGA TCC GAA TTC ATG GCG GGA CAC CTG GCT TCGG-3’(SEQ IDNO:15)及5’-AAA AAA GTC GAC GCG GCG TCT GCG TCT GCG GCG TCT GCG GTT TGAATG CATGGG AGA GCC-3’(SEQ ID NO:38),对于人Sox2引物为5’-GGA TCC GAA TTC ATG TAC AACATG ATG GAG ACG G-3’(SEQ ID NO:16)和5’-AAA AAA CTC GAG GCG GCG TCT GCG TCTGCG GCG TCT GCG CAT GTG CGA CAG GGG CAG TG-3’(SEQ ID NO:39)，对于人Klf4引物为5’-GGA TCC GAA TTC ATG GCT GTC AGC GAC GCG CTG C-3’(SEQ ID NO:14)和5’-AAA AAACTC GAG GCG GCG TCT GCG TCT GCG GCG TCT GCG AAA GTG CCT CTT CAT GTG TAA GGC-3’(SEQ ID NO:37)，并且对于人c-Myc引物为5’-GGA TCC GAA TTC ATG CCC CTC AAC GTTAGC TTC AC3’(SEQ ID NO:13)和5’-AAA AAA CTC GAG GCG GCG TCT GCG TCT GCG GCGTCT GCG CGC ACA AGA GTT CCG TAG CTG TTC-3’(SEQ ID NO:36)。
化脓性链球菌Cas9 NCBI参考序列：NZ_CP010450.1(SEQ ID NO:19)，通过引用并 入本文。
Figure BDA0003574995470000561
鸡眼型葡萄球菌Cas9 NCBI参考序列：NZ_CP045927.1(SEQ ID NO:20)，通过引用 在此全部并入本文。
Figure BDA0003574995470000562
来自金黄色葡萄球菌的Cas9合成构建物，NCBI参考序列：MN548085.1(SEQ ID NO: 21)；通过引用在此全部并入本文。
Figure BDA0003574995470000571
嗜甲烷假丝酵母Mx1201 Cas12a NCBI参考序列：NC_020913.1(SEQ ID NO：22)，通 过引用在此全部并入本文。
Figure BDA0003574995470000572
嗜甲烷白念珠菌分离株MGYG-HGUT-02456Cas12a NCBI参考序列：NZ_LR699000.1 (SEQ ID NO:23)，通过引用在此全部并入本文。
Figure BDA0003574995470000573
白蚁假丝酵母MpT1株染色体Cas12a NCBI参考序列：NZ_CP010070.1(SEQ ID NO: 24)，通过引用在此并入本文。
Figure BDA0003574995470000581
定义
为了理解本发明主题内容并为了构建所附专利权利要求书，本发明包括以下定义。本文中使用的缩写词在化学和生物领域中具有传统意义。
虽然在这里显示并描述了本发明的各种实施方案和方面，但对于本领域技术人员来说，显而易见的是，这些实施方案和方面仅以举例的方式被提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以进行多种变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明时可以使用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文件或部分文件，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和专著，特此以引用的方式明确纳入其全部内容，以供任何用途。
“患者”或“有需要的受试者”是指动物中患有或有可能患有上述疾病的在世成员。在实施方案中，受试者是由可能自然患有该疾病的个体组成的成员。在实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物的非限制性实施例包括啮齿类动物(如小鼠和大鼠)、灵长类动物(如狐猴、丛猴、猴子、猿和人类)、兔子、狗(如宠物狗、服务狗或工作狗，如警犬、军犬、赛狗或表演狗)、马(如赛马和工作马)、猫(如家养猫)，牲畜(如猪、牛、驴、骡子、野牛、山羊、骆驼和绵羊)和鹿。在实施方案中，受试者是人类。
术语“受试者”、“患者”、“个人”等并不局限于其本身，通常可以互换。也就是说，被描述为“患者”的个人不一定有特定的疾病，但可能只是寻求医疗建议。
过渡术语“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，具有包容性或开放性，不排除其他未引用的元素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤上，以及那些对权利要求保护的发明的基本和新颖特征没有实质性影响的材料或步骤上。
在本文的说明书和权利要求书中，诸如“至少一个”或“一个或多个”之类的短语可以出现在元素或特征的连接列表之后。术语“和/或”也可能出现在两个或多个元素或特征的列表中。除非另有说明或者与使用该短语的上下文的意思相矛盾，否则该短语意指单独列出的任何元素或特征，或任何列出的元素或特征与任何其他元素或特征的组合。例如，短语“至少A和B中的一个“A和B中的一个或多个；”“A和/或B”分别表示“A单独、B单独或A和B一起”，类似的解释也适用于包含三个或三个以上项目的清单。例如，短语“至少A、B和C中的一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B和/或C”分别意指“A单独、B单独、C单独、A和B一起、A和C一起、B和C一起，或A和B和C一起”。此外，在上述和权利要求中使用术语“基于”旨在表示“至少部分基于”，从而也允许使用未引用的特征或元素。
如本文所使用的，“分离”或“纯化”的核酸分子、多核苷酸、多肽或蛋白质在通过重组技术生产时基本上不含其他细胞材料或培养基，或在化学合成时不含化学前体或其他化学品。纯化后的化合物至少占目标化合物重量(干重)的60％。优选地，制备物为至少75％、更优选至少90％、最优选至少99％(按重量计)的感兴趣化合物。例如，纯化的化合物是指所需化合物至少占总化合物重量的90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)。纯度可通过任何适当的标准方法进行测量，例如，通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱(HPLC)分析。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))或多肽不含在其自然状态下位于其侧链上的氨基酸序列或核酸序列。纯化还定义了可安全用于人类受试者的无菌程度，例如缺乏传染性或毒性物质。
相对于参照水平，所确定的水平可能会增加。如本文所用，相对于水平(例如，所述SOLUPORETM方法后T细胞的细胞因子释放、基因调节或代谢率)而言的术语“增加”指高于参照水平的任何百分比增加。在各种实施方案中，增加的水平可以是相对于参照水平，至少或者大约5％的增加、至少或者大约10％的增加、至少或者大约15％的增加、至少或者大约20％的增加、至少或者大约25％的增加、至少或者大约30％的增加、至少或者大约35％的增加、至少或者大约40％的增加，至少或者大约45％的增加、至少或者大约50％的增加、至少或者大约55％的增加、至少或者大约60％的增加、至少或者大约65％的增加、至少或者大约70％的增加、至少或者大约75％的增加、至少或者大约80％的增加、至少或者大约85％的增加、至少或者大约90％的增加，至少或大约增加95％。
相对于参照水平，所确定的水平可能会降低。如本文所用，相对于水平(例如，所述SOLUPORETM方法后T细胞的细胞因子释放、基因调节或代谢率)而言的术语“减少”是指相对于参照水平的任意百分比的减少。在各种实施方案中，减少的水平可以是指相对于控制水平，至少或大约减少5％、至少或大约减少10％、至少或大约减少15％、至少或大约减少20％、至少或大约减少25％、至少或大约减少30％、至少或大约减少35％、至少或大约减少40％，至少或大约减少45％、至少或大约减少50％、至少或大约减少55％、至少或大约减少60％、至少或大约减少65％、至少或大约减少70％、至少或大约减少75％、至少或大约减少80％、至少或大约减少85％、至少或大约减少90％，至少或大约减少95％。
上述增加或减少也可以表示为倍数差或对数差(例如，参见图12的相关性)。例如，基于2的对数(或log2)被用于沿着一个轴将结果标准化，该轴上的上调基因和下调基因的值相等。示例性计算如下所示：
处理的基因A vs参照＝7.0(过表达)；
参照基因B vs处理过的＝7.0或者，处理过的vs参照＝0.142(低表达).
两者都以相同的强度过度表达或表达不足，然而，线性标度不能反映这种变化。或者，基因A上调7.0倍，基因2下调0.142倍。当以log2的形式表达时，基因A上调2.81倍，基因B下调-2.81倍。
实施例
以下实施例说明本发明的特定实施方案，并不意味着限制本发明的范围。
通过以下实施例和具体的步骤进一步说明了这里的实施方案。但是，这些实施例仅仅起到说明实施方案的目的，并不构成对本发明范围的限制。本申请全文中所引用的参考文献和公开的专利及专利申请通过引证全部并入本文。
实施例1：原代人类免疫细胞的功效和多方面功能化
评估SOLUPORETM传递方法将模型货物、GFP(绿色荧光蛋白)mRNA递送至原代人T细胞的能力。由于T细胞治疗的制造过程多种多样，包括多种细胞培养体系，因此使用了PBMC(外周血单个核细胞)启动的和CD3+(抗原决定簇3)纯化的T细胞培养物，每种培养物均从三名人类供体中分离。对于PBMC启动的和CD3+纯化的T细胞，GFP在24小时的表达分别为65-75％和40-50％，细胞存活率大于70％(图1A和图1B)。
接下来使用Cas9(CRISPR相关核酸内切酶Cas9(Cas9))蛋白-核糖核蛋白(RNP)复合物评估SOLUPORETM传递方法对功能性货物的效率，设计所述复合物使其靶向TRAC(T细胞受体α)和PDCD1(程序性死亡细胞蛋白1)基因。RNP被输送到从三个供体分离的T细胞中。使用TRAC RNPs，CD3的表达从90％下降至35％，相应的细胞存活率>90％(图1C)。对于PDCD1，INDEL(碱基***或删除)效率为25％，细胞活力>90％(图1D)。
实施例2：双重传递和顺序传递多种货物
下一代免疫细胞治疗产品将需要多次修改，这意味着需要使用转染技术来传递多个货物。然而，只有当细胞的健康和功能不受传递方法的不利影响时，这种工程才有用。因此，评估SOLUPORETM传递方法同时或顺序传递两种货物的功效。还对细胞活力的维持进行了评估。
双重货物传递
为了测试双重货物传递的概念，使用SOLUPORETM传递方法或者电穿孔方法将CD19(分化簇19)CAR(嵌合抗原受体)mRNA和GFP mRNA同时传递到来自3个供体的刺激后的T细胞。转染后24小时，使用SOLUPORETM传递方法传递的细胞中68.7±4.1％的细胞为CD3阳性和CAR阳性，细胞活力保持较高(图2A)。代表性流式细胞术图如图2B所示。
在治疗剂方面传递多种货物是具有优势的，这是由于有效治疗通常需要多种或复杂货物。
通过传递多个货物，可以对细胞进行复杂的编辑。每个货物都可以赋予细胞某种特定的功能或特征。如果需要提高液体和实体肿瘤自体细胞疗法的靶向性和疗效，细胞将需要使用与制造工艺一致的步骤进行多次修饰。这可能涉及多路复用或顺序工程步骤。类似的要求也适用于外源基因方法，在所诉外源基因方法中细胞排斥和GvHD问题意味着可能需要复杂的编辑。病毒载体容量和电穿孔毒性的限制意味着这些模式可能不适用于某些复杂的工程机制。此外，仅对研究级病毒载体来讲，其设计和生产也需要很长的准备时间，这意味着开发阶段的时间可能比预期的要长。这一点在实体瘤治疗方法的进展中尤其值得关注，因为在实体瘤治疗中，靶向性和有效性的挑战意味着需要测试大量候选靶抗原和细胞潜能增强。有必要以快速、高通量的方式评估大量细胞成分，如果完全依赖于病毒载体，可能会受到高度限制。
顺序货物传递
为了评估顺序传递，将TRAC(T细胞受体α)RNP(核糖核蛋白)递送至T细胞，并在两天后将CD19 CAR mRNA递送至相同的细胞群。第二天，收集细胞并分析CD3和CAR表达。CAR表达平均为67.5±8.4％，CD3敲除率为79.7±2.4％，56.7±3.4％的细胞同时为CAR阳性和CD3阴性(图2C)。细胞的平均存活率为76.7±10.9％，而未经处理的参照细胞的平均存活率为94.74±4.5％。代表性流式细胞术图如图2D所示。顺序传递(货物双重/多重传递)提供了治疗优势，其中细胞可以被修饰以具有多种新功能，以增强其靶向肿瘤细胞的能力或有效杀死肿瘤细胞的能力。例如，为了增强靶向性，可能需要靶向多种肿瘤抗原。此外，为了增加T细胞的转运，有兴趣在CAR-T细胞上表达趋化因子受体或细胞因子，或表达基质降解酶以增加CAR-T细胞在肿瘤中的迁移，或通过表达显性/阴性形式的CAR-T抑制剂(如PD-1和TGFβ)和许多其他策略来增强持续性。
实施例3:细胞因子的释放显示出最小的细胞扰动
上述实施例2中的货物传递研究表明，用SOLUPORETM传递方法进行转染是有效的，并且对细胞活力的影响最小。然而，尽管也有报道称，电穿孔等传递方法对T细胞活力的影响最小，但这种方法也可能对细胞造成压力，导致基因和蛋白质表达以及最终细胞功能的意外改变。因此，评估了转染对T细胞(实施例4)中细胞因子释放和免疫基因表达的影响。
首先使用多重分析法(Luminex)检测SOLUPORETM传递方法是否导致T细胞非特异性释放细胞因子。该实验组包含11种人类分析物：IFN-γ(干扰素γ)、IL-2(白细胞介素2)、TNFα(肿瘤坏死因子α)、IL-8(白细胞介素8)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、IL-10(白细胞介素10)、MIP-1α(巨噬细胞炎性蛋白1α)、MIP-1β(巨噬细胞炎性蛋白1β)，IL-17A(白细胞介素17A)、不规则趋化因子和ITAC(干扰素诱导T细胞α趋化剂)。
通过溶质穿孔将GFP mRNA传递到来自5个供体的受刺激的T细胞中，每个供体包括2个技术重复。还包括模拟转染(无货物)，并在5天的时间过程中测量细胞因子的释放。与未经处理的参照细胞相比较，在使用SOLUPORETM传递方法的实验组中，没有观察到GFP mRNA和模拟转染组中任意分析的细胞因子之间的显著差异。这表明细胞没有受到足以导致这些细胞因子的非特异性释放的干扰。
相比之下，当使用电穿孔法转染细胞时，IL-2和IL-8分泌的显著差异是明显的，这表明电穿孔过程造成细胞应激，导致这些细胞释放细胞因子(图3A和图6A-6I)。T细胞释放细胞因子，要么是对特定刺激配体的特异性反应，要么是对应激的非特异性反应。在这些实验中没有使用特定的刺激配体，这表明电刺激的细胞受到了应激。
实施例4:免疫基因曲线说明最小的细胞扰动
本文描述的实验是以货物-独立的方式进行的，这意味着进行这些实验是为了证明SOLUPORETM传递方式对T细胞中的蛋白质和基因表达的影响最小，重要的是，如增殖等生物学特性得以保留。此外，使用SOLUPORETM传递方式向免疫细胞中添加外源性物质对蛋白质和基因表达的影响最小，也能维持生物功能和活性。使用Nanostring CAR-T表征面板评估了转染过程对T细胞基因表达的影响，该面板测量了多达780个免疫相关基因的基因表达，包括与免疫细胞衰竭、激活和持久性相关的基因。据报道，电穿孔可以显著影响T细胞中的基因表达。使用模拟转染的未被刺激的T细胞(或“未激活T细胞”)来避免货物对基因表达的潜在混杂效应。制造商(Lonza)推荐使用“T细胞高效”FI-115电穿孔程序。
在第一项研究(研究1)中，使用SOLUPORETM传递方法或者电穿孔方法模拟转染来自3个供体的未激活T细胞(每个供体包含两个技术重复)。在转染后6小时和24小时分析基因表达。在SOLUPORETM传递方法的6小时组中，与未经处理的参照细胞相比，1.7％的基因被确定为差异表达组(10/582个基因，1个log2倍数(>2倍)变化，p<0.05，表7-8)。转染后24小时(SOLUPORETM传递方法)，未发现基因表达变化(0/582个基因)。
相比之下，对于电穿孔6小时组，265/582个基因被确定为发生了改变，占检测到的基因的45.5％(表7-9)。在24小时电穿孔组中，11.3％的基因差异表达(66/582，表9)。当比较6小时和24小时电穿孔组时，发现37个基因在两个时间点都有差异表达(下表4)。
表4：研究1–对于电穿孔，37个基因在第6小时和24小时时间点都是相同的
Figure BDA0003574995470000661
Figure BDA0003574995470000671
在SOLUPORETM传递方法的6小时组中确定在10个基因中有8个基因与电穿孔6小时组的基因是共同的(见下表5)。
表5:研究1中SOLUPORETM传递方法的6小时组和电穿孔6小时组中的共同基因
Figure BDA0003574995470000672
Figure BDA0003574995470000681
生成火山图(图3B)和热图(图3C和图7)，以提供差异表达基因的概述。还完成了路径分析(下表1和图8)。在电穿孔6小时组中发现的大多数基因与T细胞活化、代谢和衰竭相关的途径对应。
表1:在CAR-T表征6小时组中确定的基因通路分析
Figure BDA0003574995470000682
鉴于电穿孔组中存在大量基因变化，为了验证研究结果，进行了第二项研究。在研究2中，在转染后24小时进行基因表达分析。每组包括来自2个供体的未受刺激的T细胞，2次技术重复，第三个供体进行一次，全部模拟转染。结果与第一项研究中的结果相似，在SOLUPORETM传递方法组中仅确定了9/597个基因(1.5％)，而FI-115电穿孔组发现43/597(7.2％)基因(表11和表12)，与研究1的结果一致。在本研究中，SOLUPORETM传递方法和电穿孔24小时组确定出四个基因是共同的(下表6)。
表6:研究2中电穿孔和SOLUPORETM传递方法孔中24小时组的共同基因
Figure BDA0003574995470000691
当比较研究1和研究2时，发现在24小时电穿孔组中有38个基因是共同的，这再次表明了研究结果之间的一致性(下表2)。
表2:在24小时时间点比较研究1和研究2电穿孔组的结果，显示共有基因的变化为 1个log2倍数(>2倍)，p<0.05。
Figure BDA0003574995470000692
Figure BDA0003574995470000701
另外一个核感染项目EO-115也包括在研究2中。该程序被制造商描述为“高细胞功能”，大概没有FI-115那么苛刻。在EO-115项目中，有16/597(2.7％)基因差异表达(表11和表12)。两个核感染项目中确定的基因高度重叠，EO-115组的16个基因中有12个也存在于FI-115组(表11和表12)。与FI-115相比，EO-115组中识别的基因数量较少，这一结果与该项目是不太严苛的电穿孔过程相符合。
T细胞耗竭特征与表型
对于下一代CAR T疗法，研究了几个问题从而在更多患者中实现长期疾病控制和改善实体瘤的反应，并且T细胞耗竭在这方面正受到越来越多的关注。在慢性病毒感染或癌症期间，T细胞耗竭表型在抗原长期暴露后自然发生，其特征是抑制性受体的表达、代谢损伤和效应器功能(如细胞因子分泌)的下调。有人认为，耗竭涉及TCR(T细胞受体)信号传导介导的代谢过程的大量重组，转录因子包括AP-1(激活蛋白1)复合物、IRF4(干扰素调节因子4)，BATF(碱性亮氨酸拉链转录因子，ATF样)和NFAT(活化T细胞的核因子)在这一过程中发挥关键作用。
通过T细胞受体发出的抗原信号会激活这些信号通路，同时细胞应激也会刺激T细胞中的这些通路。因此，对CAR-T特征化小组中的疲劳相关基因进行了评估。在这两项研究中，电穿孔组中FOSB(Fos原癌基因)、Fos(原癌基因)、JUN、BATF(碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样)、BATF3(碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样3)和IRF4(干扰素调节因子4)基因的表达持续上调，而使用SOLUPORETM传递方法组对这些基因的干扰最小，与未经处理的参照细胞进行比较(下表3)。
表3在研究1和研究2中AP-1(激活蛋白1)相关基因出现1个log2倍数(>2倍)的变 化，p<0.05
Figure BDA0003574995470000711
在其他实施方案中，本发明的免疫细胞(具有外源性货物的免疫细胞)所具有分子曲线，与参照免疫细胞中表达的水平相比，程序性死亡蛋白1(PD1)的表达水平的log2倍数变化为3、log2倍数变化为2或log2倍数变化为1。
耗尽的T细胞的转录过程不同于功能效应子或记忆T细胞的转录过程，其特征在于能够表达抑制性细胞表面受体，包括PD-1。例如，本发明的免疫细胞(具有外源性货物的免疫细胞)所具有的分子曲线中PD-1的表达水平与参照免疫细胞中表达的水平相比具有约为1的log2倍数变化。例如，本发明的免疫细胞(具有外源性货物的免疫细胞)的具有分子曲线中PD-1的表达水平与参照免疫细胞中表达的水平相比具有约2个log2倍数变化。例如，本发明的免疫细胞(具有外源性货物的免疫细胞)的具有分子曲线中PD-1的表达水平与参照免疫细胞中表达的水平相比具有约3个log2倍数变化。在一些实施方案中，本发明的免疫细胞(具有外源性货物的免疫细胞)所具有分子曲线中与参照免疫细胞中表达的水平相比，程序性死亡蛋白1(PD1)的表达水平的log2倍数变化为3、log2倍数变化为2或log2倍数变化为1。
实施例5:转染细胞的增殖和体内植入
综上所述，上述货物传递以及基因和蛋白质表达研究表明SOLUPORETM传递方法可以有效地输送货物来修饰T细胞，从而使细胞压力最小，蛋白质和基因表达受到非特异性干扰。然而，对于细胞治疗剂制造应用来讲，还需要确认修饰后的细胞保留其所需的生物学特性，例如稳健的增殖和体内植入。因此，在本实施例中检验转染的T细胞中的这些特征。
为了检测转染对T细胞增殖作用的影响，从5个随机供体中分离细胞并进行GFPmRNA转染。每个供体包括5个独立的技术重复，并在7天内计算细胞增殖。用SOLUPORETM传递方法转染的细胞的增殖率与未经处理的参照细胞相似(图4A)。相比之下，用电穿孔法转染的细胞增殖速度较慢。
为了进一步评估转染对T细胞健康和功能的影响，使用了体内植入小鼠模型。以注射人类外周血单核细胞(hu-PBMC)免疫缺陷株为基础的异种GvHD的人类化小鼠模型是研究人类免疫功能的重要工具。该模型的特点是hu-PBMC植入血液，最终植入注射小鼠的脾脏、***和骨髓。将这些细胞通过静脉注射的方式快速植入免疫缺陷
Figure BDA0003574995470000721
小鼠体内，该小鼠缺乏T细胞、B细胞和NK细胞，并带有IL-2受体γ链(IL-2Rγ空)的靶向突变，该突变允许接受人类细胞和组织。GvHD的成功植入和发展依赖于hu PBMC与小鼠MHC I和II类的反应性，因此依赖于高活性和功能性供体细胞。
使用SOLUPORETM传递方法或电穿孔方法将3kDa右旋糖酐Alexa Fluor 488转染至人PBMC中，并注入经辐射的NOD scid IL-2Rγ缺失小鼠。在注射后第28天收获时，经研究发现，使用SOLUPORETM传递方法获得的细胞，在脾脏中的植入水平与未经处理的参照细胞相似(图4B)。相比之下，电穿孔细胞的植入水平较低，表明这些细胞的功能效率降低。
实施例6: CD19 CAR-T细胞的产生和体内体外细胞毒性
已经证明了SOLUPORETM传递方法允许在保持T细胞增殖和植入能力的同时有效地修饰T细胞(如上实施例2-5所示)，生成CAR-T细胞，并评估其体外和体内的癌细胞杀伤能力。
通过SOLUPORETM传递方法或者电穿孔方法将CD19 CAR mRNA传递至来自3个供体的T细胞中。在3个供体中，使用SOLUPORETM传递方法得到的CD19-CAR表达略低于电穿孔细胞，分别为72-76％和74-81％(图5A)。使用实时细胞阻抗法测定对表达CD19的RAJI细胞的体外细胞毒性。使用SOLUPORETM传递方法获得的CAR-T细胞与电穿孔CAR-T细胞对靶细胞RAJI细胞具有同等的细胞毒性(图5A)，尽管CAR表达水平较低。
使用NSG小鼠中表达荧光素酶的RAJI肿瘤模型评估CAR T细胞的体内治疗能力，所述CAR T细胞是使用SOLUPORETM传递方法产生的(图5B)。CD19 CAR T细胞是使用SOLUPORETM方法产生的，以电穿孔法作为阳性对照；CAR的平均表达率分别为73％和85％。小鼠接受剂量为1x106、2x106或4x106的CAR T细胞，并通过生物发光成像监测疾病进展。在CAR T细胞给药后12天，在使用SOLUPORETM传递方法以及阳性参照电穿孔组(图5D)中观察到，肿瘤生长明显减少，且呈剂量依赖性。虽然SOLUPORETM给药方法和电穿孔剂量之间的肿瘤负担减少相似，但值得注意的是，最高剂量4x106 CAR T细胞组的3/10小鼠似乎没有疾病。流式细胞术分析证实，与电穿孔对照组相比，接受SOLUPORETM传递方法的小鼠血液中的人类T细胞数量显著增加(图5D)，这一观察结果与此相关。同样，在接受SOLUPORETM传递方法制备的CAR-T细胞的小鼠中，根据CD20(分化簇20)的表达确定的肿瘤植入率较低(T试验)(图5E)。
实施例7:转染后活化的人T细胞的表型分析
来自3个供体的活化CD3+T细胞要么被溶质穿孔，要么被核感染(使用程序EO115-“T细胞的高功能性”)，使用mRNA GFP或者在没有货物的情况下(模拟)。使用一组针对T细胞相关激活/耗尽表面标记物(PD-1和CD69为主要靶点)的特异性单克隆抗体(mAb)对细胞进行分析(图13和图14)。
在3个供体中，CD4+细胞群占65％，分化簇8(CD8)(分化簇4(CD4)阴性染色)占T细胞群的35％，无论是在天然UT细胞的还是活化的UT细胞中，即CD4:CD8比率为65:35。在用GFP(67:33)或模拟溶液(63:37)进行溶质穿孔后，T细胞的CD4:CD8比率保持不变。在GFP(65:35)或模拟核感染(69:31)后，T细胞的CD4:CD8比率也没有变化(图13和图14)。
在3个供体中，天然CD4+T细胞中的PD1表达为2％。激活后，该值增加至18％±5％。用GFP或模拟溶液溶质穿孔后的PD1表达分别为16％±4％或14％±5％。在核感染后，无论是GFP还是模拟核感染，CD4+细胞中的PD1表达分别为14％±5％或17％±5％。在相同的3个供体中，幼稚的CD8+T细胞中的PD1表达为1％。激活后，CD8+T细胞上的PD1在溶解后分别增加至6％±1％或7％±1％PD1表达，无论是使用GFP还是模拟溶解。在核感染后，无论是GFP还是模拟核感染，CD8+细胞中的PD1表达分别为5％±2％或6％±2％(图13)。
在3个供体中，CD69在天然CD4+T细胞中的表达为2％±4％。激活后CD69表达上调至61％±1％。用GFP或模拟溶液进行溶质穿孔之后，CD69表达分别为66％±1％或62％±1％。在核感染后，无论是GFP还是模拟核感染，CD4+细胞中的CD69表达分别为69％±2％或62％±2％。在相同的3个供体中，CD69在天然的CD8+T细胞中的表达为4％±8％。激活后，CD8+T细胞上的CD69增加至29％±3％。用GFP或模拟溶液进行溶质穿孔后，CD69表达分别为32％±1％或64％±2％。在核感染后，无论是GFP还是模拟核感染，CD8+细胞中的CD69表达分别为30％±2％或32％±1％(图14)。
因此，在溶质穿孔或者核感染后，PD-1或者CD69的表达均未被改变。
实施例8:代谢研究
通过3种方式评估转染后T细胞的代谢率：1)乳酸的产生，2)耗氧率和3)细胞外酸化率。活化的T细胞在经历从氧化磷酸化到有氧糖酵解的代谢过程时释放乳酸，这是它们旺盛的增殖和获得效应子功能所必需的。细胞外乳酸与T细胞增殖密切相关。通过分析氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，可以了解线粒体呼吸和糖酵解的关键细胞功能。
1.
转染后活化的人T细胞产生乳酸
使用ChromaDazzle乳酸测定法评估转染后细胞的乳酸生成。来自5个供体的活化CD3+T细胞要么被mRNA GFP或者或者在没有货物的情况下(模拟)溶质穿孔，要么被核感染(使用程序EO115-“T细胞的高功能性”)。转染后6小时收集上清液，并在-20℃下储存。对上清液进行乳酸浓度测定(一种酶催化的动力学反应)，与参照相比，乳酸的产生如图15所示。
UT细胞的乳酸产量设置为1。与UT相比，溶质穿孔或受核感染的细胞产生的乳酸略少，所有细胞产生的乳酸量都是UT的0.8到0.9倍(图15)。
2
转染后活化T细胞的代谢
海马仪器测量氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，分别作为线粒体呼吸和糖酵解的指标。下图(图16A和16B)显示了如何分析海马数据。图17显示了来自一个供者的原始数据痕迹，无论是溶质穿孔的还是受核感染的。糖酵解、氧化磷酸化、糖酵解能力和最大呼吸如图18所示，使用图16A和图16B中的计算确定。
氧化磷酸化(OCR数据)
海马实验装置如图16A和16B所示。对于观察UT的OCR数据，当添加低聚物时，OCR率略有下降，在FCCP(羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙)刺激作用下又有所上升，在添加Rot/AA时再次下降。该试剂盒中包含的调节剂包括寡霉素、羰基氰化物-4(三氟甲氧基)苯肼(FCCP)、鱼藤酮和抗霉素A，这些调节剂应刺激图16A和16B中所示的耗氧率模式。在所示的实验中，模拟溶质穿孔过程几乎与UT相同，表明溶解过程本身不会干扰正常的细胞氧化磷酸化(图17)。与UT相比，经mRNA GFP进行溶质穿孔后，FCCP刺激的OCR率略有增加，从约60pmol/min增加到接近100pmol/min。然而，对于受核穿孔影响的细胞，在FCCP刺激后，OCR率的增加更为明显，OCR率上升到近150pmol/min(图17和图18)。因此，在本实验中，核感染细胞的备用呼吸能力(SRC)与使用溶质穿孔的细胞SCR相比，与UT的差距更大。值得注意的是，这是转染18小时后这一时间点这些细胞代谢的快照。
糖酵解测定(ECAR)
海马实验设置如图16A和16B所示。对于观察UT的ECAR数据，在添加低聚物后，ECAR速率略有增加，然后在2DG后急剧下降，与图16A和16B中所示的模式类似。与OCR速率类似，模拟溶质穿孔ECAR速率的轨迹几乎与UT相同，表明溶质穿孔过程本身不会干扰正常的细胞糖酵解(图17)。与UT相比，mRNA GFP的溶质穿孔显示ECAR率略有增加，从大约50mpH/min到接近70mpH/min，在添加低聚物后，从大约60mpH/min到接近80mpH/min。然而，与核感染细胞相比，在FCCP刺激后，OCR率的增加更为明显，OCR率上升至150pmol/min(图17和图18)。数据表明，与未经处理或接受核感染的T细胞相比，接受SoluporeTM处理的T细胞的细胞糖酵解(ECAR)没有实质性或显著性差异。这对于基础糖酵解测定和T细胞糖酵解能力测定都是正确的。糖酵解能力是细胞在被迫进行糖酵解时所能达到的最大糖酵解速率，是细胞可用糖酵解机制的一个量度。
实施例9:CAR Plus数据
对已经经过额外货物传递操作方法的细胞实施SOLUPORETM传递方法。例如，使用SOLUPORETM传递方法将外源性货物(例如mRNA)递送到已经被病毒转导的细胞中。或者，首先使用SOLUPORETM传递方法递送外源性货物，例如mRNA，然后对细胞进行额外的传递操作，例如病毒转导。
术语“CAR plus”指的一种细胞群，所述细胞群经历了1)病毒转导，然后再附加其他的细胞内传递方法(例如SOLUPORETM传递方法、电穿孔或核转染，或其任何组合)或2)SOLUPORETM传递方法用于递送外源性货物，然后对细胞进行其他的细胞内传递方法(例如，病毒转导、SOLUPORETM传递方法、电穿孔或核转染，或其任何组合)。细胞首先被病毒转导，然后使用SOLUPORETM传递方法进行细胞内传递时，病毒成分可能仍然存在。
对病毒转导的CAR T细胞评估了SOLUPORETM传递方法的可行性。评估LV(慢病毒)CAR+T细胞(3个供体x n＝1)中GFP的表达和活性。图19A和19B证明了使用SOLUPORETM传递方法生成经过多次修改的细胞的可行性。在病毒转导的CAR-T细胞中，使用SOLUPORETM传递方法观察到65％的转染效率(图19A)(在3个供体的CAR+T细胞中，GFP+分别为63％、60％和67％)，并且在24小时时观察到大于80％的存活率(图19B)。
本文所述研究中使用了以下材料和方法。
细胞分离和培养
使用淋巴预备密度梯度培养基(StemCell)从新鲜白细胞中分离PBMC，并用标准方法冷冻保存。解冻后，使用针对T细胞上细胞表面标记物的特异性抗体，例如可溶性CD3(克隆：OKT3)和CD28(克隆：15E8)抗体(均为Miltenyi Biotech)，每个100ng/ml，将PBMC启动(即刺激或激活)至T细胞。细胞在完整的培养基中培养3天，培养基由CTS优化器+补充剂(Gibco)和5％生理血清替代物(Nucleus Biologics)、1％L-谷氨酰胺和250IU/ml IL-2(CellGenix)组成。根据制造商的说明书，在收集24小时后，使用MultiMACS 24(MiltenyiBiotech)和Leukopak CD4和CD8 T细胞试剂(Milteyni Biotech)直接从Leukopak中分离人CD3+T细胞。T细胞在补充有2mM L-谷氨酰胺和250U/ml IL-2(CellGenix)的CTS培养基(Gibco)中以1x106/ml的密度培养。用抗CD3/CD28涂层珠(细胞治疗***(CTS)Dynabeads)以2:1的珠细胞比激活细胞。
SOLUPORETM传递方法
根据之前描述的方法对SOLUPORETM传递方法进行了调整。使用SOLUPORETM传递方法，将细胞以每孔3.5x105个细胞的量转移至96孔过滤器底板(安捷伦公司)上，或以每孔6x106个细胞的速度转移至荚膜(阿维塔斯公司)。以350×g的速率离心120秒，从96孔板中移除培养基，并通过重力流从豆荚中移除培养基。将货物与传递溶液(32.5mM蔗糖、106mM氯化钾、5mM(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙基磺酸)(HEPES)在水中的溶液)混合，并将1μl或50μl的上述混合物分别输送到96孔板和荚膜中的细胞上。对于mRNA的传递，所述传递溶液还含有12％v/v的乙醇。对于核糖核蛋白(RNPs)的传递，所述溶液还含有25mM乙酸铵和10％v/v的乙醇。在室温下培养30秒后，添加50-2000μl 0.5倍磷酸盐缓冲盐溶液(68.4mM氯化钠、1.3mM氯化钾、4.0mM磷酸氢钠、0.7mM磷酸二氢钾)，30秒后添加完整培养基。完整的培养基包括CTS OpTimizer+补充剂(Gibco)，含5％生理血清替代物(Nucleus Biologics)、1％L-谷氨酰胺和250IU/ml IL-2(CellGenix)。
电穿孔
按照标准方法对细胞进行电穿孔，按照使用说明书使用4D Nucleofector***(Lonza)(20μl nucleocuvette或100μl nucleocuvette格式)，并使用预加载FI-115和EO-115脉冲程序的P3原代细胞4-D Nucleofector溶液电穿孔细胞。
GFP mRNA和CAR mRNA传递
对于SOLUPORETM传递方法和电穿孔法，GFP mRNA(模型货物)和CD19 CAR mRNA(功能货物)(均来自TriLink生物技术公司)的最终浓度分别为每百万个细胞2微克和每1x106个细胞3.3微克。使用生物素结合的CD19-CAR检测试剂(购自Miltenyi Biotec公司)评估CD19-CAR表达，然后使用Steptavidin–PE和7-氨基放线菌素D(7AAD)作为活性染色剂。
CD19 CAR序列(SEQ ID NO:8)
Figure BDA0003574995470000801
Figure BDA0003574995470000811
RNP复合物
在SOLUPORETM传递方法和电穿孔方法中，以3.3μg/1x106细胞的最终浓度递送Cas9蛋白(整合DNA技术)，并与2摩尔过量的引导RNA(gRNA)预复合(CRISPR相关内切酶Cas9(Cas9)–2.48μM和gRNA 4.96μM；整合DNA技术)。靶向gRNA的人TRAC(T-细胞α受体)的序列是AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:25)并且靶向gRNA的人PDCD1(程序性死亡蛋白-1)的序列是GTCTGGGCGGTGCTACAACT(SEQ ID NO:26)。转染后第2天，通过流式细胞术分析CD3(分化簇3)的表达。为了进行PDCD1基因INDEL(碱基***或删除)分析，在转染后第4天收集细胞。
流式细胞术分析
使用NovoCyte 3000进行刘氏细胞术。使用NovoExpress software(AceaBiosciences公司)进行数据检验。
PDCD1基因INDEL分析
使用MagNA Pure Compact核酸分离试剂盒1(罗氏化学)从细胞中提取基因组DNA。进行PCR，扩增编辑位点附近305bp区域(正向引物–AGCACTGCCTCTGTCACTCTCG(SEQ ID NO:40)；反向引物–AGGGACTGAGGGTGGAAGGTC(SEQ ID NO:41)；整合DNA技术)。通过Sanger测序仪(Eurofins基因组学公司)和TIDE(通过分解跟踪核酸***及删除)分析对PCR产物在TIDE序列上进行测序(https://tide.nki.nl/)。
细胞因子释放分析
通过SOLUPORETM传递方法或者核转染方法将GFP mRNA递送至来自5名健康捐赠者的活化人类T细胞中。处理4小时后，将细胞以1x106/ml的量重新接种到96孔板中，每天收集上清液，持续5天。采用类似的方法进行细胞增殖试验，细胞计数并每天重新播种至1x106/ml。设计了一个定制的Luminex分析小组(默克密理博公司)来测量11种人类分析物：IL-2(白细胞介素2)、IFN-γ(干扰素γ)、TNFα(肿瘤坏死因子α)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、IL-8(白细胞介素8)、IL-10(白细胞介素10)、MIP-1α(巨噬细胞炎性蛋白1α)，MIP-1β(巨噬细胞炎性蛋白1β)、Fractalkine、ITAC(干扰素诱导T细胞α趋化剂)和IL-17A(白细胞介素17A)。使用Luminex 200TM***(默克密理博公司)上的人类高灵敏度T细胞磁珠板方案，对上清液样品进行了两次分析。
基因曲线
按照制造商的使用说明书，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)从细胞中分离RNA。使用NanoString nCounter人类CAR-T表征面板(NanoString)分析转录本。使用log2倍数变化显示差分表达式，表格过滤为-1≥log2≤1。NanoString面板是一个综合性免疫面板，包含来自14种不同免疫细胞类型、常见检查点抑制剂、CT(癌症/睾丸)抗原的770个基因，以及涵盖适应性和先天性免疫反应的基因。
下面提供了NanoString面板的免疫细胞类型基因覆盖率表。
Figure BDA0003574995470000831
Figure BDA0003574995470000841
小鼠体内移植研究
通过SOLUPORETM传递方法或者核感染方法，用3μMAlexa FluorTM-标记的3kDa右旋糖酐-Alexa488转染人PBMC。第0天，对非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)IL-2Rγnull(NSG)小鼠进行照射(2.4Gy)。四小时后，对小鼠静脉注射PBMC(1x10^6/g)。在研究过程中(28天)，仔细观察小鼠的疾病迹象，特别是GvHD的发展。第14天，收集小鼠外周血，通过流式细胞术分析人类(CD45(克隆HI30，购自Biolegend公司)、CD3(克隆UCHT1，购自Biolegend公司)、CD4(克隆SK3，购自Biolegend公司)、CD8(克隆SK1，购自Biolegend公司))细胞植入。在研究过程中或研究结束时(第28天)，采集脾脏，通过流式细胞术分析人(CD45、CD3、CD4、CD8)细胞的植入情况。
体外细胞毒性实验
使用SOLUPORETM传递方法或者电穿孔方法将CD19 CAR mRNA传递至T细胞中。转染后24小时，细胞在CryoStor CS10(Sigma-Aldrich)中冷冻保存。使用
Figure BDA0003574995470000842
实时细胞分析仪单板(RTCA SP)仪器(ACEA Biosciences)通过阻抗分析测量体外细胞毒性。用4μg/ml CD40(分化簇40)(ACEA Biosciences)涂覆电子微量滴定板孔3小时细胞(
Figure BDA0003574995470000851
以5x104的速度播种细胞/孔，使其粘附过夜。第二天，19-21小时后，解冻CAR-T细胞，计数并添加到RAJI细胞中，在以下效应子与目标的比率下：2.5:1、1.25:1、0.6:1、0.3:1、0.15:1。在4小时内每1分钟监测一次阻抗，在8小时内每5分钟监测一次阻抗，然后在至少92小时内每15分钟监测一次阻抗。将细胞指数(CI)标准化为CAR-T时时间点的CI细胞与对照效应细胞纯培养物相比，计算特异性裂解。
体内鼠CAR T细胞功效研究
使用SOLUPORETM或者核转染方法将CD19 CAR mRNA传递到T细胞中冷冻保存所得细胞。在第0天向NSGTM小鼠体内植入CD19+RAJI-荧光素酶肿瘤细胞(2.5x105,静脉注射)，然后根据体重将小鼠随机分为不同的治疗组。在第三天，解冻CAR T细胞并向每只动物注射1x106,2x106或者4x106个细胞。在第15天，进行生物发光成像，并通过二氧化碳窒息对动物实施安乐死。
数理统计
使用未配对的学生t检验评估肿瘤或CAR T细胞的体内植入的意义。使用95％置信区间，比较Luminex上分析的每个重复的平均值。使用双向方差分析(方差分析)比较各组与未治疗对照组在每个时间点的平均值，**P<0.01*P<0.05。所有统计分析均使用GraphPadPrism 8.0进行。
细胞表型分析核代谢分析
分别使用流式细胞术和海马分析评估T细胞活化标志物的表面表达和阿维塔斯产生的T细胞的糖酵解活性细胞。简单的说，使用dyna珠和IL-2激活T细胞19小时，之后细胞或者不进行下一步处理(UT)、或者通过溶剂穿孔的方法(Sol-mock)或核转染(NF-mock)的方法进行模拟转染，或通过溶剂穿孔的方法(Sol)或核转染(NF)的方法进行GFP mRNA转染。使用一组针对T细胞相关激活/耗尽表面标记物(PD-1和CD69为主要靶点)具有特异性的单克隆抗体进行分析。在分析过程中，对溶质穿孔或者和转染的GFP+细胞进行门控，并与未经处理的活化细胞(UT)进行比较。用于细胞外通量分析2x10^5T细胞在海马培养板上接种四份，并在IL-2培养基中过夜。第二天，使用CellTak将细胞粘附在海马培养板上，并重新悬浮在海马培养基中(控制pH值和营养成分)。然后使用海马分析仪在每个时间点对细胞进行4次测量分析。除细胞外酸化率(ECAR)外，还测量了耗氧量(OCR)，并表示为氧化磷酸化率(OxPhos)。剩下的T细胞使用OxPhos，但激活后“切换”到糖酵解代谢。
乳酸测定
通过溶质穿孔或核感染法(程序EO115)，使用mRNA-GFP转染活化T细胞的L-乳酸生成细胞，并使用ChromaDazzle乳酸检测试剂盒(AssayGenie)进行分析。转染后6小时收集上清液，并在-20℃下储存。
表7–6小时后S1研究数据组(电穿孔FI-115第6小时)
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过滤＝>1并且<-1log2倍数变化(2倍线性变化)
表8–6小时后S1研究数据组(SOLUPORETM传递方法的第6小时)
Figure BDA0003574995470000922
表9–24小时后S2研究数据组(电穿孔FI-115的第24小时)
Figure BDA0003574995470000923
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Figure BDA0003574995470000941
过滤＝>1和<-1log2倍数变化(2倍线性变化)
*在使用SOLUPORETM传递方法的组中在第24小时没有识别出基因
表10–24小时电穿孔FI-115后数据组S3研究2
Figure BDA0003574995470000942
Figure BDA0003574995470000951
过滤＝>1和<-1log2倍数变化(2倍数线性变化)
表11–使用SOLUPORETM传递方法在第24小时的数据组S3研究2
Figure BDA0003574995470000952
过滤＝>1和<-1log2倍数变化(2倍数线性变化)
表12–数据组S3研究2第24小时，FI-115电穿孔和EO-115电穿孔之间的比较
Figure BDA0003574995470000961
过滤＝>1和<-1log2倍数变化(2倍数线性变化)
表13-T细胞传递后6小时(使用SOLUPORETM传递方法)
Figure BDA0003574995470000962
Figure BDA0003574995470000971
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表14.传递后24小时的T细胞(使用SOLUPORETM传递方法)
Figure BDA0003574995470001092
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表15.核感染(FI-115)传递后6小时的T细胞
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表16–核转染(FI-115)传递后24小时的T细胞
Figure BDA0003574995470001302
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表17–核转染(EO115)传递后24小时的T细胞
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其他实施方案
虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利、公开的美国专利申请、指定美国的PCT专利申请、公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。通过附录号引用的Genbank和NCBI附录均通过引用并入本文。本文引用的所有其他已出版参考文献、文件、手稿和科学文献均通过引用并入本文。这里引用的所有其他公开的参考文献、文件、文稿或者科技期刊均通过引用在此全部并入本文。如果发生矛盾，以本申请说明书及其定义的内容为准。另外，这里描述的材料、方法和实施例仅起到说明的目的，并不作为对本发明的限制。
虽然已经参考本发明的优选实施例具体地示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以对本发明的形式和细节进行各种改变。

Claims (36)

1.一种包括外源性货物的免疫细胞，其中，与参照免疫细胞在货物传递后24小时所得的基因或者蛋白水平相比，所述免疫细胞在货物传递后24小时的基因或蛋白质的表达水平分子曲线的log2倍数变化在3以内，并且其中，所述基因或蛋白在激动蛋白1(AP-1)信号转导通路中。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，与参照免疫细胞的基因或者蛋白水平相比，所述免疫细胞的基因或者蛋白表达水平的log2倍数变化在2以内，或者与参照免疫细胞的基因或者蛋白水平相比，所述免疫细胞的基因或者蛋白表达水平的log2倍数变化在1以内。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述外源性货物包括核酸、小分子、蛋白、多肽或者其组合。
4.根据权利要求3所述的免疫细胞，其中，所述核酸包括信使核糖核酸(mRNA)、小干扰性RNA(siRNA)、短发夹状RNA(ShRNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其任意组合。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，在AP-1信号转导通路中的基因和蛋白表达包括Fos(v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物，FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物)、Jun(v-Jun禽肉瘤病毒17癌基因同源物)或其组合。
6.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，在AP-1信号转导通路中的基因和蛋白包括Fos、Jun、FosB(FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B)、BATF(碱性亮氨酸拉链ATF-样转录因子)、BATF3(碱性亮氨酸拉链ATF-样转录因子3)，或其组合。
7.根据权利要求5所述的免疫细胞，其中，所述Fos包括人Fos，具有SEQ ID NO:1所示的核酸序列，并且其中，Jun包括人Jun，具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
8.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述货物包括信使核糖核酸(mRNA)。
9.根据权利要求8所述的免疫细胞，其中，所述mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。
10.根据权利要求9所述的免疫细胞，其中，所述CAR靶向CD19(分化簇19)“CD19 CAR”)。
11.根据权利要求10所述的免疫细胞，其中，CD19 CAR包括SEQ ID NO:6或者SEQ IDNO:8所示的mRNA序列。
12.根据权利要求10所述的免疫细胞，其中，CD19 CAR包括SEQ ID NO:7或者SEQ IDNO:9所示的蛋白序列。
13.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，在包括外源性货物的免疫细胞AP-1信号转导通路中基因或蛋白的表达与参照免疫细胞相比，其log2倍数变化约为-3。
14.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，在包括外源性货物的免疫细胞AP-1信号转导通路中基因或蛋白的表达与参照免疫细胞相比，其log2倍数变化约为-2。
15.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，在包括外源性货物的免疫细胞AP-1信号转导通路中基因或蛋白的表达与参照免疫细胞相比，其log2倍数变化约为-1。
16.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞包括至少两种外源性货物。
17.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述包括外源性货物的免疫细胞不显示T细胞耗竭或者T细胞无能表型。
18.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述包括外源性货物的免疫细胞包括未被刺激的免疫细胞。
19.一种包括外源性货物的免疫细胞，其中，所述免疫细胞分泌至少一种细胞因子，其分泌水平与没有经历细胞工程化过程的免疫细胞的分泌水平相比，log2倍数变化在3以内。
20.根据权利要求19所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞分泌至少一种细胞因子，其分泌水平与没有经历细胞工程化过程的免疫细胞的分泌水平相比，log2倍数变化在2以内。
21.根据权利要求19所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞分泌至少一种细胞因子，其分泌水平与没有经历细胞工程化过程的免疫细胞的分泌水平相比，log2倍数变化在1以内。
22.根据权利要求19所述的免疫细胞，其中，所述细胞因子包括人IL-2(白介素2)，其具有的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，人IL-8(白介素8)其具有的核酸序列如SEQ ID NO:18所示，或其组合。
23.根据权利要求19所述的免疫细胞，其中，所述细胞因子包括IFN-γ(干扰素γ)、IL-2(白细胞介素2)、TNFα(肿瘤坏死因子α)、IL-8(白细胞介素8)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、IL-10(白细胞介素10)、MIP-1α(巨噬细胞炎性蛋白1α)、MIP-1β(巨噬细胞炎性蛋白1β)、IL-17A(白细胞介素17A)、不规则趋化因子或ITAC(干扰素诱导T细胞α趋化剂)。
24.一种将外源性货物通过细胞质膜传递到非粘附免疫细胞的方法，包括，
提供非粘附细胞群；以及
将细胞群与一定体积的等渗水溶液相接触，所述水溶液包括的外源性货物和浓度大于0.2％(v/v)的醇，其中，非粘附免疫细胞的免疫功能包括未经历细胞工程步骤的细胞的表型，其中免疫功能选自(i)细胞因子释放；(ii)基因表达；和(iii)代谢率。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述醇浓度大于0.5％(v/v)。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述醇浓度大于2％(v/v)。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，所述醇浓度大于5％(v/v)。
28.根据权利要求24所述的方法，其中，所述醇浓度大于10％(v/v)。
29.根据权利要求24所述的方法，其中，所述免疫细胞在货物传递前未被激活。
30.根据权利要求24所述的方法，其中，在免疫细胞与外源性货物接触之前，免疫细胞未与CD3、CD28或其组合的配体接触。
31.根据权利要求24所述的方法，其中进一步包括至少两种外源性货物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述至少两种外源性货物被同时传递。
33.根据权利要求31所述的方法，其中，所述至少两种外源性货物被顺序传递。
34.一种通过非粘附细胞的细胞质膜传递外源性货物的方法，该方法包括以下步骤：
提供非粘附细胞群，并使用至少两种细胞内传递方法，所述传递方法选自：(i)将细胞群与一定体积的等渗水溶液相接触，所述水溶液包括外源性货物和浓度大于0.5％(v/v)的醇，(ii)病毒转导，(iii)，电穿孔或(iv)核感染，从而将两种外源性货物传递至免疫细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述细胞内传递方法包括将细胞群与一定体积的等渗水溶液相接触，该水溶液包括外源性货物和浓度大于0.5％(v/v)的醇，随后进行病毒转导。
36.根据权利要求34所述的方法，其中细胞内传递方法包括病毒转导，随后将细胞群与一定体积的等渗水溶液接触，该水溶液包括外源性货物和浓度大于0.5％(v/v)的醇。
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