CN114354926A - 一种埃可病毒9型抗体检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种埃可病毒9型抗体检测方法，本发明将ECHO9 VP1重组蛋白作为酶标板的抗原，突破以往直接用病毒株灭活作为抗原包被酶标板，或者用病毒株感染细胞制备抗原片的局限，实现了酶标抗原板制备高通量和安全性的要求。本发明不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗，而且对ECHO9引起突发疫情早发现、早干预、流行病学的研究，保障人民群众健康起到技术支持的重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，具体为一种埃可病毒9型抗体检测方法。
背景技术
埃可病毒9型(Echovirus 9，ECHO9)引起的无菌性脑炎暴发在美国、加拿大、英国、欧洲、日本、韩国等地均有报道。在国内病毒性脑炎发病率较高，但报道ECHO9引起的病毒性脑炎较少，这可能与没有有效检测ECHO9的方法有关。目前对ECHO9的病原学检测主要采用病毒培养，血清中和试验或者RT-PCR扩增目的基因条带，然后进行基因测序，在GeneBank网站进行Blast比对来确定埃可病毒的型别。这些方法共同的不足是费时、费力、不能高通量检测，而且对实验人员及仪器设备的要求比较高、成本较大，不能在基层实验室进行。因此ECHO9抗体检测方法建立不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗，而且对突发疫情早发现、早干预，保障人民群众健康起到至关重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种埃可病毒9型抗体检测方法。本发明不仅具有检测快捷、准确性高的优点，而且满足检测高通量和安全性的要求。
本发明的技术方案：一种埃可病毒9型抗体检测方法，按以下步骤进行：
S1：ECHO9 pET28a-VP1重组质粒制备：在ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化，重新基因合成ECHO9 VP1序列；
质粒pET28a+表达阅读框设计VP1基因的扩增引物：
上游引物：5'-CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG-3'，含NdeI酶切位点和启始密码子ATG；
下游引物：5'-CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCTTGG-3'，含XhoI酶切位点；
重新合成的ECHO9 VP1序列和质粒pET28a+原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切，获得ECHO9 pET28a-VP1重组质粒；
S2：高效表达ECHO9 VP1重组蛋白及验证：采用IPTG诱导的重组菌高效表达ECHO9VP1重组蛋白，并利用该蛋白的N末端含有的6个组氨酸，用镍柱亲和层析法使其得到纯化和鉴定，获得37kD ECHO9 VP1重组蛋白；
S3：酶标抗原板制备:用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制10μg/ml的重组蛋白溶液，96孔酶标板每孔加0.1ml，4℃包被过夜；次日用0.05％Tween 20-0.01mol/L PBS洗涤3次后用20％小牛血清封闭，制备好的酶标抗原板密封于4℃冰箱保存；
S4:人血清中ECHO9 IgM/IgG抗体检测方法建立：以1:20稀释的人血清为一抗；1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgM或HRP标记羊抗人IgG为二抗、TMB为显色底物，建立检测ECHO9 VP1-IgM/IgG-ELISAs，在终止反应后用Bio-Rad酶标仪测定各孔OD值：测定波长为450nm，参比波长为630nm；若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
上述的埃可病毒9型抗体检测方法，步骤S1中，采用T4连接酶连接，连接后将产物转入E.coli DH 5α中培养，挑取单克隆进行PCR，酶切及测序鉴定重组质粒。
前述的埃可病毒9型抗体检测方法，步骤S4中，人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作步骤如下：
S4.1、试验设阴性对照2孔和阳性对照1孔，每孔加相应液体100μL；设空白对照1孔空置；
S4.2、样品孔加入用生理盐水或PBS1：20稀释的血清样品100μL，振荡混匀后贴上封口膜，置于37℃孵箱30分钟；
S4.3、配制0.05％Tween 20-0.01mol/L PBS洗涤液备用；
S4.4、置洗板机洗板，重复洗板5次；
S4.5、加入酶标工作液，每孔100μL，空白孔不加，置于37℃孵箱30分钟；
S4.6、置洗板机洗板，重复洗板5次；
S4.7、吸100μL TMB到每孔，充分混匀，置室温显色10分钟；
S4.8、立即加入终止液每孔100μL，置酶标仪测定波长为450nm，参比波长为630nm。以空白孔调零，读取各孔OD值；若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
前述的埃可病毒9型抗体检测方法，所述人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作的结果判断包括：
人血清中IgM、IgG抗体均为阴性，则未感染ECHO9；
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阴性，则为ECHO9感染急性期；
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阳性，则为ECHO9感染恢复期；
人血清中ECHO9 IgM阴性、IgG阳性，则为ECHO9既往感染。
与现有技术相比，本发明将ECHO9 VP1重组蛋白作为酶标板的抗原，突破以往直接用病毒株灭活作为抗原包被酶标板，或者用病毒株感染细胞制备抗原片的局限，实现了酶标抗原板制备高通量和安全性的要求。本发明将表达、纯化好的ECHO9 VP1重组蛋白包被酶标板，优化ELISA的试验条件，建立间接ELISA方法检测人血清中抗ECHO9的IgM和IgG方法。本发明不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗，而且对突发疫情早发现、早干预，保障人民群众健康起到至关重要的作用。
附图说明
图1为本发明的流程步骤图；
图2为ECHO9 pET28a-VP1重组质粒构建示意图；
图3为重组质粒pET28a-VP1的酶切鉴定示意图；
图4是Western blot鉴定纯化后VP1蛋白示意图；
图5是Western blot鉴定VP1蛋白兔抗体示意图；
图6是ELISA法鉴定VP1蛋白兔抗体滴度示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例：一种埃可病毒9型抗体检测方法，如图1所示，按以下步骤进行：
S1：如图2所示，ECHO9 pET28a-VP1重组质粒制备：在GenBank发表的ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化，重新基因合成ECHO9 VP1序列；
质粒pET28a+表达阅读框设计VP1基因的扩增引物：
上游引物：5'-CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG-3'，含NdeI酶切位点和启始密码子ATG；
下游引物：5'-CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCTTGG-3'，含XhoI酶切位点；
重新合成的ECHO9 VP1序列和质粒pET28a+原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切。采用T4连接酶连接，连接后将产物转入E.coli DH 5α中培养，挑取单克隆进行PCR，如图3所示(注：1：DNA marker；2：NdeI和XhoI双酶切pET28a-VP1)，酶切及测序鉴定重组质粒，重组质粒命名为pET28a-VP1。
S2：高效表达ECHO9 VP1重组蛋白及验证：采用IPTG诱导的重组菌高效表达ECHO9VP1重组蛋白，并利用该蛋白的N末端含有的6个组氨酸，用镍柱亲和层析法使其得到纯化和鉴定，获得37kD ECHO9 VP1重组蛋白，如图4所示(注1：蛋白marker；2：纯化VP1蛋白)。用纯化的VP1重组蛋白免疫兔子制备的多克隆抗体，结果表明能特异性结合VP1蛋白,如图5所示(注：1：蛋白marker抗体；2：VP1蛋白兔抗体)。图5的实验结果表明该纯化的重组蛋白具有较好的抗原性，可以作为间接ELISA诊断抗原使用。
表1
ELISA法鉴定VP1蛋白兔抗体滴度如表1和图6所示。纯化的VP1重组蛋白100ng/孔包被酶标板；1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000稀释的兔血清多克隆抗体作为第一抗体；羊抗兔IgG(H+L)作为第二抗体，阴性对照用5％PBS牛奶作为第一抗体；阳性对照用抗-His抗体6E25ug/ml作为第一抗体。实验显示兔血清多克隆抗体稀释十万倍仍能够与纯化的VP1重组蛋白结合显色。结果表明重组VP1蛋白具有很好的免疫反应原性。其中图6中从左至右，1-5孔为1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000稀释的兔血清；6孔为阴性对照。
S3：酶标抗原板制备:用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制10μg/ml的重组蛋白溶液，96孔酶标板每孔加0.1ml，4℃包被过夜；次日用0.05％Tween 20-0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤3次后用20％小牛血清封闭，制备好的酶标抗原板密封于4℃冰箱保存；
S4:人血清中ECHO9 IgM/IgG抗体检测方法建立：以1:20稀释的人血清为一抗；1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgM或HRP标记羊抗人IgG为二抗、TMB为显色底物，建立检测ECHO9 VP1-IgM/IgG-ELISAs，在终止反应后用Bio-Rad酶标仪测定各孔OD值：测定波长为450nm，参比波长为630nm；若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作步骤如下：
S4.1、试验设阴性对照2孔和阳性对照1孔，每孔加相应液体100μL；设空白对照1孔空置；
S4.2、样品孔加入用生理盐水或PBS1：20稀释的血清样品100μL，振荡混匀后贴上封口膜，置于37℃孵箱30分钟；
S4.3、配制0.05％Tween 20-0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤液备用；
S4.4、置洗板机洗板，重复洗板5次；
S4.5、加入酶标工作液(HRP标记羊抗人IgM或IgG)，每孔100μL，空白孔不加，置于37℃孵箱30分钟；
S4.6、置洗板机洗板，重复洗板5次；
S4.7、吸100μL TMB到每孔，充分混匀，置室温显色10分钟；
S4.8、立即加入终止液每孔100μL，置酶标仪测定波长为450nm，参比波长为630nm。以空白孔调零，读取各孔OD值；若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
检测操作的结果判断包括：
人血清中IgM、IgG抗体均为阴性，则未感染ECHO9；
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阴性，则为ECHO9感染急性期；
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阳性，则为ECHO9感染恢复期；
人血清中ECHO9 IgM阴性、IgG阳性，则为ECHO9既往感染。
本发明将表达、纯化好的ECHO9 VP1重组蛋白包被酶标板，优化ELISA的试验条件，建立间接ELISA方法检测人血清中抗ECHO9的IgM和IgG方法。本发明建立ELISAs方法检测ECHO-9疫情阳性血清与德国赛润埃可病毒检测试剂盒所做的结果一致。运用本发明所建立的ELISA方法，对杭州地区风疹、麻疹IgM抗体检测均阴性的未满十四周岁发热儿童的血清176份及健康体检儿童的血清240份进行了ECHO9的筛查。并将结果与德国赛润埃克病毒检测试剂盒进行比对，发现本发明的方法检测阳性率与德国赛润试剂盒接近。本发明还发现两种方法检测发热儿童的抗体阳性率是差不多的，但是健康儿童的抗体ECHO9阳性率相差了一倍多。对两种方法比较之后发现针对发热儿童，2＝1.647，P＝0.199没有统计学差异。但是针对健康儿童，2＝5.47，P＝0.019；两种方法是有统计学差异。
综上所述，本发明将ECHO9 VP1重组蛋白作为酶标板的抗原，突破以往直接用病毒株灭活作为抗原包被酶标板，或者用病毒株感染细胞制备抗原片的局限，实现了酶标抗原板制备高通量和安全性的要求。本发明不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗，而且对ECHO9引起突发疫情早发现、早干预、流行病学的研究，保障人民群众健康起到技术支持的重要作用。
Claims (4)
1.一种埃可病毒9型抗体检测方法，其特征在于：按以下步骤进行：
S1：ECHO9 pET28a-VP1重组质粒制备：在ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化，重新基因合成ECHO9 VP1序列；
质粒pET28a+表达阅读框设计VP1基因的扩增引物：
上游引物：5'-CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG-3'，含NdeI酶切位点和启始密码子ATG；
下游引物：5'-CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCTTGG-3'，含XhoI酶切位点；
重新合成的ECHO9 VP1序列和质粒pET28a+原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切，获得ECHO9 pET28a-VP1重组质粒；
S2：高效表达ECHO9 VP1重组蛋白及验证：采用IPTG诱导的重组菌高效表达ECHO9 VP1重组蛋白，并利用该蛋白的N末端含有的6个组氨酸，用镍柱亲和层析法使其得到纯化和鉴定，获得37kD ECHO9VP1重组蛋白；
S3：酶标抗原板制备:用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制10μg/ml的重组蛋白溶液，96孔酶标板每孔加0.1ml，4℃包被过夜；次日用0.05％Tween 20-0.01mol/L PBS洗涤3次后用20％小牛血清封闭，制备好的酶标抗原板密封于4℃冰箱保存；
S4:人血清中ECHO9 IgM/IgG抗体检测方法建立：以1:20稀释的人血清为一抗；1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgM或HRP标记羊抗人IgG为二抗、TMB为显色底物，建立检测ECHO9VP1-IgM/IgG-ELISAs，在终止反应后用Bio-Rad酶标仪测定各孔OD值：测定波长为450nm，参比波长为630nm；若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
2.根据权利要求1所述的埃可病毒9型抗体检测方法，其特征在于：步骤S1中，采用T4连接酶连接，连接后将产物转入E.coli DH 5α中培养，挑取单克隆进行PCR，酶切及测序鉴定重组质粒。
3.根据权利要求1所述的埃可病毒9型抗体检测方法，其特征在于：步骤S4中，人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作步骤如下：
S4.1、试验设阴性对照2孔和阳性对照1孔，每孔加相应液体100μL；设空白对照1孔空置；
S4.2、样品孔加入用生理盐水或PBS1：20稀释的血清样品100μL，振荡混匀后贴上封口膜，置于37℃孵箱30分钟；
S4.3、配制0.05％Tween 20-0.01mol/L PBS洗涤液备用；
S4.4、置洗板机洗板，重复洗板5次；
S4.5、加入酶标工作液，每孔100μL，空白孔不加，置于37℃孵箱30分钟；
S4.6、置洗板机洗板，重复洗板5次；
S4.7、吸100μL TMB到每孔，充分混匀，置室温显色10分钟；
S4.8、立即加入终止液每孔100μL，置酶标仪测定波长为450nm，参比波长为630nm。以空白孔调零，读取各孔OD值；若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
4.根据权利要求3所述的埃可病毒9型抗体检测方法，其特征在于：所述人血清中ECHO9IgM或IgG抗体检测操作的结果判断包括：
人血清中IgM、IgG抗体均为阴性，则未感染ECHO9；
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阴性，则为ECHO9感染急性期；
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阳性，则为ECHO9感染恢复期；
人血清中ECHO9 IgM阴性、IgG阳性，则为ECHO9既往感染。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 邱晓枫;黄志成;张国忠;濮小英;潘劲草;王咪咪;: "埃可病毒9型VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备", 中国卫生检验杂志, no. 07, 10 April 2015 (2015-04-10), pages 951 - 965 * |
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