CN114354926A - 一种埃可病毒9型抗体检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种埃可病毒9型抗体检测方法,本发明将ECHO9 VP1重组蛋白作为酶标板的抗原,突破以往直接用病毒株灭活作为抗原包被酶标板,或者用病毒株感染细胞制备抗原片的局限,实现了酶标抗原板制备高通量和安全性的要求。本发明不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗,而且对ECHO9引起突发疫情早发现、早干预、流行病学的研究,保障人民群众健康起到技术支持的重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术领域,具体为一种埃可病毒9型抗体检测方法。
背景技术
埃可病毒9型(Echovirus 9,ECHO9)引起的无菌性脑炎暴发在美国、加拿大、英国、欧洲、日本、韩国等地均有报道。在国内病毒性脑炎发病率较高,但报道ECHO9引起的病毒性脑炎较少,这可能与没有有效检测ECHO9的方法有关。目前对ECHO9的病原学检测主要采用病毒培养,血清中和试验或者RT-PCR扩增目的基因条带,然后进行基因测序,在GeneBank网站进行Blast比对来确定埃可病毒的型别。这些方法共同的不足是费时、费力、不能高通量检测,而且对实验人员及仪器设备的要求比较高、成本较大,不能在基层实验室进行。因此ECHO9抗体检测方法建立不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗,而且对突发疫情早发现、早干预,保障人民群众健康起到至关重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种埃可病毒9型抗体检测方法。本发明不仅具有检测快捷、准确性高的优点,而且满足检测高通量和安全性的要求。
本发明的技术方案:一种埃可病毒9型抗体检测方法,按以下步骤进行:
S1:ECHO9 pET28a-VP1重组质粒制备:在ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化,重新基因合成ECHO9 VP1序列;
质粒pET28a+表达阅读框设计VP1基因的扩增引物:
上游引物:5'-CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG-3',含NdeI酶切位点和启始密码子ATG;
下游引物:5'-CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCTTGG-3',含XhoI酶切位点;
重新合成的ECHO9 VP1序列和质粒pET28a+原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切,获得ECHO9 pET28a-VP1重组质粒;
S2:高效表达ECHO9 VP1重组蛋白及验证:采用IPTG诱导的重组菌高效表达ECHO9VP1重组蛋白,并利用该蛋白的N末端含有的6个组氨酸,用镍柱亲和层析法使其得到纯化和鉴定,获得37kD ECHO9 VP1重组蛋白;
S3:酶标抗原板制备:用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制10μg/ml的重组蛋白溶液,96孔酶标板每孔加0.1ml,4℃包被过夜;次日用0.05%Tween 20-0.01mol/L PBS洗涤3次后用20%小牛血清封闭,制备好的酶标抗原板密封于4℃冰箱保存;
S4:人血清中ECHO9 IgM/IgG抗体检测方法建立:以1:20稀释的人血清为一抗;1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgM或HRP标记羊抗人IgG为二抗、TMB为显色底物,建立检测ECHO9 VP1-IgM/IgG-ELISAs,在终止反应后用Bio-Rad酶标仪测定各孔OD值:测定波长为450nm,参比波长为630nm;若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
上述的埃可病毒9型抗体检测方法,步骤S1中,采用T4连接酶连接,连接后将产物转入E.coli DH 5α中培养,挑取单克隆进行PCR,酶切及测序鉴定重组质粒。
前述的埃可病毒9型抗体检测方法,步骤S4中,人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作步骤如下:
S4.1、试验设阴性对照2孔和阳性对照1孔,每孔加相应液体100μL;设空白对照1孔空置;
S4.2、样品孔加入用生理盐水或PBS1:20稀释的血清样品100μL,振荡混匀后贴上封口膜,置于37℃孵箱30分钟;
S4.3、配制0.05%Tween 20-0.01mol/L PBS洗涤液备用;
S4.4、置洗板机洗板,重复洗板5次;
S4.5、加入酶标工作液,每孔100μL,空白孔不加,置于37℃孵箱30分钟;
S4.6、置洗板机洗板,重复洗板5次;
S4.7、吸100μL TMB到每孔,充分混匀,置室温显色10分钟;
S4.8、立即加入终止液每孔100μL,置酶标仪测定波长为450nm,参比波长为630nm。以空白孔调零,读取各孔OD值;若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
前述的埃可病毒9型抗体检测方法,所述人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作的结果判断包括:
人血清中IgM、IgG抗体均为阴性,则未感染ECHO9;
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阴性,则为ECHO9感染急性期;
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阳性,则为ECHO9感染恢复期;
人血清中ECHO9 IgM阴性、IgG阳性,则为ECHO9既往感染。
与现有技术相比,本发明将ECHO9 VP1重组蛋白作为酶标板的抗原,突破以往直接用病毒株灭活作为抗原包被酶标板,或者用病毒株感染细胞制备抗原片的局限,实现了酶标抗原板制备高通量和安全性的要求。本发明将表达、纯化好的ECHO9 VP1重组蛋白包被酶标板,优化ELISA的试验条件,建立间接ELISA方法检测人血清中抗ECHO9的IgM和IgG方法。本发明不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗,而且对突发疫情早发现、早干预,保障人民群众健康起到至关重要的作用。
附图说明
图1为本发明的流程步骤图;
图2为ECHO9 pET28a-VP1重组质粒构建示意图;
图3为重组质粒pET28a-VP1的酶切鉴定示意图;
图4是Western blot鉴定纯化后VP1蛋白示意图;
图5是Western blot鉴定VP1蛋白兔抗体示意图;
图6是ELISA法鉴定VP1蛋白兔抗体滴度示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明,但并不作为对本发明限制的依据。
实施例:一种埃可病毒9型抗体检测方法,如图1所示,按以下步骤进行:
S1:如图2所示,ECHO9 pET28a-VP1重组质粒制备:在GenBank发表的ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化,重新基因合成ECHO9 VP1序列;
质粒pET28a+表达阅读框设计VP1基因的扩增引物:
上游引物:5'-CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG-3',含NdeI酶切位点和启始密码子ATG;
下游引物:5'-CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCTTGG-3',含XhoI酶切位点;
重新合成的ECHO9 VP1序列和质粒pET28a+原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切。采用T4连接酶连接,连接后将产物转入E.coli DH 5α中培养,挑取单克隆进行PCR,如图3所示(注:1:DNA marker;2:NdeI和XhoI双酶切pET28a-VP1),酶切及测序鉴定重组质粒,重组质粒命名为pET28a-VP1。
S2:高效表达ECHO9 VP1重组蛋白及验证:采用IPTG诱导的重组菌高效表达ECHO9VP1重组蛋白,并利用该蛋白的N末端含有的6个组氨酸,用镍柱亲和层析法使其得到纯化和鉴定,获得37kD ECHO9 VP1重组蛋白,如图4所示(注1:蛋白marker;2:纯化VP1蛋白)。用纯化的VP1重组蛋白免疫兔子制备的多克隆抗体,结果表明能特异性结合VP1蛋白,如图5所示(注:1:蛋白marker抗体;2:VP1蛋白兔抗体)。图5的实验结果表明该纯化的重组蛋白具有较好的抗原性,可以作为间接ELISA诊断抗原使用。
表1
ELISA法鉴定VP1蛋白兔抗体滴度如表1和图6所示。纯化的VP1重组蛋白100ng/孔包被酶标板;1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000稀释的兔血清多克隆抗体作为第一抗体;羊抗兔IgG(H+L)作为第二抗体,阴性对照用5%PBS牛奶作为第一抗体;阳性对照用抗-His抗体6E25ug/ml作为第一抗体。实验显示兔血清多克隆抗体稀释十万倍仍能够与纯化的VP1重组蛋白结合显色。结果表明重组VP1蛋白具有很好的免疫反应原性。其中图6中从左至右,1-5孔为1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000稀释的兔血清;6孔为阴性对照。
S3:酶标抗原板制备:用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制10μg/ml的重组蛋白溶液,96孔酶标板每孔加0.1ml,4℃包被过夜;次日用0.05%Tween 20-0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤3次后用20%小牛血清封闭,制备好的酶标抗原板密封于4℃冰箱保存;
S4:人血清中ECHO9 IgM/IgG抗体检测方法建立:以1:20稀释的人血清为一抗;1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgM或HRP标记羊抗人IgG为二抗、TMB为显色底物,建立检测ECHO9 VP1-IgM/IgG-ELISAs,在终止反应后用Bio-Rad酶标仪测定各孔OD值:测定波长为450nm,参比波长为630nm;若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作步骤如下:
S4.1、试验设阴性对照2孔和阳性对照1孔,每孔加相应液体100μL;设空白对照1孔空置;
S4.2、样品孔加入用生理盐水或PBS1:20稀释的血清样品100μL,振荡混匀后贴上封口膜,置于37℃孵箱30分钟;
S4.3、配制0.05%Tween 20-0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤液备用;
S4.4、置洗板机洗板,重复洗板5次;
S4.5、加入酶标工作液(HRP标记羊抗人IgM或IgG),每孔100μL,空白孔不加,置于37℃孵箱30分钟;
S4.6、置洗板机洗板,重复洗板5次;
S4.7、吸100μL TMB到每孔,充分混匀,置室温显色10分钟;
S4.8、立即加入终止液每孔100μL,置酶标仪测定波长为450nm,参比波长为630nm。以空白孔调零,读取各孔OD值;若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
检测操作的结果判断包括:
人血清中IgM、IgG抗体均为阴性,则未感染ECHO9;
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阴性,则为ECHO9感染急性期;
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阳性,则为ECHO9感染恢复期;
人血清中ECHO9 IgM阴性、IgG阳性,则为ECHO9既往感染。
本发明将表达、纯化好的ECHO9 VP1重组蛋白包被酶标板,优化ELISA的试验条件,建立间接ELISA方法检测人血清中抗ECHO9的IgM和IgG方法。本发明建立ELISAs方法检测ECHO-9疫情阳性血清与德国赛润埃可病毒检测试剂盒所做的结果一致。运用本发明所建立的ELISA方法,对杭州地区风疹、麻疹IgM抗体检测均阴性的未满十四周岁发热儿童的血清176份及健康体检儿童的血清240份进行了ECHO9的筛查。并将结果与德国赛润埃克病毒检测试剂盒进行比对,发现本发明的方法检测阳性率与德国赛润试剂盒接近。本发明还发现两种方法检测发热儿童的抗体阳性率是差不多的,但是健康儿童的抗体ECHO9阳性率相差了一倍多。对两种方法比较之后发现针对发热儿童,2=1.647,P=0.199没有统计学差异。但是针对健康儿童,2=5.47,P=0.019;两种方法是有统计学差异。
综上所述,本发明将ECHO9 VP1重组蛋白作为酶标板的抗原,突破以往直接用病毒株灭活作为抗原包被酶标板,或者用病毒株感染细胞制备抗原片的局限,实现了酶标抗原板制备高通量和安全性的要求。本发明不仅有利于无菌性脑炎疾病临床治疗,而且对ECHO9引起突发疫情早发现、早干预、流行病学的研究,保障人民群众健康起到技术支持的重要作用。
Claims (4)
1.一种埃可病毒9型抗体检测方法,其特征在于:按以下步骤进行:
S1:ECHO9 pET28a-VP1重组质粒制备:在ECHO9 VP1序列进行大肠杆菌的稀有密码子优化,重新基因合成ECHO9 VP1序列;
质粒pET28a+表达阅读框设计VP1基因的扩增引物:
上游引物:5'-CATATGGGTAGGGTTGCTGACACAATACG-3',含NdeI酶切位点和启始密码子ATG;
下游引物:5'-CTCGAGTTACACATACACAGCTCCAGATTCTTGG-3',含XhoI酶切位点;
重新合成的ECHO9 VP1序列和质粒pET28a+原核表达载体用NdeI和XhoI分别进行双酶切,获得ECHO9 pET28a-VP1重组质粒;
S2:高效表达ECHO9 VP1重组蛋白及验证:采用IPTG诱导的重组菌高效表达ECHO9 VP1重组蛋白,并利用该蛋白的N末端含有的6个组氨酸,用镍柱亲和层析法使其得到纯化和鉴定,获得37kD ECHO9VP1重组蛋白;
S3:酶标抗原板制备:用pH9.6、0.01mol/L碳酸盐缓冲液配制10μg/ml的重组蛋白溶液,96孔酶标板每孔加0.1ml,4℃包被过夜;次日用0.05%Tween 20-0.01mol/L PBS洗涤3次后用20%小牛血清封闭,制备好的酶标抗原板密封于4℃冰箱保存;
S4:人血清中ECHO9 IgM/IgG抗体检测方法建立:以1:20稀释的人血清为一抗;1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgM或HRP标记羊抗人IgG为二抗、TMB为显色底物,建立检测ECHO9VP1-IgM/IgG-ELISAs,在终止反应后用Bio-Rad酶标仪测定各孔OD值:测定波长为450nm,参比波长为630nm;若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
2.根据权利要求1所述的埃可病毒9型抗体检测方法,其特征在于:步骤S1中,采用T4连接酶连接,连接后将产物转入E.coli DH 5α中培养,挑取单克隆进行PCR,酶切及测序鉴定重组质粒。
3.根据权利要求1所述的埃可病毒9型抗体检测方法,其特征在于:步骤S4中,人血清中ECHO9 IgM或IgG抗体检测操作步骤如下:
S4.1、试验设阴性对照2孔和阳性对照1孔,每孔加相应液体100μL;设空白对照1孔空置;
S4.2、样品孔加入用生理盐水或PBS1:20稀释的血清样品100μL,振荡混匀后贴上封口膜,置于37℃孵箱30分钟;
S4.3、配制0.05%Tween 20-0.01mol/L PBS洗涤液备用;
S4.4、置洗板机洗板,重复洗板5次;
S4.5、加入酶标工作液,每孔100μL,空白孔不加,置于37℃孵箱30分钟;
S4.6、置洗板机洗板,重复洗板5次;
S4.7、吸100μL TMB到每孔,充分混匀,置室温显色10分钟;
S4.8、立即加入终止液每孔100μL,置酶标仪测定波长为450nm,参比波长为630nm。以空白孔调零,读取各孔OD值;若被检标本OD吸光值≥阴性对照均值+3SD者为阳性。
4.根据权利要求3所述的埃可病毒9型抗体检测方法,其特征在于:所述人血清中ECHO9IgM或IgG抗体检测操作的结果判断包括:
人血清中IgM、IgG抗体均为阴性,则未感染ECHO9;
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阴性,则为ECHO9感染急性期;
人血清中ECHO9 IgM阳性、IgG阳性,则为ECHO9感染恢复期;
人血清中ECHO9 IgM阴性、IgG阳性,则为ECHO9既往感染。
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WO2017107974A1 (zh) * | 2015-12-23 | 2017-06-29 | 中国人民解放军第二军医大学 | 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用 |
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Title |
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邱晓枫;黄志成;张国忠;濮小英;潘劲草;王咪咪;: "埃可病毒9型VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备", 中国卫生检验杂志, no. 07, 10 April 2015 (2015-04-10), pages 951 - 965 * |
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