CN113640513A - 非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条，所述试纸条由两条联检试纸条和处理液组成，每个试纸条均包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；两条试纸条的乳胶微球垫均为乳胶微球标记非洲猪瘟病毒P30蛋白；两条试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线均为抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体，其中之一的检测线为非洲猪瘟病毒P30蛋白，另一个检测线为羊抗猪二抗。本发明所提供的试纸条适用于猪血清、全血和组织液的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于非洲猪瘟病毒的早期筛查，特别适合现场非洲猪瘟感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验等。

Description

非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(英文名称：African Swine fever，简称：ASF)是由非洲猪瘟病毒(英文名称：African Swine fevervirus，简称：ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，***、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似。
ASFV是一种双链的核质大DNA病毒(Nucleocytoplasmic Large DNA Viruses,NCLDV)。根据不同的病毒株型，基因组DNA的碱基数约为17万到19万，其中含有151至167个开放阅读框(Opening Reading Frames,ORFs)[Alejo A,Matamoros T,Guerra M,AndrésG.,2018.A Proteomic Atlas of the African Swine Fever Virus Particle.J Virol92:e01293-18.]。与其它的NCLDV一样，ASFV编码许多蛋白质，这些蛋白质除了专门用于病毒组装的结构蛋白外，还参与逃避宿主防御机制，诸如I型干扰素和细胞凋亡途径等，以及DNA复制的修复和基因表达的调控的生物学过程。大多数ASFV的基因功能是未知的，仍需要人们对其进行探索。ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定。
目前，市场上面没有疫苗用于非洲猪瘟的防控，检测非洲猪瘟抗原成本高、速度慢，不适合大批量快速检测。因此，急需开发一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试纸条，用于非洲猪瘟抗体的快速检测，以达到快速筛查是否有非洲猪瘟感染。从而起到非洲猪瘟的防控目的。针对非洲猪瘟抗体检测，试纸条有双抗原夹抗体方法、间接检测方法以及竞争检测方法。但对非洲猪瘟病毒抗体来说，竞争方法不适用(抗原较大，不止一个抗原位点，竞争法容易产生假阴性)。而双抗原夹心方法的敏感性较差，间接检测方法特异性较差。因此，急需开发一种特异性强、敏感性好的快速检测试纸条。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是提供一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条。
因此，本发明一方面提供了一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条，所述非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条由两条联检试纸条和处理液组成，所述两条联检试纸条为合并在一起的试纸条，每个试纸条均包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；两条试纸条的乳胶微球垫均为乳胶微球标记非洲猪瘟病毒P30蛋白；两条试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线均为抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体，其中之一的检测线为非洲猪瘟病毒P30蛋白，另一个检测线为兔抗猪IgG。
优选地，本发明所述的非洲猪瘟病毒P30蛋白由CHO细胞株表达，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的相对分子量为36kD，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的编码序列如SEQ ID No.1所示。
优选地，本发明所述的样品处理液为1×PBS溶液。
优选地，本发明所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，本发明所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77-aa92位，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77-aa92位的氨基酸序列为EHQAQEEWNMILHVLF。
优选地，本发明所述的试纸条在检测样本时，当两条试纸条均出现两条条带时，判为阳性；当其中一个出现两条带，一个出现一条质控带时，判为可疑；当两条试纸条均只出现一条质控带时，判为阴性；其他情况判为无效。
优选地，本发明所述的当其中一个出现两条带，一个出现一条质控带时，判为可疑时，需要重新检测；当第二次检测结果均出现两条带时判为阳性，当第二次检测结果仍然是一个出现两条带、一个出现一条质控带时，判为阳性；当第二次检测结果均只出现一条质控带时，判为阴性。
优选地，本发明所述的试纸条适用于检测猪血清、血液和组织液中的非洲猪瘟病毒抗体。
优选地，本发明所述的组织液为唾液。
优选地，本发明所述的组织液为乳汁。
本发明所提供的非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条适用于猪血清、全血和组织液(如唾液、乳汁)中非洲猪瘟病毒抗体的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于非洲猪瘟病毒抗体的早期筛查，特别适合现场非洲猪瘟感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验等。
本发明所提供的非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条集合了双抗原夹抗体和间接检测方法来检测样品中的非洲猪瘟病毒抗体，不仅克服了双抗原夹抗体检测时的敏感性差的问题，还克服了间接检测方法特异性差的问题，实现了非洲猪瘟病毒抗体的准确检测。
本发明用于制备试纸条的非洲猪瘟病毒P30蛋白是采用真核表达体系(CHO***)制备，适合大规模化发酵生产，成本低(产量高)、质量好(纯度高、真核表达***，有翻译后修饰功能，与人源的最接近)、批次间稳定性好(同一个细胞株发酵纯化，保证表达蛋白基本一致)。因此，该P30蛋白适用于制备不同的非洲猪瘟病毒诊断试剂，如胶体金、化学发光检测试纸条等。
本发明用于用于制备试纸条的抗体非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体，对其结构和识别位点均有公开，且该抗体具有良好的特异性和敏感性，也适用于制备不同的非洲猪瘟病毒诊断试剂，如胶体金、化学发光检测试纸条等。
附图说明
图1非洲猪瘟病毒P30蛋白SDS-PAGE电泳图，1是Marker，2是未去糖基化的P30蛋白，3是去除糖基化的P30蛋白。
图2非洲猪瘟病毒抗体检测试纸条的组装(大板制作)，其中1是样品垫，2是胶体金垫，3是硝酸纤维素膜，4是吸水垫，5是检测线，6是质控线，7是PVC板。
图3非洲猪瘟病毒抗体检测试纸条内包装成品图，其中左边试纸条为间接法制备，右边试纸条为双抗原夹心法制备。
图4非洲猪瘟病毒抗体检测试纸条检测判定模式图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例中未进行详细说明的实验方法，通常按照本技术领域常规操作或按照厂商建议的条件进行。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例1非洲猪瘟病毒P30蛋白的制备
将密码子优化后的非洲猪瘟病毒P30蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.1所示)克隆到真核表达载体(如)中。以密码子优化的非洲猪瘟病毒P30蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，分别用EcoRI和HindⅢ双酶切位点进行连接以构建pEE12.4-P30-6His表达质粒。将鉴定为阳性的重组质粒送到华大生物公司进行序列测定，用软件对测定的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行分析比对，检查阅读框架的正确性。
将鉴定正确的pEE12.4-P30-6His表达质粒转染CHO-K1细胞。转染后24h开始加压筛选：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7天，中间观察细胞，死细胞多换液。加压筛选至阴性对照细胞基本死光时(约7天)进行单克隆筛选：取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mLDMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。经过筛选，共收获2株细胞株，编号为130株、172株。将筛选的单克隆细胞株驯化成悬浮培养，经驯化，130株、172株都满足要求，这表明130株、172株都驯化成功。
将130株、172株CHO-K1细胞进行摇瓶发酵培养，至第12天后收获细胞培养上清，用镍柱(GE医疗)亲和纯化分泌表达的P30-6His蛋白；用BCA试纸条(碧云天)测定浓度，并用SDS-PAGE测定纯度。经测定，其表达产量能达到500mg/L或以上，且SDS-PAGE纯度(如图1所示，表达后的P30蛋白的分子量约为36kDa，P30蛋白去除糖基化分子量约为30kDa(去糖基化酶购自NEB公司，具体操作按照说明书进行)，两者差值为P30蛋白在CHO-K1细胞中翻译后修饰所致，均为糖基化结果)＞90％。测定后的蛋白分装冻存于-80℃备用。这说明经过单克隆化和悬浮化的130株、172株的CHO-K1细胞株适合大规模化发酵生产，成本低(产量高)、质量好(纯度高、真核表达***，有翻译后修饰功能，与人源的最接近)、批次间稳定性好(同一个细胞株发酵纯化，保证表达蛋白基本一致)。
实施例2抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的制备
用实施例1制备的非洲猪瘟病毒P30重组蛋白免疫8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫时，非洲猪瘟病毒P30重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化，腹腔接种小鼠，100μg蛋白/只；7天后非洲猪瘟病毒P30重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化，第二次腹腔接种途径免疫小鼠，100μg蛋白/只；7天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫非洲猪瘟病毒P30重组蛋白，100μg/只；免疫后的第3天，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，HAT选择性培养基培；10天后以非洲猪瘟病毒P30重组蛋白为包被抗原，间接ELISA检测细胞上清，筛选阳性杂交瘤细胞，从中筛选到7B5细胞株。
取8～10周龄Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5mL，7～10日后每只小鼠注射杂交瘤细胞(47株、118株分别培养注射)1×106～2×106个，7～10日后，抽取小鼠腹水，在2～8℃下，以1200r/min离心10分钟，收集上清液。使用ProteinG亲和层析柱纯化单克隆抗体，将抗体分别分装成0.5mL/管，-20℃保存备用。
接下来，我们委托南京金斯瑞公司对来单克隆抗体进行分型检测和所识别的抗原表位进行检测，结果显示，本发明所述的抗非洲猪瘟病毒P30的两株单克隆抗体均为IgG1亚型，其中，7B5株结合的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30的aa77-aa92位(氨基酸序列具体EHQAQEEWNMILHVLF)。
参见中国发明专利(CN 111393525 B)实施例5的方法对制备的单克隆抗体进行重链可变区和轻链可变区的测定，经过测定，重链可变区和轻链可变区的序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示。
实施例3非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条制备
1制造用材料乳胶微球(300nm)购自上海辉质生物技术有限公司；兔抗猪IgG购自北京索莱宝公司；PVC底板购自杭州瑞建；样品垫购自通成纸业；标记垫购自通成纸业；吸水纸购自上海捷宁生物科技有限公司。
2质控线抗体(抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体)制备(试纸条1和试纸条2通用)抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体为实施例2制备的单克隆抗体，用PBS稀释至1mg/mL，备用。
3硝酸纤维素膜的制备
3.1包被缓冲液的配制将1g蔗糖加入到100mL的PBS(0.01mol/L，pH值7.2)中配制成包被缓冲液，0.22μm滤膜过滤除菌，置2～8℃保存备用。
3.2硝酸纤维素膜的制备
3.2.1试纸条1的制备(间接检测法)将硝酸纤维素膜贴于PVC底板的相应位置，用包被缓冲液将非洲猪瘟病毒P30蛋白(实施例1制备)稀释至1mg/mL，调整划膜机的划线位置及高度，划线为T线，即为检测线，T线靠近乳胶微球垫端，用包被缓冲液将兔抗猪IgG抗体稀释到1mg/mL，调整划膜机的划线位置及高度，划线为C线，即为质控线，C线靠近吸收垫，两线距离5～8mm。置37℃烘箱烘干15小时，装入放有干燥剂的铝箔袋中密封，2～30℃保存备用。
3.2.2试纸条2的制备(双抗原夹心法)将硝酸纤维素膜贴于PVC底板的相应位置，用包被缓冲液将非洲猪瘟病毒P30蛋白(实施例1制备)稀释至1mg/mL，调整划膜机的划线位置及高度，划线为T线，即为检测线，T线靠近乳胶微球垫端，用包被缓冲液将非洲猪瘟病毒P30蛋白(实施例1制备)稀释到1mg/mL，调整划膜机的划线位置及高度，划线为C线，即为质控线，C线靠近吸收垫，两线距离5～8mm。置37℃烘箱烘干15小时，装入放有干燥剂的铝箔袋中密封，2～30℃保存备用。
4乳胶垫的制备(试纸条1和试纸条2通用)
4.1乳胶微球的制备本试纸条所用的乳胶微球为商化试剂。
4.2标记将非洲猪瘟病毒P30蛋白(实施例1制备)按1mg/mL乳胶微球的量加入到乳胶微球中，旋转混匀2小时。加入BSA至终浓度为1％，旋转混匀30分钟。在2～8℃下，以10000r/min离心30分钟，弃上清，收集沉淀，沉淀用1mL保存液(保存液的配制：称取Tris0.25g、BSA 1g、蔗糖2g加入到90mL双蒸水中溶解，待完全溶解后，混匀，调pH值至8.0，再加入双蒸水定容至100mL)重悬超声1分钟，置2～8℃保存。
4.3乳胶微球垫的制备将重悬好的乳胶微球标记抗体均匀的铺在已处理的乳胶微球垫上，置37℃烘箱烘干15小时，铝箔袋封装，置2～30℃保存备用。
5样品垫的处理(试纸条1和试纸条2通用)将样品垫(300mm×20mm)浸泡于封闭液(封闭液的配制：称取BSA 1g加入到10mL的纯化水中，充分溶解)中30分钟后，37℃烘箱烘干15小时，铝箔袋封装，置2～30℃保存备用。
6非洲猪瘟病毒抗体检测试纸条的组装(试纸条1和试纸条2通用)如图2所示，将样品垫，乳胶微球垫，吸收垫依次粘贴到已粘有硝酸纤维素膜的PVC底板的相应位置，使乳胶微球垫、吸水垫分别与硝酸纤维素膜部分接触，样品垫与乳胶微球垫部分接触，制成大板。.
7包装用切条机将试纸条1和试纸条2大板切成3mm宽的试纸条，装上外壳，每个外壳里面包含一条试纸条1和一条试纸条2(具体包装见图3)，用铝箔袋密封包装，内含试纸条2个，吸管一个，干燥剂一包。
8样品缓冲液的制备1×PBS(0.01mol/L PBS pH值7.4)，无菌分装，10mL/管，2～30℃保存备用。
9试纸条的组装将检验合格的各试纸条组份按下表组装
组分 数量 规格
非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条 50袋 1组/袋
样品缓冲液 1管 10mL/管
说明书 1份 /
10试纸条用法与判定
10.1样本处理血液、血清和组织液(如唾液和乳汁等)直接用于检测。
10.2操作步骤取适量的检测样品(30～40μl，滴管1滴)，缓慢滴加到样品孔中，然后滴加2滴样品缓冲液。加样完成后将试纸条平放在桌面上，5～10分钟内观察结果。
10.3判定(如图4所示)
10.3.1两条试纸条均出现两条条带(T：检测线，C：质控线)，判为阳性。
10.3.2两条试纸条均只出现一条带(C：质控线)，判为阴性。
10.3.3两条试纸条一个出现两条带(T：检测线，C：质控线)，一个出现一条带(C：质控线)时，判为可疑。当出现可疑时，需要重新检测，当第二次检测结果均出现两条带(T：检测线，C：质控线)时判为阳性；当第二次检测结果仍然是一个出现两条带(T：检测线，C：质控线)、一个出现一条带(C：质控线)时，也判为阳性；当第二次检测结果均只出现一条带(C：质控线)时，判为阴性。
10.3.4试纸条质控线处不出现条带，判为无效。
11试纸条使用注意事项
11.1包装破损、过有效期的，请勿使用。
11.2试纸条贮藏与运输过程中不可冷冻，避免阳光直晒。
11.3试验时，请勿饮食和吸烟。
11.4处理疑似被感染物时，应带上手套，并在处理后将手洗净。
11.5试验完毕后，试纸条和其他物品与检测样品一起进行无害化处理。
12试纸条贮藏与有效期2～30℃阴凉干燥处保存，有效期为24个月。
实施例4非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条性能评价
1试剂条制备非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条，参见实施例3制备，批号分别为批号为210301、210302、210305。
2特异性评价
2.1将6份特异性样品(猪***O型病毒阳性血清(购自中监所)、猪伪狂犬病毒阳性血清(购自中监所)、猪瘟病毒阳性血清(购自中监所)、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清(购自中监所)、猪圆环病毒阳性血清、猪流行性腹泻病毒阳性血清)分别用三批试纸条进行检测，3批试纸条的检测结果全部为阴性，即阴性检出率为100％，具体见表1。
2.2将5份非洲猪瘟病毒抗体阴性猪血清样品、5份非洲猪瘟病毒抗体阴性猪血液样品、10份非洲猪瘟病毒抗体阴性组织液(ELISA检测为阴性)分别用三批试纸条进行检测，3批试纸条的检测结果全部为阴性，即阴性检出率为100％，具体见表1。
表1特异性检测结果
Figure BDA0003216868110000071
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
3敏感性检验3批试纸条对3份阳性样品的检测结果显示(表2)，3份阳性血清的最低检出限分别为1:320(ELISA为1:640)、1:80(ELISA为1:160)、1:160(ELISA为1:320)。说明试纸条的敏感性较好。
表2敏感性检测结果
Figure BDA0003216868110000072
Figure BDA0003216868110000081
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
4重复性评价三批试纸条均按照说明书检测强阳性血清、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清样品，结果见表3。从表可见，本实验室试制的3批试纸条检测非洲猪瘟病毒抗体强阳性血清、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清样品的批内和批间都一致，表明以实验室方法制备的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸条具有较好的重复性。
表3重复性检测结果
Figure BDA0003216868110000082
Figure BDA0003216868110000091
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序 列 表
<110> 杭州恒奥科技有限公司
<120> 非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> 密码子优化后的非洲猪瘟病毒P30核苷酸序列
<400> 1
CACATGGACT TCATTCTGAA CATCTCGATG AAGATGGAGG TCATCTTCAA GACGGACCTC 60
CGGTCCTCCA GCCAGGTGGT CTTCCACGCG GGCTCCCTGT ATAACTGGTT CAGCGTGGAG 120
ATCATCAACA GCGGCCGCAT CGTGACCACG GCGATCAAGA CCCTGCTCAG CACCGTGAAG 180
TACGACATCG TGAAGTCCGC CCACATCTAC GCGGGCCAGG GTTACACGGA GCACCAGGCC 240
CAGGAGGAGT GGAACATGAT CCTGCACGTG CTGTTCGAGG AGGAGACCGA GTCGTCCGCT 300
TCGAGCGAGA GCATCCACGA GAAGAACGAC AACGAGACGA ACGAGTGCAC GTCCAGCTTC 360
GAGACGCTGT TCGAGCAGGA GCCCAGCAGC GAGGAGCCCA AGGACAGCAA GCTGTACATG 420
CTGGCCCAGA AGACGGTGCA GCACATCGAG CAATACGGCA AGGCGCCCGA CTTCAACAAG 480
GTCATCCGCG CTCACAACTT CATCCAGACC ATCCACGGCA CCCCTCTGAA GGAGGAGGAG 540
AAGGAGGTGG TGCGCCTGAT GGTGATCAAG CTGCTGAAGA AGAACAAGCT GCTCAGCCAC 600
CTGCACCTGA TGTTCCTGGA G 621
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体重链可变区序列
<400> 2
Val Gln Leu Lys Glu His Gln Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile
1 5 10 15
Thr Cys Thr Val His Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Ile Lys Trp Gln Gly
20 25 30 35
Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Leu Gly Phe Trp Trp Gly Glu Gly
40 45 50
Asn Thr Asp Tyr Phe Ala Ala Gln Cys Ser Thr Leu Leu Gly Ser Lys Asp Asn
55 60 65 70
Ser Lys Ser Pro Val Gln Ile Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Cys Thr Pro
75 80 85 90
Met Tyr Pro Ile Ala Arg Tyr Tyr Ala Gly Ser Ile Tyr Asp Thr Met Asp Tyr
95 100 105
Asn Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Cys
110 117
<210> 3
<211> 108
<212> PRT
<213> 抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体轻链可变区序列
<400> 3
Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Gly Val His Gln Gly Ile Gln Ala Ser Ile
1 5 10 15
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Gly Val His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Tyr His Trp
20 25 30 35
Tyr Pro Gln Lys Ser Gly Glu Ser Pro Lys Val Leu Tyr Tyr Lys Val Ser Asn Pro
40 45 50 55
Phe Ala Gly Val Pro Asp Arg Ser Gln Gly Ser Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
60 65 70 75
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu His Gln Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr
80 85 90 95
His Val Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu
100 105

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条由两条联检试纸条和处理液组成，所述两条联检试纸条为合并在一起的试纸条，每个试纸条均包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；两条试纸条的乳胶微球垫均为乳胶微球标记非洲猪瘟病毒P30蛋白；两条试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线均为抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体，其中之一的检测线为非洲猪瘟病毒P30蛋白，另一个检测线为羊抗猪二抗。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒P30蛋白由CHO细胞株表达，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的相对分子量为36kD，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的编码序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的样品处理液为1×PBS溶液。
4.根据权利要求1所述的试纸条，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77-aa92位，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77-aa92位的氨基酸序列为EHQAQEEWNMILHVLF。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的试纸条在检测样本时，当两条试纸条均出现两条条带时，判为阳性；当其中一个出现两条带，一个出现一条质控带时，判为可疑；当两条试纸条均只出现一条质控带时，判为阴性；其他情况判为无效。
7.根据权利要求6所述的试纸条，其特征在于，所述的当其中一个出现两条带，一个出现一条质控带时，判为可疑时，需要重新检测；当第二次检测结果均出现两条带时判为阳性，当第二次检测结果仍然是一个出现两条带、一个出现一条质控带时，判为阳性；当第二次检测结果均只出现一条质控带时，判为阴性。
8.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的试纸条适用于检测猪血清、血液和组织液中的非洲猪瘟病毒抗体。
9.根据权利要求8所述的试纸条，其特征在于，所述的组织液为唾液。
10.根据权利要求8所述的试纸条，其特征在于，所述的组织液为乳汁。
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Denomination of invention: African Swine Fever Virus Antibody Rapid Detection Test Strip and Its Preparation Method and Application

Effective date of registration: 20230608

Granted publication date: 20220401

Pledgee: Bank of Jiangsu Limited by Share Ltd. Hangzhou branch

Pledgor: Hangzhou Heng Ao Technology Co.,Ltd.

Registration number: Y2023330001138