CN113122540B - 一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用，属于生物技术和农业应用领域。该RNAi的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，其获得的步骤如下：(1)提取蛴螬的总RNA，反转录获得cDNA第一链；(2)以步骤(1)中获得的cDNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增；(3)以步骤(2)中的PCR产物为模板，使用SEQ ID NO.3～6所示的引物进行PCR，获得合成dsRNA的正、反向模板；(4)反应完成后回收电泳产物，以回收的电泳产物为模板，转录合成dsRNA。注射或饲喂上述dsRNA72h后，蛴螬幼虫的HpCDA1沉默效率高于95％，死亡率高于90％。

Description

一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和农业应用领域，尤其涉及一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用。

背景技术

蛴螬是国内外公认难防治的土栖性害虫，对农作物、果树和林木等造成严重危害。化学农药防治破坏了生态环境和作物品质，因此利用生物防治方法控制蛴螬危害成为必然，开发新的生物防治靶标的害虫治理策略成为研究热点。昆虫体壁是维护昆虫生长发育的重要防御***，其中体壁中表皮层主要由几丁质和蛋白质组成，可作为杀虫药物的新型靶标。几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）是几丁质代谢过程中的重要酶，可通过催化 N−乙酰氨基−D−葡萄糖胺（N−acetyl−b−D−glucosamine）脱去乙酰基将几丁质转变为壳聚糖，通过改变几丁质，破坏昆虫生长机制，是重要的生防靶标。

RNA干扰 (RNAi) 是由双链RNA (dsRNA) 引发的内源特异性基因转录后沉默机制。dsRNA导入生物体内后，被细胞中称为Dicer的RNase Ⅲ分解成21-23 bp的小干扰RNA(siRNA)，siRNA在沉默复合体 (RISC) 的作用下与目标mRNA结合，序列特异性地降解靶mRNA，阻止相应蛋白产物的合成，造成靶标基因的功能丧失。自从这种快速且直接沉默特定基因的机制被发现以来，RNAi技术迅速在非模式动物的基因功能研究领域得到广泛应用。RNAi作为一种基因功能研究的工具被大量应用，尤其是在遗传操作工具不完善的动植物中被广泛应用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因，该RNAi靶标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

该RNAi靶标基因的制备方法包括如下步骤：

（1）提取蛴螬的总RNA，反转录获得cDNA第一链；

（2）以步骤（1）中获得的cDNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR，获得chitin deacetylase1（HpCDA1）全长基因；

（3）以步骤（2）中的PCR产物为模板，使用SEQ ID NO.3~6所示的引物进行PCR扩增，获得作为扩增dsRNA序列的正、反向模板；

（4）反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，后回收电泳产物，以回收的电泳产物为模板，转录合成dsRNA，即获得RNAi靶标基因，该RNAi靶标基因由SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列组成。

进一步的，所述步骤（2）中的PCR反应体系为： 25 µL：2×PrimeSTAR Max Premix12.5µL、10 μmol/L 上下游引物各1 µL、模板1 µL、无菌蒸馏水10.5 μL。

进一步的，所述步骤（2）中的PCR反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 15 s，72℃ 10 s，35 个循环。

进一步的，所述步骤（3）中PCR反应体系为： 25 µL：2×PrimeSTAR Max Premix12.5µL、10 μmol/L 上下游引物各1 µL、模板1 µL、无菌蒸馏水10.5 μL。

进一步的，所述步骤（3）中的PCR反应条件为： 95°C，5 min；95°C，30 s；60°C，30s；72°C，45 s，5个循环；95°C，30s；50°C，30s；72°C，45s，35个循环；72°C，10min。

本发明的目的之二在于提供所述RNAi靶标基因在蛴螬防控中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种生物制品，其含有上述RNAi靶标基因。

进一步的，所述生物制品为注射式杀虫剂或饵剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

通过注射、饲喂蛴螬chitin deacetylase 1（HpCDA1）的dsRNA（即RNAi靶标基因），统计摄入dsRNA后72h虫口死亡率以及基因沉默效率，以绿色荧光蛋白（GFP）为对照进行相同处理。结果显示，注射和饲喂dsRNA的蛴螬的HpCDA1基因沉默效率高于95%，虫口死亡率高于90%。本发明为蛴螬的生物防治提供了高效的靶标基因。

附图说明

图1为实施例2中注射dsGFP和dsHpCDA1 72h后蛴螬HpCDA1基因的相对表达量图。

图2为实施例2中注射dsHpCDA1 72h蛴螬形态图。

图3为实施例2中对照组dsGFP蛴螬形态图。

具体实施方式

实施例1

1.HpCDA1特异序列

将蛴螬几丁质脱乙酰酶基因HpCDA1基因序列提交GenBank，登录号为MG189704，基因长1593bp，编码530个氨基酸，预测蛋白分子量为60.1kDa，结构域分析结果显示HpCDA1包含几丁质结合区（ChBD）、低密度脂蛋白受体区（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化区（CDA）。

2. HpCDA1基因特异序列扩增

根据序列信息，设计HpCDA1全长基因特异引物，引物序列如表1所示，其包括SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，可扩增出长度为1593bp的目的片段。

表1 基因克隆特异引物

3.供试昆虫饲养

蛴螬为河北农业大学植物保护学院昆虫生化与分子生物学实验室使用人工饲料饲养，饲养温度为26±1°C，相对湿度60–70%，光照16:8。

4. RNA的提取

（1）提取蛴螬整虫总RNA，称量幼虫组织14 mg，参照TIANGENRNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒说明书，提取其总RNA。具体提取RNA操作步骤如下：

①匀浆处理：每10-20 mg组织加300 μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），用研磨 杵将组织彻底研磨（如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器）；随后向匀浆液 中加入590 μl RNase-Free ddH₂O和10 μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20 min。 注意：组织量一定不要超过20 mg，否则将导致RNA得率和质量下降。

②12,000 rpm(~13,400×g)离心2-5 min，取上清进行以下操作。

③缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀 一起转入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)离心30- 60sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

④向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

⑤DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I 储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入 70 μl RDD缓冲液，轻柔混匀。

⑥向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I 工作液，室温放置15 min。

⑦向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60sec，弃 废液，将吸附柱放回收集管中。

⑧向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

⑨重复步骤8。

⑩12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以 彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑪将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30μl RNase-Free ddH2O，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g) 离心2 min，得到RNA溶液。后取1ul得到的RNA溶液稀释10倍后，使用分光光度计检测RNA的纯度，浓度。并同样取1ul稀释10倍后跑琼脂糖凝胶检测完整性。

5. cDNA的合成

按照Promega cDNA Synthesis Kit（Promega）试剂盒说明书合成cDNA。具体如下，配制反转录体系：1ul 上述所提总RNA，1ul oligo dT，3ul Nucleacen free-water， PCR仪中70℃，5min；之后添加5×Realtion Buffer，2.5ul mM MgCl_2，1ul Mix，0.5ul Inhibitor，1ul RT，6ul ddH₂O。在PCR仪25℃ 5min，42℃ 1h，70℃ 15min。合成后将cDNA放于-20℃冰箱保存。

6. dsRNA的合成

参照T7 RiboMAX™ Express RNAi System说明书，设计扩增HpCDA1基因以及对照GFP基因的正、反向Linear DNA的引物，如表2所示，其包括SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.10。分别以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物并以步骤2中获得的1593bp的HpCDA1基因为模板进行PCR，获得合成靶标基因HpCDA1 的dsRNA所需正、反向模板。以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为一组引物并以pGR107质粒为模板进行PCR，获得合成对照GFP 的dsRNA所需正、反向模板。PCR 反应体系（25 µL）：2×PrimeSTAR Max Premix 12.5µL、10 μmol/L 上下游引物各1 µL、模板1 µL、无菌 蒸馏水10.5 μL。PCR 反应程序 ：95°C，5 min；95°C，30 s；60°C，30 s；72°C，45 s，5个循环；95°C，30s；50°C，30s；72°C，45s，35个循环；72°C，10min。反应完成后分别进行琼脂糖凝胶电泳，然后用试剂盒回收电泳产物，以回收的正、反向产物为模板，用转录试剂盒合成dsRNA。dsRNA合成转录体系（20µL）：RiboMAX^TM Express T7 2×Buffer 10µL，正、反向模板各 5µL（2µg），T7 Express Enzyme Mix 2µL，无菌蒸馏水3µL。PCR 仪中 37℃，4 h，体外转录合成正、反向单链 ssRNA。将等体积正、反向 ssRNA 产物混合，轻柔混匀，70℃，10 min，自然冷却至室温。加入 RNaseA Solution 和 RNaseFree DnaseSolution，37℃，30 min，去除 DNA 模板及 ssRNA。加入 2.5 倍体积的 95%乙醇及 1/10 体积的 3 mol/LNaAc（pH 5.2），轻柔混匀，冰浴 5 min，12000 rpm 离心 10 min，纯化 dsRNA。去除上清，加入 500 mL预冷 70%乙醇洗涤沉淀，12000 rpm 离心 3 min，去除上清，于超净台内干燥，加入 100µLNucleaseFree ddH₂O 溶解 dsRNA。

电泳检测上述扩增获得的dsRNA（dsHpCDA1和dsGFP）的质量及片段大小。通过分光光度计检测dsHpCDA1的浓度为6950.8μg/ml，OD值260/280为2.08，dsGFP的浓度为5750.5μg/ml，OD值260/280为2.03，PCR条带较为单一无其他杂带，大小、浓度均符合要求，可用于RNAi试验。

表2 dsRNA特异引物

实施例2

挑取2龄1天蛴螬，以dsGFP为对照，将上述合成的dsHpCDA1注射入蛴螬体内，注射部位位于腹部侧面第2和第3对足的交界处。每头试虫的dsRNA注射量均为10ug（2 ul，5000ng/ ul）。实验共设置3个生物学重复，每个生物学重复20头若虫，共计60头试虫。试虫置于24孔板中饲养，注射72h后，统计试虫死亡率以及基因沉默效率。

分别提取注射dsGFP和dsHpCDA1 72h后蛴螬总RNA，反转录合成cDNA第一链，以HpCDA1F SEQ ID NO.11和HpCDA1R SEQ ID NO.12为引物用qRT-PCR法测定注射dsGFP、dsHpCDA1后72h的HpCDA1的表达量，统计分析沉默效率，结果发现注射dsHpCDA1的蛴螬HpCDA1的基因表达量受到抑制，结果如图1所示，经计算沉默率约为99%，而注射dsGFP的蛴螬HpCDA1基因没有被沉默。

基因的相对表达量的获得过程如下：实时荧光定量PCR得到结果后，分析溶解曲线后通过比较Ct值的方法进行数据分析。每一个cDNA设置三个重复，以β-actin作为内参基因。用SPSS软件分析样本间差异显著性，用下面这个公式计算相对表达量：

2^△△Ct=2^{-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]处理组-[(Ct目的基因-Ct内参基因)]对照组}

注射dsHpCDA1的暗黑鳃金龟（幼虫）虫体颜色变深，甚至变为黑色，生长缓慢，动作迟缓，少动，表皮皱缩，出现蜕皮困难直至死亡，其状态如图2所示。对照组的暗黑鳃金龟（幼虫）状态如图3所示。注射dsHpCDA1的幼虫72h的死亡率为100%，显著高于对照组的死亡率3.33%。

表3

实施例3

本实施例以喂食蛴螬的方式代替实施例2中的注射方式，将20µg（2 µl，5000ng/ µl）dsRNA混入2g人工饲料（玉米秸秆粉末，甘蔗粉加500ml水煮至糜烂，将残渣捣碎，取300ml水加入糖及琼脂，加水煮沸，倒入上述组分中，定容至1L即得人工饲料）喂食72h后统计试虫死亡率以及基因沉默效率。

分别提取饲喂dsGFP和dsHpCDA1 72h后蛴螬总RNA，方法同实施例2，72h时统计分析沉默效率，结果发现喂食蛴螬HpCDA1的基因表达量受到抑制，经计算沉默率约为95.51%，幼虫死亡率为91.67%，而喂食dsGFP的蛴螬HpCDA1基因没有沉默，死亡率为0。

由实施例2和实施例3可知，两种实施方法均可实现HpCDA1基因的沉默，蛴螬的死亡率在90%以上，具有极高的应用前景。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用

<130> 2021.04.09

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgcgct tgcacagtg 19

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatctccagt tggatcgttc accc 24

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taatacgact cactatagga cagcttcgaa gcggaactct gt 42

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtagccttg atgtcaca 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acagcttcga agcggaactc tgt 23

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taatacgact cactataggg gtagccttga tgtcacaccc at 42

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taatacgact cactataggc cacaagttca gcgtgtccg 39

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agttcacctt gatgccgttc t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccacaagttc agcgtgtccg 20

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taatacgact cactatagga gttcaccttg atgccgttct 40

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgataattg ccgtgacgtc atcc 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgtcggtgta cagaagtggc ttgac 25

<210> 13

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggcgcgct tgcacagtgc gcttttggtt ctttctattt gtgccttcgc cgccggacaa 60

gaggaagcgg ccgtcaagaa ggaggacagc ttcgaagcgg aactctgtaa agataaagat 120

gcaggagaat ggttcagatt ggtagcagga gaaggtgata attgccgtga cgtcatccaa 180

tgcacatcat cgggtctcca agccattcgt tgccccgccg gtctgttctt cgacatcgaa 240

aaacaaacgt gcgattggaa ggaatcggtg aaaaactgca aattaaagaa caaagagcgt 300

aaagtcaagc cacttctgta caccgacgaa ccagtctgtt ccgaaggaca gttggcatgc 360

ggcgacagta tttgtataga cagaggtctt ttctgtaacg gagaaaagga ctgttcagac 420

ggttcagacg aaaatacttg tgacatagat aacgatccga atagagcgcc tccttgcgat 480

ccagccgtct gtacgctccc ggactgtttc tgctccgaag atggtacaca ggtgccgggc 540

gacttgccac ctaaggacgt accccaaatg atcacaatca cttttgatga cgccatcaac 600

aacaataata tcgaattgta caaagaaatc ttcaacggta accgtaagaa tccgaatggg 660

tgtgacatca aggctacctt ctttgtttcg cacaagtata ccaattattc tgctgtacag 720

gaaatgcacc gtaaaggaca cgagattgcc gtgcactcaa taacacacaa tgacgaagaa 780

cgtttctgga gtaatgcaac tgtagatgac tgggctaaag aaatggctgg catgagaatc 840

attaccgaaa aattcgccaa tttaaccgac aacagtgtag taggtgtccg tgcaccatat 900

ttacgtgtag gaggcaacaa tcaattcacc atgatggaag aacaagcttt cctttacgat 960

tccaccatca cagcacctct aagcaatcct ccattgtggc cgtacaccat gtatttccgc 1020

atgccgcacc gctgtcacgg taacgttcag aactgtccga caagaagtca cgccgtgtgg 1080

gaaatggtcc tcaacgaatt ggatagaaga gaagatccca ccaacgacga atatctgcca 1140

ggttgcgcta tggtcgactc atgttcgaac atcttgaccg gtgaccaatt ctacaatttc 1200

ctcaaccaca atttcgaacg acattacgaa gaaaatcggg cccctctcgg tctgtacttc 1260

cacgccgctt ggttaaagaa taatccagac ttcttggacg ctttcttgta ttggatagac 1320

gaaattctga aggaccacag cgacgtatac ttcgtgacga tgacgcaagt tattcaatgg 1380

gttcagaatc caagaacagt atcagaatcc aagaatttcg aaccatggag ggagaagtgc 1440

gtaatcgatg gaataccaaa ttgttgggtg ccgcattctt gtaaactaac atccaaagaa 1500

gttcctggag aaaccatcaa tttacagacg tgcgtcagat gcccgaacaa ctatccatgg 1560

gtgaacgatc caactggaga tggattcttc taa 1593

Claims (9)

1.一种对蛴螬高效致死的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的制备方法包括以下步骤：以SEQ ID NO.13所示的核苷酸为模板，以SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6为引物，分别进行PCR扩增获得正、反向产物，后再转录合成dsRNA。

2.根据权利要求1所述的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的制备方法包括如下步骤：

（1）提取蛴螬的总RNA，反转录获得cDNA第一链；

（2）以步骤（1）中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增；

（3）以步骤（2）中的PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6为引物，分别进行PCR扩增，获得作为扩增dsRNA序列的正、反向模板；

（4）反应完成后回收电泳产物，以回收的电泳产物为模板，转录合成dsRNA，即获得RNAi靶标基因。

3.根据权利要求2所述的dsRNA，其特征在于，所述步骤（2）中的PCR反应体系为：25 µL：2×PrimeSTAR Max Premix 12.5µL、10 μmol/L 上下游引物各1 µL、模板1 µL、无菌蒸馏水10.5 μL。

4.根据权利要求3所述的dsRNA，其特征在于，所述步骤（2）中的PCR反应条件为：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 10 s，35 个循环。

5.根据权利要求2所述的dsRNA，其特征在于，所述步骤（3）中PCR反应体系为： 25 µL：2×PrimeSTAR Max Premix 12.5µL、10 μmol/L 上下游引物各1 µL、模板1 µL、无菌蒸馏水10.5 μL。

6.根据权利要求5所述的dsRNA，其特征在于，所述步骤（3）中的PCR反应条件为： 95°C，5 min；95°C，30 s；60°C，30 s；72°C，45 s，5个循环；95°C，30s；50°C，30s；72°C，45s，35个循环；72°C，10min。

7.权利要求1-6任一项所述的dsRNA在蛴螬防控中的应用。

8.一种生物制品，含有权利要求1-6任一项所述的dsRNA。

9.根据权利要求8所述的生物制品，其特征在于，所述生物制品为注射式杀虫剂或饵剂。

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