CN113041289B - 复方一枝黄花喷雾剂干粉抗rna病毒药物靶点活性及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉在制药中的新应用,本发明发现复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉在1mg/mL时,对新冠病毒药物靶点Cathepsin L蛋白酶抑制率达55.6%;对艾滋病病毒蛋白酶的抑制率为IC50=0.38mg/mL可单独用或与其它药物复配用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎药物和抗病毒药物。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域,特别是涉及复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉在制备新型冠状病毒肺炎和抗病毒药物中的应用。
技术背景
新冠病毒(SARS-CoV-2)属于单链RNA正链包膜β冠状病毒,通过飞沫、接触、粪口侵入人体后,迅速攻击肺部、心脏、肾脏、肠道等多个器官,造成多器官衰竭,最后导致死亡。该病毒目前无有效疫苗和特效治疗药物。目前新冠肺炎感染全球已超300万例,新冠病毒感染已成为世界上最致命的感染性疾病之一,严重危害人类健康。
新冠病毒(SARS-CoV-2)的复制周期包括侵入、复制、组装与分泌等阶段,阻断病毒复制周期的任何阶段,都可以抑制病毒的复制,该病毒基因组包括28种编码蛋白,其中16种非结构蛋白,4种结构蛋白和8种辅助蛋白。目前已确立新冠病毒的7个药物筛选靶点分别是刺突糖蛋白(SARS-CoV S)、病毒受体ACE2 蛋白、木瓜样蛋白酶(PLpro)、3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(Mpro)、介导病毒 RNA帽子的甲基化修饰的nsp16、病毒转录复制相关的RNA聚合酶(RdRp)和潜在病毒用于干扰宿主免疫的X domain蛋白。据报道SARS-CoV S蛋白水解过程对病毒侵入和融合起着关键的作用,肽链内切酶组织蛋白酶L(Cathepsin L,CatL PR)已被证明是SARS-CoV S蛋白酶酶解过程中关键裂解位点的相关外源基因蛋白酶,是研究抗SARS-CoV-2(2019-nConV)药物的有效靶点。([1]Zhang J.S.,Ma, X.C.,Yu,F.,etal.Teicoplanin potently blocks the cell entry of 2019-nCoV, https://doi.org/10.1101/2020.02.05.935387doi:bioRxiv preprint.[2]Markus Hoffmann et al.SARS-CoV-2cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically-proven protease inhibitor,Cell,2020,doi:10.1016/j.cell.2020.02.052)。
HIV病毒由核心和包膜组成,核心包括两条单股RNA链、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶(逆转录酶、整合酶和蛋白酶)。在病毒圆熟和感染过程中,艾滋病病毒蛋白酶(HIV-1PR),将gag和gag-pol基因产物裂解为病毒成熟所需的结构蛋白(机质、壳、壳核)和酶(蛋白酶、整合酶、逆转录酶)。因此艾滋病病毒蛋白酶(HIV-1PR)已被认为是艾滋病药物筛选的重要靶标([3]Kohl,N. E.;Emini,E.A.;Schleif,W.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988,85,4686.)。
天然产物具有化学结构复杂性和生物活性多样性,是创新药物研究开发的重要物质来源之一。
复方一枝黄花喷雾剂由一枝黄花167g、山银花287g、贯众167g、连翘167g、薄荷111g、荆芥111g、艾纳香111g制成1000mL喷雾剂。具有清热解毒,宣散风热,清利咽喉等功效。用于上呼吸道感染,急、慢性咽炎,口舌生疮,牙龈肿痛,口臭等病症治疗。上述7种药材用水浸泡2-3小时后,加热蒸馏,首先提取挥发油和芳香水;药渣经水提醇沉,除去多糖和蛋白质等沉淀后,滤过,滤液减压回收乙醇,获得清膏;加入芳香水,混匀、冷藏、滤过;滤液加入甜菊素、山梨酸钾混匀,加水至规定量,灌装即得产品,通过质量标准检测确定为合格产品。 (贵州百灵制药股份有限公司,ZL 200910306184.3)。据报道复方一枝黄花喷雾剂与利多卡因配合治疗108例手足口病毒引起的口腔疱疹,效果较好(李文红,曲雪梅,刘艳杰,于淑玲,利多卡因配合复方一枝黄花喷雾剂用于手足口病患儿口腔疱疹的护理效果分析,临床和实验医学杂志.2012年02期第127页)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有治疗新型冠状肺炎的有效药物稀少的缺陷,提供复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉在制备Cathepsin L和HIV-1蛋白酶抑制剂、治疗新型冠状肺炎和抗病毒药物中的应用。
本发明的技术方案包括:
复方一枝黄花喷雾剂干粉抗RNA病毒药物靶点活性及应用。
具体说,是复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉在制备抗新型冠状病毒和艾滋病毒药物中的应用。
更具体来说,复方一枝黄花喷雾剂前浸膏干粉具有抑制新型冠状病毒肺炎药物靶点Cathepsin L蛋白酶活性。
作为一种优选,复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉在1mg/mL时抑制新型冠状病毒肺炎药物靶点Cathepsin L蛋白酶活性为55.6%。
复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉具有抑制艾滋病病毒蛋白酶活性。
作为一种优选,复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉抑制艾滋病病毒蛋白酶活性, IC50为0.38mg/mL。
作为一种优选方案,取复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉,可以制成包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、注射剂、口服液、软胶囊剂、滴丸剂在内的药剂上可以接受的剂型。
作为另一种优选方案,取复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉,加入其它抗病毒原料药复配,可以制成包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、注射剂、口服液、软胶囊剂、滴丸剂在内的药剂上可以接受的剂型。
与现有技术相比,本发明的申请人经过研究发现复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉对新型冠状病毒肺炎药物靶点Cathepsin L和艾滋病病毒蛋白酶具有一定的抑制作用,因此可单独用于制备新型冠状病毒肺炎Cathepsin L蛋白酶抑制剂、制备新型冠状病毒肺炎的药物,以及预防和治疗新型冠状病毒肺炎药物,也可与其它组分或药物复配用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎药物和抗病毒药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,但不作为对本发明的任何限制。
为了确认药物质量及验证其抗Cathepsin L和HIV-1蛋白酶作用,本发明做了相关的实验如下:
1、复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉的质量检测
1.1薄层色谱法:照发明专利ZL 200910306184.3薄层色谱法测定(贵州百灵企业集团制药股份有限公司完成)。
1.2 HPLC法:照发明专利ZL 200910306184.3HPLC法测定(贵州百灵企业集团制药股份有限公司完成)。
2、药效评价:
检测仪器:Synergy II,十万分之一电子分析天平型号:MS205DU(METTLERTotoledo瑞士)。
试剂盒:520 Cathepsin L试剂盒*Fluorimetric*(Cat#:AS-72218,Lot#.1010美国圣何塞AnaSpec);520HIV-1试剂盒*Fluorimetric* (Cat#:AS-71147,Lot#.美国圣何塞AnaSpec)。
受试药物:复方一枝黄花喷雾剂(批号:2020.10,贵州百灵企业集团制药股份有限公司提供)浸膏干粉(FJGF)。
阳性对照:Cathpsin L inhibitor(Cat#:AS-72218,Lot#:1010美国圣何塞AnaSpec)、磷酸氯喹(Cas#:50-63-5,阿拉丁试剂)、Ribavirin(Cas#:6791-04-5,阿拉丁试剂)、Lopinavir(Cas#:192725-17-0,阿拉丁试剂)、Ritonavir(Cas #:155213-67-5,阿拉丁试剂)、莲花清瘟胶囊(批号:B1908014,石家庄以岭药业股份有限公司);Pepstatin A(Cat#:AS-71147,Lot#:1028.美国圣何塞 AnaSpec)。
数据处理与分析:数据以均数标准差表示(X±S),通过微软Windows 2003 Excel软件完成统计学处理,计量资料采用STDEV-t检验计算抑制率。
抑制率计算公式:
抑制率%=100×(Fvehicle-Fsample)/Fvehicle;式中的F为对照组和样品组荧光值。
2.1.Cathepsin L蛋白酶实验方法及结果:
测试溶液的配制(按试剂盒说明手册操作):
缓冲溶液:将2X实验缓冲液(Component D)1M DDT(Component F)按 124:1:进行混合,冰浴备用。
Cathepsin L蛋白酶底物溶解:用2X实验缓冲液稀释底物(Component A)100 倍,冰浴备用。
Cathepsin L蛋白酶溶液:用2X实验缓冲液稀释酶(Component C)200倍,现配现用,冰浴备用。
Cathepsin L抑制剂:用2X实验缓冲液稀释100μM的Cathepsin L抑制剂(Component E)100倍。
测定方法(按试剂盒说明手册操作):在384孔黑色平板(Lot#.09818015,美国Coring公司)中,先分别加入底物空白溶液(Substrate Control,SC)、溶剂空白溶液(Vehicle Control,VC)、阳性对照(Positive Control,PC)、抑制剂对照(InhibitorControl,IC)、测试化合物对照(Test Compound Control,TCC),再加入 Cathepsin L蛋白酶和底物。每个浓度均为3个复孔,震荡混匀后,37℃下暖孵 30分钟,经Synergy II在激发波长485nm和发射波长535nm下测试荧光强度。实验结果见表1。
2.2.HIV-1蛋白酶实验方法及结果:
测试溶液的配制(按试剂盒说明手册操作):
缓冲溶液:将2X实验缓冲液(Component D)、1M DDT(Component F) 和去离子水按1:0.002:1:进行混合,冰浴备用。
HIV-1蛋白酶底物溶解:用2X实验缓冲液稀释底物(Component A)50倍, 冰浴备用。
HIV-1蛋白酶溶液:用2X实验缓冲液稀释HIV-1蛋白酶至适当浓度,现配现用,冰浴备用。
Pepstatin A(阳性对照):添加20μLof DMSO(Component F)到Pepstatin A(Component C)形成2mM的Pepstatin A.用去离子水稀释冰浴备用。
测定方法(按试剂盒说明手册操作):在384孔黑色平板(Lot NO.09818015, 美国Coring公司)中,先分别加入底物空白溶液(Substrate Control,SC)、溶剂空白溶液(Vehicle Control,VC)、阳性对照(Positive Control,PC)、抑制剂对照(InhibitorControl,IC)、测试化合物对照(Test Compound Control,TCC),再加入HIV-1蛋白酶和底物。每个浓度均为3个复孔,震荡混匀后,37℃下暖孵30 分钟,经Synergy II在激发波长485nm和发射波长535nm下测试荧光强度。实验结果见表1。
2.3.抗病毒蛋白酶实验结果:实验结果见表1。
表1复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉对Cathepsin L和HIV-1蛋白酶的抑制率(n=3,平均值±RSD%)
“-”:未测试
阳性对照(Cat PR):PC-1~PC-6分别为:磷酸氯喹、Ribavirin、Lopinavir、Ritonavir、莲花清瘟胶囊、Cathepsin L inhibitor。数据为:平均值±相对标准偏差(三次独立实验值);阳性对照(HIV PR):PC-1:Pepstatin A。
复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉,在1mg/mL时,对Cathepsin L蛋白酶抑制率为55.6%,对新冠肺炎药物靶点Cathepsin L蛋白酶具有一定的抑制作用,对艾滋病病毒蛋白酶的抑制率为IC50=0.38mg/mL。
下面给出本发明的几个实施例。
实施例1:经实验验证,复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉,在1mg/mL时,对 CathepsinL蛋白酶抑制率为55.6%;对HIV-1蛋白酶抑制率为IC50=0.38mg/mL,可用于制备治疗新冠肺炎和抗病毒药物。
实施例2:取复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉,制成颗粒剂、胶囊剂、片剂、注射剂、口服液、软胶囊剂、滴丸剂等药剂上可以接受的剂型。
实施例3:取复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉,加入其它抗病毒原料药复配,制成颗粒剂、胶囊剂、片剂、注射剂、口服液、软胶囊剂、滴丸剂等药剂上可以接受的剂型。
以上只是本发明的具体应用范例,本发明还有其他的实施方式,凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案,均落在本发明所要求的保护范围之内。
Claims (4)
1.复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉在制备抗艾滋病病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉具有抑制艾滋病病毒蛋白酶活性。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉抑制艾滋病病毒蛋白酶活性, IC50为0.38 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:取复方一枝黄花喷雾剂浸膏干粉,制成药剂上可以接受的剂型。
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